專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L-氨基酸的方法，尤其涉及一種使用屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸、L-谷氨酸、L-高絲氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-異亮氨酸的方法。
傳統(tǒng)上，L-氨基酸(如L-蘇氨酸和L-谷氨酸)主要是采用屬于短桿菌屬、棒狀桿菌屬和微桿菌屬的棒形細(xì)菌或其突變體通過(guò)發(fā)酵方法進(jìn)行生產(chǎn)(“氨基酸發(fā)酵”，Gakkai Shuppan Center,195-215頁(yè)，1986)。
另外，已經(jīng)公開(kāi)了采用基因重組技術(shù)培育生產(chǎn)L-氨基酸的埃希氏桿菌屬細(xì)菌的技術(shù)。
例如，已經(jīng)公開(kāi)了一種采用大腸桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，其中大腸桿菌中編碼二氫吡啶二羧酸合成酶、天冬氨酸激酶的基因被脫敏而對(duì)L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制不敏感，并且二氨基庚二酸脫氫酶(或四氫吡啶二羧酸琥珀酰酶和琥珀酰二氨基庚二酸脫酰酶)被增強(qiáng)(95/16042)。
盡管L-氨基酸的產(chǎn)生能力通過(guò)培育上述的微生物得到很大的提高或生產(chǎn)方法被改進(jìn)，但仍然希望研究出生產(chǎn)L-氨基酸更有效的方法以便滿足將來(lái)對(duì)氨基酸的大量需要。
丙酮酸羧化酶[丙酮酸:二氧化碳連接酶(形成ADP),EC6.4.1.1]是一種含生物素的酶。它催化丙酮酸形成草酰乙酸的羧化反應(yīng)。還不知道大腸桿菌中是否有丙酮酸羧化酶，但枯草芽胞桿菌(Diesterhaft,MD.和Freese,E.,J.，生物化學(xué)，248,No.176062-6070(1973))和谷氨酸棒狀桿菌(Peters-Wendisch,P.G.等，微生物學(xué)，144,915-927(1998))具有丙酮酸羧化酶，并且編碼酶的基因的核苷序列已被報(bào)導(dǎo)過(guò)。
而且，已知丙酮酸羧化酶的活性被增強(qiáng)了的谷氨酸棒狀桿菌或丙酮酸羧化酶基因被滅活了的谷氨酸棒狀桿菌(Peters-Wendisch,P.G.等，微生物學(xué)，144,915-927(1998))。然而，構(gòu)創(chuàng)建這些微生物是為了作為實(shí)驗(yàn)材料來(lái)研究利用葡萄糖生長(zhǎng)所必需的酶。還不知道丙酮酸羧化酶活性與L-氨基酸產(chǎn)生能力的關(guān)系。也不知道將丙酮酸羧化酶基因引入埃希氏桿菌屬的細(xì)菌中的意圖。
本發(fā)明根據(jù)前述觀點(diǎn)得以完成，其目的是提供一種高效生產(chǎn)L-氨基酸，尤其是L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-高絲氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-異亮氨酸的方法。
為了達(dá)到上述目的，進(jìn)行了辛勤的研究，結(jié)果本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將編碼丙酮酸羧化酶的基因(下文定義為“pyc基因”)引入埃希氏桿菌屬的細(xì)菌中能夠提高細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的產(chǎn)生能力。因此本發(fā)明得以完成。
即，本發(fā)明涉及被編碼丙酮酸羧化酶的基因轉(zhuǎn)化了并且具有L-氨基酸產(chǎn)生能力的埃希氏桿菌屬的細(xì)菌。
本發(fā)明也提供了含有源自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的編碼丙酮酸羧化酶的基因的上述細(xì)菌。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了引入了低拷貝數(shù)的編碼丙酮酸羧化酶的基因的上述細(xì)菌。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供了其中所說(shuō)的L-氨基酸選自于L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-高絲氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-異亮氨酸的上述細(xì)菌。
本發(fā)明也提供了包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-氨基酸，并從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸的L-氨基酸生產(chǎn)方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了其中所說(shuō)的L-氨基酸選自于L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-高絲氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-異亮氨酸的上述方法。
術(shù)語(yǔ)“L-氨基酸產(chǎn)生能力”是指所述細(xì)菌比其野生型菌株在培養(yǎng)基中更多地生產(chǎn)和積累L-氨基酸的特性。
根據(jù)本發(fā)明，L-氨基酸，如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-高絲氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸或L-異亮氨酸的產(chǎn)生能力在埃希氏桿菌屬的細(xì)菌中能得到提高。并且，本發(fā)明可被用來(lái)培育屬于埃希氏桿菌屬的L-氨基酸產(chǎn)生菌。


圖1表示為克隆pycA基因構(gòu)建枯草芽胞桿菌pyc::KmR受體菌株的方案；圖2表示自枯草芽胞桿菌168克隆pycA基因的方案；圖3表示含有pycA基因的質(zhì)粒的構(gòu)建方案。
下面詳述本發(fā)明。
<1>用pyc基因轉(zhuǎn)化的埃希氏桿菌屬的細(xì)菌本發(fā)明埃希氏桿菌屬的細(xì)菌是用pyc基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。作為埃希氏桿菌屬的細(xì)菌，以大腸桿菌為例。然而，本發(fā)明使用的pyc基因并不特別限定，只要它能編碼具有丙酮酸羧化酶活性的蛋白，pyc基因的例子包括，例如，源自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的pyc基因或源自于棒狀桿菌的pyc基因。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了源自于枯草芽胞桿菌(Genbank/EMBL/DDBJ Accession Z97025,NID g2224758)和谷氨酸棒狀桿菌(Peters-Wendisch,P.G.等，微生物學(xué)，144,915-927(1998))的pyc基因的核苷酸序列。因此，采用根據(jù)芽胞桿菌屬細(xì)菌(如枯草芽胞桿菌)或棒狀桿菌屬細(xì)菌(如谷氨酸棒狀桿菌)染色體DNA的核苷酸序列合成的引物，以該引物作模板、通過(guò)PCR(多聚酶鏈反應(yīng)White,T.J.等，Trends Genet.,5,185(1989))可制備出pyc基因。
其中具有含枯草芽胞桿菌pyc基因的pMW119-pycA的大腸桿菌44/pMW119-pycA轉(zhuǎn)化子自1999年8月30日被保藏在俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物(VKPM)保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms Depositary),GNIIgenetika；1,Dorozhny Proezd.1,113545,莫斯科，俄羅斯，保藏號(hào)是VKPM B-7822,并且根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2000年9月1日被從原始保藏轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。
其中具有含枯草芽胞桿菌pyc基因的pMW119-pycA的大腸桿菌MG442/pMW119-pycA的轉(zhuǎn)化子自1999年8月30日被保藏在俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物(VKPM)保藏中心(RussianNational Collectionof Industrial Microorganisms Depositary),GNIIgenetika;1,DorozhnyProezd.1,113545，莫斯科，俄羅斯，保藏號(hào)是VKPM B-7821，并且根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2000年9月1日被從原始保藏轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。
另外，通過(guò)下述完成本發(fā)明的方法克隆了編碼枯草芽胞桿菌的丙酮酸羧化酶的基因(pycA基因)。
首先，構(gòu)建了一株pycA基因缺陷型的枯草芽胞桿菌菌株。然后，以該菌株作為受體，通過(guò)從枯草芽胞桿菌野生型菌株的基因組DNA文庫(kù)中分離補(bǔ)充檸檬酸或天冬氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株的DNA片段進(jìn)行pycA基因的克隆。由于枯草芽胞桿菌通過(guò)丙酮酸羧化酶產(chǎn)生草酰乙酸，如果枯草芽胞桿菌是該酶的缺陷型，其就不能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。然而，通過(guò)添加L-天冬氨酸、L-谷氨酸、檸檬酸或琥珀酸，可以恢復(fù)生長(zhǎng)。pycA基因的核苷酸序列和通過(guò)該基因編碼的氨基酸序如SEQ ID NoS:3和4所示。
pycA基因-缺陷菌株，例如，按如下所述獲得。緊接在pycA基因后面的定位在染色體上的ylaP基因的部分DNA片段通過(guò)PCR獲得。作為PCR的合成引物由SEQ ID NoS:1和2所示的寡聚核苷酸舉例說(shuō)明。然后用含有獲得的DNA片段和標(biāo)記基因的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化一株枯草芽胞桿菌的野生型菌株，接著通過(guò)同源重組將該質(zhì)粒DNA整合到染色體DNA上的ylaP基因中。采用能識(shí)別pycA基因中的限制酶切位點(diǎn)的限制酶，例如，PstⅠ來(lái)構(gòu)建所獲得的菌株的染色體DNA文庫(kù)。含有標(biāo)記基因和部分pycA基因片段的重組質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)用該文庫(kù)轉(zhuǎn)化一株枯草芽胞桿菌的野生型菌株并篩選表達(dá)標(biāo)記基因的克隆來(lái)獲得。然后，用線性化的該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一株枯草芽胞桿菌的野生型菌株并且篩選出表達(dá)標(biāo)記基因的克隆以便獲得pycA基因-缺陷株，該基因缺陷株中的質(zhì)粒DNA被整合到該菌株染色體DNA上的pycA基因中。
用pyc基因轉(zhuǎn)化埃希氏桿菌屬的細(xì)菌，可通過(guò)將pyc基因插到在埃希氏桿菌屬的細(xì)菌中具有功能的合適載體上以構(gòu)建一個(gè)重組載體，并將重組載體引入埃希氏桿菌屬的細(xì)菌中來(lái)完成。
載體通過(guò)質(zhì)粒(如pBR322,pMW118,pMW119,pUC18,pUC19等)，噬菌體載體(如λ1059,λBF101,M13mp9等)，和轉(zhuǎn)座子(如Mu,Tn10,Tn5等)來(lái)舉例說(shuō)明。然而，本發(fā)明中，因?yàn)槿绻愿呖截愘|(zhì)粒作為載體引入pycA基因，含有該載體的轉(zhuǎn)化子可能是不穩(wěn)定的，所以低拷貝質(zhì)粒諸如pMW118和pMW119是更優(yōu)選的。
將DNA引入埃希氏桿菌屬的細(xì)菌中可通過(guò)，例如，D.A.Morrison的方法(酶學(xué)方法68,326,(1979))或采用氯化鈣處理受體細(xì)菌細(xì)胞來(lái)增加DNA的通透性的方法(Mandel,M.和Higa,A.,J.,Mol.Biol.,53,159(1970))等來(lái)完成。
基因組DNA的制備，基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建，雜交，PCR,質(zhì)粒DNA的制備，DNA的消化和連接，轉(zhuǎn)化等根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。這種方法由Sambrook,J.,Fritsche,E.F.,Maniatis,T.在冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社的“分子克隆”1.21(1989)中進(jìn)行了描述。
埃希氏桿菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)L-氨基酸的能力可通過(guò)采用PYC基因轉(zhuǎn)化細(xì)菌來(lái)賦予或增強(qiáng)細(xì)菌中丙酮酸羧化酶的活性進(jìn)行提高。這可能是由于草酰乙酸不但由磷酸烯醇丙酮酸生成，也由丙酮酸生成的緣故。即，由磷酸烯醇丙酮酸系統(tǒng)調(diào)節(jié)的葡萄糖(或蔗糖)分子到細(xì)菌細(xì)胞中的運(yùn)送是通過(guò)消耗一個(gè)分子的磷酸烯醇丙酮酸而伴隨著一個(gè)分子的丙酮酸生成而進(jìn)行的。盡管形成的丙酮酸不是直接用于細(xì)菌細(xì)胞中L-氨基酸的合成，L-氨基酸的產(chǎn)生能力可通過(guò)從丙酮酸生成草酰乙酸來(lái)提高。
可采用一株具有產(chǎn)生目的L-氨基酸能力的菌株，作為引入PYC基因的埃希氏桿菌屬的細(xì)菌。或者，被PYC基因轉(zhuǎn)化的埃希氏桿菌屬的細(xì)菌可被賦予生產(chǎn)L-氨基酸的能力。另外，大腸桿菌的PYC基因不是已知的，然而，如果以后大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了該基因，可以使用該基因。
下面描述生產(chǎn)L-氨基酸的埃希氏桿菌屬細(xì)菌的實(shí)施例。
(1)L-蘇氨酸-產(chǎn)生菌埃希氏桿菌屬的L-蘇氨酸-產(chǎn)生菌可通過(guò)菌株MG442(被保藏在俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物(VKPM)保藏中心(RussianNational Collectionof Industrial Microorganisms Depositary),GNIIgenetika;1,DorozhnyProezd.1,113545，莫斯科，俄羅斯，保藏號(hào)是VKPM B-1628)(USP4278765；Guayatiner M.M.等，Genetika(在俄羅斯)，14,947-956(1978))來(lái)舉例說(shuō)明。所得到的菌株MG442為抗L-蘇氨酸類似物，2-氨基-3-羥基戊酸的突變體，它也是一種滲漏型的異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷體。它以副產(chǎn)物的形式產(chǎn)生L-蘇氨酸和L-谷氨酸。
或者，用pVIC40(USP5175107)轉(zhuǎn)化MG442的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選地被用作L-蘇氨酸-產(chǎn)生菌株。
(2)L-賴氨酸-產(chǎn)生菌株埃希氏桿菌屬的L-賴氨酸-產(chǎn)生菌株可通過(guò)WO95/16042中描述的各種細(xì)菌來(lái)舉例說(shuō)明。L-賴氨酸-產(chǎn)生菌株通過(guò)其中天冬氨酸激酶活性和二氫二吡啶甲酸還原酶活性增高了的細(xì)菌諸如W3110(tyrA)RSFD80+pdapB來(lái)具體舉例說(shuō)明。
(3)L-高絲氨酸-產(chǎn)生菌株埃希氏桿菌屬的L-高絲氨酸-產(chǎn)生菌株可通過(guò)菌株44(thrB)來(lái)舉例說(shuō)明。這株菌是從作為L(zhǎng)eu+回復(fù)突變株的已知菌株C600(thrB,leuB)(Appleyard R.K.,Genetics,39,440-452(1954))衍生來(lái)的。用含有編碼天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ的thrA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化44的轉(zhuǎn)化菌株可優(yōu)選被使用。
大腸桿菌44的一株菌自1980年9月23日被保藏在俄羅斯國(guó)家工業(yè)微生物(VKPM)保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms Depositary),GNIIgenetika;1,Dorozhny Proezd.1,113545,莫斯科，俄羅斯，保藏號(hào)是VKPM B-2175,并且根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2000年9月1日被從原始保藏轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏。
(4)L-谷氨酸-產(chǎn)生菌埃希氏桿菌屬的L-谷氨酸-產(chǎn)生菌可通過(guò)一株抗纈氨酸的菌株，例如，大腸桿菌菌株B11,K-12(ATCC10798)，B(ATCC11303)和W(ATCC9637)來(lái)舉例說(shuō)明。
(5)L-異亮氨酸-產(chǎn)生菌埃希氏桿菌屬的L-異亮氨酸-產(chǎn)生菌可通過(guò)一株菌TDH6/pVIC40,pMWD5(Hashiguchi,K.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.,63(4),672-679(1999))或EPO685555A1中記載的AJ12919來(lái)舉例說(shuō)明。
<2>L-氨基酸的生產(chǎn)方法可通過(guò)培養(yǎng)被上述pycA基因轉(zhuǎn)化并在適當(dāng)培養(yǎng)基中具有L-氨基酸產(chǎn)生能力的埃希氏桿菌屬的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-氨基酸，和收集培養(yǎng)基中的L-氨基酸來(lái)有效生產(chǎn)L-氨基酸。
L-氨基酸優(yōu)選地通過(guò)L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-高絲氨酸、L-甲硫氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-異亮氨酸來(lái)舉例說(shuō)明。通過(guò)本發(fā)明的方法可生產(chǎn)出單一種類的L-氨基酸或兩種以上L-氨基酸的混合物。
本發(fā)明的方法中，埃希氏桿菌屬的細(xì)菌的培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基中的氨基酸的收集和純化可通過(guò)與采用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的傳統(tǒng)方法類似的方式進(jìn)行。只要培養(yǎng)基包括碳源和氮源以及礦物質(zhì)，培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基既可以是合成培養(yǎng)基也可以是天然培養(yǎng)基，并且如果必要，細(xì)菌所用營(yíng)養(yǎng)的量需適合于菌體的生長(zhǎng)。碳源可包括各種碳水化合物(如葡萄糖和蔗糖)，以及各種有機(jī)酸。根據(jù)所使用細(xì)菌的同化能力，可以使用包括乙醇在內(nèi)的醇和甘油。氨、各種銨鹽諸如硫酸銨、其它氮化合物諸如胺、天然氮源諸如胨、大豆水解物和消化的發(fā)酵微生物被作為氮源使用。磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、碳酸鈣被作為礦物質(zhì)使用。
培養(yǎng)優(yōu)選地是在有氧條件諸如振蕩培養(yǎng)、和通氣并攪拌培養(yǎng)下進(jìn)行。培養(yǎng)的溫度通常是20至40℃，優(yōu)選地是30至38℃。培養(yǎng)PH通常是5和9，優(yōu)選地是6.5和7.2。培養(yǎng)基的PH可采用氨，碳酸鈣，各種酸，各種堿，和緩沖液來(lái)調(diào)節(jié)。通常培養(yǎng)1至3天可導(dǎo)致培養(yǎng)基中積累目的L-氨基酸。
L-氨基酸的收集和純化可通過(guò)培養(yǎng)后的離心或膜過(guò)濾從培養(yǎng)基中去掉固體(如細(xì)胞)，接著進(jìn)行離子交換，濃縮和結(jié)晶分餾等方法來(lái)進(jìn)行。
本發(fā)明將通過(guò)下述實(shí)施例得到更具體的解釋。
實(shí)施例1從枯草芽胞桿菌168菌株克隆pycA基因<1>用于克隆的枯草芽孢桿菌pycA::KmR受體菌株的構(gòu)建通過(guò)pycA基因的插入誘變，構(gòu)建枯草芽孢桿菌的受體菌株。pycA基因的片段分兩步克隆(參考圖.1和圖.2).
在數(shù)據(jù)庫(kù)中枯草芽孢桿菌基因組序列方案中的一個(gè)閱讀框(ylaP)被鑒定為pycA基因，編碼丙酮酸羧化酶。使用下面一對(duì)寡聚核苷酸5′-GATATAAGGGGACTTCAGAG，和5′-GGCGCTTTATGCGTTTCAATC通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆緊接在pycA基因終止子后面定位的區(qū)域。
用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段使269bp(堿基對(duì))的DNA片段平端化并克隆到E.coli菌株的pBR322質(zhì)粒的ScaⅠ位點(diǎn)上。產(chǎn)生的質(zhì)粒pBRYCAll用ClaⅠ消化并連接到帶有cat基因的1628bp(堿基對(duì))的DNA片段上，該DNA片段通過(guò)用ClaⅠ消化pC194而獲得。然后，采用獲得的質(zhì)粒pBRYCAllCmR3轉(zhuǎn)化枯草芽胞桿菌168 trpC2菌株并篩選CmR-克隆。質(zhì)粒pBRYCAllCmR3在芽胞桿菌屬的細(xì)菌中不能自主復(fù)制，但能夠通過(guò)與269bp DNA片段同源整合到pycA基因附近的染色體上。該菌株被命名為枯草芽孢桿菌trpC2 xyz::pBRYCACmR3。整合體攜帶有pBR322-復(fù)制子、源自于pBR322的抗四環(huán)素的tet編碼基因和CmR標(biāo)記。
分離枯草芽孢桿菌trpC2 xyz::pBRYCACmR3的染色體DNA并用來(lái)克隆pycA基因的末端部分。用PstⅠ消化的染色體DNA自身連接并轉(zhuǎn)化到E.coli TGl菌株中。篩選出對(duì)四環(huán)素和氯霉素有抗性的重組子。從一個(gè)重組子中提取質(zhì)粒并命名為pPYCl。質(zhì)粒pPYCl獲得了單一BglⅡ限制酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)定位在pycA基因片段中。這一位點(diǎn)被插到含有用于B芽胞桿菌的卡那霉素抗性標(biāo)記的1818bp DNA片段中。質(zhì)粒pPYCl用BglⅡ消化并連接到被BamHⅠ消化的pUC7KmR上來(lái)獲得質(zhì)粒pPYCl::KmR。
野生型枯草芽孢桿菌168 trpC2中的pycA基因的失活通過(guò)線性化的質(zhì)粒pPYCl::KmR一步轉(zhuǎn)化相同菌株而獲得，接著在補(bǔ)充了卡那霉素的Luria培養(yǎng)液上進(jìn)行篩選。通過(guò)同源雙交換重組將KmR標(biāo)記插到染色體DNA的pycA基因中。
除非培養(yǎng)基中加入檸檬酸或天冬氨酸，所構(gòu)建的枯草芽孢桿菌pycA::KmRtrpC2不能在具有色氨酸的Spizizen基本培養(yǎng)基(Anagnostopoulos,C和Spizizen,J.,J.Bacteriol.,81,741-746(1961))中生長(zhǎng)。
(Spizizen基本培養(yǎng)基的組成)
K2HPO4·3H2O18.3g/LKH2PO46.0g/L(NH4)2SO42.0g/L五水檸檬酸鈉 1.2g/LMgSO4·7H2O 0.2g/L葡萄糖 10.0g/LpH7.0枯草芽孢桿菌trpC2 pycA::KmRrecE::TcR菌株通過(guò)用噬菌體E40轉(zhuǎn)導(dǎo)枯草芽孢桿菌recE::TcR菌株中的recE基因的鈍化等位基因構(gòu)建(圖.2)。終止受體菌株中重組過(guò)程是克隆枯草芽孢桿菌的pycA基因所必要的。所構(gòu)建的枯草芽孢桿菌trpC2 pycA::KmRrecE::TcR菌株被用作克隆pycA基因的受體。<2>通過(guò)互補(bǔ)克隆枯草芽孢桿菌的天然pycA基因從枯草芽孢桿菌168trpC2菌株克隆pycA基因。從菌株168trpC2制備的染色體DNA用EcoRⅠ部分消化并連接到被EcoRⅠ消化的pCB20(EmR)(由Yu Jomantas博士贈(zèng)送，參考L.O.Butler等編的“遺傳轉(zhuǎn)化和表達(dá)”，eds.,Intercept Ltd.,POBOX402,Wimborne,Dorset,BH229T2,U.K.,1989,269-281頁(yè))上。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化trpC2 pycA::KmRrecE::TcR受體菌株(圖.2)。在沒(méi)有補(bǔ)充檸檬酸或天冬氨酸而補(bǔ)充了色氨酸、紅霉素和卡那霉素的Spizizen基本培養(yǎng)基上篩選Asp+,EmR,KmR克隆?；パa(bǔ)了pycA突變體的一個(gè)篩選克隆中的質(zhì)粒pPYCR3具有可描述的結(jié)構(gòu)并在二次轉(zhuǎn)化后賦予了相同的Asp+,EmR表型。<3>將含有枯草芽孢桿菌168 trpC2菌株的pycA基因的DNA片斷克隆到高拷貝數(shù)質(zhì)粒pUC18和pUC19中質(zhì)粒pPYCR3用HindⅡ和ScaⅠ消化，然后將帶有pycA基因和其5′端上游的序列(包括啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn))的HincdⅡ-ScaⅠ片斷(4414bp)克隆到用SmaⅠ消化了的pUC18上。因此獲得了質(zhì)粒pUC18-pycA(圖.3，上邊)。連接反應(yīng)如下具體進(jìn)行。90ng SmaⅠ消化的pUC18和300ng由瓊脂糖凝膠電泳純化的帶有pycA基因的HindⅡ-ScaⅠ片斷(4414bp)在45μl含有1×One-Phor-All緩沖液(Pharmacia,Sweden)和1mM ATP的反應(yīng)混合物中用2單位的T4DNA連接酶(Pharmacia,Sweden)進(jìn)行連接反應(yīng)。
用pUC18-pycA轉(zhuǎn)化E.Coli TGl。獲得的轉(zhuǎn)化子通過(guò)采用KpnⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶進(jìn)行分析。所有克隆在pUC18質(zhì)粒的lac啟動(dòng)子的反方向上帶有pycA基因。然而，pUC18上克隆的pycA基因可在固有啟動(dòng)子基因的調(diào)控下表達(dá)。
然后，為了將pycA基因重新置于在lac啟動(dòng)子的調(diào)控下，pUC18-pycA的KpnⅠ-XbaⅠ片斷被克隆到用KpnⅠ-XbaⅠ消化的pUC19上。然而，所獲得的克隆不穩(wěn)定并且在短的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)(6-8小時(shí))重組質(zhì)粒丟失。
<4>將帶有pycA基因的DNA片斷克隆到低拷貝數(shù)質(zhì)粒pMW119中pUC18-pycA的KpnⅠ-XbaⅠ片斷被連接到用KpnⅠ和XbaⅠ消化的低拷貝數(shù)質(zhì)粒pMW119中(圖.3，下邊)。連接反應(yīng)于50μl含有60ng用KpnⅠ和XbaⅠ消化的pMW119,120ng由瓊脂糖凝膠電泳純化的pUCl8-pycA的KpnⅠ-XbaⅠ片斷，1×One-Phor-ALL緩沖液(Pharmacia,Sweden),1mM ATP和1單位的T4 DNA連接酶(Pharmacia,Sweden)的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。
采用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli TGl。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子采用SacⅠ、KpnⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行分析。所有克隆帶有由pMW119的lac啟動(dòng)子和其本身啟動(dòng)子調(diào)控的pycA基因。由此獲得的克隆被命名為TGl(pMW119-pycA)，從該克隆獲得質(zhì)粒pMW119-pycA。
實(shí)施例2L-蘇氨酸和L-谷氨酸的生產(chǎn)E.coli菌株MG442用質(zhì)粒pMW119-pycA轉(zhuǎn)化并篩選出10個(gè)Ampr(抗氨芐青霉素)克隆。克隆生產(chǎn)L-蘇氨酸和L-谷氨酸的能力通過(guò)下面的發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)檢測(cè)。
(發(fā)酵培養(yǎng)基的組成)葡萄糖(單獨(dú)滅菌) 60g/L(NH4)2SO415.0g/L
KH2PO41.5g/LMgSO4·7H2O1.0g/LL-異亮氨酸 100mg/L硫胺素 0.1mg/LCaCO3(單獨(dú)滅菌) 20g/L通過(guò)搖床，發(fā)酵在32℃下于試管(20×300mm)中進(jìn)行72小時(shí)。10個(gè)克隆的每一個(gè)克隆取一環(huán)接種到含有2.0ml發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中。不含質(zhì)粒的菌株MG442的10個(gè)單菌落作為對(duì)照。發(fā)酵培養(yǎng)后，通過(guò)薄層層析測(cè)定培養(yǎng)基中積累的L-蘇氨酸和L-谷氨酸的濃度。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1
實(shí)施例3L-高絲氨酸的生產(chǎn)生產(chǎn)L-高絲氨酸的E.coli菌株44用質(zhì)粒pMW119-pycA轉(zhuǎn)化并篩選出5個(gè)抗氨卞青霉素的克隆。按照實(shí)施例1的方法檢測(cè)L-高絲氨酸的產(chǎn)量，但發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)充了0.5g/l的L-蘇氨酸。使用不含質(zhì)粒的菌株44的克隆作對(duì)照。發(fā)酵培養(yǎng)后，L-高絲氨酸的平均濃度是4.5g/l(菌株44)和5.7g/l(含有質(zhì)粒pMW119-pycA的菌株44)。
pycA基因?qū)τ贚-賴氨酸的產(chǎn)生能力的影響也是可以預(yù)測(cè)的，因?yàn)榇_信pycA基因?qū)εcL-賴氨酸共用部分相同的生物合成途徑的L-蘇氨酸和L-谷氨酸的生產(chǎn)具有正面影響。
序列表<110>Ajinomoto Co.,lnc.<120>發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130>OP877<141>2000-10-14<150>RU 99121636<151>2000-10-14<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>1<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>2ggcgctttat gcgtttcaatc 20<210>3<211>3462<212>DNA<213>芽胞枯草桿菌<220><221>CDS<222>(16)..(3458)<400>3aagggggaga aaagt ttg tct cag caa tcg ata caa aaa gta tta gta gca 51Leu Ser Gln Gln Ser Ile Gln Lys Val Leu Val Ala1 5 10aac agg gga gaa att gca atc cga ata ttc cgg gcg tgt acc gag ttg 99Asu Arg Gly Glu Ile Ala Ile Arg Ile Phe Arg Ala Cys Thr Glu Leu15 20 25aat att cgt aca gtt gcg gtc tat tca aaa gaa gat tcc ggt tcc tac 147Asn Ile Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Lys Glu Asp Ser Gly Sar Tyr30 35 40cat cgg tac aaa gcg gat gaa gca tac ttg gtc ggt gaa ggg aaa aaa 195His Arg Tyr Lys Ala Asp Glu Ala Tyr Leu Val Gly Glu Gly Lys Lys45 50 55 60ccg att gat gct tac ctg gat att gaa ggt atc att gat att gcg aaa 243Pro Ile Asp Ala Tyr Leu Asp lle Glu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys65 70 75aga aac aaa gtc gat gca att cat ccg gga tac ggt ttc tta tct gaa 291Arg Asn Lys Val Asp Ala Ile Hls Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu80 85 90aat att cat ttt gcg aga cga tgt gaa gaa gaa ggc atc gta ttc ata 339Asn Ile His Phe Ala Arg Arg Cys Glu Glu Glu Gly Ile Val Phe Ile95 100 105ggg cca aaa tcc gag cat ctc gat atg ttt ggt gac aag gta aaa gcg 387Gly Pro Lys Ser Glu His Leu Asp Met Phe Gly Asp Lys Val Lys Ala110 115 120cgt gag cag gca gaa aaa gcg gga atc ccc gtg att ccg gga agc gac 435Arg Glu Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Pro Val Ile Pro Gly Ser Asp125 130 135 140ggt cct gcc gaa acg ctt gaa gcc gtc gaa caa ttt gga caa gct aac 483Gly Pro Ala Glu Thr Leu Glu Ala Val Glu Gln Phe Gly Gln Ala Asn145 150 155ggt tat ccg atc atc att aaa gcc tcg ctt ggc ggc ggc ggc cgc ggt 531Gly Tyr Pro Ile Ile Ile Lys Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Arg Gly160 165 170atg cgg att gtc aga tct gaa agt gaa gtt aaa gaa gca tat gag cgt 579Met Arg Ile Val Arg Ser Glu Ser Glu Val Lys Glu Ala Tyr Glu Arg175 180 185gct aaa tca gag gcg aaa gca gcc ttt ggc aat gat gaa gtt tat gta 627Ala Lys Ser Glu Ala Lys Ala Ala Phe Gly Asn AsP Glu Val Tyr Val190 195 200gaa aaa tta att gag aat ccg aaa cat att gag gtt cag gtc att gga 675Glu Lys Leu lle Glu Asn Pro Lys His Ile Glu Val GlN Val Ile Gly205 210 215 220gac aag cag ggc aat gtc gtc cat ctt ttt gag agg gat tgc tcc gtt 723Asp Lys Gln Gly Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val225 230 235caa aga cgc cat caa aaa gtc att gaa gtg gcg ccg agt gtc tcg ctg 771Gln Arg Arg His Gln Lys Val Ile Glu Val Ala Pro Ser Val Ser Leu240 245 250tca cct gaa tta agg gac caa att tgt gag gct gca gLt gcg ctt gcc 819Ser Pro Glu Leu Arg Asp Gln Ile Cys Glu Ala Ala Val Ala Leu Ala255 260 265aaa aat gta aac tat ata aat gcg ggg acg gtc gaa ttc ctt gtt gca 867Lys Asn Val Asn Tyr Ile Asn Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val Ala
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1．一種被編碼丙酮酸羧化酶的基因轉(zhuǎn)化了的并且具有L-氨基酸產(chǎn)生能力的埃希氏桿菌屬的細(xì)菌。
2．如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其中編碼丙酮酸羧化酶的基因源自于芽孢桿菌屬的一種細(xì)菌。
3．如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其中編碼丙酮酸羧化酶的基因被以低拷貝數(shù)引入所述細(xì)菌。
4．如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌，其中L-氨基酸選自L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-高絲氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-異亮氨酸。
5．生產(chǎn)L-氨基酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1要求保護(hù)的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L-氨基酸，并從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。
6．如權(quán)利要求5所述的方法，其中L-氨基酸選自L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-高絲氨酸、L-蛋氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸和L-異亮氨酸。
全文摘要
通過(guò)培養(yǎng)被編碼丙酮酸羧化酶的基因轉(zhuǎn)化了的和具有L－氨基酸產(chǎn)生能力埃希氏桿菌屬的細(xì)菌,在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累L－氨基酸,并從培養(yǎng)基中收集L－氨基酸生產(chǎn)L－氨基酸(如L－蘇氨酸和L－谷氨酸)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1305002SQ0013489
公開(kāi)日2001年7月25日 申請(qǐng)日期2000年10月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月14日
發(fā)明者M·M·古斯雅蒂納, Y·I·科茲洛夫, L·R·皮蒂斯恩, I·B·阿爾特曼, E·B·伏羅希洛瓦, Y·A·V·約曼塔斯, T·A·雅普爾斯卡雅 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社