專利名稱：改善植物的農(nóng)藝和營養(yǎng)價值的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物細胞、種子、組織和全植株的轉化領域。更具體地講，本發(fā)明涉及將編碼類胡蘿卜素生物合成途徑所特有的一種或多種酶的重組核苷酸序列插入植物材料，以便改善其農(nóng)藝和營養(yǎng)價值。
背景技術：
前維生素A(β-胡蘿卜素)缺陷是一種非常嚴重的健康問題，它會在以諸如大米之類的谷物作為幾乎唯一的主要食物的世界人群中導致嚴重的臨床癥狀。僅在東南亞，估計每年就有500萬兒童發(fā)生眼睛疾病——干眼病，其中有2.5萬人最終會失明(Sommer，1988；Grant，1991)。另外，盡管維生素A缺陷不是直接的死亡決定因素，但它與增加了的易患潛在的致命性疾病相關，如腹瀉、呼吸道疾病和兒童疾病，如麻疹(Grant，1991)。根據(jù)UNICEF的統(tǒng)計數(shù)字，改善前維生素營養(yǎng)，每年能夠預防1-4歲兒童中1-200萬人的死亡，并能預防0.25-0.5百萬兒童在以后時間死亡(Humphrey等，1992)。因此，非常需要提高主要食物中的類胡蘿卜素含量。另外，已知類胡蘿卜素有助于預防幾種類型的癌癥，并且證實了視網(wǎng)膜中的葉黃素和玉米黃素在預防黃斑變性方面的作用(例如，參見Brown等，1998；Schalch，1992)。
另外，類胡蘿卜素作為人類食品和動物飼料以及在制藥行業(yè)中作為著色劑具有廣泛用途。另外，類胡蘿卜素在“功能食品”中作為營養(yǎng)化合物的價值也在增加。這是因為某些類胡蘿卜素，例如，β-胡蘿卜素在哺乳動物體內具有前維生素-A特征。
類胡蘿卜素是由8個異戊二烯單位縮合而產(chǎn)生的40個碳原子(C40)的類異戊二烯，所述異戊二烯單位是由生物合成前體——異戊二烯二磷酸酯產(chǎn)生的(參見


圖1)。在命名時，類胡蘿卜素分成兩種類型，即包括烴的胡蘿卜素，和被稱作葉黃素的加氧衍生物。它們在植物中的主要作用是，防止對質體的光合裝置造成光氧化損傷。另外，它們在光合作用中參與集光，并且是光合反應中心的組成成分。類胡蘿卜素是植物激素脫落酸的直接前體。
業(yè)已研究了
圖1所示的類胡蘿卜素生物合成，并且業(yè)已在細菌、真菌、和植物中闡明了其途徑(例如，參見Britton，1998)。在植物中，類胡蘿卜素是在質體中形成的。
類胡蘿卜素生物合成的早期中間體是香葉基香葉基二磷酸酯(GGPP)，它是通過香葉基香葉基二磷酸酯合成酶的作用由異戊烯二磷酸酯(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)形成的(參見
圖1)。隨后的酶促步驟代表第一個類胡蘿卜素專一性反應，是由八氫番茄紅素合成酶催化的。該反應包括一個兩步反應，導致兩個GGPP分子的頭對頭的縮合，以便形成第一種尚未著色的胡蘿卜素產(chǎn)物八氫番茄紅素(Dogbo等，1988；Chamovitz等，1991；Linden等，1991；Pecker等，1992)。八氫番茄紅素合成酶以兩種形式存在可溶的無活性形式和膜結合的/活性形式，并且它需要連位的羥基官能團以便在含有質體半乳糖脂的膜表面具有活性(Schledz等，1996)。
盡管在細菌和植物中八氫番茄紅素的形成相似，但八氫番茄紅素的代謝明顯不同。在植物中，有兩種基因產(chǎn)物按順序起作用，以便產(chǎn)生著色的胡蘿卜素番茄紅素(Beyer等，1989)。這兩種酶是八氫番茄紅素脫飽和酶(PDS，例如，參見Hgueney等，1992)和ζ-胡蘿卜素脫飽和酶(ZDS，參見Albrecht等，1996)。每引入兩個雙鍵都能分別通過六氫番茄紅素產(chǎn)生ζ-胡蘿卜素和通過鏈孢紅素產(chǎn)生番茄紅素。據(jù)信PDS通過質體醌(Mayer等，1990；Schulz等，1993；Norris等，1995)與一種膜結合氧化還原鏈機械連接(Nievelstein等，1995)，而ZDS以不同的方式機械地起作用(Albrecht等，1996)。在植物中，所述整個途徑似乎與順式結構的中間體相關(Bartley等，1996)。相反，在諸如歐文氏菌屬的許多細菌中，產(chǎn)生所有4個雙鍵的整個脫飽和序列是由一種基因產(chǎn)物(CrtI)完成的，將八氫番茄紅素直接轉化成番茄紅素(例如，參見Miawa等，1990；Armstrong等，1990；Hundle等，1994)。已知這種類型的細菌脫飽和酶不容易受漂白型除草劑的影響，這些除草劑能有效抑制植物類型的八氫番茄紅素脫飽和酶。
在植物中，有兩種基因產(chǎn)物催化番茄紅素的環(huán)化，即α(ε)-和β-番茄紅素環(huán)化酶，分別形成α(ε)-和β-紫羅酮端基(例如，參見Cunningham等，1993；Scolnik和Bartley，1995，Cunningham等，1996)。在植物中，正常情況下生成具有兩個β-紫羅酮端基的β-胡蘿卜素和具有一個α(ε)和一個β-紫羅酮端基的α-胡蘿卜素。
植物葉黃素的形成首先是由兩種基因產(chǎn)物介導的，α-和β-羥化酶(Masamoto等，1998)，它們分別作用于α-和β-胡蘿卜素的胡蘿卜素主鏈的C3和C3’位置。產(chǎn)生的葉黃素被稱為黃體素和玉米黃質。
進一步的加氧反應是由玉米黃質環(huán)氧酶催化的，這種酶能催化環(huán)氧官能團導入玉米黃質主鏈的C5、C6、和C5’、C6’(Marin等，1996)。這會導致花藥黃質和紫黃質的形成。在不同基因產(chǎn)物紫黃質脫環(huán)氧酶的作用下可以逆轉該反應(Bugos和Yamamoto，1996)。
導致新黃質形成的基因產(chǎn)物尚有待鑒定。
業(yè)已從包括細菌到植物的生物中克隆了編碼類胡蘿卜素生物合成基因的基因和cDNA。細菌和藍細菌基因包括草生歐文氏菌(申請?zhí)朩O91/13078，Armstrong等，1990)，噬夏孢歐文氏菌(Misawa等，1990)，R.capsulatus(Armstrong等，1989)，嗜熱棲熱菌(Hoshino等，1993)，藍細菌屬聚球藍細菌(Genbank保藏號X63873)，黃桿菌菌株R1534(Pasamontes等，1997)。業(yè)已從各種來源克隆了編碼高等植物類胡蘿卜素生物合成途徑的酶的基因和cDNA，所述來源包括擬南芥、白芥、辣椒、黃水仙、番茄等，正如可以從公共數(shù)據(jù)庫中推導的。
目前對所述克隆基因在高等植物轉化及所產(chǎn)生的效果的了解還比較少。來自番茄的八氫番茄紅素合成酶的表達，可以影響果實中類胡蘿卜素的含量(Bird等，1991；Bramley等，1992；Fay和Grierson，1993)。業(yè)已報導了八氫番茄紅素合成酶在轉化的番茄植物中的組成型表達會導致矮化，這是因為改變了赤霉素生物合成途徑中代謝產(chǎn)物GGPP的方向(Fray等，1995)。當來自黃水仙的八氫番茄紅素合成酶在水稻胚乳中進行組成型表達時沒有出現(xiàn)上述問題(Burhardt等，1997)。已知作為細菌脫飽和酶的噬夏孢歐文氏菌CrtI能在植物中起作用，并能產(chǎn)生對漂白性除草劑的抗性(Misawa等，1993)。
在過去幾年里，為了改變或增強諸如營養(yǎng)組織或種子的各種植物組織中或細菌中類胡蘿卜素生物合成途徑，業(yè)已進行了許多嘗試。例如，參見WO96/13149，WO98/06862，WO98/24300，WO96/28014，和US5618988。以上所有嘗試都局限于對細胞中現(xiàn)有類胡蘿卜素生物合成反應的操作。致力于改變富含油種子的類胡蘿卜素生物合成的其他用途是不同的，因為它們提供了能容納由于轉化而產(chǎn)生的增產(chǎn)刺激所形成的過多的類胡蘿卜素的庫。
很顯然，需要一種轉化植物材料的方法，以便得到能夠表達產(chǎn)生感興趣的胡蘿卜素和葉黃素所必需的類胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了轉化植物細胞、種子、組織或全植株以便產(chǎn)生能夠表達類胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶的轉化體的裝置和方法，這些酶是目標宿主植物積累感興趣的胡蘿卜素和/或葉黃素所必需的。本發(fā)明還提供了為了適用于實施本發(fā)明方法而設計的DNA，以及包括所述分子的質粒和載體系統(tǒng)。另外，本發(fā)明提供了具有改善了的營養(yǎng)品質并含有所述DNA分子的和/或用本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉基因植物細胞、種子、組織和全植株。
因此，本發(fā)明提供了類胡蘿卜素生物合成的從頭導入和表達，它對于諸如水稻胚乳和許多其他谷類種子的、已知基本上不含類胡蘿卜素的植物材料來說是特別重要的，以及對現(xiàn)有的類胡蘿卜素生物合成進行修飾，以便上調或下調某些感興趣的中間體或產(chǎn)物的積累。
附圖簡述
圖1表示植物類胡蘿卜素生物合成的總體途徑。酶的名稱用黑體表示。還示出了由細菌CrtI型胡蘿卜素脫飽和酶催化的反應。
圖2表示中間體香葉基香葉基二磷酸酯(GGPP)不僅參與類胡蘿卜素的生物合成，而且是通過異戊二烯化反應(例如，生育酚、醌、葉綠素)或通過不利用非異戊烯受體分子(例如，赤霉素、芳香劑和香味物質)的不同反應通向不同化合物的途徑中起著建筑組件的作用。
圖3表示對來自未轉化過的(圖3A)和轉化過的(圖3B，用質粒A；圖3C，用質粒A+B)水稻植物的拋光的水稻種子(胚乳)的HPLC分析。在表示轉化種子的圖樣中證實了類胡蘿卜素、環(huán)狀胡蘿卜素和葉黃素的出現(xiàn)。
圖4表示用于“質粒A”和“質粒B”中的表達框。LB，左臂；RB，右臂；psy，八氫番茄素合成酶，cDNA來自黃水仙；crtI來自噬夏孢歐文氏菌的胡蘿卜素脫飽和酶基因；cyc番茄紅素環(huán)化酶，cDNA來自黃水仙；aph IV，潮霉素磷酸轉移酶；Gtl，水稻谷蛋白1啟動子；35S，CaMV35S啟動子；nos，胭脂氨酸合成酶終止子；NptII，卡那霉素抗性基因。
圖5A，用未處理過的(泳道1)和CPTA-處理過的(泳道2)黃水仙花RNA進行的Northern印跡。對固定的RNA進行反復劃線，以便讓標記過的探針雜交；B，八氫番茄紅素脫飽和酶；C，ζ-胡蘿卜素脫飽和酶；E，番茄紅素環(huán)化酶。B，用未處理過的(泳道1)和處理過的(泳道2)黃水仙花的蛋白提取物進行的Western印跡。用抗A，八氫番茄紅素合成酶；B，八氫番茄紅素脫氫酶；C，ζ-胡蘿卜素脫飽和酶；D，番茄紅素環(huán)化酶的抗體檢測所述印跡。
本說明書所用縮略語本文所提到的相關類胡蘿卜素的系統(tǒng)名稱為八氫番茄紅素7，8，11，12，7’，8’，11’，12’-八氫-φ，φ-胡蘿卜素六氫番茄紅素7，8，11，12，7’，8’-六氫-φ，φ-胡蘿卜素ζ-胡蘿卜素7，8，7’，8’-四氫-φ，φ-胡蘿卜素鏈孢紅素7，8-二氫-φ，φ-胡蘿卜素番茄紅素-φ，φ-胡蘿卜素β-胡蘿卜素β，β-胡蘿卜素α-胡蘿卜素β，ε-胡蘿卜素玉米黃質β，β-胡蘿卜素-3，3’-二醇葉黃素β，ε-胡蘿卜素-3，3’-二醇花藥黃質5，6-環(huán)氧-5，6-二氫-β，β-胡蘿卜素-3，3’-二醇紫黃質5，6，5’，6’，雙環(huán)氧-5，6，5’，6’，四氫-β，β-胡蘿卜素-3，3’-二醇新黃質5’，6’-環(huán)氧-6，7-二脫氫-5，6，5’，6’-四氫-β，β-胡蘿卜素-3，5，3’-三醇酶PSY八氫番茄紅素合成酶PDS八氫番茄紅素脫飽和酶CrtI細菌胡蘿卜素脫飽和酶ZDSζ-胡蘿卜素脫飽和酶
CYC番茄紅素β-環(huán)化酶非胡蘿卜素中間體IPP異戊烯二磷酸酯DMAPP二甲基烯丙基-二磷酸酯GGPP香葉基香葉基二磷酸酯在本文中，術語“植物”一般包括真核藻類，有胚植物，包括苔蘚植物、蕨類植物、和種子植物，如裸子植物和被子植物，后者包括Magnoliopsida，Rosopsida(真-“雙子葉植物”)、Liliopsida(單子葉植物)。代表性的和優(yōu)選的例子包括谷類種子，例如水稻、小麥、大麥、燕麥、莧、亞麻、黑小麥、黑麥、玉米和其他禾本科植物；油用種子，如油用蕓薹種子、棉籽、大豆、紅花、向日葵、椰子果、和棕櫚等；其他食用種子或具有可食用部分的種子，包括南瓜、西葫蘆、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻、樹木堅果，如胡桃、杏、大胡桃、鷹嘴豆等。另外，還有馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、番茄、辣椒、木薯、柳樹、橡樹、榆樹、楓樹、蘋果、香蕉；觀賞花卉，如百合、蘭花、蘆葦、薔薇、毛茛、矮牽牛、草夾竹桃、紫羅蘭、和向日葵等。一般，本發(fā)明可應用于觀賞類植物以及為了獲得食物、纖維、木材、鞣料、燃料、色素、樹膠、樹脂、膠乳產(chǎn)品、脂肪、油、藥物、和飲料等而栽培的植物。被選擇用于轉化的目標植物優(yōu)選是為了獲得食物而栽培的，例如，谷物、根、豆、堅果、蔬菜、塊莖、果實、和調料等。
發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了轉化植物細胞、種子、組織或全植株以便產(chǎn)生能夠表達類胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶的轉化體的裝置和方法，所述酶是目標宿主植物積累感興趣的胡蘿卜素和/或葉黃素所必需的。按照本發(fā)明的另一方面，所述方法還可用于修飾現(xiàn)有的類胡蘿卜素生物合成，以便上調或下調某些感興趣的中間體或產(chǎn)物的積累。另外，提供了特殊的DNA分子，該分子包括具有能夠指導類胡蘿卜素生物合成途徑所特有的一種或多種酶產(chǎn)生的一個或多個表達框的核苷酸序列，所述酶選自下列一組-源于植物、真菌、或細菌的八氫番茄紅素合成酶，
-源于植物、真菌、或細菌的八氫番茄紅素脫飽和酶，-源于植物或藍細菌的ζ-胡蘿卜素脫飽和酶，和-源于植物、真菌、或細菌的番茄紅素環(huán)化酶。
根據(jù)一種優(yōu)選實施方案，上述表達框包括一個或多個編碼植物、真菌或細菌八氫番茄紅素合成酶，植物、真菌或細菌八氫番茄紅素脫飽和酶，植物ζ-胡蘿卜素脫飽和酶，或植物、真菌、或細菌的番茄紅素環(huán)化酶的基因或cDNA，所述基因各自可操作地與合適的組成型、誘導型、或組織專一型啟動子連接，使其能在植物細胞、種子、組織或全植株中表達。特別優(yōu)選的基因或cDNA編碼植物八氫番茄紅素合成酶，細菌八氫番茄紅素脫飽和酶或植物番茄紅素環(huán)化酶。業(yè)已分離了大量的、數(shù)量仍在增加的編碼八氫番茄紅素合成酶(植物和細菌)、CrtI-型胡蘿卜素脫飽和酶(細菌)和番茄紅素環(huán)化酶(植物和細菌)的基因，并可以從數(shù)據(jù)庫中獲得該基因。這些基因來自各種來源，并且都可用于本發(fā)明的方法中。
優(yōu)選的是，所述DNA分子還包括至少一個可操作地連接于合適的組成型、誘導型或組織專一型啟動子上的選擇標記基因或cDNA，最優(yōu)選的是受組成型啟動子控制的潮霉素磷酸轉移酶選擇標記。盡管本領域技術人員可以選擇能在植物材料中起作用的現(xiàn)有啟動子中的任一種，但在設計本發(fā)明的合適表達框時，優(yōu)選將編碼八氫番茄紅素脫飽和酶、ζ-胡蘿卜素脫飽和酶、或番茄紅素環(huán)化酶的相應的核苷酸序列可操作地連接于組織專一型或組成型啟動子上，而編碼八氫番茄紅素合成酶的核苷酸序列優(yōu)選是在組織專一型啟動子的控制下表達，以便避免赤霉素形成的干擾。
可以理解的是，作為本發(fā)明DNA分子的功能元件的核苷酸序列可以包括上述一種或多種基因或cDNA任意組合。在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實施方案中，所述核苷酸序列包括八氫番茄紅素合成酶和細菌或真菌八氫番茄紅素脫飽和酶的功能性表達框，可以在整合到合適的質粒或載體系統(tǒng)(質粒A)上之后導入目標植物材料，可以單獨導入或者與包括編碼番茄紅素環(huán)化酶的核苷酸序列的第二種質粒(質粒B)一起導入。
本發(fā)明還提供了包括上述DNA分子或核酸序列的一種或多種的質?；蜉d體系統(tǒng)，所述質?；蜉d體系統(tǒng)源于根癌農(nóng)桿菌。
本發(fā)明還提供了轉基因植物細胞、種子、組織和全植株，它具有改善了的營養(yǎng)品質，并含有上述DNA分子、質?；蜉d體中的一種或多種，和/或它是用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的。
本發(fā)明基于以下事實早期中間體香葉基香葉基二磷酸酯(GGPP)不僅用于胡蘿卜素生成，而且是用于若干不同生物合成途徑的分支點(圖2)。因此，可以得出這樣的結論這種前體存在于含有或不含類胡蘿卜素的所有植物組織的質體中，如水稻胚乳中。因此，GGPP的來源可用于實現(xiàn)本發(fā)明的目的，即部分或整個導入類胡蘿卜素生物合成途徑，和/或增強或加速現(xiàn)有的類胡蘿卜素生物合成途徑。
在本說明書中術語“不含類胡蘿卜素”在用于區(qū)分某些目標植物細胞或組織時，是指已知未按照本發(fā)明轉化的相應的植物材料正常情況下是基本上不含類胡蘿卜素的，例如，對于儲存器官來說就是這樣，例如，水稻胚乳等。不含類胡蘿卜素并不表示排除了能積累幾乎不可檢測的量的類胡蘿卜素的細胞或組織。優(yōu)選的是，所述術語限定的是類胡蘿卜素含量為0.001％w/w或更低的植物材料。
在選擇產(chǎn)生類胡蘿卜素途徑酶的合適來源時，可以理解的是，與相應植物序列同源的源于藍細菌的編碼序列也可用于本發(fā)明。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，將高等植物八氫番茄紅素合成酶可操作地連接于能進行組織專一性表達的啟動子上。該結構與細菌(Crt-E-型)八氫番茄紅素脫飽和酶統(tǒng)一在相同質粒(質粒A)上，后者與編碼轉運肽的DNA序列融合，并可操作地連接于能進行組成型表達的啟動子上。用存在于合適載體上的該結構轉化植物能指導番茄紅素在特定組織中的形成，例如，通過控制八氫番茄紅素合成酶的啟動子可以在不含類胡蘿卜素的谷類種子中產(chǎn)生番茄紅素。令人驚奇的是，僅是所述轉化除了能產(chǎn)生番茄紅素之外，還能啟動類胡蘿卜素合成向下游葉黃素發(fā)展，如葉黃素、玉米黃質、花藥黃質、紫黃質，和新黃質，即使是在諸如水稻胚乳的不含類胡蘿卜素的組織中也是這樣。另外，還觀察到了α-胡蘿卜素的形成。因此，形成了類似于存在于綠色葉子中的類胡蘿卜素補體。這種出人意料的現(xiàn)象(本文又稱為“超越”機制)可能是由于相應的晚期基因(番茄紅素環(huán)化酶、β-胡蘿卜素羥化酶、環(huán)氧化酶)的組成型表達，所述晚期基因是由轉化介導的底物供應激活的，或者是通過轉化誘導類胡蘿卜素生物合成基因的表達而激活的。在所述“超越”機制不起作用的情況下，與編碼番茄紅素環(huán)化酶的基因或cDNA共轉化(質粒B)可以克服這一問題，并且至少能形成α-或β-胡蘿卜素(前維生素A)。在所述“超越”機制能起作用的情況下，這種共轉化能夠增強由八氫番茄紅素合成酶和CrtI型胡蘿卜素脫飽和酶所產(chǎn)生的效果。因此，本發(fā)明包括通過用質粒A或A+B轉化以遺傳學以外的方式導入類胡蘿卜素生物合成途徑。
質粒A還能提高含有類胡蘿卜素的組織的類胡蘿卜素產(chǎn)量。所述轉化可以增強人類食品和動物飼料的營養(yǎng)價值。將crtI型細菌八氫番茄紅素脫飽和酶用于轉化的另一個優(yōu)點是，所述酶也能在葉片葉綠素中表達，因此，產(chǎn)生對針對植物八氫番茄紅素脫飽和酶的漂白性除草劑的抗性。因此，本發(fā)明還包括將漂白性除草劑抗性一起應用于至少攜帶質粒A的轉基因植物中。
可以使用可能具有編碼植物番茄紅素環(huán)化酶的第二種質粒B；或者該質粒具有與轉運序列連接的細菌番茄紅素環(huán)化酶。將其可操作地連接于一種啟動子上，優(yōu)選能產(chǎn)生與質粒A上的八氫番茄紅素合成酶相同的組織專一性表達。質粒A和B的共轉化，能導致全面形成補充目標組織，如根、果實、塊莖、和種子，以便實現(xiàn)從香葉基香葉基二磷酸酯產(chǎn)生β-胡蘿卜素的類胡蘿卜素生物合成途徑。對于現(xiàn)有途徑或該途徑的誘導的晚期反應來說，這種共轉化(參見上文)能夠提高類胡蘿卜素含量并增強β-胡蘿卜素-衍生的葉黃素的形成。
所使用的所有基因都可操作地裝配有編碼能夠輸入質體的轉運序列的DNA序列。這一目的是通過重組DNA技術實現(xiàn)的，或者所述轉運序列存在于使用中的植物cDNA上。然后，所述轉化作用能夠利用存在于質體中的前體香葉基香葉基二磷酸酯庫形成類胡蘿卜素。這種中心化合物既不是類胡蘿卜素，也不是專門僅用于類胡蘿卜素生物合成的前體(參見圖2)。
所述植物應當表達導入的基因，并且優(yōu)選進行純合表達。一般，所述基因應當可操作地連接于能在特別植物的目標宿主細胞中起作用的啟動子上。所述表達的水平應當能夠獲得所述基因的所需特征。例如，選擇標記基因的表達應當提供按照本發(fā)明方法所產(chǎn)生的轉化體的合適選擇。類似的，類胡蘿卜素和葉黃素生物合成途徑上的編碼增強的營養(yǎng)品質的一個或多個基因的表達應當?shù)玫脚c不按照本發(fā)明的方法進行轉化的同一物種相比具有較高含量的一種或多種所述途徑的中間體或產(chǎn)物的植物。另一方面，通常需要限制所述感興趣的基因的過度表達，以便避免對該植物的正常生理學造成明顯的負面影響，即避免達到使其栽培變得困難的程度。
編碼感興趣的酶的基因可用于表達框中，以便在轉化的植物組織中表達。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，即在感興趣的目標植物中導入或補充類胡蘿卜素生物合成途徑，用至少一個包括一個連接于感興趣的基因上的轉錄起始區(qū)的表達框轉化所述植物。
所述轉錄起始可以是宿主所固有的或類似于該宿主或對該宿主來說是外源的或異源的。外源是指所述轉錄起始區(qū)不存在于導入了該轉錄起始區(qū)的野生型宿主中。
特別感興趣的是與儲存蛋白相關的轉錄起始區(qū)，如谷蛋白、patatin、napin、ciferin、β-conglycinin、或菜豆蛋白等。
所述轉錄框沿轉錄的5’-3’方向包括一個轉錄和翻譯起始區(qū)，一個感興趣的DNA序列，以及一個能在植物中起作用的轉錄和翻譯終止區(qū)。所述終止區(qū)可以是所述轉錄起始區(qū)所固有的，可以是所述感興趣的DNA序列所固有的，或者可源于其他來源。常見的終止區(qū)來自根癌農(nóng)桿菌的Ti質粒，如章魚氨酸合成酶和胭脂氨酸合成酶終止區(qū)(同樣參見Guerineau等，1991；Proudfoot，1991；Sanfacon等，1991；Mogen等，1990；Munroe等，1990；Ballas等，1989；Joshi等，1987)。
在多數(shù)情況下，本發(fā)明感興趣的基因是針對質體，如葉綠體表達的。這樣，如果感興趣的基因不是直接插入質體中的話，所述表達框應當額外包括一個編碼轉運肽的序列，以便引導感興趣的基因進入質體。所述轉運肽為本領域技術人員所公知(例如，參見Von Heijne等，1991；Clark等，1989；Della-Cioppa，1987；Romer等，1993；和Shah等，1986)。可用于本發(fā)明的所有類胡蘿卜素途徑基因都可使用天然或異源轉運肽。
所述結構還可以包括任何其他必需調節(jié)子，如植物翻譯共有序列(Joshi，1987)，和內含子(Luehrsen和Walbot，1991)等，它們可操作地連接于感興趣的核苷酸序列上。需要導入的基因上的內含子序列能夠通過穩(wěn)定轉錄物，并使其能夠有效轉運到細胞核外面，并增強其表達。已知的所述內含子序列包括植物遍在蛋白基因的內含子(Cornejo，1993)。另外，業(yè)已觀察到相同的結構插入所述基因組的不同位點上，可以改變在植物中的表達水平，據(jù)信，這一結果至少部分是由于所述基因在染色體上的位置，即單個的分離體會具有不同的表達水平(例如，參見Hoever等，1994)。例如，可用于構建表達框的其他調控DNA序列包括能夠在植物組織中以誘導或抑制方式調控相關DNA序列轉錄的序列。
例如，已知有些植物基因是通過各種內部和外部因素誘導的，如植物激素、熱激、化合物、病原體、缺氧、光照、脅迫等。
能夠調控的另一類DNA序列包括通過化學方法啟動的序列，例如，所述序列存在于煙草的PR(病理相關)蛋白基因上的并可以通過化學調節(jié)子方式誘導的序列，如披露于EP-A0332104中的序列。
在植物中表達外源基因的另一個需要考慮的因素是轉基因基因組的穩(wěn)定性水平，即外源基因從該群體中分離的傾向。如果一種選擇標記連接于感興趣的基因或表達框上，則可以進行選擇，以便保持轉基因植株。
在所述表達框結構中包括5’前導序列是有利的。所述前導序列能夠起到增強翻譯的作用。翻譯前導序列為本領域所公知，并且包括小R病毒前導序列，例如，EMCV前導序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū)；Elroy-Stein等，1989)；馬鈴薯Y病毒組前導序列，例如，TEV前導序列(煙草蝕刻病毒；Allisson等，1986)；和人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP，Macejak和Sarnow，1991)；來自苜?；ㄈ~病毒的外被蛋白mRNA的未翻譯的前導序列(AMV RNA4；Joblig和Gehrke，1987)；煙草花葉病毒前導序列(TMV；Gallie等，1989)；和玉米退綠條斑病毒前導序列(MCMV；Lommel等，1991；還可參見Della-Cioppa，1987)。
根據(jù)感興趣的DNA序列是否要表達，可能需要合成具有植物優(yōu)選密碼子或具有葉綠體優(yōu)選密碼子的序列。植物優(yōu)選密碼子，可以在感興趣的特定植物物種中以最大量表達的蛋白的出現(xiàn)頻率最高的密碼子中確定(參見EP-A0359472；EP-A0386962；WO91/16432；Perlak等，1991；和Murray等，1989)。這樣，可以優(yōu)化所述核苷酸序列在任何植物中的表達。業(yè)已認識到，可以對所述基因序列的全部或任何部分進行優(yōu)化或合成。就是說，也可以使用合成的或部分優(yōu)化的序列。有關葉綠體優(yōu)選基因的構建可以參見USPN5545817。
在制備所述轉錄框時，可以對各種DNA片段進行操作，以便提供正確方向的DNA序列，并且適應于正確的讀框。為此，可以用接頭連接所述DNA片段或者進行其他操作，以便提供常見的限制位點，除去多余的DNA，或除去限制位點等。為此，可以進行體外誘變、引物修復、限制、退火、切除、或連接等，其中，可以進行插入、缺失、或取代，例如，轉換和顛換。
用標準方法將具有感興趣的基因的表達框置入表達載體中。合適表達載體的選擇取決于將該表達載體導入宿主細胞的方法。一種典型的表達載體包括編碼細菌復制起點的原核DNA元件，和在細菌宿主中生長并選擇表達載體的抗生素抗性基因；一個用于插入外源DNA序列的克隆位點，在本發(fā)明中，所述外源DNA序列編碼類胡蘿卜素生物合成途徑的一種或多種特定的酶；控制所述外源基因轉錄起始的真核DNA元件，如啟動子；和控制轉錄物加工的DNA元件，如轉錄終止/聚腺苷酸化序列。它還可以包括最終將該載體整合到染色體上所需的序列。
在一種優(yōu)選實施方案中，所述表達載體還包括一個編碼諸如潮霉素磷酸轉移酶的選擇標記的基因(van den Elzen等，1985)，它與一個啟動子呈功能性連接。能產(chǎn)生抗生素抗性、并因此適合作為選擇標記的其他基因的例子，包括編碼新霉素磷酸轉移酶卡那霉素抗性的基因(Velten等，1984)；源于Tn5的卡那霉素抗性(NPTII)基因(Bevan等，1983)；由Thompson等(1987)所披露的PAT基因；以及氯霉素乙酰轉移酶基因。適用于本發(fā)明的植物表達載體和選擇標記基因的一般性描述可以參見Gruber等(1993)的著述。如上文所述，還可以從包括細菌crtI的表達框中省略其他選擇標記，業(yè)已證實該基因產(chǎn)物能產(chǎn)生對漂白性除草劑的抗性。在這種特定實施方案中，crtI優(yōu)選是受組成型或組織專一型啟動子的控制。在一種高度優(yōu)選的實施方案中，crtI是由綠色光合活性組織或細胞中所特有并且在其中起作用的啟動子控制。
用于分別控制感興趣的基因和標記基因表達的啟動子元件可以是任何植物相容的啟動子。所述啟動子可以是植物基因啟動子，如核酮糖-1，5-二磷酸酯羧化酶小亞基(RUBISCO)的啟動子，或來自根癌農(nóng)桿菌的Ti質粒的啟動子，如胭脂氨酸和章魚氨酸合成酶啟動子或病毒啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子或玄參花葉病毒35S啟動子。例如，適用于本發(fā)明的已知植物啟動子的綜述可以參見國際專利申請?zhí)朩O91/19806。
“組織專一性”啟動子能夠使要表達類胡蘿卜素或葉黃素生物合成途徑產(chǎn)物的組織中的所述一種或多種基因產(chǎn)物的積累量特別高；某些表達可能出現(xiàn)在植物的其他部分。已知組織專一性啟動子的例子包括谷蛋白1啟動子(Kim等，1993；Okita等，1989；Zheng等，1993)，塊莖定向的I型patatin啟動子(Bevan等，1986)；與馬鈴薯塊莖ADPGPP基因相關的啟動子(Muller等，1990)；大豆β-conglycinin的啟動子，又被稱作7S蛋白，它能啟動種子定向的轉錄(Bray，1987)；和來自玉米胚乳的玉米醇溶蛋白基因的種子定向啟動子(Pedersen等，1982)?？捎糜诒景l(fā)明的另一種類型的啟動子是植物遍在蛋白啟動子。植物遍在蛋白啟動子為本領域所熟知，正如由Kay等(1987)和EP-A0342926所證實的。同樣適用于本發(fā)明的有肌動蛋白啟動子、組蛋白啟動子和微管蛋白啟動子。優(yōu)選的化學誘導型啟動子的例子，如煙草PR-1a啟動子詳細披露于EP-A0332104中。另一類優(yōu)選的啟動子是創(chuàng)傷誘導型的。這種類型的優(yōu)選啟動子包括披露于以下文獻中的啟動子Stanford等(1989)，Xu等(1993)，Lozemann等，(1989)，Rohrmeier&Lehle(1993)，F(xiàn)irek等(1993)，和Warner等(1993)。
本發(fā)明所涉及的植物細胞、種子、組織和全植株可以通過若干種方法中的任一種獲得。本領域技術人員可以理解的是，方法的選擇取決于用于轉化的植物的類型，即單子葉或雙子葉植物。所述方法通常包括直接基因轉移、化學誘導的基因轉移、電穿孔、顯微注射(Crossway等，1986；Neuhaus等，1987)，農(nóng)桿菌屬介導的基因轉移，ballistic粒子加速，例如，使用Agracetus公司出售的裝置(Madison，Wisconsin)和杜邦公司(Wilmington，Delaware)出售的裝置(例如，參見Sanford等，US4945050；和McCabe等，1988)。
用于獲得本發(fā)明轉化的植物或其部分的一種方法是直接基因轉移，其中，在合適的條件下培養(yǎng)或以其他方式生長植物細胞，所述培養(yǎng)是在有包括需要導入所述植物或其部分中的核苷酸序列的DNA寡核苷酸的條件下進行的。供體DNA來源通常是包括所需基因的質粒或其他合適載體。為方便起見，這里專指質粒，但要理解的是，也包括所需基因的其他合適啟動子。
能夠攝入所述質粒的任何合適的植物組織都可以通過直接基因轉移處理。例如，所述植物組織包括發(fā)育早期，特別是在減數(shù)分裂之前，特別是減數(shù)分裂之前的1-2周的生殖結構，一般，將減數(shù)分裂之前的生殖器官浸泡在質粒溶液中，例如，通過將質粒溶液直接注射到植物的生殖器官中或靠近生殖器官的地方。然后讓所述植物自花授粉，或者與用同樣方法處理過的另一個植株異花授粉。在每一個花結構中，所述質粒溶液通過在大約0.1-10毫升體積中含有大約10-50微克DNA，但可以根據(jù)特定花結構的大小高于或低于這一用量。所述溶劑通常是無菌水、鹽水、或緩沖過的鹽水、或常規(guī)植物培養(yǎng)基，如果需要，所述質粒溶液可以含有能化學誘導或增強質粒攝取的試劑，如PEG、或Ca2+等。
所述生殖器官在接觸所述質粒之后，讓所述花結構生長到成熟，并收獲種子。根據(jù)質粒標記，可以通過在標記敏感性或優(yōu)選在標記抗性培養(yǎng)基中發(fā)芽或生長植株選擇具有所述標記基因的轉化植物。例如，從用具有卡那霉素抗性基因的質粒處理過的植株上獲得的種子仍然保持綠色，而沒有該標記基因的植株會白化。還可以通過常規(guī)Southern、Northern和Western印跡技術證實所需mRNA基因轉錄和肽表達的存在。
在適用于完成本發(fā)明的另一種方法中，對植物原生質體進行處理，以便誘導所述質粒的攝入。原生質體制備為本領域所熟知，并且通常包括用纖維素酶或其他酶消化植物細胞足夠長的時間，以便除去細胞壁。通常通過篩分和洗滌將原生質體與消化混合物分離。然后將原生質體懸浮在合適培養(yǎng)基中，如培養(yǎng)基F，CC培養(yǎng)基等，通常為104-107細胞/毫升。然后向該懸浮液添加上述質粒溶液和諸如聚乙二醇、Ca2+、或仙臺病毒之類的誘導物。另外，所述質粒可以膠囊化于脂質體中。然后將所述質粒溶液和原生質體培養(yǎng)一段合適的時間，通常是在大約25℃下培養(yǎng)大約1小時。在某些場合下，可能需要熱激所述混合物，通過加熱到大約45℃，保持2-5分鐘，并迅速冷卻到所述培養(yǎng)溫度而實現(xiàn)。然后對處理過的原生質體進行克隆，并選擇所需基因的表達，例如，通過表達所述標記基因和常規(guī)吸印技術。然后按常規(guī)方法由所述克隆再生全植株。
電穿孔技術是類似的，所不同的是，通常在電穿孔室中，在沒有或有聚乙二醇或Ca2+的條件下對裸露的質粒和原生質體的混合物施加電流。典型的電穿孔包括用40-10000DC伏特的電壓進行1-10次脈沖，脈沖時間為1-2000微秒，脈沖的時間間隔通常為0.2秒。還可以采用相似程度的交流電脈沖。更具體地講，讓一個充電的電容器通過含有所述質粒原生質體懸浮液的電穿孔室放電。該處理會導致生物膜可滲透性的可逆的增加，并因此能夠插入本發(fā)明的DNA。電穿孔的植物原生質體可以再生其細胞壁，分裂并形成愈傷組織(例如，參見Riggs等，1986)。
適用于轉化目標細胞的另一種方法包括使用農(nóng)桿菌。在該方法中，用包括具有所需基因或基因框的質粒的農(nóng)桿菌感染植物細胞，并將所述質粒插入靶細胞的基因組中。然后按上述方法篩選并克隆能表達所需基因的細胞。例如，通過質粒，如Ri質粒和農(nóng)桿菌，如發(fā)根或根癌農(nóng)桿菌將感興趣的基因導入目標組織，如塊莖、根、谷?；蚨怪械囊环N方法，是利用適用于克隆到大腸桿菌中的小的重組質粒，在該質粒中業(yè)已剪接了T-DNA片段，在所述T-DNA內的一個位點上將該重組質粒切開，將一段“乘客”DNA剪接到該切口上。所述乘客DNA包括要整合到所述植物DNA中的本發(fā)明的基因和一個選擇標記，如編碼對抗生素抗性的基因。然后將該質粒再次克隆到較大的質粒上，然后導入具有未修飾過的Ri質粒的農(nóng)桿菌菌株中。在所述細菌生長期間，有時會發(fā)生罕見的雙重組，會產(chǎn)生T-DNA獲得了插入片段-即所述乘客DNA的細菌。然后根據(jù)其能在含有所述抗生素的培養(yǎng)基存活鑒定并選擇所述細菌。將所述細菌用于將其T-DNA(用乘客DNA修飾過)插入植物基因組。該方法采用發(fā)根農(nóng)桿菌或根癌農(nóng)桿菌，產(chǎn)生了能再生成健康的，有活力的植株的轉化植物細胞(例如，參見Hinchee等，1988)。
另一種合適的方法是用所述轉化的DNA包衣的微粒轟擊所述細胞(Wang等，1988)，或通過壓力沖擊沿待轉化細胞方向對含有DNA的溶液進行加速，在所述壓力沖擊的作用下將該溶液分散成很細的煙霧(WP-A0434616)。
微粒轟擊被作為包括植物細胞在內的細胞的有效轉化技術。在Sanford等(1987)的著述中，報導了微粒轟擊能將核酸有效輸送到洋蔥的植物細胞細胞質中。Chrisstou等(1988)報導了通過微粒轟擊用卡那霉素抗性基因穩(wěn)定地轉化大豆愈傷組織。同一位作者還報導了能穿透至少大約0.1-5％的細胞，并發(fā)現(xiàn)了轉化的愈傷組織在可觀察水平的NPTII酶活性和高達400毫克/升卡那霉素中具有抗性。McCabe等(1988)報導了用微粒轟擊穩(wěn)定轉化大豆。McCabe等還報導了從R0嵌合植株中回收轉化的R1植株(還可以參見Weissinger等，1988；Datta等，1990(水稻)；Klein等，1988a(玉米)；Klein等，1988b(玉米)；Fromm等，1990；和Gordon-Kamm等，1990(玉米))。
另外，可以直接轉化植物質體。業(yè)已報導了在高等植物中對葉綠體的穩(wěn)定轉化，例如，參見Svab等，1990；Svab和Maliga，1993；Staub和Maliga，1993。該方法依賴于含有選擇標記的DNA的粒子槍輸送，并通過同源重組讓該DNA定向到質體基因組中。在所述方法中，質體基因表達可以用質體基因啟動子完成，或者通過反式激活沉默的質體所具有的轉基因而實現(xiàn)，所述轉基因是用于由選擇性的啟動子序列進行表達的，如由T7 RNA聚合酶識別。所述沉默的質體基因是通過以下方式激活的由細胞核表達結構表達特定的RNA聚合酶，并利用轉運肽將該聚合酶定向到所述質體中。組織專一性表達可以用以下方法獲得利用由合適的植物組織專一性啟動子表達的細胞核編碼的、并且是質體定向的特定RNA聚合酶。所述系統(tǒng)業(yè)已披露于McBride等的著述中(1994)。
上文通過舉例的方式所列舉的可行的轉化方法并不完全，并且并非要以任何方式限定本發(fā)明的主題。
因此，本發(fā)明還包括選自原生質體、細胞、愈傷組織、組織、器官、種子、胚胎、胚珠、合子等的轉基因植物材料，特別是全植株，所述轉基因植物材料通過本發(fā)明的方法轉化過，并且包括可表達形式的本發(fā)明的重組DNA。并且，本發(fā)明還包括用于生產(chǎn)所述轉基因植物材料的方法。
用本領域眾所周知的方法將陽性轉化體再生成植株(例如，參見McCormick等，1986)。然后可以讓所述植株生長，并用相同的轉化株系或不同的株系授粉，然后評估其后代中所需特性的存在和/或所需特性表達的程度，并鑒定所得到的具有所需表型特征的雜種。例如，第一次評估可以包括轉化植株的細菌/真菌抗性水平。可以生長兩代或兩代以上，以便證實目標表型特征得到穩(wěn)定地保持和遺傳，然后收獲種子，以確保業(yè)已獲得所需的表型或其他特性。
本發(fā)明的范圍還包括轉基因植物，特別是用本發(fā)明方法轉化過的轉基因可育植物及其由于轉化母本而仍然具有新的或所需特性的無性和/或有性后代。
術語‘后代’被理解為包括轉基因植株的“無性”和“有性”繁殖后代。該定義還意味著包括可以通過諸如細胞融合或突變體篩選的已知方法獲得的所有突變體和變體，所述突變體仍然具有原始轉化植株所具有的特有特征，還包括所述轉化植物材料的所有雜交和融合產(chǎn)物。
本發(fā)明的目的還包括植株部分，如事先用本發(fā)明方法轉化過的轉基因植物或其后代的花、莖、果實、葉、根，因此它至少包括部分轉基因細胞。
下面的實施例是說明性的，而不是要限定本發(fā)明。
生物學材料的保藏攜帶有本發(fā)明表達框的大腸桿菌菌株業(yè)已按照布達佩斯條約規(guī)定交由德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ)保藏，Braunschweig，德國，保藏號如下菌株 保藏號PRiceCYCTOP10(質粒B的框) DSM12714Pbaa142TOP10(質粒A的框) DSM12713實施例將前維生素A(β胡蘿卜素)和葉黃素生物合成導入不含類胡蘿卜素的水稻胚乳。
八氫番茄紅素形成(Burkhardt等，1997)以前用放射性標記過的異戊烯二磷酸酯進行的生物化學研究業(yè)已證實，水稻胚乳具有酶促活性的GGPP合成酶，因此，提供了類胡蘿卜素生物合成的重要前體。因此，通過微粒轟擊方法，用來自黃水仙的、受組成型控制并受胚乳專一性啟動子控制的編碼八氫番茄紅素合成酶cDNA，轉化日本水稻模型品種Taipei309(黃水仙；保藏號X78814，Schledz和Beyer，1996)。在轉基因水稻植物中，證實了黃水仙酶通過無色胡蘿卜素八氫番茄紅素在水稻胚乳中的體內積累而被激活。因此，首次證實了原則上可以在非光合的、缺乏類胡蘿卜素的組織中通過工程方法實現(xiàn)類胡蘿卜素生物合成的第一個類胡蘿卜素專一的酶促步驟。
將通向番茄紅素、β胡蘿卜素(前維生素A)和葉黃素類胡蘿卜素生物合成途徑導入水稻胚乳。質粒構建有關標準分子生物學技術參見Sambrook等，1989(有關結構的示意性說明參見圖4)。有關類胡蘿卜素生物合成酶的結構基因為Psy源于黃水仙的八氫番茄紅素合成酶(保藏號X78814)。
CrtI源于噬夏孢歐文氏菌的與豌豆Rubisco的轉運序列融合的胡蘿卜素脫飽和酶(Misawa等，1993)。
Cyc源于黃水仙的番茄紅素環(huán)化酶(保藏號X98796)。
構建pB19hpc(在本文中被稱為“質粒A”)Misawa等(1993)業(yè)已構建了具有源于噬夏孢歐文氏菌的完整的八氫番茄紅素脫飽和酶(crtI)基因和位于CaMC35S-啟動子下游和nos3’聚腺苷化信號上游的豌豆Rubisco小亞基(tp)的轉運肽序列的DNA片段，并將其連接到HindIII/EcoRI消化過的pUC19上，以便獲得質粒pUCET4。以HindIII/EcoRI片段形式將crtI表達框從pUCET4上切除，并連接到HindIII/EcoRI消化過的pBluescriptKS上，得到質粒pBaal1。用SacII消化具有psy表達框的質粒pGt1PsyH(Burckhardt等，1997)，它包括受水稻谷蛋白1啟動子(Gte；Kim等，1993；Okita等，1989；Zheng等，1993)控制的源于黃水仙的八氫番茄紅素合成酶cDNA(保藏號X78814)和nos3’聚腺苷化信號。并用T4-DNA聚合酶補平末端。為了獲得psi表達框，用KpnI進行再次消化。然后將SacII(補平的)/KpnI片段連接到用pBaal1消化過的XhoI(補平的)/KpnI上，以便獲得具有crtI和psy表達框的質粒pBaal2。
取代pUC18上的多接頭位點，以便按以下順序包括以下限制位點HindIII、I-SceI、KpnI、NotI、SmaI、IsceI、EcoRI。用KpnI和NotI消化所得到的質粒pUC18M。用KpnI和NotI將具有crtI和psy表達框的DNA片段從pBaal2上切除，并連接到上述消化過的pUC8M上。所得到的質粒pBaal3含有雙表達框，其旁側為大范圍核酸酶限制位點(I-SceI)。
以KpnI片段形式將含有在CaMV35S啟動子和CaMV35S聚腺苷酸化控制之下的aph IV的潮霉素磷酸轉移酶aph IV表達框從pRice上切除(參見質粒B的結構)，并連接到KpnI消化過的pBaal3上。所得到的pBaal42和pBaal41沿相同的方向包括潮霉素抗性框，類似于psy表達框(pBaal42)，或者呈相反方向(pBaal41)。
用EcoRI和HandIII消化載體pBin19(Bevan，1984)，并用標準方法導入含有以下順序的下列限制位點的合成寡核苷酸序列HandIII、I-SaeI、KpnI、NotI、SmaI、IsceI、EcoRI，由此產(chǎn)生pBin19M。
通過大范圍核酸酶位點I-sceI將crtI、psy和aph IV的表達框從pBaal42上切除，并連接到用I-sceI消化過的pBin19M上。然后將所得到的質粒pB19hpc用于轉化。構建pZCycH(在本文中被稱為“質粒B”)用EcoRI/BglII切除pKS1上的谷蛋白1啟動子Gt1(Okita等，1989)。并連接到用BamHI/MunI消化過的pV34(Futtere和Potrykus，未發(fā)表)上，位于兩個I-SceI大范圍核酸酶位點之間，以便獲得質粒pV34Gt1。在用SalI和SacI從pCIB900(Wunn等，1996)上切除之后，所述潮霉素磷酸轉移酶基因aph IV表達框含有CaMV 35S聚腺苷酸化信號，其后是CaMV35S啟動子控制下的aph IV，以及另一個CaMV35S聚腺苷酸化信號。將XhoI接頭連接到所獲得的片段的SalI位點上，然后將該框連接到pV34Gt1上，以便獲得所述質粒(pRice)。用Ecl136II和BamHI將源于黃水仙的番茄紅素環(huán)化酶cyc(保藏號X99796)從質粒pGEM4CYC上切除(Bonk等，1997)。在用Klenow片段處理之后，將cyc連接到Ec136II消化過的pRice上，以便獲得pRiceCYC。
用EcoRI和HindIII消化載體pPZP100(Hajdukiewicz等，1994)，并用標準方法導入一個含有以下順序的限制位點的合成寡核苷酸序列HindIII、I-SceI、KpnI、NotI、SmaI、IsceI、EcoRI，以便形成pPZP100M。
用IsceI大范圍核酸酶將cyc aph IV雙框從pRiceCYC上切除，并連接到IsceI消化過的pPZP100M上，以便獲得轉化質粒pZCycH。愈傷組織誘導和轉化愈傷組織誘導從溫室生長的植株上采集日本水稻栽培種TP309的乳熟期的未成熟的種子，在70％乙醇(v/v)中表面消毒1分鐘，在搖床上，在6％次氯酸鈣中培養(yǎng)1小時，然后用無菌蒸餾水漂洗3-5次。然后在超凈工作臺上，在雙目顯微鏡下從消毒組織上分離未成熟的胚胎，并在NB培養(yǎng)基(N6鹽和B5維生素，補充了30克/升麥芽糖，500毫克/升脯氨酸，300毫克/升酪蛋白水解產(chǎn)物，500毫克/升谷氨酰胺，和2毫克/升2，4-D，pH5.8)上培養(yǎng)。4-5天除去胚芽鞘，并在新的NB培養(yǎng)基上對膨大的盾片進行繼代培養(yǎng)3-5天，直到接種農(nóng)桿菌。
農(nóng)桿菌介導的轉化按公開方法(Uze等，1997)將1周齡預先培養(yǎng)的未成熟胚胎浸泡在根癌農(nóng)桿菌LBA4404細胞懸浮液中。為了共轉化兩種獨立的載體——pZPsC和pZCycH，將LBA4404/pZPsC(OD600＝2.0)與等體積的LBA4404/pZCycH(OD600＝1.0)混合，在用丙酮丁香酮誘導之后用于接種。在補充了200mM丙酮丁香酮的NB培養(yǎng)基上共培養(yǎng)接種過的預培養(yǎng)的胚胎3天，在回收培養(yǎng)基(含有250毫克/升頭孢氨噻的NB)上繼代培養(yǎng)1周，然后轉移到含有30毫克/升潮霉素和250毫克/升頭孢氨噻的NB選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)4-6周。在補充了0.5毫克/升NAA和3毫克/升BAP的NB培養(yǎng)基上，用4周時間由回收的抗性愈傷組織再生植株，長根并轉移到溫室中。Southern印跡為了證實所述轉基因的存在，按照標準方法(Sambrook等，1989)，用源于八氫番茄紅素合成酶、CrtI和環(huán)化酶的同源標記的探針實施Southern印跡。類胡蘿卜素色素分析將來自R0植株的種子(1克)去皮，并在搖床上用金剛砂紙?zhí)幚?小時，以便除去種子包衣。目測檢查轉化的品系，發(fā)現(xiàn)了由于類胡蘿卜素的存在而出現(xiàn)的明顯可檢測的黃色。另外，在某些場合下的分離形式是可檢測的，非常接近預期的3(黃色)∶1(白色)的比例。
用微量粉碎機(Bruan，Melsungen)將來自單個品系的種子各50粒)一起磨成細粉。用丙酮對所述細粉進行反復萃取，以便徹底脫色。在氮氣流下讓合并的提取物干燥。將殘余物溶解在氯仿中，并用裝有光學二極管排列的檢測器的Waters HPLC系統(tǒng)和C30反相柱(YMCEurope GmbH)進行定量HPLC分析。用溶劑系統(tǒng)AMeOH∶叔丁基甲基乙醚(1∶1，v/v)，BMeOH∶叔丁基甲基乙醚∶H2O(6∶1.2∶1.2，v/v/v)進行分離，在25分鐘內使用100％B-43％B的梯度，然后再用75分鐘時間達到0％B。將該最終條件再維持10分鐘，然后再重新平衡。在圖3A中給出了用未轉化對照所獲得的結果的例子，在圖3B中給出了用僅具有質粒A的品系所獲得的結果，而在圖3C中給出了用具有質粒A和B的品系獲得的結果。很明顯，在轉化體中積累了類胡蘿卜素。所述對照有時表現(xiàn)出微量的類胡蘿卜素，它可能在最大程度上是由于種子包衣所造成的，種子包衣難于徹底清除。在轉化種子中所檢測到的類胡蘿卜素，β胡蘿卜素(前維生素A)是主要產(chǎn)物(高達60％)。另外，成葉黃素途徑是有效的，導致葉黃素和玉米黃質的形成，以及某些數(shù)量的環(huán)氧化類胡蘿卜素的形成。所得到的結論是，所述途徑的后一部分要么是由轉化誘導的，要么是由源于該轉化的產(chǎn)物誘導的。另外，所述成葉黃素途徑在水稻胚乳中是以組成型形式表達的，導致葉黃素玉米黃質和葉黃素加上代表環(huán)氧化葉黃素的某些其他微量成分的形成。
原則上講，僅用質粒A轉化過的品系表現(xiàn)出相同的類胡蘿卜素特征，不過，類胡蘿卜素的含量一般較低，因此，上述結論可以延伸到水稻胚乳中的番茄紅素環(huán)化酶上。
特別是葉黃素和玉米黃質的存在，被視為具有出人意料的額外價值，因為它具有正面效果，例如，在視覺方面的效果(參見Brown等，1998；Schalch，1992)。
很顯然，根據(jù)以上說明，可以對本發(fā)明作出多種改進和改變。因此，應當理解的是，在所附權利要求書的范圍之內，可以除上述具體說明以外的方式實施本發(fā)明。普遍存在于植物材料中的前體香葉基香葉基二磷酸酯為了證實GGPP在除水稻以外的其他組織中的存在，以類似于上述水稻胚乳的方法用從小麥的兩種實驗室品種，大麥的兩種品種和Cavendish香蕉果實進行培養(yǎng)實驗。將未成熟的小麥和大麥谷粒去皮，取出胚乳，并除去胚胎。培養(yǎng)實驗是在存在0.5μCi[1-14C]異戊烯二磷酸酯的條件下在100mM Tris/HCl緩沖液pH7.4，10mM氯化鎂、1mM氯化錳、3mM ATP中，在25℃下進行6小時。在每一個實驗中添加堿性磷酸酶，以便所形成的異戊烯二磷酸酯進行脫磷酸化。在3-6小時之后，通過用氯仿/甲醇(2/1，v/v)萃取，分離包括相應的異戊二烯醇的脂溶性材料。然后按上述方法進行HPLC分析。
在來自檢驗過的小麥品種的胚乳中(兩個品種基本上都不含類胡蘿卜素)，用真實的脫磷酸化GGPP(用來自白芥的重組GGPP合成酶產(chǎn)生的)觀察到了非常顯著的信號，證明它是香葉基香葉醇。因此，通過將前維生素A生物合成轉化到小麥中進行安裝，與在水稻上一樣可行。在大麥中也觀察到了相應醇形式的較少的，但是可檢測數(shù)量的GGPP。這是由于表達所產(chǎn)生的，即大麥胚乳表現(xiàn)出稍小背景的類胡蘿卜素形成。類似地，Cavendish香蕉產(chǎn)生了類胡蘿卜素，因此，特別是在成熟狀態(tài)下觀察到形成GGPP活性的存在并不意外。
CPTA誘導類胡蘿卜素生物合成基因很早以前就已知的番茄紅素環(huán)化酶抑制劑CPTA(2-(4-氯苯基硫代)氯化三乙胺)及相關化合物(例如，參見El-Sayed Osman等，1984；Fosket和Radin1982)模擬物與用質粒A進行轉化的番茄紅素積累相關。為了證實類胡蘿卜素生物合成基因的上調，我們按照Scheutz和Baldwin(1957)披露的方法合成了CPTA，將該化合物的濃度為1mM水溶液施加到黃水仙花上。這種沒有光合作用活性的組織象預期的那樣產(chǎn)生了積累番茄紅素的反應。不過，用CPTA(一種抑制劑)的主要作用無法解釋的是，類胡蘿卜素的含量幾乎翻番。因此，進行了Northern和Western印跡分析，以便證實對編碼類胡蘿卜素生物合成酶的轉錄物的豐裕量或酶豐裕量的誘導。
圖5A提供了Northern印跡的結果。從未處理過的(泳道1)和CPTA處理過的花中分離總RNA。反復劃擦固定的RNA，以便隨后能與八氫番茄紅素合成酶(B)、八氫番茄紅素脫飽和酶(C)、ζ-胡蘿卜素脫飽和酶和番茄紅素環(huán)化酶的探針雜交。很顯然，除了ζ-胡蘿卜素脫飽和酶之外，包括番茄紅素環(huán)化酶在內的所有特定胡蘿卜素發(fā)生RNA的含量都增加了。
為了進行Western印跡分析(參見圖5B)，從未處理過的和用CPTA處理過的花中分離總蛋白，并在SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳(每個泳道30微克蛋白)之后轉移到硝酸纖維素膜上。讓所述印跡與抗八氫番茄紅素合成酶(A)、八氫番茄紅素脫飽和酶(B)、ζ-胡蘿卜素脫飽和酶(C)和番茄紅素環(huán)化酶的抗體一起培養(yǎng)。顯然，在蛋白水平上，在CPTA處理中出現(xiàn)了酶豐度的增加。
通過上面所提供的水稻的數(shù)據(jù)我們可以得出結論，類胡蘿卜素(或其衍生產(chǎn)物)能夠以遺傳學方式，以反饋機制形式誘導類胡蘿卜素的形成。
因此，本發(fā)明提供了通過遺傳工程將類胡蘿卜素生物合成途徑導入不含類胡蘿卜素的組織中，或提高現(xiàn)有類胡蘿卜素生物合成途徑產(chǎn)量的方法。該方法可用于改善營養(yǎng)價值、改善種子、果實、塊莖、花或葉子的藥理學價值和外觀。
本發(fā)明主要用于改善營養(yǎng)要求，其中，并非特別與產(chǎn)生大量類胡蘿卜素相關。例如，磨過的稻米包括胚乳，它不含有可檢測的有色類胡蘿卜素。存在于種子包衣中的類胡蘿卜素在加工期間被除去了。該工藝是長期儲存稻米谷物所必需的。
本發(fā)明是從頭工程產(chǎn)生類胡蘿卜素生物合成途徑的第一個例子，并可應用于在農(nóng)藝上有重要價值的不含類胡蘿卜素的農(nóng)作物的其他組織上。例如，不含有色的或無色的類胡蘿卜素的其他谷類種子，根組織。它并不排除該方法在增加或改變現(xiàn)有類胡蘿卜素方面的潛在用途。
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1.一種分離的DNA分子，包括具有一個或多個表達框的核苷酸序列，所述表達框能夠指導選自下列一組的類胡蘿卜素生物合成途徑所特有的一種或多種酶產(chǎn)生-源于植物、真菌、或細菌的八氫番茄紅素合成酶，-源于植物、真菌、或細菌的八氫番茄紅素脫飽和酶，-源于植物的ζ-胡蘿卜素脫飽和酶，和-源于植物、真菌、或細菌的番茄紅素環(huán)化酶，其前提是，排除了僅能指導八氫番茄紅素合成酶產(chǎn)生的表達框。
2.如權利要求1的DNA分子，其中，所述表達框包括一個或多個編碼植物、真菌或細菌八氫番茄紅素合成酶，植物、真菌或細菌八氫番茄紅素脫飽和酶，植物ζ-胡蘿卜素脫飽和酶，或植物、真菌、或細菌的番茄紅素環(huán)化酶的基因或cDNA，所述基因各自可操作地與合適的組成型、誘導型、或組織專一型啟動子連接，使其能在植物細胞、種子、組織或全植株中表達，其前提是，排除了僅包括編碼八氫番茄紅素合成酶的基因或cDNA的表達框。
3.如權利要求1或2的DNA分子，還包括至少一個可操作地連接于能使其在植物細胞、種子、組織或全植株中表達的組成型、誘導型或組織專一型啟動子上的選擇標記基因或cDNA。
4.如權利要求1-3中任一項的DNA分子，其中，所述編碼八氫番茄紅素合成酶的核苷酸序列源于植物，優(yōu)選在組織專一型啟動子的控制下表達。
5.如權利要求1-4中任一項的DNA分子，其中，所述編碼八氫番茄紅素脫氫酶的核苷酸序列源于細菌并且與合適的質體轉運肽編碼序列融合，這兩個序列優(yōu)選在組織專一型或組成型啟動子的控制下表達。
6.如權利要求1-5中任一項的DNA分子，其中，所述編碼源于植物的番茄紅素環(huán)化酶的核苷酸序列優(yōu)選是在組織專一型或組成型啟動子的控制下表達。
7.如權利要求2-6中任一項的DNA分子，其中，所述選擇標記基因或cDNA是受組成型啟動子控制的潮霉素磷酸轉移酶。
8.如權利要求1-7中任一項的DNA分子，其中，所述核苷酸序列包括編碼八氫番茄紅素合成酶和細菌或真菌八氫番茄紅素脫飽和酶的功能性表達框。
9.如權利要求1-7中任一項的DNA分子，其中，所述核苷酸序列包括編碼番茄紅素環(huán)化酶的功能性表達框。
10.如權利要求5或8的DNA分子，其中，所述質體轉運肽序列源于豌豆Rubisco小亞基(tp)。
11.一種包括一個或多個權利要求1-10中任一項所述的DNA分子的質粒或載體系統(tǒng)。
12.如權利要求11的質粒或載體系統(tǒng)，它源于根癌農(nóng)桿菌。
13.含有權利要求1-10中任一項所述DNA分子的轉基因植物細胞、種子、組織或全植株。
14.如權利要求13的轉基因植物細胞、種子、組織或全植株，選自下列一組真核藻類，有胚植物，包括苔蘚植物、蕨類植物、和種子植物，如裸子植物和被子植物，后者包括Magnoliopsida，Rosopsida、Liliopsida(單子葉植物)。
15.如權利要求14的轉基因植物細胞、種子、組織或全植株，選自下列一組谷類種子，優(yōu)選水稻、小麥、大麥、燕麥、莧、亞麻、黑小麥、黑麥、和玉米；油用種子，優(yōu)選蕓薹種子、棉籽、大豆、紅花、向日葵、椰子果、和棕櫚；其他食用種子或具有可食用部分的種子，選自南瓜、西葫蘆、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹木堅果，優(yōu)選胡桃、杏、大胡桃、鷹嘴豆；馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、番茄、辣椒、木薯、柳樹、橡樹、榆樹、楓樹、蘋果、香蕉；以及觀賞花卉，優(yōu)選百合、蘭花、蘆葦、薔薇、毛茛、矮牽牛、草夾竹桃、紫羅蘭、和向日葵。
16.一種轉化植物細胞、種子、組織或全植株以便產(chǎn)生能夠表達產(chǎn)生感興趣的胡蘿卜素或葉黃素所必需的類胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶的轉化體的方法，包括用一種或多種如權利要求1-10中任一項所述DNA分子或用權利要求1或11所述的質?；蜉d體系統(tǒng)轉化所述植物細胞、種子、組織或全植株。
17.如權利要求16的方法，其中，被選擇用于轉化的宿主植物細胞、種子或組織正常情況下是不含類胡蘿卜素的。
18.如權利要求16的方法，其中，被選擇用于轉化的所述宿主植物細胞、種子或組織正常情況下含有希望增加或改變量的類胡蘿卜素。
19.由權利要求16-18中任一項所產(chǎn)生的轉化體再生的轉化全植株或其部分，選自下列一組真核藻類，有胚植物，包括苔蘚植物、蕨類植物、和種子植物，如裸子植物和被子植物，后者包括Magnoliopsida，Rosopsida、Liliopsida(單子葉植物)。
20.如權利要求19的轉化過的全植株或其部分，選自下列一組谷類種子，優(yōu)選水稻、小麥、大麥、燕麥、莧、亞麻、黑小麥、黑麥、和玉米；油用種子，優(yōu)選蕓薹種子、棉籽、大豆、紅花、向日葵、椰子果、和棕櫚；其他食用種子或具有可食用部分的種子，選自南瓜、西葫蘆、芝麻、罌粟、葡萄、綠豆、花生、豌豆、菜豆、蘿卜、苜蓿、可可、咖啡、大麻；樹木堅果，優(yōu)選胡桃、杏、大胡桃、鷹嘴豆；馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、番茄、辣椒、木薯、柳樹、橡樹、榆樹、楓樹、蘋果、香蕉；以及觀賞花卉，優(yōu)選百合、蘭花、蘆葦、薔薇、毛茛、矮牽牛、草夾竹桃、紫羅蘭、和向日葵。
全文摘要
本發(fā)明提供了轉化植物細胞、種子、組織或全植株以便產(chǎn)生能夠表達類胡蘿卜素生物合成途徑的所有酶的轉化體的裝置和方法,這些酶是目標宿主植物積累感興趣的胡蘿卜素和/或葉黃素所必需的。本發(fā)明還提供了為了適用于實施本發(fā)明方法而設計的DNA分子,以及包括所述分子的質粒和載體系統(tǒng)。另外,本發(fā)明提供了具有改善了的營養(yǎng)品質、并含有所述DNA分子的和/或用本發(fā)明方法產(chǎn)生的轉基因植物細胞、種子、組織和全植株。
文檔編號C12N15/82GK1347454SQ00804609
公開日2002年5月1日 申請日期2000年3月3日 優(yōu)先權日1999年3月5日
發(fā)明者P·貝耶, I·波特賴庫斯 申請人:格林諾瓦森植物生物技術股份有限公司