專利名稱：一種橢圓偏振術(shù)檢測(cè)dna芯片雜交的方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用橢圓偏振術(shù)檢測(cè)DNA芯片雜交效率的方法及涉及該檢測(cè)方法的裝置。
傳統(tǒng)的雜交都在膜上進(jìn)行，即將樣品固定在膜上，用熒光、生物素或者同位素標(biāo)記過的探針對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)效果和標(biāo)記有很大關(guān)系，并且必須及時(shí)進(jìn)行?，F(xiàn)在生物芯片多采用固態(tài)基片，即將探針固定在基片上，去檢測(cè)標(biāo)記過的樣品。由于檢測(cè)需要等待時(shí)間，因此該方法不適合臨床和普及檢查的需要，而且由于標(biāo)記物的信號(hào)會(huì)衰減導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)，因此人們都在尋求不加標(biāo)記運(yùn)用DNA分子本身的光學(xué)性質(zhì)來檢測(cè)雜交的有效方法。
本發(fā)明的目的是研究一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)DNA芯片雜交的技術(shù)及其裝置。
本發(fā)明是用橢圓偏振光譜測(cè)量技術(shù)檢測(cè)DNA芯片雜交的方法。分子雜交是當(dāng)一個(gè)核酸分子與另一個(gè)核酸分子的堿基有相對(duì)應(yīng)的排列關(guān)系時(shí)，兩個(gè)核酸分子即穩(wěn)定組合。DNA芯片也稱基因芯片，芯片的基質(zhì)一般是玻璃或硅單晶，在數(shù)平方厘米區(qū)域根據(jù)用途劃分出數(shù)百個(gè)甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)小區(qū)，在指定小區(qū)內(nèi)固定有大量特定功能的核酸分子。由于被固定的分子探針在基質(zhì)上形成不同的探針陣列，利用分子雜交及平行處理原理，基因芯片可對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行分子檢測(cè)。本發(fā)明中利用橢圓偏振光譜測(cè)量中的兩個(gè)橢偏參量ψ和Δρ=Rp/Rs=(rp/rs)exp[i(δp-δs)]=tanψexp(iΔ)，式中ρ為膜層的復(fù)反射比，Rp和Rs分別為光束傾斜入射時(shí)，p偏振光和s偏振光的復(fù)反射率，tanψ和Δ分別表示p偏振光和s偏振光的振幅比和相位差，由上式可得下式tanψ=rp/rsΔ=δp-δs對(duì)雜交檢測(cè)，只要ψ和Δ其中的一個(gè)在某波長(zhǎng)下的值能區(qū)別樣品即可，實(shí)驗(yàn)得到，450-550nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)不同樣品的ψ和Δ測(cè)量值可以明顯區(qū)別，并且和該樣品的序列匹配程度成比例關(guān)系。因此對(duì)于一個(gè)樣品，測(cè)得某波長(zhǎng)下的ψ或Δ值，可以用該波長(zhǎng)下雜交完全匹配以及只有探針存在時(shí)的ψ或Δ作為極大值和極小值，近似按照線性關(guān)系來定義雜交的效率。
例如同樣入射角下，選擇三個(gè)樣品，樣品A和探針的序列完全匹配，定義其雜交效率ηA定義為100％；樣品B是無(wú)雜交反應(yīng)的探針，定義其雜交效率ηB定義為零；樣品C是待檢測(cè)樣品，其雜交效率是ηC，則ηC=|ψC-ψB|/|ψA-ψB|。其中ψC是待測(cè)樣品C雜交后的ψ測(cè)量值，ψA是樣品A雜交后的ψ測(cè)量值，ψB是樣品B的ψ測(cè)量值。利用450-550nm范圍內(nèi)某個(gè)波長(zhǎng)，測(cè)量得ψA、ψB、ψC，從而得到ηC值。
若從Δ計(jì)算，待測(cè)樣品C的雜交效率ηc=|ΔC-ΔB|/|ΔA-ΔB|。其中ΔC是待測(cè)樣品C雜交后的Δ測(cè)量值，ΔA是樣品A雜交后的Δ測(cè)量值，ΔB是樣品B的Δ測(cè)量值。利用450-550nm范圍內(nèi)某個(gè)波長(zhǎng)，測(cè)量得ψΔA、ΔB、ΔC，從而得到ηc值。
本發(fā)明檢測(cè)時(shí)可用單晶硅片，先對(duì)基片進(jìn)行硅烷化處理，然后在表面修飾醛基。探針固定在硅基片上，通過硅片上的醛基和探針DNA片段上的胺基進(jìn)行醛胺結(jié)合反應(yīng)，探針DNA片段以共價(jià)鍵形式結(jié)合在硅片上，這樣結(jié)合上去的DNA片段分子基本是單分子層，比較均勻。最后將待測(cè)樣品與基片上固定的探針雜交，雜交后的基片通過橢圓偏振術(shù)檢測(cè)。上述過程均為該領(lǐng)域技術(shù)人員的現(xiàn)有技術(shù)，在此不多贅述。
上述橢圓偏振術(shù)檢測(cè)DNA雜交效率的裝置是按下列順序裝配的光源→單色儀→起偏器→共聚焦系統(tǒng)→樣品→步進(jìn)轉(zhuǎn)動(dòng)檢偏器→CCD→圖象采集卡→計(jì)算機(jī)。光束經(jīng)過共聚焦后到達(dá)樣品，樣品是雜交后的DNA芯片，芯片上光束照射部分是一個(gè)檢測(cè)單元，每個(gè)檢測(cè)單元的雜交情況對(duì)應(yīng)于CCD的各獨(dú)立光敏單元的檢測(cè)信號(hào)。
當(dāng)光束經(jīng)過共聚焦系統(tǒng)后直徑可達(dá)5-50μm,CCD為面陣型，光敏單元尺寸與聚焦后光束直徑匹配，芯片上每個(gè)探針樣點(diǎn)的直徑為幾十微米，包含了一到幾十個(gè)之間的檢測(cè)單元。樣品和CCD置于二維平臺(tái)上，由計(jì)算機(jī)控制在x-y二維平面里精密快速步進(jìn)移動(dòng)。
該裝置檢測(cè)時(shí)，在樣品和CCD處于某個(gè)位置時(shí)，由CCD將得到的光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，再由圖象采集卡轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)，計(jì)算得到橢圓偏振參數(shù)ψ和Δ，再由上述定義的計(jì)算方法得到樣品該點(diǎn)的雜交效率，然后移動(dòng)樣品和CCD，得到芯片其余點(diǎn)的ψ和Δ，計(jì)算出雜交效率。
由于芯片上的各檢測(cè)單元的檢測(cè)信號(hào)對(duì)應(yīng)于CCD的各獨(dú)立光敏單元，芯片快速掃描一遍的信息能被CCD及時(shí)響應(yīng)處理，所以可以實(shí)現(xiàn)高速處理，因此該套裝置即為用于芯片無(wú)標(biāo)記檢測(cè)的“芯片橢圓偏振儀”。
橢圓偏振光譜測(cè)量術(shù)是研究薄膜材料常用的高精度測(cè)量手段，測(cè)量靈敏度以及精確度都很高，本發(fā)明將基因芯片雜交效率用該測(cè)量方法獲得，取得了十分滿意的效果。由于在單入射角下測(cè)得單波長(zhǎng)的ψ和Δ值是非?？焖俚模瑑H幾秒種即可完成，用CCD來檢測(cè)還可更大程度地提高檢測(cè)速度。入射光束經(jīng)過共聚焦系統(tǒng)，其線度達(dá)幾十微米以下，可以用于芯片的掃描檢測(cè)。對(duì)于1000點(diǎn)陣的芯片，幾分鐘內(nèi)即可檢測(cè)完畢。本發(fā)明方法由于將不進(jìn)行標(biāo)記的探針固定在基片上，所以檢測(cè)效果不受標(biāo)記信號(hào)的影響，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度。本發(fā)明裝置簡(jiǎn)捷，測(cè)量穩(wěn)定。由于本發(fā)明裝置和方法能快速準(zhǔn)確測(cè)量，因此可高效地應(yīng)用于基因研究、醫(yī)學(xué)鑒定、疾病檢測(cè)和藥物篩選等，是傳統(tǒng)生物技術(shù)的創(chuàng)新和飛躍。


圖1是實(shí)施例1中5份樣品在65度入射角下的ψ譜，其它2個(gè)入射角的圖譜和此近似。
圖2是實(shí)施例1中5份樣品在65度入射角下的Δ譜，其它2個(gè)入射角的圖譜和此近似。
實(shí)施例1硅片晶向?yàn)?100)的N型拋光單晶硅片，將其切割成2×3cm2大小若干片，清洗后做硅烷化處理，然后在表面修飾醛基。探針(上海生工訂購(gòu))NH2-5’TTGAG ATCTT CTGCG ACGCG G3’樣品(上海生工訂購(gòu))樣品1．5’CCGCG TCGCA GAAGA TCTCA A3’和探針完全匹配樣品2．5’CCGCG TCGTT GAAGA TCTCA A3’有2個(gè)堿基和探針不匹配樣品3．5’ACTCA GTAGC TCCTG CCATG C3’和探針完全不匹配探針固定1．將訂購(gòu)的氨基修飾DNA片段溶解于雙蒸水，10-100pm/ul，和5*SSC以1∶1比例混合，上下?lián)u動(dòng)10次，取15ul點(diǎn)樣到基片上?；胖糜谂囵B(yǎng)皿內(nèi)，半蓋，在室溫25度，相對(duì)濕度小于30％條件下干燥12小時(shí)。用0.2％SDS和雙蒸水依次漂洗。再把基片放置于硼氫化鈉溶液里，5分鐘后取出用0.2％SDS和雙蒸水漂洗，然后晾干。在室溫下放置于儲(chǔ)存盒內(nèi)可以保存1年。2．硅片上的醛基和DNA片段的胺基進(jìn)行醛胺結(jié)合反應(yīng)，將DNA片段以共價(jià)鍵形式結(jié)合在硅片上。這樣結(jié)合上去的DNA片段分子基是單分子層，比較均勻。雜交1．把固定探針的基片放在雜交盒里，加3ul 5*SSC和0.1％SDS混合雜交液濕潤(rùn)基片。把5ul樣品放置在22mm的蓋玻片上，再蓋到基片上，密封好雜交腔。放在62度水浴下雜交6小時(shí)。然后用1*SSC和0.1％SDS室溫下清洗，再用0.1*SSC清洗以去除SDS，在空氣中干燥。2．將樣品1,2,3分別放置于3塊基片上和固定的探針雜交。得到三塊待測(cè)樣品。待測(cè)樣品樣品1固定探針的硅片+完全匹配片段 雜交樣品2固定探針的硅片+有2個(gè)堿基不匹配的片段 雜交樣品3固定探針的硅片+完全不匹配的片段 雜交樣品4固定探針的硅片樣品5只有醛基修飾的硅片本發(fā)明用橢圓偏振光譜儀，對(duì)5塊樣品做檢測(cè)。用氙燈做光源，經(jīng)光柵單色儀輸出單色光，測(cè)量光譜范圍為250-830nm。實(shí)驗(yàn)在同樣的室溫下在暗室里進(jìn)行。測(cè)量中，對(duì)同一個(gè)樣品，光源入射角分別取60°、65°和70°三組進(jìn)行寬譜掃描，掃描光譜范圍從1.5-4.8eV，步長(zhǎng)為0.05eV。得到這兩個(gè)橢偏參數(shù)的譜，見
圖1、圖2。
對(duì)于雜交檢測(cè)，只要ψ和Δ其中的一個(gè)在某個(gè)波長(zhǎng)下的值能區(qū)別樣品即可，由圖可見，450-550nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)不同樣品的ψ和Δ測(cè)量值可以明顯區(qū)別，并且和該樣品的序列匹配程度成比例關(guān)系。因此對(duì)于一個(gè)樣品，測(cè)得某波長(zhǎng)下的ψ或Δ值，可以用該波長(zhǎng)下雜交完全匹配以及只有探針存在時(shí)的ψ或Δ作為極大和極小值，近似按照線性關(guān)系來定義雜交的效率。
本實(shí)施例取λ=532nm來計(jì)算。1．以ψ值為例來計(jì)算雜交效率η。532nm波長(zhǎng)處5個(gè)樣品的ψ值分別為ψ1=44.2,ψ2=42.9,ψ3=36.9,ψ4=33.7,ψ5=24.8,定義完全匹配的樣品1的雜交效率η1=100％,沒有進(jìn)行雜交反應(yīng)的探針的雜交效率η4=0,計(jì)算2個(gè)堿基失配的樣品2的雜交效率η2=|ψ2-ψ4|/|ψ1-ψ4|=|42.9-33.7|/(44.2-33.7|=87.6％計(jì)算完全失配的樣品3的雜交效率η3=|ψ3-ψ4|/|ψ1-ψ4|=|36.9-33.7|/|44.2-33.7|=34.8％2．以Δ值為例來計(jì)算雜交效率η。532nm波長(zhǎng)處5個(gè)樣品的Δ值分別為Δ1=-146.9,Δ2=-137.6,Δ3=-106.9,Δ4=-110.6,Δ5=-133.1,雜交效率的極大和極小值定義同上。計(jì)算2個(gè)堿基失配的樣品2的雜交效率
η2=|Δ2-Δ4|/|Δ1-Δ4|=|(-137.6)-(-110.6)|/|(-146.9)-(-110.6)|=74.4％計(jì)算完全失配的樣品3的雜交效率η3=|Δ3-Δ4|/|Δ1-Δ4|=|(-106.9)-(-110.6)|/|(-146.9)-(-110.6)|=10.2％樣品2的堿基匹配率為19/21=90％，樣品3的堿基匹配率為0，可以看到，我們由測(cè)量計(jì)算出的雜交效率在將完全失配樣品3的雜交效率當(dāng)做本底扣除后，可以用來描述雜交的兩個(gè)序列的匹配程度。
光束經(jīng)過共聚焦后直徑為20μm，以65°入射角到達(dá)樣品，樣品是雜交后的DNA芯片，光束照射部分是一個(gè)檢測(cè)單元，芯片上點(diǎn)樣面積為1×1cm2，每個(gè)樣點(diǎn)直徑為50μm，相鄰樣點(diǎn)中心距離為100μm，芯片共有100×100個(gè)樣點(diǎn)單元，每個(gè)樣點(diǎn)單元包含有25個(gè)檢測(cè)單元。CCD的光敏單元尺寸與聚焦后光束直徑匹配，每個(gè)檢測(cè)單元的雜交情況對(duì)應(yīng)于CCD的各獨(dú)立光敏單元的檢測(cè)信號(hào)。樣品和CCD置于二維平臺(tái)上，由計(jì)算機(jī)控制在x-y二維平面里快速精密移動(dòng)，每步移動(dòng)距離和光束直徑相等。該裝置檢測(cè)時(shí)，在樣品和動(dòng)，每步移動(dòng)距離和光束直徑相等。該裝置檢測(cè)時(shí)，在樣品和CCD處于某個(gè)位置時(shí)，由CCD將得到光的光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，然后再通過圖象采集卡轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)，再計(jì)算得到橢圓偏振參數(shù)ψ和Δ，再由上述定義的計(jì)算方法得到樣品該點(diǎn)的雜交效率，然后移動(dòng)樣品和CCD，得到芯片其余點(diǎn)的ψ和Δ，計(jì)算出雜交效率。
每個(gè)檢測(cè)單元的信號(hào)采集和計(jì)算以及平臺(tái)移動(dòng)一步需要的時(shí)間一共約為幾十毫秒，以50ms來計(jì)算，檢測(cè)該100*100點(diǎn)陣芯片需要的時(shí)間為20分鐘。而對(duì)于一般臨床應(yīng)用的只有400點(diǎn)陣左右的芯片，可以增加光束直徑和平臺(tái)步進(jìn)距離，只要幾分鐘左右即可檢測(cè)完畢。
權(quán)利要求
1．一種橢圓偏振術(shù)檢測(cè)DNA芯片雜交的方法，橢偏光譜測(cè)量中兩個(gè)橢偏參量是ψ和Δρ=Rp/Rs=(rp/rs)exp[i(δp-δs)]=tanψexp(iΔ)，式中ρ為膜層的復(fù)反射比，Rp和Rs分別為光束傾斜入射時(shí)，p偏振光和s偏振光的復(fù)反射率，tanψ和Δ分別表示p偏振光和s偏振光的振幅比和相位差，由上式可得下式tanψ=rp/rsΔ=δp-δs選擇λ=450-550nm范圍測(cè)量，定義完全匹配的樣品雜交效率是100％，沒有進(jìn)行雜交反應(yīng)的探針的雜交效率是零，則雜交效率η=|ψ樣品-ψB|/|ψA-ψB|，其中ψ樣品是待測(cè)樣品雜交后的ψ測(cè)量值，ψA是完全匹配序列雜交后的ψ測(cè)量值，ψB是沒有進(jìn)行雜交反應(yīng)的探針的ψ測(cè)量值，若用Δ來計(jì)算，方法相同。
2．據(jù)權(quán)利要求1所述的橢圓偏振術(shù)檢測(cè)DNA芯片雜交的裝置，主要由光源、單色儀、起偏器、聚焦系統(tǒng)、檢偏器、檢測(cè)器等部件構(gòu)成，其特征是該裝置各部件安置順序是光源→單色儀→起偏器→共聚焦系統(tǒng)→樣品→步進(jìn)轉(zhuǎn)動(dòng)檢偏器→CCD→圖象采集卡→計(jì)算機(jī)，其中光束經(jīng)過共聚焦系統(tǒng)后到達(dá)樣品，樣品是雜交后的DNA芯片，芯片上光束照射部分是一個(gè)檢測(cè)單元，每個(gè)檢測(cè)單元的雜交情況對(duì)應(yīng)于CCD的各獨(dú)立光敏單元的檢測(cè)信號(hào)，芯片上每個(gè)探針樣點(diǎn)由多個(gè)檢測(cè)單元組成，芯片樣品置于二維平臺(tái)上，計(jì)算機(jī)控制平臺(tái)精密步進(jìn)二維移動(dòng)。
全文摘要
本發(fā)明是一種橢圓偏振術(shù)檢測(cè)DNA芯片雜交效率的方法及其裝置?，F(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)方法多是將探針固定在基片上,去檢測(cè)標(biāo)記過的樣品,這樣的檢測(cè)需要時(shí)間和等待,而且檢測(cè)信號(hào)會(huì)隨標(biāo)記物信號(hào)的衰減而失去準(zhǔn)確性。本發(fā)明用橢圓偏振儀檢測(cè)DNA芯片雜交效率,通過生物分子本身的光學(xué)性質(zhì),測(cè)得其橢圓偏振參數(shù)Ψ、△,定義與探針完全匹配的樣品和只有探針存在時(shí)的芯片雜交效率分別為極大值和極小值,從而獲得待測(cè)樣品的雜交效率。本發(fā)明裝置簡(jiǎn)捷,測(cè)量快速準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1305011SQ00137209
公開日2001年7月25日 申請(qǐng)日期2000年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月28日
發(fā)明者符維娟, 李晶, 周仕明, 周魯衛(wèi), 陳良堯 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)