專利名稱：硫酸化巖藻半乳聚糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為一種用于糖技術(shù)的試劑是有用途的硫酸化巖藻半乳聚糖，來自硫酸化聚糖的較小分子及其生產(chǎn)方法，還涉及在糖技術(shù)領(lǐng)域是有用途的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶和生產(chǎn)該酶的方法。
背景技術(shù)：
褐藻含有多種含有聚糖的硫酸化巖藻糖。例如，如(1)由巖藻糖和硫酸基團組成的硫酸化巖藻聚糖；(2)含有葡萄糖醛酸、甘露糖、巖藻糖和硫酸基團等的硫酸化fucoglucuronomnans，例如在WO97/26896中所描述的那樣含有多糖-U的硫酸化巖藻糖(組成性糖的近似的摩爾比為巖藻糖∶甘露糖∶半乳糖∶糖醛酸∶硫酸基團＝10∶7∶4∶5∶20；在下文中稱作U-巖藻多糖)；和(3)包括巖藻糖和半乳糖的硫酸化巖藻半乳聚糖，例如在WO97/26896中所描述的那樣含有多糖-F的硫酸化巖藻糖(組成性糖的近似的摩爾比，巖藻糖∶甘露糖＝10∶1；在下文中稱作F-巖藻多糖)的含有多糖的硫酸化巖藻糖是已知的。幾乎所有的這些包含多糖的硫酸化巖藻糖都是大分子陰離子。因此，在多種純化步驟中它們表現(xiàn)出在物理和化學上地相似的方式，使得它們相互之間難于分離。為此，通常一直檢測沒有使它們相互分離的得自褐藻的含有多糖的硫酸化巖藻糖的生物學活性。因此，難于鑒定對觀察到的生物學活性起作用的含有多糖的硫酸化巖藻糖。
迄今為止，已經(jīng)知道了如在《農(nóng)業(yè)的和生物的化學》，44(8)1965-1966(1980)中所描述的硫酸化巖藻聚糖部分的活性和分子之間的相互關(guān)系，其與抗凝血活性有關(guān)，并且如在WO97/26896中描述的U-巖藻多糖，其與誘導凋亡的抗腫瘤細胞的活性有關(guān)。
已經(jīng)檢測了硫酸化巖藻聚糖部分作為替代肝素的抗凝劑的用途。但是，如果硫酸化巖藻聚糖要被用作成藥，那么為了避免由于不能預(yù)料的活性而出現(xiàn)的副作用需要獲得高純的硫酸化巖藻聚糖。因此，一直期望獲得用于此的一種方法。
關(guān)于U-巖藻多糖，為了利用誘導凋亡的抗腫瘤細胞的活性制備藥物，類似地需要方便地獲得高純度的含有多糖-U的硫酸化巖藻糖。因此，一直期望獲得用于此的一種方法。
通常，酶消化是用于多糖結(jié)構(gòu)分析和寡糖生產(chǎn)的最有效的方法。而且，只有一種多糖可以輕易地從如下幾乎不能相互分開的多糖混合物中去除。將要被去除的多糖通過用特異地消化多糖的酶消化它轉(zhuǎn)化成小分子。然后混合物進行如超濾法等的分子量分級分離。
如果可獲得特異地消化硫酸化巖藻半乳聚糖的酶，那么就可容易地進行硫酸化巖藻半乳聚糖的結(jié)構(gòu)分析和硫酸化巖藻半乳聚糖寡糖的生產(chǎn)。
如上所述，一直期望獲得硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶和酶法生產(chǎn)硫酸化巖藻半乳聚糖寡糖的方法。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的主要目的是提供(1)硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽，其可用作用于糖技術(shù)或肝細胞生長因子(HGF)產(chǎn)生的誘導物的一種試劑；(2)通過由硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽獲得的較小的分子；(3)可用于糖技術(shù)的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶；(4)通過由上述酶作用于硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽獲得的生產(chǎn)較小分子的方法；和(5)生產(chǎn)硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的方法。發(fā)明概述作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)包含在褐藻中的硫酸化巖藻半乳聚糖、消化硫酸化多糖的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶及其生產(chǎn)方法。而且，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)來自可被用作用于糖技術(shù)的試劑的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子及其生產(chǎn)方法，因此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的第一各方面涉及具有下面化學和物理性質(zhì)的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽。硫酸化巖藻半乳聚糖含有以1∶1至6∶1摩爾比的半乳糖和巖藻糖作為組成性糖并且含有通式(XI)的硫酸化糖作為組成性糖的基本成分 其中R是H或SO3H。
而且，通過本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶將硫酸化巖藻半乳聚糖轉(zhuǎn)化為較小的分子以產(chǎn)生至少一種選自通式(I)至(IV)的化合物 其中R是H或SO3H。
本發(fā)明的第二個方面涉及具有選自通式(II)、(III’)和(IV)的化學結(jié)構(gòu)的糖或其鹽 其中R是H或SO3H。
本發(fā)明的第三個方面涉及具有下面化學和物理性質(zhì)的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶此酶能做用于將含有以1∶1至6∶1摩爾比的半乳糖和巖藻糖作為組成性糖的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽來轉(zhuǎn)化硫酸化巖藻半乳聚糖成小分子并且在它的還原末端產(chǎn)生具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖；具有約7到9的最適pH和約25到45℃的最適溫度。
本發(fā)明的第四個方面涉及由硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽生產(chǎn)較小分子的方法，特征在于此方法包括由根據(jù)第三個方面的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于得自褐藻的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽并且獲得較小分子。使用酶獲得的較小分子的例子包括根據(jù)第二個方面的寡糖或其鹽。
本發(fā)明的第五個方面涉及生產(chǎn)第三方面的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的方法，特征在于此方法包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的黃桿菌屬細菌和收集來自培養(yǎng)物的該酶。
附圖簡述


圖1示本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶pH和相對活性(％)之間的關(guān)系。
圖2示本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶溫度和相對活性(％)之間的關(guān)系。
圖3闡明來自根據(jù)本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(A)的1H-NMR圖譜。
圖4示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(A)的13C-NMR圖譜。
圖5示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(A)的質(zhì)譜圖。
圖6示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(B)的1H-NMR圖譜。
圖7示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(B)的13C-NMR圖譜。
圖8示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(B)的質(zhì)譜圖。
圖9示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(C)的1H-NMR圖譜。
圖10示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(C)的13C-NMR圖譜。
圖11示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(C)的質(zhì)譜圖。
圖12示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(D)的1H-NMR圖譜。
圖13示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(D)的13C-NMR圖譜。
圖14示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(D)的質(zhì)譜圖。
圖15示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(E)的1H-NMR圖譜。
圖16示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(E)的13C-NMR圖譜。
圖17示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(E)的質(zhì)譜圖。
圖18示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(F)的1H-NMR圖譜。
圖19示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(F)的13C-NMR圖譜。
圖20示來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(F)的質(zhì)譜圖。
圖21示本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的1H-NMR圖譜。
圖22示本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的13C-NMR圖譜。
圖23示本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的的紅外吸收圖譜。
圖24示來自用0.4M氯化鈉洗脫的含有多糖的硫酸巖藻糖的較小分子部分的質(zhì)譜圖。
圖25示來自用0.4M氯化鈉洗脫的含有多糖的硫酸巖藻糖的較小分子部分的1H-NMR圖譜。
圖26示來自用0.4M氯化鈉洗脫的含有多糖的硫酸巖藻糖的較小分子部分的13C-NMR圖譜。
圖27示來自用0.6M氯化鈉洗脫的含有多糖的硫酸巖藻糖的較小分子部分的1H-NMR圖譜。
發(fā)明詳述下面將詳細地解釋本發(fā)明。
海藻(Seaweed)屬于含有多種含有多糖的硫酸化巖藻糖的褐藻。已經(jīng)報道了包括硫酸化巖藻聚糖和硫酸化fucoglucurnomannans的這樣的多糖的幾種分子類型。
本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖主要包含以1∶1至6∶1摩爾比的半乳糖和巖藻糖作為組成性糖的硫酸化巖藻半乳聚糖(在下文中稱作本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或G-巖藻多糖)。其例子包括含有以2∶1的摩爾比的半乳糖和巖藻糖的硫酸化巖藻半乳聚糖。硫酸化巖藻半乳聚糖是具有如用HPLC凝膠過濾確定的約為130,000(分子量分布約100,000至約200,000)平均分子量的硫酸化多糖。硫酸化巖藻半乳聚糖的分子量、糖組成和硫酸基團的含量依硫酸化巖藻半乳聚糖原料收獲的時間、用于干燥原料的方法和用于貯存原料的方法而變化。另外，它們依用于提取硫酸化巖藻半乳聚糖的加熱條件、pH等而變化。例如，硫酸化巖藻半乳聚糖可以被酸水解。因此，如這里所描述的硫酸化巖藻半乳聚糖的分子量、分子量分布、糖組成或硫酸基團含量只是例子并且依用于提取硫酸化巖藻半乳聚糖的條件可以輕易地改變。例如，當通過使用如這里所描述的含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖和含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖制備本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖時，可獲得具有如上所述的糖組成和分子量的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖。因此，可使用適當?shù)目蛇x擇的制備條件制備具有任何分子量、分子量分布、糖組成或硫酸基團含量的硫酸化巖藻半乳聚糖。例如，在本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的6個主要組成性糖中含有約5個硫酸基團殘基。通常，通過酯鍵連接到糖上的硫酸基團在化學上是不穩(wěn)定的并且容易用酸、堿或熱裂解。例如，通過在酸或堿的條件下加熱可減少硫酸基團的含量。相應(yīng)地，可將本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖有意識地脫硫酸。裂解硫酸基團的數(shù)量可通過選擇酸或堿的類型和/或濃度還有根據(jù)脫硫酸鹽作用的加熱的溫度和/或時間來控制。因此，本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖包括是具有如上所述的特征的硫酸化巖藻半乳聚糖的那些得自褐藻的全部和通過本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶轉(zhuǎn)化成小分子的硫酸化巖藻半乳聚糖。
本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖主鏈由下面的通式(XII)代表。本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖包括那些其中n是1或更大數(shù)字的整數(shù)的通式，例如1到1000，優(yōu)選地1到500。本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖包括具有通式(XII)是連續(xù)地重復的那些結(jié)構(gòu)和具有只要它們是在如上所述的定義之內(nèi)的不連續(xù)地包括被其他結(jié)構(gòu)插入的通式(XII)的那些結(jié)構(gòu)。 其中R是H或SO3H。
例如，可以由其制備本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的褐藻包括，但不只限于，Kjellmaniella crassifolia，裙帶菜(Undariapinnatifida)，海帶(Laminaria japonica)，雙環(huán)羽葉藻(Eiseniabicyclis)，Ecklonia cava，鵝掌菜(Ecklonia Kurome)，Lessonianigrescence，Giant kelp和durvillaea。沒有限制，例如得自Kjellmaniella crassifolia的巖藻多糖含有U-巖藻多糖和F-巖藻多糖也有本發(fā)明的G-巖藻多糖。
藥物可接受的鹽可以被用作本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的鹽。鹽的例子包括如鈉和鉀等堿金屬鹽、如鈣和鎂的堿土金屬鹽和如鋅的過渡金屬的鹽，也包括胺鹽。
如這里所使用的，來自硫酸化巖藻半乳聚糖的小分子指在它的還原末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖，其通過由本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖來獲得。
本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖來轉(zhuǎn)化硫酸化巖藻半乳聚糖成較小分子并且產(chǎn)生在它的還原末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖。如在WO97/26896中所述的內(nèi)型含有多糖消化酶的硫酸巖藻糖，其消化含有多糖-F的硫酸化巖藻糖，不消化本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖。另外，本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶是消化在本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖中的硫酸化D-半乳糖或半乳糖和硫酸化D-半乳糖或半乳糖之間的β1-6鍵和β1-4鍵的酶。
通過首先獲得含有包含來自褐藻的多糖的硫酸化巖藻糖的部分，然后從其中純化本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖可方便地生產(chǎn)作為本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的底物的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖。例如，為了生產(chǎn)含有包含多糖的硫酸化巖藻糖部分，首先從褐藻中獲得水溶性部分的提取物。在這種情況下，為了防止含有多糖的硫酸化巖藻糖轉(zhuǎn)化成較小分子，優(yōu)選地在pH4-9、100℃或低于100℃的溫度下進行提取。
用于從提取物中除去褐藻酸的方法包括利用通過在酸性條件下處理褐藻酸的等電點沉淀的方法、在其中加入鹽(例如，鈣鹽)與褐藻酸形成沉淀的方法、用褐藻酸降解酶消化褐藻酸的方法等。而且如氨基酸和甘露醇的小分子可以使用超濾有效地除去?；钚蕴刻幚砜捎行У挠糜谑杷镔|(zhì)的除去。
如上所述可獲得含有多糖的硫酸化巖藻糖的混合物。本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖可以通過如在WO97/26896中所描述的含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖作為內(nèi)型含有多糖消化酶的硫酸巖藻糖和如在WO97/26896中所描述的含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖作為內(nèi)型巖藻多糖消化酶來做用于含有多糖的硫酸化巖藻糖的混合物而從混合物中制備，然后使用超濾去除較小分子部分。
因此獲得的硫酸化巖藻半乳聚糖制品可能含有除硫酸化巖藻半乳聚糖之外的幾種含有多糖的硫酸化巖藻糖。在這種情況下，例如，通過使用陰離子交換樹脂的分離和純化可以分離本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖。這一過程的應(yīng)用使得要使用的樹脂的量少于用于含有多糖的硫酸化巖藻糖的混合物直接用陰離子交換樹脂進行分離的過程的量。而且，由于沒有污染上述兩種含有多糖的硫酸化巖藻糖而明顯地改善了分離。
當本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶得到純化時如上所述獲得的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖可用作確定活性的底物?？商娲兀捎米魃a(chǎn)本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖寡糖的原料。上述含有多糖的硫酸化巖藻糖混合物可用作生產(chǎn)硫酸化巖藻半乳聚糖寡糖的原料。
任何細菌菌株都可用于生產(chǎn)本發(fā)明的酶，只要它們產(chǎn)生轉(zhuǎn)化本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖成較小分子的酶。例如，可優(yōu)選地使用如在WO97/26896所描述的黃桿菌SA-0082(Flavobacterium sp.SA-0082)。該菌株于1995年3月29日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學和人體技術(shù)研究所，保藏于FERM P-14982(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號，郵編305-8566)，并于1996年1月15日轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號FERM BP-5402。根據(jù)包括革蘭氏染色、DNA的GC含量和主要的苯醌的細菌學性質(zhì)確定了這一菌種屬于黃桿菌屬。另一方面，由于近來在分類標準中經(jīng)?？紤]到16S rDNAs堿基序列，本發(fā)明人使用在因特網(wǎng)上可得到的生物技術(shù)信息國家中心(NCBI)的高級BLAST搜索進行了本細菌16S rDNA堿基序列的同源性搜索。
對基因序列與上述堿基序列高度同源的細菌的搜索顯示Polaribacter filamentus的基因在整個區(qū)域具有最高的同源性(在1424個堿基的區(qū)域有89％同源性)。沒有發(fā)現(xiàn)其它在整個區(qū)域具有高度同源序列的細菌。來自Polaribacter irgensii(在1360個堿基的區(qū)域有89％同源性)、噬纖維菌類(Cytophaga sp.)(在1249個堿基的區(qū)域有92％同源性)和海洋黃桿菌(Flexibacter maritimus)(在1247個堿基的區(qū)域有91％同源性)的序列顯示相對高的同源性。通常，如果在16S rDNAs堿基序列之間的同源性是90％或更少則不能確定細菌為相同屬。于是，如果使用這一遺傳分類，判定本細菌不屬于已知細菌的屬。因此，因為本細菌的大多數(shù)細菌學性質(zhì)與那些屬于噬纖維菌目(Cytophagales)的黃桿菌屬的細菌相匹配并且因為16S rDNAs堿基序列與本細菌的16S rDNAs堿基序列高度同源的全部的這四個細菌屬于噬纖維菌目，所以認為本細菌是屬于噬纖維菌目的一個新的細菌。如這里所使用的，黃桿菌屬細菌包括在細菌學上歸類于黃桿菌屬的細菌也包括依據(jù)序列同源性在遺傳學上歸類于噬纖維菌目的細菌。因此，生產(chǎn)本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的方法包括培養(yǎng)屬于噬纖維菌目的細菌來生產(chǎn)本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的方法。
在生產(chǎn)本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的方法中任何培養(yǎng)基都可用于細菌菌株，只要它們被用于生產(chǎn)本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的細菌菌株所代謝。例如，可利用硫酸化巖藻半乳聚糖、含有多糖的硫酸化巖藻糖混合物、海藻粉、海藻酸、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇、甘油、蔗糖、麥芽糖等作為碳源。優(yōu)選的使用蛋白胨、酵母提取物、肉浸膏等作為氮源。而且，本細菌在含有上述營養(yǎng)的海水或人造海水中生長良好。
生產(chǎn)量依用于培養(yǎng)本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的生產(chǎn)菌株的條件而變化。優(yōu)選的培養(yǎng)條件是15到30℃的培養(yǎng)溫度和6到9的培養(yǎng)基的pH。通氣攪拌培養(yǎng)5到72小時候獲得本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的最大產(chǎn)量。自然地，確定培養(yǎng)條件以使本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的產(chǎn)量變成最大程度地依賴所用的細菌菌種、培養(yǎng)基組成等。在細胞和培養(yǎng)基上清中都存在硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶。
通過在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)黃桿菌SA-0082、收集細胞、和通過例如超聲處理的細胞裂解的常規(guī)的方法裂解細胞獲得無細胞提取物。然后可以從提取物中通過常規(guī)的純化方法獲得純化的酶制劑。通過使用例如，鹽析、離子交換柱層析、疏水鍵柱層析、凝膠過濾等的純化可獲得基本上不含其他含有多糖消化酶的硫酸化巖藻糖的純化的形式的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶。而且，可以使用類似于細胞內(nèi)酶純化的純化過程從也含有大量酶的和從培養(yǎng)物中除去細胞而得到的培養(yǎng)上清液中來純化本發(fā)明的酶。
本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的化學和物理性質(zhì)如下(I)作用于含有以1∶1到6∶1的摩爾比的半乳糖和巖藻糖作為組成性糖的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽以轉(zhuǎn)化硫酸化巖藻半乳聚糖成為較小分子并且產(chǎn)生在其還原性末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖；(II)具有約7到9的最適pH(
圖1，闡明本發(fā)明的酶的反應(yīng)pH和相對活性之間關(guān)系的圖形，其中縱軸代表相對活性(％)，橫軸代表pH)；和(III)具有約25到45℃的最佳溫度(圖2，闡明本發(fā)明的酶的反應(yīng)溫度和相對活性之間關(guān)系的圖形，其中縱軸代表相對活性(％)橫軸代表溫度(℃))。
例如，通過分析由酶作用于硫酸化巖藻半乳聚糖獲得的消化產(chǎn)物、使用HPLC和確定轉(zhuǎn)化成小分子的程度可確定本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的活性?？商娲?，通過根據(jù)常規(guī)的方法通過測量還原末端的產(chǎn)生可確定活性。即可使用來自生產(chǎn)菌株的細胞提取物也可用色譜純化后獲得的酶溶液確定活性。
可通過由本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶去作用于本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或含有硫酸化巖藻半乳聚糖的原料來制備來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽的較小分子。例如，來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的部分純化產(chǎn)物、來自褐藻的含有多糖的硫酸化巖藻糖的部分、通過用水溶劑提取褐藻得到的產(chǎn)物、或褐藻本身可被優(yōu)選地用作含有本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的原料。
根據(jù)傳統(tǒng)方法可以溶解本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或含有硫酸化巖藻半乳聚糖的原料?？梢宰畲鬂舛仍谌芤褐腥芙獗景l(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或含有硫酸化巖藻半乳聚糖的原料。但是，通常選擇的濃度考慮到它的可操作性和酶的滴度。可依據(jù)目的從水、緩沖液等中選擇本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的溶劑。通常，溶液的pH近中性。酶反應(yīng)通常是在約30℃進行。可通過調(diào)節(jié)酶量反應(yīng)時間等來控制較小分子的分子量。通過將較小分子進行分子量分級分離可制備具有更均一分子量分布的來自本發(fā)明硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子。可應(yīng)用如凝膠過濾和分子量分級分離膜的分子量分級分離的常規(guī)的方式?？蛇x擇地，較小分子可使用離子交換樹脂處理、活性炭處理來進一步純化，或者它們可以被脫鹽、滅菌或凍干。
沒有限制，例如，來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子包括通過由本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖獲得的二糖至六糖。在本發(fā)明的較小分子中用硫酸基團取代的位置依賴于制備方法。通過本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的作用獲得的所有的較小的分子都包括在本發(fā)明的較小分子中。例如，較小分子的化學結(jié)構(gòu)由下面的通式(I)至(IV)表示。在這些中，認為通式(III)是硫酸化巖藻半乳聚糖組成性單位。
其中R是H或SO3H。
本發(fā)明的較小分子在分子內(nèi)具有硫酸基團，這一基團與多種堿反應(yīng)形成鹽。來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子當其是以鹽的形式的時候是穩(wěn)定的。其通常以鈉和/或鉀和/或鈣鹽的形式提供。游離形式的來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子可通過應(yīng)用如Dowex 50W(Dow Chemical)陽離子交換樹脂從其鹽中獲得。任選地，可進一步進行常規(guī)的鹽交換以轉(zhuǎn)化其為想要的多種鹽的任何一種。
藥學上可接受的鹽可被用作來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子的鹽。鹽的例子包括如鈉和鉀等堿金屬鹽、如鈣和鎂的堿土金屬鹽和如鋅的過渡金屬在內(nèi)的鹽，也包括胺鹽。
只有包含在任何含有包含多糖的硫酸化巖藻糖的部分中的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖可通過使用本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶轉(zhuǎn)化成較小分子。因此，本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖可通過使用酶結(jié)合分子量分級分離選擇性地除去。例如，已報道含有硫酸化巖藻聚糖的部分具有如抗凝活性、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性和抑制病毒感染活性的多種生物學活性。按照常規(guī)方法從褐藻中獲得的含有硫酸化巖藻聚糖的部分含有硫酸化巖藻聚糖和其它多糖。通過應(yīng)用本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶可從含有硫酸化巖藻聚糖的部分中除去硫酸化巖藻半乳聚糖。結(jié)果，可獲得高純的硫酸化巖藻聚糖。
而且，已報道了例如，硫酸化fucoglucuronmannans具有抗腫瘤細胞的誘導凋亡的活性。在從褐藻中獲得的硫酸化fucoglucuronmannans中污染的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖可通過應(yīng)用本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶輕易地除去。結(jié)果，可方便的獲得高純度的硫酸化fucoglucuronmannans。
例如，為了除去本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖在水溶劑中制備含有本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖原料的溶液。按照常規(guī)方法可以溶解含有本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的原料?？梢宰畲鬂舛仍谌芤褐腥芙夂斜景l(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的原料。但是，通常選擇的濃度考慮到它的可操作性和酶的滴度。可依據(jù)目的從水、緩沖液等中選擇本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的溶劑。通常，溶液優(yōu)選的pH近中性。然后加入本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶或已經(jīng)固定在底物上的酶、或兩者都加入并且與含有本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖原料的溶液反應(yīng)以轉(zhuǎn)化本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖成為較小分子。酶反應(yīng)通常在約30℃進行。依據(jù)在后來的步驟中分子量分級分離的能力可以適當?shù)卣{(diào)整酶量、反應(yīng)時間等?？赏ㄟ^將結(jié)果混合物進行分子量分級分離來制備已經(jīng)輕易地去除了來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子的目的產(chǎn)品?？蓱?yīng)用如凝膠過濾和利用分子量分級分離膜的超濾的分子量分級分離的常規(guī)方式。
本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖。因此，它可用于本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的結(jié)構(gòu)分析。例如，通過使用本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖獲得了具有上面通式(I)至(IV)化學結(jié)構(gòu)的較小分子。
可通過由本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶選擇性地從含有本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的含有多糖的硫酸化巖藻糖中除去本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖。例如，可優(yōu)選地將已經(jīng)除去了本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖成分的高純的硫酸化巖藻聚糖或硫酸化fucoglucuronomannans用作藥品原料。
本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶可與如在WO97/26896所描述的含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖和/或如在WO97/26896所描述的含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖結(jié)合使用。沒有限制，例如，當用上述的含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖和本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶處理通過在pH4到9在100℃或低于100℃條件下的Kjellmaniella crassifolia的提取獲得的含有多糖的硫酸化巖藻糖的混合物時，可獲得含有下面通式(XVI)以重復的方式的作為組成性糖的基本成分的硫酸化糖的硫酸化多糖。獲得了其中n是1或更大數(shù)字的整數(shù)，例如1至10,000，優(yōu)選地1到5,000的下面通式的硫酸化糖。 其中R是H或OSO3H。
上述硫酸化多糖含有巖藻糖作為組成性糖。例如，在pH6到8在95℃提取2個小時產(chǎn)生約200,000的平均分子量(分子量分布約10,000至約1,000,000)。而且，例如，在pH6到8在25℃提取24個小時產(chǎn)生約13,000,000的平均分子量(分子量分布約100,000至約20,000,000)。平均分子量和分子量分布依賴上述的提取條件而變化。但是，通過含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖將結(jié)果硫酸化多糖轉(zhuǎn)化成較小分子與所用的提取條件無關(guān)。硫酸化多糖的分子量和硫酸基團的含量依賴于硫酸化多糖原料收獲的時間、用于干燥原料的方法和用于貯存原料的方法而變化。另外，它們依賴于用于提取的加熱條件、pH等而變化。例如，用酸可以水解硫酸化多糖。因此，如這里所述的硫酸化多糖分子量、分子量分布或硫酸基團的含量只是些例子并且依據(jù)提取硫酸化多糖的條件可以輕易地改變。因此，使用適當?shù)乜蛇x擇的制備條件可制備具有任何分子量、分子量分布或硫酸基團含量的硫酸化多糖。例如，在硫酸化多糖的7個主要的組成性糖中含有約12個硫酸基團。通常，通過酯鍵連接到糖上的硫酸基團在化學上是不穩(wěn)定的并且容易用酸、堿或加熱裂解。例如，通過在酸或堿的條件下加熱減少了硫酸基團的含量。相應(yīng)地，可將硫酸化多糖可有意地脫硫酸鹽。通過選擇酸或堿的類型和/或濃度還有脫硫酸鹽作用時加熱的溫度和/或時間可控制裂解的硫酸基團的量。
而且，通過聯(lián)合使用硫酸化巖藻半乳聚糖、含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖和含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖可獲得新的硫酸化糖。另外，通過上述三種消化酶的聯(lián)合使用可將硫酸化糖以不同于常規(guī)的方式分類。沒有限制，例如，當由酶作用于得自如Kjellmaniella crassifolia的褐藻的含有多糖的硫酸化巖藻糖時可獲得下面的部分(1)不能用含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖消化酶或含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖消化但是能用硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶(本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶)消化的硫酸化糖的部分；(2)不能用硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶或含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖消化但是能用含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖消化的硫酸化糖的部分；(3)不能用硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶或含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖消化但是能用含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖消化的硫酸化糖的部分；和(4)不能用硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶、含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖或含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖消化的硫酸化糖的部分。不聯(lián)合使用含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖或含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖和本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶將不能獲得硫酸化糖的這些部分。
本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽具有誘導生長因子產(chǎn)生的活性，尤其是誘導肝細胞生長因子(HGF)產(chǎn)生的活性。
在進行部分肝切除術(shù)后肝迅速地再生至原始大小。知道肝再生涉及的必須的因子已很長時間了。然后，在來自患有爆發(fā)型肝炎的患者的血漿中發(fā)現(xiàn)了HGF并且從那里分離和純化(臨床調(diào)查雜志(J.Clin.Invest.)，88414-419，1988)。而且，克隆了人HGF的cDNA，并且揭示了HGF的一級結(jié)構(gòu)(生物化學生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，163967-973，1989)。而且，證明了激活細胞運動性的分散因子和腫瘤細胞毒素因子(TCF)與HGF是相同的物質(zhì)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 887001-7005；生物化學生物物理學研究通訊，1801151-1158，1991)。
HGF促進多種類型的包括除肝細胞外的膽管上皮細胞、腎小管上皮細胞和胃粘膜細胞的上皮細胞的生長。而且，HGF是一種多功能的活性物質(zhì)，其顯示了包括上皮細胞運動性激活還有如上皮細胞血管形成和腔形成的形態(tài)發(fā)生的誘導的種種廣泛的生理學活性。換句話說，在用于損傷器官修復的上皮細胞生長促進和運動性激活、如在多種器官中血管形成等的形態(tài)發(fā)生誘導中涉及到HGF。HGF也顯示了增殖肝細胞的活性、促進蛋白質(zhì)合成的活性、改善膽汁郁積的活性、防止由于藥物的腎損傷的活性等。以這些事實為依據(jù)，期望HGF被用作用于嚴重的肝炎、肝硬化和在肝中的膽汁郁積的治療劑。
HGF的mRNA在腦、腎、肺等中合成。HGF顯示了對肝細胞、腎小管細胞、上皮細胞等的生長活性。因此，HGF是中胚層細胞生長因子。于是，誘導肝細胞生長因子產(chǎn)生的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽可用作治療或防止肝炎、嚴重肝炎、肝硬化、在肝中的膽汁郁積、慢性腎炎、肺炎和創(chuàng)傷的組合物的成分。
依據(jù)它的誘導HGF產(chǎn)生的活性可使用本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽作為化妝品組合物的活性成分。例如，它作為誘導HGF產(chǎn)生的化妝品組合物是有用途的。因此，可提供具有誘導HGF產(chǎn)生活性的生物學化妝品組合物。
根據(jù)常規(guī)的方法可將含有本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽的用于誘導生長因子產(chǎn)生的化妝品組合物(例如，誘導HGF產(chǎn)生的化妝品組合物)配制成，例如，洗液、乳狀洗液、乳膏、填塞物、沐浴劑、面部清潔劑、沐浴清潔劑、洗發(fā)劑、生發(fā)油和香波。
本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖、來自硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽的較小分子可被用作抗原。根據(jù)常規(guī)的方法生產(chǎn)抗體。例如，多克隆抗體可通過用本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖、來自硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽的較小分子和佐劑一起免疫如兔的動物制備。而且，單克隆抗體可通過融合黑素瘤細胞和用抗原免疫獲得的產(chǎn)生抗體的B細胞、挑選產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤和培養(yǎng)細胞制備。這一抗體可用于純化本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖、來自硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽的較小分子。同樣地，此抗體可用于鑒定在海藻中的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖。例如，使用識別本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的抗體可輕易地確定在海藻提取物中的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的含量。因此，可有效地制備具有高含量的提取物。而且，識別本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖、來自硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽的較小分子的抗體對于本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖、來自硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽的較小分子的抑制受精的作用方式、抑制病毒感染的作用方式、在體內(nèi)新陳代謝等的分析是有用途的。
此外，通過由本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽獲得的較小分子、或寡糖可被用作糖技術(shù)試劑。例如，通過使較小分子進行如在JP-B5-65108中描述的吡啶基-(2)-氨化作用以制備較小分子的吡啶基-(2)-氨化產(chǎn)物可用作糖技術(shù)試劑的物質(zhì)是非常有用途的。
實施例下面的實施例進一步詳細地闡明了本發(fā)明，但不能解釋為限制其范圍。
實施例1硫酸化巖藻半乳聚糖的制備(1)按下面方法制備硫酸化巖藻半乳聚糖。
使用配有具有1mm直徑孔的篩網(wǎng)的碾磨剪切機(Masuko Sangyo)將2kg的干燥的Kjellmaniella crassifolia破碎、在20L的80％的乙醇中在25℃攪拌3小時、過濾并洗滌。結(jié)果殘渣懸浮于20L的含有50mM氯化鈣、100mM氯化鈉、10％乙醇和1U含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖的30mM的咪唑緩沖液(pH8.2)中。含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖從如在WO97/26896中所描述的交替單孢菌sp.SN-1009(Alteromonas sp.SN-1009)(保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學和人體技術(shù)研究所，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號，郵編305-8566，保藏號FERM P-15436，保藏日期1996年2月13日，并于1996年11月15日轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號FERM BP-5747)的培養(yǎng)物中獲得。懸浮液在25℃攪拌2天后完全失去了由于具有高分子量的含有多糖的硫酸化巖藻糖的高粘度和彈性。通過具有32μm直徑孔的不銹鋼篩網(wǎng)過濾懸液以從含有多糖的硫酸化巖藻糖中除去較小的分子、然后洗滌。結(jié)果殘渣懸浮于40L的含有100mM氯化鈉、10％乙醇和4g褐藻酸鹽裂解酶(Nagase Biochemicals)的磷酸鈉緩沖液(pH6.6)中。懸液在25℃攪拌4天，然后離心以獲得上清液。使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維以從在上清液的褐藻酸中除去較小分子的超濾裝置將上清液濃縮至2L。將濃縮的溶劑交換成含有10％乙醇的100mM氯化鈉。將等體積的400mM醋酸鈉加入至溶液中。攪拌后，將混合物離心。當在冰上冷卻后將1N的鹽酸加入至結(jié)果上清液中以調(diào)節(jié)pH至2。通過離心除去形成的沉淀。將1N的氫氧化鈉加入至結(jié)果上清液中以調(diào)節(jié)pH至8。通過超濾將溶液濃縮至1L并且將溶劑交換成100mM氯化鈉。通過離心除去形成的沉淀。為了除去在結(jié)果上清液中的疏水物質(zhì)進行了下面的過程。將氯化鈉以1M的濃度加入到上清液中。將混合物上樣至用1M氯化鈉平衡的3-L苯基-Cellulofine(SeikagakuCorporation)上并且收集流過的部分。此部分使用超濾裝置濃縮、將溶劑交換成20mM氯化鈉并且凍干。凍干產(chǎn)品的重量是29.3g。
(2)將15g凍干產(chǎn)品溶于1.5L含有400mM氯化鈉和9U的含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖的50mM Tris-鹽酸緩沖液中。含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖從如在WO97/26896中所描述的黃桿菌sp.SA-0082(Flavobacterium sp.SA-0082)(保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學和人體技術(shù)研究所，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號，郵編305-8566，保藏日期1995年3月29日，保藏號FERM P-14872，并于1996年2月15日轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏號FERM BP-5402)的培養(yǎng)物中獲得。將溶液在25℃反應(yīng)6天然后使用蒸發(fā)器濃縮自約300ml。將濃縮液置于具有3500排阻分子量的透析管中并且充分地透析以除去來自硫酸化fucoglucuronomannans的較小分子。將留在透析管中的溶液上樣于用50mM氯化鈉平衡的4-L DEAE-Cellulofine A-800(Chisso corporation)。用50mM氯化鈉充分洗滌后，用50到650mM氯化鈉的梯度進行洗脫。用650mM氯化鈉進一步地從柱上進行充分的洗脫。收集用650mM氯化鈉洗脫的部分作為硫酸化巖藻半乳聚糖部分，使用具有100,000排阻分子量的超濾裝置濃縮、將溶劑交換成10mM氯化鈉和凍干以獲得0.85g的硫酸化巖藻半乳聚糖部分的凍干產(chǎn)品。分析此部分的糖組合物。如在生物化學雜志(Journal of Biological Chemistry)，175595(1948)中所描述的確定巖藻糖的量。
將硫酸化巖藻半乳聚糖的干燥的產(chǎn)品以0.5％的濃度溶于1N的鹽酸中。溶液在110℃處理2小時以水解成組成性單糖。使用GlycoTAG(Takara Shuzo)和GlycoTAG試劑盒(Takara Shuzo)將由水解作用產(chǎn)生的單糖的還原末端進行吡啶基-(2)-氨化作用以使用HPLC確定組成性糖的比率。HPLC按下面條件進行。
儀器L-6200(Hitachi)；柱Palpak A型(4.6mm×150mm；Takara Shuzo)；洗脫液700mM硼酸鹽緩沖液(pH9.0)∶乙腈＝9∶1；檢測使用熒光檢測器F-1150(Hitachi)在310nm的激發(fā)波長和在380nm的發(fā)射波長；流速0.3ml/分鐘；和柱溫65℃。
如在分析化學，4330(1962)中所描述的那樣確定糖醛酸的量。而且，如在生物或?qū)W雜志，84106(1962)中所描述的那樣確定硫酸鹽的含量。
結(jié)果，硫酸化巖藻半乳聚糖含有以約2∶1的摩爾比作為組成性糖的半乳糖和巖藻糖。在其中基本上不含糖醛酸或其它的中性糖。巖藻糖和硫酸基團的的摩爾比約為1∶2。
(3)測量硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶活性的方法使用在(2)中獲得的硫酸化巖藻半乳聚糖部分測量本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的活性按如下方法。
扼要地，將60μl 50mM鹽酸咪唑緩沖液(pH7.5)、4.8μl 2.5％的硫酸化巖藻半乳聚糖部分的溶液、6μl 4M的氯化鈉、37.2μl水和12μl本發(fā)明的第一個方面的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶混合在一起。在37℃反應(yīng)3小時后，將反應(yīng)混合物在100℃處理10分鐘。離心后，使用HPLC分析100μl的上清液以確定轉(zhuǎn)化成較小分子的程度。作為對照，制備在相似的條件下通過用溶解本發(fā)明的第一個方面的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的緩沖液替代酶和用水替代硫酸化巖藻半乳聚糖部分的反應(yīng)獲得的反應(yīng)混合物、并且使用HPLC進行相似的分析。
酶的1個單位定義為在上述反應(yīng)系統(tǒng)中在1分鐘內(nèi)在1μmol的硫酸化巖藻半乳聚糖部分中裂解半乳糖鍵的酶的量。按照下面的公式計算裂解半乳糖鍵的量。
{(4.8×1000×2.5/100)MG}×{(MG/M)-1}×{1/(180×0.012)}＝U/ml4.8×1000×2.5/100加入到反應(yīng)系統(tǒng)中的硫酸化巖藻半乳聚糖(μg)；MG在作為底物的部分中硫酸化巖+藻半乳聚糖的平均分子量；M反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量；MG/M)-1在1摩爾的硫酸化巖藻半乳聚糖中被酶裂解的鍵的數(shù)目；180反應(yīng)時間(分鐘)；和0.012酶溶液的體積(ml)。
HPLC按下面條件進行。
儀器L-6200(Hitachi)；柱OHpak SB-806HQ(8×300mm；Showa Denko)；洗脫液含有5mM疊氮化鈉的50mM氯化鈉；檢測示差折射率檢測器(Shodex RI-71，Showa Denko)；流速1ml/分鐘；和柱溫25℃。
為了確定反應(yīng)產(chǎn)物的平均分子量進行了下面的過程。在如上述的HPLC分析一樣的相同的條件下分析市場上買得到的分子量已知的普魯蘭(Pullulan)(標準P-82，Showa Denko)。將普魯蘭的分子量和保留時間之間的關(guān)系表達成曲線，用其作為確定酶反應(yīng)產(chǎn)物分子量的標準曲線。
通過測量酶溶液在280nm的吸收確定蛋白質(zhì)的量。規(guī)定含有1mg/ml濃度的蛋白質(zhì)溶液的吸收為1進行計算。
實施例2硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用方式的確定(1)硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的制備為硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的生產(chǎn)，將黃桿菌sp.(FERM BP-5402)接種至已在120℃滅菌20分鐘的包括含有0.1％葡萄糖、1.0％蛋白胨和0.05％酵母提取物(pH7.5)的人造海水(JamarineLaboratory)的600ml培養(yǎng)基中，并且在24℃培養(yǎng)23小時以制備種子培養(yǎng)物。將包括含有0.2％如在下面的實施例3(1)中所描述的從Kjellmaniella crassifolia中制備的含有多糖的硫酸化巖藻糖部分、2.0％蛋白胨、0.01％酵母提取物和0.01％消沫劑(KM70，Shin-EtsuChemical)(pH7.5)的人造海水的20L的培養(yǎng)基置于30L的小型發(fā)酵罐中并且在120℃滅菌20分鐘。冷卻后，將600ml的種子培養(yǎng)物接種至培養(yǎng)基中并以每分鐘10L的通氣量和125轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌在24℃培養(yǎng)23小時。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物離心以收集細胞。
將細胞懸于含有0.4M氯化鈉的1,200ml的10mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中、超聲處理并離心以獲得細胞提取物。將細胞提取物用相同的緩沖液充分透析并離心以獲得上清液。以90％飽和度的終濃度加入硫酸銨至上清液中。將通過離心收集的沉淀溶于150ml的含有50mM氯化鈉的10mM的tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中并用相同的緩沖液充分透析。將通過離心獲得的上清液上樣至用相同的緩沖液平衡的500-ml DEAE-瓊脂糖FF柱(Amersham Pharmacia)。用相同的緩沖液洗滌后，接著用50mM至600mM的氯化鈉的梯度進行洗脫以收集活性部分。
活性部分用含有0.1M氯化鈉的10mM的tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)充分透析、上樣至用相同的緩沖液平衡的100-ml DEAE Cellulofine柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用0.1M至0.4M的氯化鈉的梯度進行洗脫以收集活性部分。以4M的濃度將氯化鈉加入到活性部分中。將此部分上樣至用含有4M氯化鈉的10mM的tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)平衡的20-ml苯基-Cellulofine柱(Chissocorporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用4M至1M的氯化鈉的梯度進行洗脫。用含有1M氯化鈉的10mM的tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)進一步進行充分的洗脫以收集活性部分。以3M的濃度將氯化鈉加入到活性部分中。將此部分上樣至用含有3M氯化鈉的10mM的tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)平衡的10-ml苯基-Cellulofine柱(Chissocorporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用3M至0.5M的氯化鈉的梯度進行洗脫。用含有0.5M氯化鈉的10mM的tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)進一步進行充分的洗脫以收集活性部分。如此獲得的純化的酶被用作硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶。
(2)來自硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子的制備通過由純化的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于如在實施例1(2)中描述的硫酸化巖藻半乳聚糖制備較小分子。扼要地，將1.94g硫酸化巖藻半乳聚糖部分溶于含有0.2M氯化鈉的25mM的tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中。將如在實施例2(1)中描述的186mU的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶加入其中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)6天。使用蒸發(fā)器將反應(yīng)混合物濃縮自80ml并使用Cellulofine GCL-1000柱(ChissoCorporation)(4×90cm)進行分子量分級分離。將相當于15,000或更少的分子量的部分收集以獲得來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化的部分。
將來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化的部分的一份使用GlycoTAG(TakaraShuzo)和GlycoTAG試劑盒(TakaraShuzo)進行還原末端吡啶基-(2)-氨化作用。結(jié)果吡啶基-(2)-氨化糖通過在2N的鹽酸中在100℃處理它們3小時得到水解。使用HPLC檢查在還原末端的糖。HPLC按下面條件進行。
儀器L-6200(Hitachi)；柱Palpak A型(4.6×150mm；Takara Shuzo)；洗脫液0.7M硼酸鹽緩沖液(pH9.0)∶乙腈＝9∶1；檢測使用熒光檢測器(F-1150 Hitachi)在310nm的激發(fā)波長和在380nm的發(fā)射波長；流速0.3ml/分鐘；和柱溫65℃。
結(jié)果，只檢測到半乳糖。因此，表明在來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化部分中在還原末端的所有的糖都是硫酸化半乳糖或半乳糖。
而且，為了分析在來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化部分中的中性糖組成將在還原末端已經(jīng)進行過糖分析的樣品的一份再一次進行吡啶基-(2)-氨化作用并使用如上所述的HPLC分析。結(jié)果，表明來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化部分包括約以2∶1摩爾比的半乳糖和巖藻糖。上述結(jié)果表明本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶是內(nèi)型半乳糖苷酶，其裂解在硫酸化巖藻半乳聚糖中的半乳糖鍵以產(chǎn)生在其還原末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖。
實施例3(1)從Kjellmaniella crassifolia制備含有多糖的硫酸化巖藻糖部分。扼要地，使用配有具有1mm直徑孔的篩網(wǎng)的碾磨剪切機(Masuko Sangyo)將2kg市場上買得到的的干燥的Kjellmaniellacrassifolia破碎并懸于20L的80％的乙醇中。懸液在25℃攪拌3小時并通過濾紙過濾。將結(jié)果殘渣懸浮于40L的含有100mM氯化鈉的30mM的磷酸鈉緩沖液中(pH6.5)。懸液在95℃處理2小時并通過具有106μm直徑孔的不銹鋼篩網(wǎng)過濾。將200g活性炭、4.5L的乙醇和12,000U的藻酸鹽裂解酶(Nagase Biochemicals)加入到濾液中?；旌衔镌?5℃攪拌20小時，然后離心。使用使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置將結(jié)果上清液濃縮至4L，離心以除去不溶物并使在5℃保持24小時。通過離心除去沉淀。使用超濾裝置將結(jié)果上清液的溶劑交換成100mM的氯化鈉。將溶液冷卻至4℃或更低，并且用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0。通過離心除去形成的沉淀。用氫氧化鈉將結(jié)果上清液的pH調(diào)節(jié)至8.0。將上清液濃縮至4L。使用超濾裝置將溶劑交換成20mM的氯化鈉。通過離心除去溶液中得不溶物。將82ml 50％的乙醇加入到溶液中。將混合物凍干獲得76g的來自Kjellmaniella crassifolia的含有多糖的硫酸化巖藻糖部分的干燥產(chǎn)品。
(2)將黃桿菌sp.SA-0082(FERM BP-5402)接種至已在120℃滅菌20分鐘的在500-ml的錐形瓶中的包括含有0.2％如在實施例3(1)中所描述的來自Kjellmaniella crassifolia含有多糖的硫酸化巖藻糖部分、1.0％蛋白胨和0.01％酵母提取物(pH7.5)的人造海水的100ml的培養(yǎng)基中，并在24℃振蕩培養(yǎng)23小時。培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物離心以獲得細胞和培養(yǎng)物上清液。
將細胞懸于5ml的含有0.4M氯化鈉的10mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)中、超聲處理并離心以獲得細胞提取物。
在培養(yǎng)物上清液和細胞提取物中檢測到的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的活性分別為2mU/ml培養(yǎng)基和2mU/ml培養(yǎng)基。表明在上述條件下在培養(yǎng)的黃桿菌屬的細菌的細胞的內(nèi)部和外部獲得了幾乎等量的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶。
實施例4將在實施例3(1)中獲得的7g含有多糖的硫酸化巖藻糖部分溶于700ml的含有50mM氯化鈉和10％乙醇的20mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8.0)中。將溶液上樣至用相同的緩沖液平衡的5-L DEAE Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用50至1550mM的氯化鈉的梯度進行洗脫。收集在550至1550mM的鹽濃度洗脫的含有多糖的硫酸化巖藻糖部分。
此部分含有被硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶轉(zhuǎn)化成較小分子的組分，即，在約10％濃度的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖。使用配有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置將此部分脫鹽。將溶劑交換為含有200mM氯化鈉的20mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8.0)。將600mU的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶加入其中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)3天并進行超濾。超濾一直進行到在濾液中含有的糖的量如按照苯酚-硫酸法測量檢測不到為止。被本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶轉(zhuǎn)化成較小分子的組分，即本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖可以從含有多糖的硫酸化巖藻糖部分中通過這些步驟除去。
實施例5(1)來自硫酸化巖藻半乳聚糖(i)的酶消化物的制備將70g在實施例3中獲得的來自Kjellmaniella crassifolia的含有多糖的硫酸化巖藻糖部分溶于含有300mM氯化鈉、20mM氯化鈣和10％乙醇的20mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH7.5)中并使用配有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去可以被超濾的物質(zhì)。使用與上面用于溶解的相同的緩沖液用于超濾。
將5U的從如在WO97/26896中所描述的交替單孢菌sp.SN-1009(FERM BP-5747)的培養(yǎng)物中獲得的含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖加入到在超濾后保留的溶液中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)3天。反應(yīng)混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去由含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖轉(zhuǎn)化成較小分子的物質(zhì)，即，來自巖藻多糖的較小分子。使用與上面用于反應(yīng)混合物的相同的緩沖液用于超濾。
將20U的從如在WO97/26896中所描述的黃桿菌sp.SA-0082(FERMBP-5402)的培養(yǎng)物中獲得的含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖加入到在超濾后保留的溶液中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)5天。反應(yīng)混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去由含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖轉(zhuǎn)化成較小分子的物質(zhì)，即，來自硫酸化fucoglucuronomannan的較小分子。水被用于超濾，最終將其交換為含有200mM氯化鈉的tris-鹽酸緩沖液(pH8)。
將2U的如在實施例2(1)中所描述的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶加入到在超濾后保留的溶液中。混合物在25℃反應(yīng)5天。將反應(yīng)混合物分成兩等份。一份使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底超濾由硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶轉(zhuǎn)化成較小分子的物質(zhì)，即，來自硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子。超濾使用含有50mM氯化鈉的10mM的tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)。由此獲得的濾液被命名為來自硫酸化巖藻半乳聚糖(i)的酶消化物。
(2)來自硫酸化巖藻半乳聚糖(ii)的酶消化物的制備將550mU的如在實施例2(1)中所描述的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶加入到在實施例5(1)中均分的混合物的剩余部分中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)7天并確定較小分子的轉(zhuǎn)化。反應(yīng)混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底超濾來自硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子。超濾使用含有50mM氯化鈉的10mM的tris-鹽酸緩沖液(pH8.0)。由此獲得的濾液被命名為來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化物(ii)。
(3)來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化物(i)的分離和純化。
使用蒸發(fā)器將在實施例5(1)中獲得的來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化物(i)濃縮至500ml、使用電透析裝置脫鹽并上樣至用含有10mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8)平衡的1-L DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。在用相同的緩沖液洗滌后，用10mM到900mM的氯化鈉梯度進行洗脫。每部分收集62ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。用約130mM氯化鈉和約220mM氯化鈉洗脫的部分構(gòu)成含有糖的峰。分別收集這些部分并命名為130mM-洗脫部分(i)和220mM-洗脫部分(i)。
使用電透析裝置將130mM-洗脫部分(i)脫鹽。以50mM的濃度將氯化鈉溶于此部分中。將溶液上樣至用含有50mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用50至200mM的氯化鈉的梯度進行洗脫。每部分收集10ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。用約55mM氯化鈉至約75mM氯化鈉洗脫的部分構(gòu)成含有糖的峰。收集用約60mM氯化鈉洗脫的部分、用SpeedVac(SAVANT Instruments Inc.)濃縮至2ml、上樣至用10％乙醇平衡的200-ml Cellulofine GCL-25柱(Chisso corporation)、并用相同的緩沖液洗脫。每部分收集2ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。收集構(gòu)成含有糖的峰的部分并命名為(A)。
另一方面，使用電透析裝置將220mM-洗脫部分(i)脫鹽。以100mM的濃度將氯化鈉溶于此部分中。將溶液上樣至用含有100mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8)平衡的100-ml DEAE-CellulofineA-800柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用100至350mM的氯化鈉的梯度進行洗脫。每部分收集10ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。收集用約160mM氯化鈉洗脫的部分、用SpeedVac(SAVANT Instruments Inc.)濃縮至2ml、上樣至用10％乙醇平衡的200-ml Cellulofine GCL-25柱(Chissocorporation)、并用相同的緩沖液洗脫。每部分收集2ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。收集構(gòu)成含有糖的峰的部分并命名為(B)。
(4)來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化物(ii)的分離和純化使用蒸發(fā)器將如在實施例5(2)中描述的來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化物(ii)濃縮至500ml、使用電透析裝置脫鹽并上樣至用含有10mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8)平衡的1-L DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。在用相同的緩沖液洗滌后，用10mM到900mM的氯化鈉梯度進行洗脫。每部分收集61ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。用約130mM氯化鈉、約220mM氯化鈉和約270mM氯化鈉洗脫的部分構(gòu)成含有糖的峰。分別收集這些部分并命名為130mM-洗脫部分(ii)、220mM-洗脫部分(ii)和270mM-洗脫部分(ii)使用電透析裝置將130mM-洗脫部分(ii)脫鹽。以20mM的濃度將氯化鈉溶于此部分中。將溶液上樣至用含有20mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8)平衡的200-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用20至150mM的氯化鈉的梯度進行洗脫。每部分收集13ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。將用約50mM至約70mM氯化鈉洗脫的部分收集、用蒸發(fā)器濃縮至30ml、上樣至用10％乙醇平衡的1,200-mlCellulofine GCL-25柱(Chisso corporation)、并用相同的緩沖液洗脫。每部分收集10ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。收集構(gòu)成含有糖的峰的部分。以10mM的濃度將醋酸加入此部分中。用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.5。將氯化鈉加入其中以使電導率與含有20mM氯化鈉的10mM的醋酸鹽緩沖液(pH3.5)相同。將溶液上樣至用含有20mM氯化鈉的10mM的醋酸鹽緩沖液(pH3.5)平衡的30ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用20至120mM的氯化鈉的梯度進行洗脫。每部分收集3ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。將用約65mM至約80mM氯化鈉洗脫的部分收集、并用水稀釋以使電導率與含有40mM氯化鈉的10mM的醋酸緩鹽沖液(pH3.5)相同。將溶液上樣至用含有40mM氯化鈉的l0mM的醋酸鹽緩沖液(pH3.5)平衡的20ml DEAE-CellulofineA-800柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用40mM至80mM的氯化鈉的梯度進行洗脫。每部分收集3ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。將用約50mM至約65mM氯化鈉洗脫的部分收集、用SpeedVac(SAVANT Instruments Inc.)濃縮至2ml、上樣至用10％乙醇平衡的200-ml Cellulofine GCL-25柱(Chissocorporation)、并用相同的緩沖液洗脫。每部分收集2ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。對構(gòu)成含有糖的峰的部分的質(zhì)譜分析表明前部分含有與(A)相同的物質(zhì)而后面部分基本上不含與(A)相同的物質(zhì)。收集后面部分并命名為(C)。
另一方面，將水加入到220mM-洗脫部分(ii)中以使電導率與含有100mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液相同。溶液上樣至用含有100mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8)平衡的200-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。在用相同的緩沖液洗滌后，用100mM到300mM的氯化鈉梯度進行洗脫。每部分收集13ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。將用約140mM至約170mM氯化鈉洗脫的部分收集、用蒸發(fā)器濃縮至30ml、上樣至用10％乙醇平衡的1,200-ml Cellulofine GCL-25柱(Chissocorporation)、并用相同的緩沖液洗脫。每部分收集10ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。對構(gòu)成含有糖的峰的收集的部分的質(zhì)譜分析表明此部分含有與如在實施例5(3)中所描述的(B)相同的物質(zhì)。
此外，將水加入到270mM-洗脫部分(ii)中以使電導率與含有150mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8)相同。溶液上樣至用含有150mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8)平衡的200-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。在用相同的緩沖液洗滌后，用150mM到300mM的氯化鈉梯度進行洗脫。每部分收集12ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。將用約160mM至約180mM氯化鈉洗脫的部分收集、用SpeedVac(SAVANT Instruments Inc.)濃縮至2ml、上樣至用10％乙醇平衡的200-ml Cellulofine GCL-25柱(Chisso corporation)、并用相同的緩沖液洗脫。每部分收集2ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。收集包括含有糖的峰的部分并命名為(D)。
實施例6(1)來自硫酸化巖藻半乳聚糖(iii)的酶消化物的制備將15g在實施例3中獲得的來自Kjellmaniella crassifolia的含有多糖的硫酸化巖藻糖部分溶于含有300mM氯化鈉、20mM氯化鈣和10％乙醇的20mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH7.5)中并使用配有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去可以被超濾的物質(zhì)。使用與用于上面反應(yīng)混合物的相同的緩沖液用于超濾。將1U的在實施例5(1)中使用的含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖加入到在超濾后保留的溶液中。混合物在25℃反應(yīng)3天。
反應(yīng)混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去由含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖轉(zhuǎn)化成較小分子的物質(zhì)，即，來自巖藻多糖的較小分子。使用與上面用于溶解的相同的緩沖液用于超濾。
將1U的在實施例5(1)中使用的含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖加入到在超濾后保留的溶液中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)5天。
反應(yīng)混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去由含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖轉(zhuǎn)化成較小分子的物質(zhì)，即，來自硫酸化fucoglucuronomannan的較小分子。含有200mM氯化鈉和10％乙醇的10mM鹽酸咪唑緩沖液(pH8)被用于超濾。
將600mU的如在實施例2(1)中所描述的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶加入到在超濾后保留的溶液中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)5天。反應(yīng)混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底超濾由硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶轉(zhuǎn)化成較小分子的物質(zhì)，即，來自硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子。超濾使用含有20mM氯化鈉的10％的乙醇。由此獲得的濾液被命名為來自硫酸化巖藻半乳聚糖(iii)的酶消化物。
(2)來自硫酸化巖藻半乳聚糖(iii)的酶消化物的分離和純化使用電透析裝置將在實施例6(1)中獲得的來自硫酸化巖藻半乳聚糖(iii)的酶消化物脫鹽、使用蒸發(fā)器濃縮至50ml并上樣至用50mM醋酸銨(pH5.5)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chissocorporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用50mM到4M的醋酸銨梯度進行洗脫。每部分收集10ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。用約420mM至約620mM醋酸銨洗脫的部分構(gòu)成含有糖的峰。收集這些部分并命名為420mM至620mM洗脫部分。
(3)420mM至620mM洗脫部分的純化使用電透析裝置將此部分脫鹽。將電導率調(diào)節(jié)至50mM醋酸銨溶液的電導率。將溶液上樣至用50mM醋酸銨(pH5.5)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液接著用100mM醋酸銨(pH5.5)洗滌后，用l00mM到800mM的醋酸銨梯度進行洗脫。每部分收集l0ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。收集約440mM到約530mM醋酸銨洗脫的部分。
使用電透析裝置將此部分脫鹽。將電導率調(diào)節(jié)至200mM醋酸銨溶液的電導率。將溶液上樣至用200mM醋酸銨(pH5.5)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用200mM到700mM的醋酸銨梯度進行洗脫。每部分收集l0ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。收集約420mM到約470mM醋酸銨洗脫的部分。此部分的質(zhì)譜分析和核磁共振譜(NMR)分析表明此部分含有與在實施例5(3)中所描述的(B)相同的物質(zhì)。使用API-III質(zhì)譜儀(Perkin-Elmer Sciex)進行質(zhì)譜分析。使用核磁共振儀器JNM-α500(Nippon Denshi)進行NMR分析。
(4)來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化物的進一步的酶消化和分離/純化由于在實施例6(2)中的除了420mM到620mM-洗脫的部分的部分含有具有相對高分子量的物質(zhì)，因此再一次用硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶將它們消化。扼要地，收集除了420mM到620mM-洗脫的部分的洗脫部分，并使用電透析裝置脫鹽。調(diào)節(jié)溶液組合物至含有10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)、200mM氯化鈉和10％乙醇。將460mU的如在實施例2(1)中描述的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶加入其中并在25℃反應(yīng)8天。反應(yīng)混合物使用電透析裝置脫鹽。將電導率調(diào)節(jié)至50mM醋酸銨溶液的電導率。將溶液上樣至用50mM醋酸銨(pH5.5)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine A-800柱(Chisso corporation)。用相同的緩沖液洗滌后，用100mM到1M的醋酸銨梯度進行洗脫。每部分收集10ml的洗脫物。按照苯酚-硫酸法測量每部分的糖含量。分別收集用約180mM到約280mM醋酸銨和約360mM到約430mM醋酸銨洗脫的部分并命名為(E)和(F)。
實施例7來自硫酸化巖藻半乳聚糖的酶消化物的結(jié)構(gòu)確定將在實施例5和6中獲得的這6個部分(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)使用電透析裝置脫鹽、凍干、并進行糖組成分析和質(zhì)譜分析。使用API-III質(zhì)譜儀(Perkin-Elmer Sciex)進行質(zhì)譜分析。使用核磁共振儀器JNM-α500(Nippon Denshi)進行NMR分析。按照常規(guī)方法在重水交換后將樣品進行結(jié)構(gòu)分析。使用HMBC方法，1H-檢測的異核多鍵連通性的方法，分析組成性糖的鍵。DQF-COSY方法和HOHAHA方法被用于在1H-NMR中的鑒定。HSQC方法被用于在13C-NMR中的鑒定。
(1)較小分子(A)的物理性質(zhì)將質(zhì)譜分析和在NMR中的鑒定結(jié)果顯示如下。在圖3、4和5中分別闡明了來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(A)的1H-NMR譜、13C-NMR譜和質(zhì)譜。圖3是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(A)的1H-NMR譜的圖形。圖4是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(A)的13C-NMR譜的圖形。圖5是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(A)的質(zhì)譜的圖形。在圖3和4中，縱軸代表信號強度和橫軸代表化學位移值(ppm)。在圖5中，縱軸代表相對強度(％)和橫軸代表m/z值。分子量632MSm/z 653.2[M＋Na+－2H+]-，315.0[M－2H+]2-1H-NMR(D2O)δ；5.15(1H，d，J＝4.3Hz，F(xiàn)1-1-H)，4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F(xiàn)2-1-H)，4.53(1H，d-d，J＝10.4，4.3Hz，F(xiàn)1-3-H)，4.49(1H，d，J＝7.6Hz，G1-1-H)，4.46(1H，d-d，J＝10.7，3.1Hz，F(xiàn)2-3-H)，4.36(1H，q，J＝6.7Hz，F(xiàn)2-5-H)，4.14(1H，q，J＝6.7Hz，F(xiàn)1-5-H)，4.09(1H，d，J＝2.4Hz，F(xiàn)1-4-H)，4.03(1H，d，J＝3.1Hz，F(xiàn)2-4-H)，3.97(1H，d-d，J＝10.4，4.3Hz，F(xiàn)1-2-H)，3.90(1H，br-s，G1-4-H)，3.81(1H，d-d，J＝10.7，3.7Hz，F(xiàn)2-2-H)，3.59(1H，m，G1-3-H)，3.59(1H，m，G1-5-H)，3.59(2H，m，G1-6-H)，3.56(1H，m，G1-2-H)，1.19(3H，d，J＝6.7，F(xiàn)1-6-H)，1.14(3H，d，J＝6.7，F(xiàn)2-6-H)13C-NMR(D2O)在13C-NMR分析中各自碳的化學位移值列于表1中。
表1


糖組成L-巖藻糖∶D-半乳糖＝2∶1硫酸基團2個分子在1H-NMR中峰鑒定的數(shù)如在下面公式(V)中所顯示的那樣。

(2)較小分子(B)的物理性質(zhì)將質(zhì)譜分析和在NMR中的鑒定結(jié)果顯示如下。在圖6、7和8中分別闡明了來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(B)的1H-NMR譜、13C-NMR譜和質(zhì)譜。圖6是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(B)的1H-NMR譜的圖形。圖7是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(B)的13C-NMR譜的圖形。圖8是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(B)的質(zhì)譜的圖形。在圖6和7中，縱軸代表信號強度和橫軸代表化學位移值(ppm)。在圖8中，縱軸代表相對強度(％)和橫軸代表m/z值。分子量1116MSm/z 1181.2[M＋3Na+－4H+]-，579.0[M＋2Na+－4H+]2-，378.6[M＋Na+-4H+]3-1H-NMR(D2O)δ；5.20(1H，d，J＝4.3Hz，F(xiàn)1-1-H)，4.95(1H，d，J＝3.7Hz，F(xiàn)2-1-H)，4.64(1H，與HOD重疊，G1-1-H)，4.60(1H，d，J＝7.9Hz，G2-1-H)，4.55(1H，d-d，J＝10.7，1.8Hz，F(xiàn)1-3-H)，4.47(1H，m，F(xiàn)2-3-H)，4.45(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.42(1H，br-s，G2-4-H)，4.38(1H，q，J＝6.4Hz，F(xiàn)2-5-H)，4.28(1H，m，G2-3-H)，4.20(1H，m，G3-3-H)，4.17(1H，br-s，G3-4-H)，4.14(1H，q，J＝6.4Hz，F(xiàn)1-5-H)，4.11(1H，d，J＝1.8Hz，F(xiàn)1-4-H)，4.06(1H，d，J＝1.8Hz，F(xiàn)2-4-H)，4.01(1H，m，G2-6-H)，3.97(1H，d-d，J＝10.7，4.3Hz，F(xiàn)1-2-H)，3.90(1H，br-s，G1-4-H)，3.88(1H，m，G2-5-H)，3.83(1H，m，G2-6-H)，3.82(1H，m，F(xiàn)2-2-H)，3.68(1H，m，G1-3-H)，3.66(1H，m，G2-2-H)，3.65(2H，m，G3-6-H)，3.62(1H，m，G3-5-H)，3.61(2H，m，G1-6-H)，3.59(1H，m，G1-2-H)，3.55(1H，m，G1-5-H)，3.54(1H，m，G3-2-H)，1.21(3H，d，J＝6.4，F(xiàn)1-6-H)，1.15(3H，d，J＝6.4，F(xiàn)2-6-H)13C-NMR(D2O)在13C-NMR分析中各自碳的化學位移值列于表2中。
表2

糖組成L-巖藻糖∶D-半乳糖＝2∶3硫酸基團4個分子在1H-NMR中峰鑒定的數(shù)如在下面公式(VI)中所顯示的那樣。 (3)較小分子(C)的物理性質(zhì)將質(zhì)譜分析和在NMR中的鑒定結(jié)果顯示如下。在圖9、10和11中分別闡明了來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(C)的1H-NMR譜、13C-NMR譜和質(zhì)譜。圖9是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(C)的1H-NMR譜的圖形。
圖10是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(C)的13C-NMR譜的圖形。
圖11是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(C)的質(zhì)譜的圖形。在圖9和10中，縱軸代表信號強度和橫軸代表化學位移值(ppm)。在
圖11中，縱軸代表相對強度(％)和橫軸代表m/z值。分子量502MSm/z 523[M＋Na+－2H+]-，250[M－2H+]2-1H-NMR(D2O)δ4.57(1H，d，J＝7.9Hz，G1-1-H)，4.43(1H，d，J＝7.9Hz，G2-1-H)，4.20(1H，br-s，G1-3-H)，4.20(1H，br-s，G1-4-H)，4.20(1H，br-s，G2-3-H)，4.15(1H，br-s，G2-4-H)，3.95(1H，m，G1-6-H)，3.82(1H，m，G1-5-H)，3.80(1H，m，G1-6-H)，3.63(2H，m，G2-6-H)，3.62(1H，m，G2-5-H)，3.55(1H，m，G2-2-H)，3.50(1H，m，G1-2-H)13C-NMR(D2O)在13C-NMR分析中各自碳的化學位移值列于表3中。
表3

糖組成 D-半乳糖硫酸基團2個分子在1H-NMR中峰鑒定的數(shù)如在下面公式(VII)中所顯示的那樣。 (4)較小分子(D)的物理性質(zhì)將質(zhì)譜分析和在NMR中的鑒定結(jié)果顯示如下。在
圖12、13和14中分別闡明了來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(D)的1H-NMR譜、13C-NMR譜和質(zhì)譜。
圖12是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(D)的1H-NMR譜的圖形。
圖13是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(D)的13C-NMR譜的圖形。
圖14是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(D)的質(zhì)譜的圖形。在
圖12和13中，縱軸代表信號強度和橫軸代表化學位移值(ppm)。在
圖14中，縱軸代表相對強度(％)和橫軸代表m/z值。分子量1358MSm/z 711.2[M＋3Na+－5H+]2-，466.6[M＋2Na+－5H+]3-，344.2[M＋Na+－5H+]4-1H-NMR(D2O)δ；5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F(xiàn)1-1-H)，4.93(1H，d，J＝3.7Hz，F(xiàn)2-1-H)，4.62(1H，與HOD重疊，G1-1-H)，4.59(1H，與HOD重疊，G2-1-H)，4.54(1H，d-d，J＝10.6，2.7Hz，F(xiàn)1-3-H)，4.46(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.46(1H，m，F(xiàn)2-3-H)，4.41(1H，br-s，G2-4-H)，4.41(1H，d，J＝7.6Hz，G4-1-H)，4.37(1H，q，J＝6.4Hz，F(xiàn)2-5-H)，4.27(1H，m，G2-3-H)，4.24(1H，br-s，G3-4-H)，4.21(1H，m，G3-3-H)，4.19(1H，m，G4-3-H)，4.15(1H，br-s，G4-4-H)，4.13(1H，q，J＝6.7Hz，F(xiàn)1-5-H)，4.09(1H，d，J＝2.7Hz，F(xiàn)1-4-H)，4.04(1H，d，J＝2.8Hz，F(xiàn)2-4-H)，3.98(1H，m，G2-6-H)，3.96(1H，d-d，J＝10.6，4.3Hz，F(xiàn)1-2-H)，3.93(1H，m，G3-6-H)，3.88(1H，br-s，G1-4-H)，3.86(1H，m，G2-5-H)，3.81(1H，m，G2-6-H)，3.81(1H，m，F(xiàn)2-2-H)，3.80(1H，m，G3-5-H)，3.80(1H，m，G3-6-H)，3.66(1H，m，G1-3-H)，3.65(1H，m，G2-2-H)，3.64(1H，m，G1-6-H)，3.64(1H，m，G4-6-H)，3.61(1H，m，G4-5-H)，3.58(1H，m，G1-2-H)，3.56(1H，m，G1-6-H)，3.56(1H，m，G4-6-H)，3.55(1H，m，G4-2-H)，3.54(1H，m，G1-5-H)，3.54(1H，m，G3-2-H)，1.20(3H，d，J＝6.7，F(xiàn)1-6-H)，1.14(3H，d，J＝6.4，F(xiàn)2-6-H)13C-NMR(D2O)在13C-NMR分析中各自碳的化學位移值列于表4和5中。
表4

表5(續(xù)表4)

糖組成L-巖藻糖∶D-半乳糖＝2∶4硫酸基團5個分子在1H-NMR中峰鑒定的數(shù)如在下面公式(VIII)中所顯示的那樣。

(5)較小分子(E)的物理性質(zhì)將質(zhì)譜分析和在NMR中的鑒定結(jié)果顯示如下。在
圖15、16和17中分別闡明了來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(E)的1H-NMR譜、13C-NMR譜和質(zhì)譜。
圖15是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(E)的1H-NMR譜的圖形。
圖16是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(E)的13C-NMR譜的圖形。
圖17是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(E)的質(zhì)譜的圖形。在
圖15和16中，縱軸代表信號強度和橫軸代表化學位移值(ppm)。在
圖17中，縱軸代表相對強度(％)和橫軸代表m/z值。分子量1036MSm/z 528.0[M＋Na+－3H+]2-，344.0[M－3H+]3-1H-NMR(D2O)δ；5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F(xiàn)1-1-H)，4.87(1H，d，J＝3.7Hz，F(xiàn)2-1-H)，4.63(1H，與HOD重疊，G1-1-H)，4.59(1H，d，J＝7.9Hz，G2-1-H)，4.53(1H，d-d，J＝10.7，1.8Hz，F(xiàn)1-3-H)，4.44(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.40(1H，br-s，G2-4-H)，4.32(1H，q，J＝6.4Hz，F(xiàn)2-5-H)，4.27(1H，m，G2-3-H)，4.19(1H，m，G3-3-H)，4.16(1H，br-s，G3-4-H)，4.12(1H，q，J＝6.4Hz，F(xiàn)1-5-H)，4.06(1H，d，J＝1.8Hz，F(xiàn)1-4-H)，3.99(1H，m，G2-6-H)，3.88(1H，br-s，G1-4-H)，3.88(1H，d-d，J＝10.7，4.3Hz，F(xiàn)1-2-H)，3.86(1H，m，G2-5-H)，3.81(1H，m，G2-6-H)，3.81(1H，m，F(xiàn)2-3-H)，3.69(1H，d，J＝1.8Hz，F(xiàn)2-4-H)，3.66(1H，m，G1-3-H)，3.65(1H，m，G2-2-H)，3.64(1H，m，F(xiàn)2-2-H)，3.63(2H，m，G1-6-H)，3.61(1H，m，G3-5-H)，3.61(2H，m，G3-6-H)，3.60(1H，m，G1-2-H)，3.53(1H，m，G1-5-H)，3.53(1H，m，G3-2-H)，1.19(3H，d，J＝6.4，F(xiàn)1-6-H)，1.12(3H，d，J＝6.4，F(xiàn)2-6-H)13C-NMR(D2O)在13C-NMR分析中各自碳的化學位移值列于表6中。
表6

糖組成L-巖藻糖∶D-半乳糖＝2∶3硫酸基團3個分子在1H-NMR中峰鑒定的數(shù)如在下面公式(IX)中所顯示的那樣。 (6)較小分子(F)的物理性質(zhì)將質(zhì)譜分析和在NMR中的鑒定結(jié)果顯示如下。在
圖18、19和20中分別闡明了來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(F)的1H-NMR譜、13C-DEPT-135°譜和質(zhì)譜。
圖18是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(F)的1H-NMR譜的圖形。
圖19是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(F)的13C-DEPT-135°譜的圖形。圖20是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子(F)的質(zhì)譜的圖形。在
圖18和19中，縱軸代表信號強度和橫軸代表化學位移值(ppm)。在圖20中，縱軸代表相對強度(％)和橫軸代表m/z值。分子量1278MSm/z 660.0[M＋2Na+－4H+]2-，432.0[M＋Na+－4H+]3-，318.2[M-4H+]4-1H-NMR(D2O)δ；5.19(1H，d，J＝4.3Hz，F(xiàn)1-1-H)，4.87(1H，d，J＝3.8Hz，F(xiàn)2-1-H)，4.61(1H，與HOD重疊，G1-1-H)，4.59(1H，J＝7.9HzG2-1-H)，4.53(1H，d-d，J＝10.6，2.7Hz，F(xiàn)1-3-H)，4.46(1H，d，J＝7.6Hz，G3-1-H)，4.42(1H，d，J＝7.6Hz，G4-1-H)，4.41(1H，br-s，G2-4-H)，4.32(1H，q，J＝6.4Hz，F(xiàn)2-5-H)，4.27(1H，m，G2-3-H)，4.24(1H，br-s，G3-4-H)，4.20(1H，m，G3-3-H)，4.20(1H，m，G4-3-H)，4.16(1H，br-s，G4-4-H)，4.12(1H，q，J＝6.7Hz，F(xiàn)1-5-H)，4.06(1H，d，J＝2.7Hz，F(xiàn)1-4-H)，3.98(1H，m，G2-6-H)，3.94(1H，m，G3-6-H)，3.89(1H，d-d，J＝10.6，4.3Hz，F(xiàn)1-2-H)，3.88(1H，br-s，G1-4-H)， 3.86(1H，m，G2-5-H)，3.86(1H，m，G2-6-H)，3.82(1H，m，F(xiàn)2-3-H)，3.80(1H，m，G3-5-H)，3.80(1H，m，G3-6-H)，3.69(1H，d，J＝2.8，F(xiàn)2-4-H)，3.66(1H，m，G1-3-H)，3.65(2H，m，G1-6-H)，3.65(2H，m，G4-6-H)，3.64(1H，m，G2-2-H)，3.64(1H，m，F(xiàn)2-2-H)，3.62(1H，m，G4-5-H)，3.59(1H，m，G1-2-H)，3.54(1H，m，G1-5-H)，3.54(1H，m，G3-2-H)，3.54(1H，m，G4-2-H)，1.19(3H，d，J＝6.7，F(xiàn)1-6-H)，1.12(3H，d，J＝6.4，F(xiàn)2-6-H)13C-NMR(D2O)在13C-NMR分析中各自碳的化學位移值列于表7和8中。
表7

表8(續(xù)表7)

糖組成L-巖藻糖∶D-半乳糖＝2∶4硫酸基團4個分子在1H-NMR中峰鑒定的數(shù)如在下面公式(X)中所顯示的那樣。

實施例8
(1)本發(fā)明硫酸化巖藻半乳聚糖主要結(jié)構(gòu)的分析為了確定如在實施例1(2)中制備的硫酸化巖藻半乳聚糖部分的全部結(jié)構(gòu)和硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的裂解位點進行了NMR分析。
在NMR中的鑒定顯示如下。在圖21、22和23中分別闡明了本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的1H-NMR譜、13C-NMR譜和紅外吸收(IR)譜。圖21是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的1H-NMR譜的圖形。圖22是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的13C-NMR譜的圖形。圖23是闡明來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的紅外吸收譜的圖形。在圖21和22中，縱軸代表信號強度和橫軸代表化學位移值(ppm)。在圖23中，縱軸代表透射率(％)和橫軸代表波數(shù)(cm-1)。1H-NMR分析和13C-NMR分析的結(jié)果列于表9和10中。
表9

表10(續(xù)表9)

以如在表9和10中顯示的鑒定為依據(jù)，表明本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的主要的主鏈是在實施例7(4)中的化合物(D)，并且本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖具有化合物被重復地結(jié)合的結(jié)構(gòu)。在重復結(jié)構(gòu)之間的鍵是如在下面公式(XIII)中所顯示的半乳糖G2到半乳糖G4位置6的β-鍵。因此，表明硫酸化巖藻半乳聚糖具有如下所示的主要主鏈的重復結(jié)構(gòu)。

而且，以本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖化學結(jié)構(gòu)和來自本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子為依據(jù)，表明本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶是降解在硫酸化巖藻半乳聚糖中在硫酸化D-半乳糖或半乳糖和硫酸化D-半乳糖或半乳糖之間的β1-6和β1-4鍵的酶endowisely。此外，本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖的平均分子量約為130,000，其具有如在實施例1(3)中所描述的條件下測量的從約10,000至約200,000的分子量分布的。
(2)本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖誘導HGF產(chǎn)生的活性如在實施例1(2)中所描述的那樣獲得的本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖誘導HGF產(chǎn)生的活性得到確定。誘導HGF產(chǎn)生的活性按下面方法測量。扼要地，將以1×105個細胞/ml濃度的500μl的在含有10％胎牛血清的DME培養(yǎng)基中的含有MRC-5細胞(CCL171；DainipponPharmaceutical，code.02-021)的懸液置于48-孔細胞培養(yǎng)板的每個孔中并將板在5％CO2存在下在37℃孵育24小時。然后將培養(yǎng)基用含有1％胎牛血清的DM培養(yǎng)基替換。將作為樣品的如在實施例1(2)中所描述的那樣獲得的硫酸化巖藻半乳聚糖以1、10或100的終濃度加入到孔中。將板進一步孵育24小時。然后使用人肝細胞生長因子(HGF)酶連免疫吸附測定定量試劑盒(Quantikine Human Hepatocyte GrowthFactor(HGF)ELISA Kit)(Funakoshi，Code.RS-0641-00) 測量在收集的培養(yǎng)基中HGF的量。將與樣品等量的蒸餾水加入用于對照。將對照的產(chǎn)生的量，4.3ng/ml，定義為100％。將樣品加入的組產(chǎn)生的HGF的量列于表11中。所有的實驗都重復兩次。顯示了平均值。
表11濃度 HGF產(chǎn)生的增加(μg/ml)(％)1 19410 355100 429對照產(chǎn)生的HGF的量為4.3ng/ml如在表11中所示，證實了本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖誘導HGF的產(chǎn)生，因此本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖可用作HGF產(chǎn)生的誘導物。
實施例9(1)將70g在實施例3中獲得的來自Kjellmaniella crassifolia的含有多糖的硫酸化巖藻糖部分溶于含有300mM氯化鈉和10％乙醇的20mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH7.5)中并使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去可以被超濾的任何物質(zhì)。使用與上面用于溶解的相同的緩沖液用于超濾。
將20U的從如在WO97/26896中所描述的黃桿菌sp.SA-0082(FERMBP-5402)的培養(yǎng)物中獲得的含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖加入到在超濾后保留的溶液中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)5天。反應(yīng)混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去由含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖轉(zhuǎn)化成較小分子的物質(zhì)，即，來自硫酸化fucoglucuronomannan的較小分子。水被用于超濾，最終將其交換成為含有200mM氯化鈉的10mM的鹽酸咪唑緩沖液(pH8)。
將2U的如在實施例2(1)中所描述的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶加入到在超濾后保留的溶液中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)5天。反應(yīng)混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去由硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶轉(zhuǎn)化成較小分子的物質(zhì)，即，來自硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子。使用與上面用于反應(yīng)混合物的相同的緩沖液用于超濾。
以20mM的終濃度將氯化鈣和5U的從如在WO97/26896中所描述的交替單孢菌sp.SN-1009(FERM BP-5747)的培養(yǎng)物中獲得的含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖加入到在超濾后保留的溶液中?；旌衔镌?5℃反應(yīng)3天。反應(yīng)混合物使用配有具有100,000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以徹底除去由含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖轉(zhuǎn)化成較小分子的物質(zhì)。水被用于超濾。檢測了包含在由此獲得的濾液中的來自含有多糖的硫酸巖藻糖的物理和化學性質(zhì)。
(2)收集在上面(1)中獲得的濾液并使用配有具有3000排阻分子量的中空纖維的超濾裝置進行超濾以從非濾液中分離濾液。
使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液濃縮至約3L并離心以獲得上清液。使用配有具有300排阻分子量的膜的電透析裝置將上清液脫鹽。以0.1M的終濃度將醋酸鈣加入到脫過鹽的溶液中。離心除去形成的沉淀。將結(jié)果上清液上樣至用50mM醋酸鈣平衡的DEAE-Gellulofine柱(樹脂體積4L)。在用50mM醋酸鈣和50mM氯化鈉充分洗滌后，用50mM至800mM氯化鈉的梯度進行洗脫。每部分收集500ml的洗脫物。根據(jù)纖維素醋酸膜電泳方法[分析化學(Analytical Biochemistry)，37197-202(1970)]分析收集的部分，并且發(fā)現(xiàn)用0.4M氯化鈉洗脫的部分(在下文中稱作0.4M-洗脫的部分)是均一的。另外，用0.6M氯化鈉洗脫的部分(在下文中稱作0.6M-洗脫的部分)同樣地由電泳確定幾乎是均一的。
將0.4M-洗脫的部分濃縮至150ml。以4M的濃度將氯化鈉加入其中。將結(jié)果溶液上樣至用4M氯化鈉平衡的苯基-Cellulofine柱(樹脂體積200ml)。用4M氯化鈉充分洗滌后，收集含有未吸附的硫酸化糖的部分并使用配有具有300排阻分子量的膜的電透析裝置脫鹽獲得505ml的脫鹽溶液。
將如此獲得的40ml的脫鹽溶液上樣至用含有10％乙醇的0.2M的氯化鈉平衡Cellulofine GCL-90柱(4.1cm×87cm)進行凝膠過濾。每個部分收集9.2ml的洗脫物。
按照苯酚-硫酸法[分析化學，28350(1956)]測量每部分的總糖含量。
硫酸化糖形成一個峰。收集在峰的中間部分的部分，使用配有具有300排阻分子量的膜的電透析裝置脫鹽并凍干獲得112mg的本發(fā)明的硫酸化糖的干品。將干品的一份進行糖組成分析和質(zhì)譜分析。另外，在按照常規(guī)方法交換成重水后將l0mg的干品進行NMR分析。
糖組成分析的結(jié)果表明0.4M-洗脫的部分含有包含巖藻糖的硫酸化糖。
使用API-III質(zhì)譜儀(Perkin-Elmer Sciex)的硫酸化糖的質(zhì)譜分析的結(jié)果顯示在圖24中。分析結(jié)果顯示如下。圖24是顯示了硫酸化糖質(zhì)譜分析結(jié)果的的圖形?？v軸代表相對強度(％)和橫軸代表m/z值。分子量被確定是2264±1表明所有的硫酸基團都形成鈉鹽。硫酸化糖只含有巖藻糖作為它的組成性糖。因此，表明硫酸化糖是將7個分子巖藻糖和12個分子的硫酸基團結(jié)合的糖，并且具有2265的理論上的分子量表明所有的硫酸基團都形成鈉鹽。
可鑒定定義本物質(zhì)為M的在圖24中主要的信號如下。
m/z 1109.05---[M-2Na+]2-(理論值1109.5)731.45---[M-3Na+]3-(理論值732)542.75---[M-4Na+]4-(理論值543.25)430.05---[M-5Na+]5-(理論值430)因此，本物質(zhì)是包含7個分子巖藻糖和12個分子的硫酸基團的寡糖。
接著為了分析巖藻糖的鍵和確定硫酸基團連接的位置使用核磁共振儀器JNM-α500(Nippon Denshi)進行了NMR分析。使用HMBC方法，用于異核鍵的1H-檢測的方法，分析組成性糖的鍵。DQF-COSY方法和HOHAHA方法被用于在1H-NMR中的鑒定。HSQC方法被用于在13C-NMR中的鑒定。
在NMR中鑒定的結(jié)果顯示在下面。在圖25和26中分別闡明了在0.4M-洗脫的部分中的硫酸化糖的1H-NMR譜和13C-NMR譜。表示了在1H-NMR中假定二氧六環(huán)的化學位移值為3.53ppm的化學位移值。表示了在13C-NMR中假定二氧六環(huán)的化學位移值為66.5ppm的化學位移值。兩次測量都在60℃進行。圖25是闡明在0.4M-洗脫的部分中的硫酸化糖的1H-NMR譜的圖形。圖26是闡明在0.4M-洗脫的部分中的硫酸化糖的13C-NMR譜的圖形。在圖25和26中，縱軸代表信號強度和橫軸代表化學位移值(ppm)。1H-NMR分析和13C-NMR分析的結(jié)果列于表12和13中。
表12

表13(續(xù)表12)

在NMR中峰鑒定的數(shù)如在下面公式(XV)中所顯示的那樣。

以這些結(jié)果為依據(jù)，表明本物質(zhì)是下面公式(XVI)的硫酸化糖。 (3)將如在實施例9(2)中所描述的來自DEAE-Cellulofine的0.6M-洗脫的部分如上面所描述的用于0.4M-洗脫的部分的那樣純化以獲得凍干產(chǎn)品。
使用HPLC的產(chǎn)品的分析表明此產(chǎn)品是比包含在0.4M-洗脫的部分中的產(chǎn)品具有更高分子量的硫酸化糖。產(chǎn)品的NMR分析提供了與用0.4M-洗脫的部分獲得的幾乎相同的譜。
在圖27中闡明了0.6M-洗脫的部分的1H-NMR譜。使用重水作為溶劑。表示了在1H-NMR中假定二氧六環(huán)的化學位移值為3.53ppm的化學位移值。測量在60℃進行。圖27是闡明在0.6M-洗脫的部分的1H-NMR譜的圖形。縱軸代表信號強度和橫軸代表化學位移值(ppm)。
結(jié)果有力地暗示0.6M-洗脫的部分具有將0.4M-洗脫的部分的幾個分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)。當使用HPLC分析用如在實施例9(1)中所描述的通過用含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖進一步消化0.6M-洗脫的部分獲得的產(chǎn)物時，許多反應(yīng)產(chǎn)物在與在如在實施例9(2)中所描述的來自DEAE-Cellulofine的0.4M-洗脫的部分中硫酸化糖相同的位置得到洗脫。
HPLC按如下條件進行。
柱Shodex SB802.5(Showa Denko)；柱溫25℃。
洗脫液含有5mM疊氮化鈉的50mM氯化鈉；檢測示差折射率檢測器Shodex RI-71。
通過使用普魯蘭作為標準的凝膠過濾測量了0.6M-洗脫的部分和0.4M-洗脫的部分的分子量。結(jié)果，表明以普魯蘭的分子量為依據(jù)0.4M-洗脫的部分具有約8500的分子量，而以普魯蘭的分子量為依據(jù)0.6M-洗脫的部分具有約26000的分子量，顯示了0.6M-洗脫的部分是在0.4M-洗脫的部分中硫酸化糖的三聚體。而且0.6M-洗脫的部分的1H-NMR譜的詳細的分析表明每個重復的庚糖通過α-(1→3)鍵結(jié)合于在公式(XV)中巖藻糖F的3位。而且，按照上述方法從來自含有多糖的硫酸化巖藻糖的較小分子中獲得了(XVI)的硫酸化糖的五聚體，即，下面通式(XIV)的硫酸化糖其中n是5。 其中R是H或OSO3H。
如上面所描述的，證實了通過用含有多糖-U-消化酶的硫酸化巖藻糖和本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶處理從如Kjellmaniellacrassifo1ia的褐藻獲得的含有多糖的硫酸化巖藻糖獲得了通過含有多糖-F-消化酶的硫酸化巖藻糖的作用轉(zhuǎn)化成較小分子的和含有下面通式的硫酸化糖作為組成性糖的基本成分的硫酸化多糖。在pH6-8、在95℃約2小時的提取條件下如同按照在實施例1(3)中所描述的方法測量的硫酸化多糖的平均分析量約為200,000(分子量分布約10,000至約1000,000)。在pH6-8、在25℃約24小時的提取條件下平均分子量約為13,000,000(分子量分布約100,000至約20,000,000)。
產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供了來自硫酸化巖藻半乳聚糖的硫酸化巖藻半乳聚糖和較小分子，其可作為用于糖技術(shù)或HGF產(chǎn)生誘導物的試劑。本發(fā)明也提供了新的可用于結(jié)構(gòu)分析和硫酸化巖藻半乳聚糖消化的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶和來自硫酸化巖藻半乳聚糖的較小分子的可再生的產(chǎn)品。本發(fā)明進一步提供了用于生產(chǎn)酶的方法。本發(fā)明也提供了使用本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶選擇性地從含有多糖的硫酸化巖藻糖的混合物中除去的硫酸化巖藻半乳聚糖的方法。而且，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶與其它含有多糖消化酶的硫酸巖藻糖結(jié)合使用獲得的新的硫酸化糖。
權(quán)利要求
1.具有下面化學和物理性質(zhì)的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽(1)含有摩爾比為1∶1至6∶1的半乳糖和巖藻糖作為組成性糖；(2)含有通式(XI)的硫酸化糖作為組成性糖的基本成分； 其中R是H或OSO3H；和(3)由硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶轉(zhuǎn)化成較小分子以產(chǎn)生至少一種選自通式(I)至(IV)的化合物 其中R是H或SO3H。
2.具有選自通式(II)、(III’)和(IV)的化學結(jié)構(gòu)的糖或其鹽 其中R是H或SO3H。
3.具有下面化學和物理性質(zhì)的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶(1)作用于含有摩爾比為1∶1至6∶1的半乳糖和巖藻糖作為組成性糖的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽以轉(zhuǎn)化硫酸化巖藻半乳聚糖成較小分子并產(chǎn)生在其還原末端具有硫酸化半乳糖或半乳糖的寡糖；(2)具有約7到9的最適pH；和(3)具有約25到45℃的最適溫度。
4.用于從硫酸化巖藻半乳聚糖生產(chǎn)較小分子的方法，其特征在于此方法包括由權(quán)利要求3的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶作用于得自褐藻的硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽并獲得較小分子。
5.用于生產(chǎn)權(quán)利要求3的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的方法，其特征在于此方法包括培養(yǎng)能產(chǎn)生權(quán)利要求3的硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的黃桿菌屬的細菌和從培養(yǎng)物中收集該酶。
全文摘要
硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽作為一種用于糖鏈工程或HGF產(chǎn)生誘導物的試劑的用途;通過用硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶處理硫酸化巖藻半乳聚糖獲得的消化產(chǎn)物或其鹽;硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶在糖鏈工程中的用途;通過用上述酶處理硫酸化巖藻半乳聚糖或其鹽生產(chǎn)降解產(chǎn)物的方法;和生產(chǎn)硫酸化巖藻半乳聚糖消化酶的方法。
文檔編號C12N9/24GK1341126SQ00804157
公開日2002年3月20日 申請日期2000年2月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月23日
發(fā)明者酒井武, 木村瞳, 児島薰, 片山薰, 嶋中一夫, 豬飼勝重, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社