專利名稱：新的纖溶酶、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼纖溶酶-蚯蚓纖溶酶Z的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和蛋白質(zhì)的制法和用途，以及含該纖溶酶的藥物組合物。
蚯蚓纖溶酶是從蚯蚓中提取到的一類能水解血纖維蛋白(原)的酶類。它存在于蚯蚓的消化道內(nèi)，分子量從15,000到60,000道爾頓。蚯蚓纖溶酶不是單一的一種酶，而是具有相同功能的多種蛋白水解酶的總稱。
研究結(jié)果表明蚯蚓纖溶酶具有雙重功能，除了能直接水解纖維蛋白外，還能激活血纖維蛋白溶酶原成血纖維蛋白溶酶，從而具有間接水解纖維蛋白的作用。體外藥理實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指出，蚯蚓纖溶酶除了能直接溶解血塊外，還能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放tPA，從而增強(qiáng)體內(nèi)的纖溶作用。體內(nèi)及體外血栓形成模型實(shí)驗(yàn)及人工血栓溶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果均指出，蚯蚓纖溶酶具有明顯的抗栓和溶栓作用。
基于蚯蚓纖溶酶這樣一種特性，國內(nèi)外已將它制成口服膠囊用于臨床上治療血栓栓塞性疾病。例如，商品名為龍心、蚓激酶、博洛克、普恩復(fù)及溶栓膠囊等藥物都是以蚯蚓纖溶酶作為原料制成的。但至今蚯蚓纖溶酶的結(jié)構(gòu)還鮮為人知，而且沒有報(bào)道過任何一種具體蚯蚓纖溶酶的氨基酸序列或核苷酸序列。
鑒于纖溶酶的在治療血栓栓塞性疾病等方面具有巨大的應(yīng)用前景，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的纖溶酶。
本發(fā)明的目的是提供一種新的纖溶酶蚯蚓纖溶酶以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些蛋白質(zhì)的方法以及該蛋白質(zhì)和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)來自蚯蚓，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或其保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該蛋白質(zhì)是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些蛋白質(zhì)的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％同源性(a)編碼上述蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-723位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-979位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)蚯蚓纖溶酶Z的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的蚯蚓纖溶酶Z以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療血栓栓塞性疾病等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。


圖1顯示了蚯蚓纖溶酶Z的PCR擴(kuò)增條帶，泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)；泳道2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖2顯示了蚯蚓纖溶酶Z的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列。
圖3顯示了表達(dá)蚯蚓纖溶酶Z的原核表達(dá)載體pET-28a(+)中的構(gòu)建過程。
圖4顯示了蚯蚓纖溶酶Z表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜和western圖譜。其中各泳道分別是1.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，2.IPTG誘導(dǎo)前菌體總蛋白質(zhì)，3.IPTG誘導(dǎo)后菌體總蛋白質(zhì)，4.Western圖譜。
本發(fā)明人首先從多種蚯蚓中中分離了一種分子量為25125.0道爾頓的蚯蚓纖溶酶(質(zhì)譜測定結(jié)果)，命名它為蚯蚓纖溶酶Z。并且，以威廉腔環(huán)蚓(Metaphireguillelmi)為代表，測定了蚯蚓纖溶酶Z的N端一段氨基酸序列，并以此為根據(jù)合成了相應(yīng)的引物，然后從蚯蚓中分離有關(guān)的mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用PCR法擴(kuò)增和克隆了蚯蚓纖溶酶Z的基因，并測定了基因的全序列。然后將蚯蚓纖溶酶Z的編碼序列插入合適載體并轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞，表達(dá)并分離了蚯蚓纖溶酶Z。并通過Western印跡分析加以鑒定。
在本發(fā)明中，術(shù)語“蚯蚓纖溶酶Z”、“蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)”或“蚯蚓纖溶酶Z多肽”可互換使用，都指基本上具有蚯蚓纖溶酶Z氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽或蛋白質(zhì)。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的纖溶酶蚯蚓纖溶酶Z。這些術(shù)語還包括含有或不含有信號(hào)肽的蚯蚓纖溶酶Z。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和蛋白質(zhì)是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或蛋白質(zhì)如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的蚯蚓纖溶酶Z多肽或蛋白質(zhì)”是指蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)(尤其是FPLC)分離純化出蚯蚓纖溶酶Z。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是重組蛋白質(zhì)、天然蛋白質(zhì)、合成蛋白質(zhì)，優(yōu)選重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括蚯蚓纖溶酶Z的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然蚯蚓纖溶酶Z相同的生物學(xué)功能或活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的蛋白質(zhì)，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的蛋白質(zhì)，或(iii)成熟蛋白質(zhì)與另一個(gè)化合物(比如延長蛋白質(zhì)半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白質(zhì)，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白質(zhì)序列而形成的蛋白質(zhì)(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此蛋白質(zhì)的序列或酶原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)”指具有蚯蚓纖溶酶Z活性的SEQ IDNO.2序列的蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括具有與蚯蚓纖溶酶Z相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括蚯蚓纖溶酶Z的活性片段和活性衍生物。
該蛋白質(zhì)的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與蚯蚓纖溶酶Z DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)的抗血清獲得的多肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了其他蛋白質(zhì)，如包含蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的蛋白質(zhì)外，本發(fā)明還包括了蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)序列的可溶性片段。通常，該片段具有蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供蚯蚓纖溶酶Z或的類似物。這些類似物與天然蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白質(zhì)包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的蛋白質(zhì)并不限于上述例舉的代表性的蛋白質(zhì)。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的蛋白質(zhì)的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白質(zhì)的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。這種修飾可以通過將蛋白質(zhì)暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明中，“蚯蚓纖溶酶Z保守性變異蛋白質(zhì)”指與SEQ ID N02的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成蛋白質(zhì)。這些保守性變異蛋白質(zhì)最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟蛋白質(zhì)的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟蛋白質(zhì)的多核苷酸包括只編碼成熟蛋白質(zhì)的編碼序列；成熟蛋白質(zhì)的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟蛋白質(zhì)的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸”可以是包括編碼此蛋白質(zhì)的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的蛋白質(zhì)的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％同源性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的同源性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2所示的成熟蛋白質(zhì)有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼蚯蚓纖溶酶Z的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的蛋白質(zhì)和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的蚯蚓纖溶酶Z核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。也可直接通過RT-PCR的方法擴(kuò)增得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白質(zhì)序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或蚯蚓纖溶酶Z編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，蚯蚓纖溶酶Z多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含蚯蚓纖溶酶Z編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的蛋白質(zhì)。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的蚯蚓纖溶酶Z或蛋白質(zhì)有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療血栓栓塞性疾病的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)跪球纠w溶酶Z功能的抗體、蛋白質(zhì)或其它配體。用表達(dá)的重組蚯蚓纖溶酶Z篩選蛋白質(zhì)庫可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激蚯蚓纖溶酶Z功能的蛋白質(zhì)分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)蚯蚓纖溶酶Z DNA或是其片段編碼的蛋白質(zhì)具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于蚯蚓纖溶酶Z基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與蚯蚓纖溶酶Z基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制蚯蚓纖溶酶Z的分子，也包括那些并不影響蚯蚓纖溶酶Z功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的蚯蚓纖溶酶Z基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的蚯蚓纖溶酶Z基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)蚯蚓纖溶酶Z或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的各類抗體可以利用蚯蚓纖溶酶Z基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用蛋白質(zhì)合成儀合成。與蚯蚓纖溶酶Z基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
利用本發(fā)明蚯蚓纖溶酶Z，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與蚯蚓纖溶酶Z發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蚯蚓纖溶酶Z及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、或拮抗劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可直接用于疾病治療，例如，用于血栓方面的治療。在使用本發(fā)明蚯蚓纖溶酶Z時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療劑，如抗腫瘤藥物等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的蚯蚓纖溶酶Z施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/天，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/天-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
一種檢測檢測樣品中是否存在蚯蚓纖溶酶Z的方法是利用蚯蚓纖溶酶Z的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與蚯蚓纖溶酶Z特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在蚯蚓纖溶酶Z。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于蚯蚓中含有10多種的纖溶酶。從蚯蚓中分離純化其中的一種成分至單一的純度，在工藝上有一定的難度。本發(fā)明克隆到蚯蚓纖溶酶Z基因，分析測定了其基因序列，并成功地進(jìn)行了表達(dá)。這些研究成果，不僅為今后開發(fā)研究基因工程產(chǎn)品創(chuàng)造了良好的條件，也為今后開發(fā)蚯蚓纖溶酶針劑提供了必要的化學(xué)結(jié)構(gòu)資料。此外，本發(fā)明的蚯蚓纖溶酶Z為治療血栓栓塞性疾病等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1從蚯蚓中分離純化天然的蚯蚓纖溶酶Z在本實(shí)施例中，采用了以下4種蚯蚓種類鉅齒遠(yuǎn)蚓(Amynthasdancatala)、赤子愛勝蚓(Eisenia faetide)、壯偉遠(yuǎn)環(huán)蚓(Amynthas robustus)、威廉腔環(huán)蚓(Metaphire guillelmi)。在本實(shí)施例及以下實(shí)施例中，除非特別注明，否則指以上四種蚯蚓。
取鮮活蚯蚓若干，經(jīng)機(jī)械粉碎，迅速冷卻至4-10攝氏度。加入一倍體積的有機(jī)溶劑(丙酮)，低溫萃取出脂質(zhì)、水分、可溶性蛋白質(zhì)、鹽等雜質(zhì)。10000rpm冷凍離心，并收集沉淀。沉淀中加入等體積的水，攪拌10分鐘，10000rpm冷凍離心，收集上清液。上清液經(jīng)過濾，采用冷凍干燥法將其凍干。取少量凍干固體進(jìn)行分析，在FPLC圖譜上出現(xiàn)9-12個(gè)蛋白峰，按照出峰時(shí)間的不同，相互有所區(qū)別，這些峰為蚯蚓纖溶酶的同工酶，其中第三個(gè)峰具有最顯著的纖溶酶活性。用蒸餾水溶解，經(jīng)離子交換柱，親和層析柱，分子篩柱等多步分離純化，得到蚯蚓纖溶酶精制樣品。樣品經(jīng)HPLC法，或SDS電泳分析，呈現(xiàn)單一條帶。然后，對(duì)該蚯蚓纖溶酶用質(zhì)譜測定測定分子量，結(jié)果為25125.0道爾頓。該酶被命名為蚯蚓纖溶酶Z。在測試的4種蚯蚓中都含有這種蚯蚓纖溶酶Z，這表明蚯蚓纖溶酶Z是一種普遍存在的纖溶酶。
實(shí)施例2蚯蚓纖溶酶Z的純化和N端10個(gè)氨基酸序列的測定鮮活蚯蚓洗凈后，攪碎。利用有機(jī)溶劑沉淀法制得蚯蚓纖溶酶粗制劑。接著通過Sephadex G-75，DEAE-Sepharose CL-6B及Mono Q柱分離，純化到蚯蚓纖溶酶Z樣品。純化的蚯蚓纖溶酶Z樣品在PE491蛋白質(zhì)測序儀上經(jīng)過10個(gè)循環(huán)，測得如下N端序列ILGGTHARVG。
實(shí)施例3引物的設(shè)計(jì)和合成據(jù)實(shí)施例2中測定的蚯蚓纖溶酶Z的N端的序列，設(shè)計(jì)上游寡核苷酸引物為5′ATGAATCCATGATC C TGGGAG(T) GG(ATC)ACG(ACT)A(GC)A3′(SEQ ID NO6)，并在成熟蛋白的N端加上了起始密碼子和BamHI位點(diǎn)，以利于該基因的表達(dá)研究和操作。由于迄今為止缺乏蚯蚓纖溶酶C端及其基因下游的任何信息，本發(fā)明人用3′RACE方法克隆該基因。下游引物為5′GACCACGCGTATCGATGTCG AC3′(SEQID NO3)。引物的合成委托上海生工生物工程公司完成。
實(shí)施例4總RNA的提取取威廉腔環(huán)蚓一條，在液氮中研磨成粉末。取200mg粉末，加入4mL溶液D(含4mol/L異硫氰酸胍，25m mol/L檸檬酸鈉，pH 7.0；5％十二烷基肌氨酸鈉，0.1mol/Lβ-巰基乙醇)，充分勻漿后，將溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃，12,000g離心5分鐘。上清吸入新的離心管中，加入0.4mL 2mol/L NaAc，Ph 4.0，4mL水飽和酚和2mL氯仿∶異戊醇(49∶1)混合物，充分振蕩后，冰浴15min。4℃，10,000g離心20min。取上層水相與等體積異丙醇混勻，-20℃放置1h。4℃，10,000g離心20min收集沉淀.沉淀重溶于2mL溶液D中，65℃溫育2-3min，使其充分溶解，加入0.2mL 2mol/L NaAc，pH4.0和2mL異丙醇，混勻后-20℃放置1h。4℃，10,000g離心20min，沉淀用75％乙醇洗滌后，敞口于空氣中放置數(shù)分鐘，使乙醇充分揮發(fā)干凈。最后溶于DEPC(焦碳酸二乙酯)處理過的滅菌水30μL中。取1μL測RNA的OD260/OD280，1μL走甲醛變性電泳，以確定RNA的純度和完整性。
實(shí)施例5RT-PCR擴(kuò)增蚯蚓纖溶酶Z基因以實(shí)施例4中制得的威廉腔環(huán)蚓總RNA為模板，用寶林曼公司3′RACE KIT反轉(zhuǎn)錄，操作按說明書進(jìn)行。
使用實(shí)施例3中合成的引物，從上述所得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。總反應(yīng)體系為50μL，其中MgCl2的終濃度為1.5m mol/L，dNTP的終濃度為200μmol/L。引物濃度為30n mol/L，Tag酶2單位(購自Gibco BRL公司)。反應(yīng)條件為先94℃變性3min，。然后進(jìn)入循環(huán)，。94℃，變性1min；50℃退火min；72℃延伸1.5min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在72℃保溫10min。PCR產(chǎn)物取5μL進(jìn)行1％的瓊脂糖電泳檢查，擴(kuò)增出一條約1000bp的DNA片段(見
圖1)。產(chǎn)物以氯仿抽提，乙醇沉淀回收，溶于10μL的滅菌水中。
實(shí)施例6蚯蚓纖溶酶Z基因的克隆由于擴(kuò)增的是一個(gè)未知序列的核酸，為避免基因內(nèi)部出現(xiàn)巧合的酶切位點(diǎn)導(dǎo)致基因被切割而破壞其完整性，用T-載體進(jìn)行克隆。
1)T-載體的制備載體pBluescript-SK(購自Stratagene公司)1μg用EcoRI切割，等體積酚氯仿處理，乙醇沉淀，溶于50μL體系中，內(nèi)含10×PCR緩沖液5μL，100m mol/L dNTP2μL，Taq酶1單位。在70℃保溫2h，等體積的酚∶氯仿處理，乙醇沉淀后，溶于10μL滅菌水。
2)取PCR回收產(chǎn)物2μL與自制T-載體1μL連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)蘭白斑篩選，酶切和PCR鑒定，獲得陽性克隆。
實(shí)施例7兔抗蚯蚓纖溶酶Z抗體的制備取體重為2公斤左右的雄性新西蘭大耳兔一只。以1mg蚯蚓纖溶酶Z樣品加弗氏完全佐劑研磨成乳膠狀，在兔勁部多點(diǎn)注射。飼養(yǎng)半個(gè)月后，以1mg蚯蚓纖溶酶Z樣品加弗氏不完全佐劑研磨成乳膠狀，再在兔勁部多點(diǎn)注射。一個(gè)月后，用1.5mg蚯蚓纖溶酶Z樣品加弗氏不完全佐劑以同樣的方法加強(qiáng)免疫。半個(gè)月后，再用1mg蚯蚓纖溶酶Z樣品加弗氏不完全佐劑再次加強(qiáng)免疫。飼養(yǎng)半個(gè)月后，勁動(dòng)脈取血，4℃靜置過夜，2,000轉(zhuǎn)離心3分鐘。上層血清即為兔抗蚯蚓纖溶酶Z抗體。
實(shí)施例8纖溶酶Z基因的鑒定實(shí)施例6中獲得的陽性克隆委托上?；瞪锛夹g(shù)公司測定?；蛉蛄泻途幋a的蛋白質(zhì)序列見圖2。該基因示于SEQ ID NO1，長924個(gè)bp，其中讀碼框長723bp(第1～723位)，編碼241個(gè)氨基酸(SEQ ID NO2)。723個(gè)bp以后為3′-非翻譯區(qū)，有兩個(gè)polyA加尾信號(hào)AATAAA。
蚯蚓纖溶酶Z cDNA編碼的蛋白質(zhì)序列與另一個(gè)被稱為Lumbricus bimastus的cDNA編碼的蛋白質(zhì)序列同源性達(dá)54％。因此，這是一個(gè)新的未見報(bào)道的蚯蚓纖溶酶基因。從這個(gè)新基因所編碼的氨基酸序列，經(jīng)電腦軟件DNASTAR所計(jì)算的分子量為25138.10，這與從蚯蚓中所提取的纖溶酶Z的分子量大小是吻合的。
實(shí)施例9蚯蚓纖溶酶Z的表達(dá)和鑒定在該實(shí)施例中，為進(jìn)一步證實(shí)該基因的確編碼了蚯蚓纖溶酶Z，將該基因的翻譯區(qū)在原核表達(dá)載體pET-28a(+)(Novagen公司)中表達(dá)，用實(shí)施例7中制得的兔抗蚯蚓纖溶酶Z抗體與表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western雜交鑒定。其中質(zhì)粒構(gòu)建圖譜見圖3，表達(dá)的結(jié)果見圖4。
(1)表達(dá)根據(jù)全基因序列另合成兩條引物，以便于在pET-28a(+)中表達(dá)上游引物為5′GCGAATTCATCCTGGGAGGGACGAAA3′(引物3)(SEQ ID NO4)，下游引物為5′CACTCGAGTTAGTGCAGTCGGCTCCA3′(引物4)(SEQ ID NO5)。以全長cDNA為模板，如上所述進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物EcoRI/XhoI酶切后克隆于pET-28a(+)的EcoRI/XhoI位點(diǎn)中，酶切的陽性克隆經(jīng)測序確保無誤之后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于菌株BL21(DE3)中。待細(xì)菌的OD600到0.6后加入IPTG至1m mol/L誘導(dǎo)基因的表達(dá)。2.5小時(shí)后離心，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。
(2)Western印跡SDS-PAGE結(jié)束后，取下電泳膠在冰浴的條件下100V電轉(zhuǎn)2h至尼龍膜上。將膜放入雜交袋，加入5mL封閉液(5％脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液)，在擺動(dòng)平臺(tái)上搖動(dòng)1h.。用封閉液以1∶1000稀釋第一抗體(實(shí)施例7中制得的兔抗蚯蚓纖溶酶Z抗體)。打開雜交袋，倒掉封閉液，加入稀釋好的第一抗體，搖動(dòng)1h.。用磷酸鹽緩沖液洗滌尼龍膜3次，每次15min。將洗滌好的膜與封閉液稀釋好的羊抗兔堿性磷酸酶(1∶3000稀釋)雜交1h.。膜用堿性磷酸酶緩沖液(100mmol/LTris-HCl，pH 9.5，5mmol/L MgCl2，100mmol/L NaCl)洗滌后，用BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-一吲哚磷酸/氮藍(lán)四唑)顯色。
雜交結(jié)果顯示，表達(dá)的蛋白質(zhì)與蚯蚓纖溶酶Z抗體專一性地結(jié)合(見圖4)。
實(shí)施例10不同來源蚯蚓纖溶酶的活性測定按Deogny等人所描述的纖維蛋白平板法(Clinica ChimicaActa，1975，60，85)，根據(jù)溶圈的面積大小計(jì)算蚯蚓纖溶酶的活性。所采用的樣品為赤子愛勝蚓纖溶酶及蚯蚓纖溶酶Z，活力測定的結(jié)果分別為赤子愛勝蚓纖溶酶為21,000mm2/mg蛋白質(zhì)，蚯蚓纖溶酶為Z 33,000mm2/mg蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(ii)發(fā)明名稱新的纖溶酶、其編碼序列及用途(iii)序列數(shù)目6(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度979bp(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATCCTGGGAG GGACGAAAGC CAGAGTTGGA GAGATCCCAT GGCAGCTGTC GCAGCAGAGA 60GGCGGAAGTC ACAGCTGCGG AGCGTCTCTT CTCAGGCCCG GTTCGGCCCT CAGCGCCGCT 120CACTGCGTTG ACGGAGCACC GCCAGCAGAT GTGCGAATTG TCGCTGGACT TCATTTGCGC 180TCAGATGAAT CCACTGCAGT GGCTTCCCTT GCTGAGAGTT TCCTAATTCA CCCGAGTTAC 240AACGTTGGAG AAGGAACTTT CCCCAACGAC ATCGCCATCA TCTACCTATT AACAAATATC 300AACTCTGCTC CAGTAGAAAA CATCGATTTT GCTCTTCTAC CTCCAGACAA CGTCGAGCAA 360TTCGTCGGAT TTACTTGCGT GCTCAGTGGA TGGGGACGCA CATCGGCCAG CAATGTACTT 420CCCGATGCCC TGCAGAAGGT CAGCATCGAC GTCATCACCA CAGCCGAATG CGACTCACGC 480ATGGCCGCTG TTGCTGGAGC CGACTGCACT GATGCTCACA TCGCCGTCTT CGATCCCGCT 540TTGCAGAAAG GATCGTGCAA CGGTGATAGC GGTGGCCCAA TGAACTGCCC TCTGAGCGGT 600GAATTTGTGG TTGCTGGTGT GACGTCATGG GGAATTTCGG GAGGCGGTGC CTGTCTGCCA 660GAATACCCAT CAGTCTACAC CAGAACAGGA TTCTACCGTC AATGGATCCT TGACAACATT 720CGCTAGACTG ACTCAGTCGT CCATTCGTCT ATGCCGGAAC CATGTTCTAC AGCGGACGGA 780TCACGGACAC CGTCCTTCAA ATTATAAAGA AATTACTGAA GAGCTTTGAA TAATAATGCA 840GACTTTAACT TCAAGTGCCC CCAACTTAGC AAGCTCCCTG TTTATCCATT GTGAATAAAT 900CAGAATAAAG ACGGCAAAAA AAAAAAAAAA GTCGACATCG ATACGCGTGG TCAATCAAGC 960TTATCGATAC CGGCGACCT 979(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度241個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2ILGGTKARVG EIPWQLSQQR GGSHSCGASL LRPGSALSAA HCVDGAPPAD 50VRIVAGLHLR SDESTAVASL AESFLIHPSY NVGEGTFPND IAIIYLLTNI 100NSAPVENIDF ALLPPDNVEQ FVGFTCVLSG WGRTSASNVL PDALQKVSID 150VITTAECDSR MAAVAGADCT DAHIAVFDPA LQKGSCNGDS GGPMNCPLSG 200EFVVAGVTSW GISGGGACLP EYPSVYTRTG FYRQWILDNI R 241(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度22堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO 3GACCACGCGT ATCGATGTCG AC 22(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度26堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4GCGAATTCAT CCTGGGAGGG ACGAAA 26(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度26堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CACTCGAGTT AGTGCAGTCG GCTCCA26(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度28堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6ATGAATCCAT GATCCTGGGA G(T) GG (ATC) ACG (ACT) A (GC) A 28
權(quán)利要求
1.一種分離的蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)、或其保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的蚯蚓纖溶酶Z。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸含有SEQ ID NO1中1-723位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種具有蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)蚯蚓纖溶酶Z的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有蚯蚓纖溶酶Z蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的蚯蚓纖溶酶Z特異性結(jié)合的抗體。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的纖溶酶－蚯蚓纖溶酶Z,編碼蚯蚓纖溶酶Z的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蚯蚓纖溶酶Z的方法。本發(fā)明還公開了此蚯蚓纖溶酶Z用于治療多種疾病的方法,如用于血栓栓塞性疾病等疾病。本發(fā)明還提供了含蚯蚓纖溶酶Z的藥物組合物。
文檔編號(hào)C12N9/64GK1361280SQ0013778
公開日2002年7月31日 申請(qǐng)日期2000年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月29日
發(fā)明者周元聰, 鐘曉燕, 朱洪 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所