專利名稱：：回收重組HBsAg的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從表達(dá)HBsAg的酵母細(xì)胞回收重組HBsAg的方法。破碎微生物的細(xì)胞壁-細(xì)胞破碎-是回收胞內(nèi)生物活性蛋白的第一步。在生產(chǎn)規(guī)模上，近幾年適合的有機(jī)械破碎方法，例如在球磨機(jī)中濕研磨。由于對(duì)于研細(xì)和分散不斷提高的要求，已經(jīng)從色素處理中使用的常規(guī)球磨機(jī)開發(fā)出了緊湊構(gòu)造型高速攪拌器球磨機(jī)。它們由垂直軸或水平軸旋轉(zhuǎn)的中空筒體組成，所述簡(jiǎn)體中裝有混合的玻璃或鋯的氧化物小球，最大裝填度為80％。轉(zhuǎn)速不以為了提高沖擊/加壓粉碎的任何期望的方式而提高，因?yàn)殡x心力補(bǔ)償了磨細(xì)效果。此外，提高的速度和裝填度會(huì)產(chǎn)生熱度問題，其可能會(huì)破壞要回收的產(chǎn)物。使用篩筒，旋轉(zhuǎn)篩隙或者使用安裝在軸承套中的同軸環(huán)隙進(jìn)行連續(xù)的研磨材料/研磨體分離。研磨材料通過研磨容器周圍的雙層夾套冷卻；轉(zhuǎn)動(dòng)軸也可以被部分冷卻。濕研磨的破碎原理在于將動(dòng)能從攪拌器傳遞給研磨體。這主要通過粘合力與排代力結(jié)合實(shí)現(xiàn)，所述排代力源于攪拌器元件的組裝和類型。該力和內(nèi)聚力驅(qū)動(dòng)研磨室。研磨體徑向方向的加速促進(jìn)層流的形成。根據(jù)研磨體運(yùn)動(dòng)的絕對(duì)速度和距離，研磨體層之間的差示速度曲線影響高剪切力，所述高剪切力除去碰撞結(jié)果外，是微生物細(xì)胞壁破碎的主要原因。細(xì)胞壁也可以通過高壓勻漿器機(jī)械破碎。這樣一種裝置主要由高壓活塞泵和勻漿裝置組成。當(dāng)達(dá)到啟動(dòng)壓力時(shí)，勻漿閥門打開，然后細(xì)胞懸浮液加壓下以非常高的速度通過該閥門裝置。之后，細(xì)胞懸浮液每100巴加熱約2.5℃。離開破碎閥裝置之后，利用熱交換器冷卻細(xì)胞懸浮液。這樣，與濕研磨相反，在這里破碎材料被短時(shí)間加熱。通過勻漿裝置時(shí)，使細(xì)胞懸浮液具有非常高的湍流，空化和剪切力。高壓勻漿器的破碎原理在于在一個(gè)非常短的時(shí)間內(nèi)迅速減小細(xì)胞懸浮液中的能量密度，即高壓差和快速注壓可以被認(rèn)為是破碎程度的主要原因。兩種機(jī)械破碎方法用于不同的微生物。根據(jù)微生物的類型，特別是根據(jù)其結(jié)構(gòu)，選擇各自的方法。例如，在Pittroff,M.等，DECHEMA-Biotechno1.Conf.；(1990),4,Pt.B,1055-60中對(duì)于各種各樣的微生物，例如釀酒酵母，藤黃微球菌和大腸桿菌，試驗(yàn)了兩種細(xì)胞破碎方法，得出的結(jié)論是微生物的形態(tài)學(xué)差異影響兩種方法的破碎效果。例如Pittroff,M.等，DECHEMA-Biotechnol.Conf.；(1992),5,Pt.B,687-91和Pittroff,M.等，Chem.Ing.Techn.；(1992),64,10,950-53指出對(duì)于特殊的微生物，例如桿狀細(xì)菌，優(yōu)選使用高壓破碎方法。相反，球磨方法優(yōu)選用于具有圓形結(jié)構(gòu)的球狀微生物。發(fā)現(xiàn)兩種方法對(duì)于破碎釀酒酵母種酵母細(xì)胞破碎程度相同。此外，Luther,H.等，Acta-Biotechnol.；(1992),12,4,281-91，描述了從釀酒酵母或大腸桿菌純化蛋白質(zhì)所使用的球磨機(jī)和高壓勻漿器之間的進(jìn)一步比較。證明酵母和細(xì)菌細(xì)胞都可以使用球磨機(jī)或高壓勻漿器破碎。發(fā)現(xiàn)高壓勻漿器的缺點(diǎn)是生成粘液的微生物或機(jī)械污染非常容易導(dǎo)致阻塞。關(guān)于酵母細(xì)胞指出，高壓勻漿器破壞了較少量細(xì)胞。盡管沒有明確指出，但是已經(jīng)設(shè)想出高壓勻漿器得到較低的產(chǎn)率。Schutte,H.,Biol.Recombinant-Microorg.Anim.Cells；(1991)Oholo34Meet.,293-305也證明高壓勻漿器可進(jìn)行酵母和細(xì)菌細(xì)胞的有效破碎，但是不非常適合菌絲體微生物。Baldwin,C.,Biotechnol.Tech；(1990),96,4,329-34中研究了使用高壓勻漿器破碎釀酒酵母。發(fā)現(xiàn)利用高壓勻漿器破碎細(xì)胞通常給出低的破碎率(5次產(chǎn)率40％)。只有事先用來自溶黃質(zhì)厄氏菌的消解酶處理才能發(fā)現(xiàn)高壓勻漿器中酵母細(xì)胞的完全破碎。從迄今為止已經(jīng)進(jìn)行的充分研究進(jìn)一步明確地看到，要純化的蛋白質(zhì)的類型對(duì)于各種破碎方法的選擇處于決定性重要地位。這里特別感興趣的是乙肝表面抗原(HBsAg)表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞破碎。Choo；K.B.等Biochem.Biophys.Res.Commun.；(1985),131,1,160-66研究了使用球磨機(jī)破碎釀酒酵母細(xì)胞回收HBsAg。但是，只能提取少量顆粒形式的HBsAg。FentonD.M.等，Abstr.Ann.Med.Am.Soc.Microbiol.；(1984),84Meet.193描述了利用高壓勻漿器細(xì)胞破碎方法從釀酒酵母回收重組HBsAg。該文獻(xiàn)中指出激活形式即抗原形式的HBsAg大規(guī)模溶解存在問題。用高壓勻漿器只有通過10次處理后才發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的充分破碎和令人滿意的蛋白質(zhì)釋放，并且只有在15次處理后才發(fā)現(xiàn)最大HBsAg釋放。作者得出結(jié)論抗原激活HBsAg的釋放需要亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破碎。因此，迄今為止這兩種破碎方法還不可能提供通過細(xì)胞破碎最佳產(chǎn)生HBsAg的合適的系統(tǒng)。因此本發(fā)明的目的是提供從重組微生物高產(chǎn)率回收重組HBsAg的方法。根據(jù)本發(fā)明，該目的是通過回收重組HBsAg的方法實(shí)現(xiàn)的，其中使用高壓勻漿器破碎能表達(dá)HBsAg的重組甲基營(yíng)養(yǎng)酵母(methylotrophicyeast)細(xì)胞，并且從得到的細(xì)胞碎屑回收HBsAg。出人意料地發(fā)現(xiàn)在高壓勻漿器中破碎表達(dá)HBsAg的多形漢遜氏酵母(Hansenulapolymorpha)細(xì)胞可以獲得比用常規(guī)方法，特別是利用高壓勻漿器或玻璃球磨機(jī)對(duì)釀酒酵母的細(xì)胞破碎，高得多的每克細(xì)胞干重的產(chǎn)品產(chǎn)率。因此，本發(fā)明方法對(duì)于以前公知的用于從微生物回收HBsAg的方法進(jìn)行了相當(dāng)大的改進(jìn)。在本發(fā)明方法中，從能表達(dá)HBsAg的重組甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞回收重組HBsAg。優(yōu)選地，使用漢遜氏酵母屬下的種的表達(dá)HBsAg的菌株，特別優(yōu)選多形漢遜氏酵母。也可以使用畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和球擬酵母屬下的種的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母。在發(fā)酵過程中控制標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，例如pH，通氣量和溫度。甘油，甲醇和葡萄糖，優(yōu)選甘油，適合用作底物。向發(fā)酵罐培養(yǎng)基補(bǔ)充該底物直到達(dá)到酵母細(xì)胞至少80，優(yōu)選至少90克/升(g.l-1)細(xì)胞干重的期望的細(xì)胞密度。達(dá)到所述細(xì)胞密度后，在酵母培養(yǎng)基中誘導(dǎo)HBsAg的表達(dá)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過自甲醇代謝中涉及的基因衍生的啟動(dòng)子來控制甲基營(yíng)養(yǎng)酵母中HBsAg的表達(dá)。充分描述過的啟動(dòng)子是MOX啟動(dòng)子，DAS和FMD啟動(dòng)子(Ledeboer,A.M.等，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)(1985),13,9,3063-3082；Janowics,Z.A.等，核酸研究(Nucl.AcideRes.)(1995),13,9,2043-3062,EP299108)。為了實(shí)現(xiàn)所述啟動(dòng)子控制下的最佳表達(dá)，首先讓酵母細(xì)胞在全合成營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。加入甲醇誘導(dǎo)，使得細(xì)胞懸浮液中含有大約1％的甲醇。關(guān)于甲基營(yíng)養(yǎng)酵母的培養(yǎng)和上述三種啟動(dòng)子的誘導(dǎo)條件的詳細(xì)情報(bào)可以例如參見Gelissen,G.,Murooka/lmanaka(編著)工業(yè)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用的重組微生物(Recombinantmicrobesforindustrialandagriculturalapplications),MarcelDekker,NY1993,787-796和Weydemann,U.等，應(yīng)用微生物。生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.)(1995),44,377-385。完成發(fā)酵過程后，通過切向流過濾從培養(yǎng)基成分分離細(xì)胞。通過用破碎緩沖液適當(dāng)稀釋來調(diào)節(jié)期望的細(xì)胞密度。對(duì)于破碎，優(yōu)選以50-150克/升細(xì)胞干重的細(xì)胞密度使用酵母細(xì)胞。精確的細(xì)胞密度取決于各重組甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞物種。特別地，70-120克/升細(xì)胞干重的細(xì)胞密度是優(yōu)選的。如果根據(jù)本發(fā)明使用的重組甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞的細(xì)胞密度太低，則該方法變得費(fèi)時(shí)且不經(jīng)濟(jì)。酵母細(xì)胞細(xì)胞密度過高時(shí)，破碎變得越來越效率低，對(duì)冷卻能力的要求提高。根據(jù)本發(fā)明使用的高壓勻漿器正如導(dǎo)論中所描述的是常規(guī)高壓勻漿器，其可以用于細(xì)胞破碎。特別優(yōu)選的是使用NanojetLAB30PL型或相當(dāng)型的高壓勻漿器。在細(xì)胞破碎過程中，勻漿器裝置中的壓力是1000-2000巴。1200-1600巴的壓力是優(yōu)選的。特別優(yōu)選的壓力是1500-1600巴。酵母細(xì)胞的起始溫度優(yōu)選是2-15℃，特別優(yōu)選4-8℃。通常以細(xì)胞懸浮液形式存在的酵母細(xì)胞可以在攪拌下冷卻到期望的溫度。優(yōu)選冷卻高壓勻漿器，使得在產(chǎn)物出口處觀察到的低出口溫度例如是2-15℃，優(yōu)選3-13℃，特別優(yōu)選5-10℃。在高壓勻漿器中，細(xì)胞通常經(jīng)幾次循環(huán)(通過)破碎。發(fā)現(xiàn)共3-8次循環(huán)(通過)對(duì)于最佳產(chǎn)物收率就足夠了。對(duì)于回收重組HBsAg的細(xì)胞破碎優(yōu)選3-6次，特別優(yōu)選4次循環(huán)(周期)。細(xì)胞破碎過程完全后，用該方法制備的產(chǎn)物優(yōu)選使進(jìn)行進(jìn)一步分離和純化步驟。所述附加的處理步驟是將提取物中的重組HBsAg進(jìn)行進(jìn)一步純化和富集的常規(guī)方法。例如，可以進(jìn)行一種或幾種下面的分離和純化步驟，如以指出的順序用聚乙二醇沉淀細(xì)胞碎屑，分離PEG上清液，在硅石基質(zhì)上吸附，分離硅石基質(zhì)，從硅石基質(zhì)解離產(chǎn)物，分離硅石基質(zhì)上清液，離子交換層析，通過超濾濃縮離子交換集液(ionexchangerpool)，氯化銫中的密度梯度分離，大小排阻層析和無(wú)菌過濾(最后的含水物質(zhì)(bulk))。下面的實(shí)施例將解釋本發(fā)明。實(shí)施例1通過高壓破碎細(xì)胞破碎多形漢遜氏酵母回收HBsAg1．高壓勻漿器下面說明的裝置用于高壓破碎方法NanojetLab30PL破碎原理高壓體積流速(100±20)毫升/分鐘，不可調(diào)節(jié)活塞泵輸入壓力4-7巴勻漿裝置壓力1200-1600巴勻漿閥門碳化鎢冷卻管式熱交換器細(xì)胞干重70克/升密封劑EPDM高壓密封BunaN材料1-45-71鋼2．微生物及其培養(yǎng)在全合成營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)HBsAg的多形漢遜氏酵母菌株，例如Janowicz等，酵母(Yeast)，7:431-443,1991中描述的菌株。在發(fā)酵過程中，控制pH，通氣量和溫度。發(fā)酵過程中，響應(yīng)溶解的氧的濃度間歇性地向發(fā)酵罐培養(yǎng)基補(bǔ)充作為底物的甘油使得細(xì)胞密度最大大約90克/升細(xì)胞干重。在細(xì)胞密度大約90克/升細(xì)胞干重和約46小時(shí)發(fā)酵時(shí)間時(shí)，通過18-26小時(shí)內(nèi)加入甲醇一次，在多形漢遜氏酵母培養(yǎng)基中誘導(dǎo)HBsAg表達(dá)。通過在干重天平上蒸發(fā)直至恒重從培養(yǎng)物等份測(cè)定細(xì)胞干重。最后加入后，使培養(yǎng)物再生長(zhǎng)2-9小時(shí)。接著，通過交叉流過濾從發(fā)酵培養(yǎng)基成分大量分離細(xì)胞。破碎之前將細(xì)胞緩沖。緩沖使用20mM磷酸鹽緩沖液和2mMNa2-乙二胺四乙酸二水合物(TriplexⅢ)。向最后的懸浮液加入每克細(xì)胞干重75毫克洗滌劑Tween2O。破碎多形漢遜氏酵母時(shí)，以大約70克/升細(xì)胞干重細(xì)胞密度使用發(fā)酵罐培養(yǎng)肉湯。3．細(xì)胞破碎攪拌下將緩沖的細(xì)胞冷卻到4-8℃。破碎裝置上的起始溫度調(diào)節(jié)到8±5℃。在一個(gè)分開的冷卻攪拌容器中收集細(xì)胞提取物。通過活塞沖程體積和每分鐘的沖程次數(shù)測(cè)定高壓勻漿器中體積流速并且不能各個(gè)調(diào)節(jié)。作為原則，在每分鐘100毫升細(xì)胞懸浮液的流速下進(jìn)行破碎。將細(xì)胞共4次循環(huán)破碎。第4次循環(huán)完成后，用80mMPMSF貯存溶液調(diào)節(jié)到2mM終濃度。細(xì)胞破碎后，可以以下面指出的次序或者以不同的次序通過下面的分離和純化步驟來純化產(chǎn)物·用聚乙二醇沉淀細(xì)胞碎屑·分離PEG上清液·在硅石基質(zhì)上吸附·分離硅石基質(zhì)·從硅石基質(zhì)解離產(chǎn)物·分離硅石基質(zhì)上清液·離子交換層析·過超濾濃縮離子交換器集液·氯化銫中的密度梯度分離·大小排阻層析·無(wú)菌過濾(最后的含水物質(zhì))為了研究高壓破碎的效率，通過Lowry方法測(cè)定總的蛋白質(zhì)含量，并且通過免疫學(xué)方法(ELISA”)測(cè)定細(xì)胞提取物中HBsAg濃度。以10升發(fā)酵規(guī)格進(jìn)行Nanojet高壓破碎。為了保證可比性，使HBsAg的產(chǎn)率與細(xì)胞破碎之前各細(xì)胞量相關(guān)聯(lián)。4．結(jié)論4．1測(cè)試Nanojet高壓破碎菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料10升發(fā)酵培養(yǎng)基RL-98/17d目的測(cè)定破碎循環(huán)必要的次數(shù)從4次起不再能夠檢測(cè)到蛋白質(zhì)和產(chǎn)物(HBsAg)明顯的增加。因此下面的試驗(yàn)設(shè)定為4次通過。4．2粗提物和“最后的含水物質(zhì)”(終產(chǎn)物)的Nanojet高壓破碎的破碎效率“最后的含水物質(zhì)”是進(jìn)行過上面提到的分離和制備步驟后，獲得的產(chǎn)物菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料10升發(fā)酵培養(yǎng)基NJ-4()RL-98/19,NJ-6,-7<tablesid="table2"num="002"><table>蛋白質(zhì)毫克數(shù)/克細(xì)胞干重HBsAg毫克數(shù)/克細(xì)胞干重NanojetLAB30PL粗提物最后的含水物質(zhì)粗提物最后的含水物質(zhì)發(fā)酵NJ-4128.21.9810.81.77發(fā)酵NJ-6100.41.297.11.41發(fā)酵NJ-792.60.996.91.10平均值107.11.428.31.43</table></tables>對(duì)比實(shí)施例1通過濕磨細(xì)胞破碎多形漢遜氏酵母回收HBsAg1．玻璃球勻漿器下面說明的裝置用于濕磨方法FrymaCoballMillMS18破碎原理濕磨轉(zhuǎn)子直徑192mm有效研磨體積1200ml研磨體的填入有效研磨體積的70-80％研磨間隙6.50mm分離間隙0.05mm篩間隙0.20mm差示間隙0.18mm轉(zhuǎn)子圓周速度14m/s冷卻雙層夾套和轉(zhuǎn)子冷卻細(xì)胞干重100-120克/升體積流速(200-300)毫升/分鐘密封材料乙烯丙烯DynoMillKDLSpezial:破碎原理濕磨有效研磨腔體積600ml攪拌盤4，聚氨基甲酸乙酯研磨體的填入有效研磨體積的80-85％轉(zhuǎn)速6.8m/s同軸環(huán)間距0.1mm冷卻雙套夾套細(xì)胞干重70克/升體積流速100毫升/分鐘密封材料Viton使用直徑0.45-0.55mm的玻璃球進(jìn)行濕磨。2．微生物及其培養(yǎng)使用和實(shí)施例1相同的材料，但是發(fā)酵培養(yǎng)肉湯的細(xì)胞密度是70-120克/升細(xì)胞干重。3．細(xì)胞破碎根據(jù)實(shí)施例1所述進(jìn)行前處理和后處理。DynoMillKDLSpezial中濕磨通過體積流速為100毫升/分鐘的蠕動(dòng)泵向臥式破碎室連續(xù)加入含有70克/升細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液。同時(shí)，為了蛋白酶抑制，加入80mMPMSF溶液，在立即混合下1/40的細(xì)胞懸浮液流向破碎室的分開的入口部分。在一個(gè)循環(huán)內(nèi)破碎細(xì)胞懸浮液。FrymaCoballMillMS18內(nèi)濕磨這里也是通過蠕動(dòng)泵連續(xù)向豎式破碎室加入細(xì)胞懸浮液。但是，該實(shí)施例中的細(xì)胞密度是100-120克/升，體積流速設(shè)定在200-300毫升/分鐘。與DynoMillKDLSpezial相對(duì)照，蛋白酶抑制劑貯存液(80mMPMSF)不在球磨機(jī)出口之前加入。細(xì)胞懸浮液在一個(gè)循環(huán)內(nèi)被破碎。終細(xì)胞提取物中的PMSF終濃度是2mM。以50升規(guī)模進(jìn)行使用FrymaCoballMillMS18進(jìn)行破碎試驗(yàn)。在使用DynoMillKDLSpezial進(jìn)行的濕研磨中使用10升發(fā)酵規(guī)模。為了保證可比性，使HBsAg的產(chǎn)率與細(xì)胞破碎之前各細(xì)胞量相關(guān)聯(lián)。4．結(jié)論4.1DynoMill玻璃球破碎的破碎效率菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料10升發(fā)酵培養(yǎng)基RL-98/194.2Fryma玻璃球破碎達(dá)到終產(chǎn)物最后的含水物質(zhì)”的破碎效率菌株多形漢遜氏酵母K3/8-1起始材料50升發(fā)酵培養(yǎng)基RL-98/26,/29,/35實(shí)施例2濕磨和高壓破碎之間的比較1．Nanojet高壓破碎和DynoMill玻璃球破碎的破碎效率在與DynoMill玻璃球研磨機(jī)中細(xì)胞破碎比較時(shí)，從相同的起始物每克干物質(zhì)釋放出高四倍的產(chǎn)物的量。而同時(shí)總的蛋白質(zhì)量只增加了2倍。結(jié)果，從相同的起始物釋放出了更大量的產(chǎn)物(HBsAg)。在得到最后的含水物質(zhì)的所有隨后的處理步驟之后，高壓破碎方法中最初的產(chǎn)物產(chǎn)率保持增長(zhǎng)，產(chǎn)物的質(zhì)量相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)方法(濕磨)的質(zhì)量。這可以利用所描述的Lowry和ELISA的組合來證明。2．Nanojet高壓破碎和FrymaCoballMill玻璃球破碎的破碎效率從各三次通過的平均值來看，與玻璃球破碎相比，Nanojet高壓破碎每克干物質(zhì)釋放出高2.9倍的產(chǎn)物的量。細(xì)胞破碎更高的產(chǎn)物量得到高2.6倍的量的最后的含水物質(zhì)中純化的產(chǎn)物。根據(jù)下面的分析證明證實(shí)，兩種破碎方法的產(chǎn)物的質(zhì)量處于相同規(guī)格。3．分析結(jié)果3.1高壓破碎樣品rHBsAg批量號(hào).NJ6GFC1參照WHO(世界健康組織)和歐洲藥學(xué)會(huì)提供的信息的固定的限定值2高分辨-誘導(dǎo)偶聯(lián)的等離子體-質(zhì)譜3鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(檢測(cè)內(nèi)毒素的方法)4內(nèi)毒素單位3.2玻璃球破碎樣品rHBsAg批量號(hào).RL98/35最終物質(zhì)(FinalBulk)1參照WHO(世界健康組織)和歐洲藥學(xué)會(huì)提供的信息的固定的限定值2高分辨-誘導(dǎo)偶聯(lián)的等離子體-質(zhì)譜3鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(檢測(cè)內(nèi)毒素的方法)4內(nèi)毒素單位4．結(jié)論上述分析提供了與現(xiàn)有技術(shù)作出的設(shè)想相反的證據(jù)，高壓破碎對(duì)于酵母細(xì)胞，至少對(duì)于甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母細(xì)胞相當(dāng)有利。通過高壓破碎，產(chǎn)率可以提高2.5-4倍。權(quán)利要求1．一種回收重組HBsAg的方法，其中使用高壓勻漿器破碎能表達(dá)HBsAg的重組甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞，并且從得到的細(xì)胞碎屑回收HBsAg。2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，特征在于所述重組甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞是漢遜氏酵母屬的種的酵母細(xì)胞。3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，特征在于所述酵母細(xì)胞在50-150克/升細(xì)胞干重的細(xì)胞密度下用于破碎。4．根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，特征在于在高壓勻漿器的勻漿裝置中的1000-2000的壓力下破碎酵母細(xì)胞。5．根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，特征在于產(chǎn)物出口處的溫度是2℃至15℃。6．根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，特征在于細(xì)胞破碎3-6次循環(huán)(通過)。7．根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，特征在于細(xì)胞破碎之后，使重組HBsAg進(jìn)行進(jìn)一步的分離和純化步驟。全文摘要本發(fā)明涉及一種獲得重組HBsAg的方法。根據(jù)該方法,使用高壓勻漿器破碎能表達(dá)HbsAg的重組甲基營(yíng)養(yǎng)酵母細(xì)胞,并且從得到的細(xì)胞碎屑回收HbsAg。本發(fā)明方法特征在于每克細(xì)胞干重的高產(chǎn)品產(chǎn)率,因此是對(duì)已知的從微生物獲得HBsAg的方法的相當(dāng)大的改進(jìn)。文檔編號(hào)C12N1/19GK1302329SQ00800644公開日2001年7月4日申請(qǐng)日期2000年4月17日優(yōu)先權(quán)日1999年4月23日發(fā)明者M(jìn)·派昂泰克,M·維尼格申請(qǐng)人:萊因新生物技術(shù)工藝和產(chǎn)品公司