專利名稱：：對真菌毒素具有抗性的轉基因植物和方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及轉基因宿主，特別是具有單端孢烯(trichothecene)抗性的轉基因植物、植物組織、種子、和細胞，及其產(chǎn)生和使用方法。本發(fā)明還涉及用于在植物、植物組織、種子、或植物細胞上預防和/或減少真菌生長的方法。本發(fā)明還涉及預防和/或減少植物、植物組織、或種子真菌毒素污染。本發(fā)明還涉及使用單端孢烯作為轉化方案中的選擇劑。很多真菌對重要的經(jīng)濟農(nóng)作物具有嚴重危害。而且，真菌毒素對農(nóng)作物的污染是世界范圍的主要農(nóng)業(yè)難題。真菌毒素是經(jīng)常在農(nóng)業(yè)產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的有毒真菌代謝物，它能夠引起脊椎動物的健康問題。單端孢烯是由鐮孢屬(Fusarium)、單端孢屬(Trichothecium)、和漆斑菌屬(Myrothecium)物種產(chǎn)生的倍半萜烯環(huán)氧化物真菌毒素，是真核蛋白質合成的強抑制劑。產(chǎn)生這些單端孢烯的鐮孢屬物種包括尖圭鐮孢(F.acuminatium)、F.crookwellense、大刀鐮孢(F.culmorum)、木賊鐮孢(F.equiseti)、禾本科鐮孢(F.graminearum)(玉蜀黍赤霉Gibberellazeae)、桑磚紅鐮孢(F.lateritium)、早熟禾鐮孢(F.poae)、接骨木鐮孢(F.sambucinum)(虱狀赤霉G.pulicaris)、和擬分枝孢鐮孢(F.sporotrichioides)(W.F.O.Marasas、P.E.Nelson、和T.A.Toussoun，1984)。正如先前描述的(A.E.Desjardins和T.M.Hohn，植物發(fā)病機理中的真菌毒素，植物與微生物的分子相互作用(Mol.Plant-MicrobeInteract.)10(2)147-152，1997)，農(nóng)場動物和人的急性和慢性真菌毒素中毒癥都與食用被產(chǎn)生單端孢烯真菌毒素的鐮孢屬物種污染的小麥、黑麥、大麥、燕麥、稻、和玉米有關。使用低劑量水平化學純的單端孢烯的實驗再現(xiàn)了在動物發(fā)霉谷粒中毒癥中觀察到的許多特征，包括貧血、免疫抑制、出血、嘔吐和拒絕進食。人群的病史和傳染病學資料指出了某些傳染病與食用被產(chǎn)生單端孢烯的鐮孢屬物種感染的谷物之間的聯(lián)系。特別提到的是，十九世紀俄國爆發(fā)的致命的消化器官中毒性白細胞缺乏癥與食用被產(chǎn)生單端孢烯T-2毒素的鐮孢屬物種污染的過冬谷物有關。在日本，稱為akakabi-byo或赤霉病的類似疾病的爆發(fā)與被產(chǎn)生單端孢烯，脫氧瓜蔞鐮孢醇(以下稱“DON”)的鐮孢屬物種感染的谷物有關。在對印度和日本最近爆發(fā)的人類疾病負有責任的有毒谷物樣品中檢測到單端孢烯。因此，存在對用于預防的農(nóng)業(yè)方法和真菌毒素污染水平減少的農(nóng)作物的需要。此外，產(chǎn)生單端孢烯的鐮孢屬物種是破壞性的病原體，它們攻擊廣泛的植物物種。單端孢烯的急性植物毒性及其在植物組織中的存在還說明，這些真菌毒素在鐮孢屬對植物的發(fā)病中具有作用。這意味著真菌毒素在疾病中具有作用，因此，減少其對植物的毒性同樣可能預防或減少植物疾病。此外，疾病水平的降低可能還有其它好處，即降低真菌毒素對植物(特別是谷物)的污染，這里的植物指谷類植物。已經(jīng)用于控制植物疾病(諸如玉米穗腐爛、原種腐爛、或小麥尖枯萎)的各種方法獲得了不同程度的成功?？刂浦参锛膊〉囊环N方法是對農(nóng)作物施用抗微生物的化學藥品。這種方法有很多本領域周知的問題?；蛘撸罱姆椒òㄊ褂蒙飳W控制生物(“生物控制”)，即有害生物的天然競爭者或抑制者。然而，大面積應用生物控制是困難的，使那些活的生物長時間停留在治理地區(qū)甚至更困難。最近，重組DNA技術提供了將克隆基因插入植物細胞從而表達抗微生物化合物的機會。然而，這種技術使得人們更加關注微生物最終對眾所周知的、天然存在的抗菌劑的抗性。因此，存在鑒定天然存在的抗微生物試劑的持續(xù)需要，諸如可以通過單基因轉化由植物細胞直接產(chǎn)生的蛋白質。已經(jīng)在擬分枝孢鐮孢中鑒定了催化許多不同鐮孢單端孢烯(包括DON的C3羥基)的乙?；磻膯味随呦?-O-乙?；D移酶(S.P.McCormick、N.J.Alexander、S.C.Trapp、和T.M.Hohn，來自擬分枝孢鐮孢、編碼單端孢烯3-O-乙酰基轉移酶的基因，TRI101的斷裂，應用和環(huán)境微生物學(Applied.Environ.Microbiol.)65(12)5252-5256，1999)。單端孢烯在C3-OH的乙?；@著降低其在脊椎動物和植物中的毒性，并產(chǎn)生反應產(chǎn)物3-乙酰脫氧瓜蔞鐮孢醇(以下“3ADON”)。參閱Kimura等人，見下文。已經(jīng)發(fā)布了來自禾本科鐮孢和擬分枝孢鐮孢之編碼單端孢烯3-O-乙酰基轉移酶的結構基因的序列，以及其它正同型物的序列。參閱Kimura等人，生物科學、生物技術、和生物化學(Biosci.Biotechnol.Biochem.)62(5)1033-1036，1998)；和Kimura等人，F(xiàn)EBS通訊(FEBSLetters)435163-168，1998)。此外，推測來自擬分枝孢鐮孢、編碼單端孢烯3-O-乙?；D移酶的基因可用于發(fā)展鐮孢屬抗性增加的植物變種。參閱T.M.Hohn等人，《植物疾病中宿主特異毒素的分子遺傳學》(MolecularGeneticsofHost-SpecificToxinsinPlantDisease)，17-24，1998；和Kimura等人，生物化學雜志(J.BiologicalChemistry)273(3)1654-1661，1998。然而，在本發(fā)明之前，許多不確定性使得在植物中表達單端孢烯3-O-乙?；D移酶是否會實際產(chǎn)生單端孢烯抗性植株變得不明確。例如，由擬分枝孢鐮孢單端孢烯3-O-乙?；D移酶催化的反應是可逆的，因此有可能不會為植物細胞提供針對單端孢烯(諸如DON)的保護。植物細胞中是否存在與3-O-乙?；D移酶由3ADON產(chǎn)生有毒DON的活性競爭的酯酶同樣不確定。反應產(chǎn)物3ADON的新陳代謝如何影響植物同樣不確定，如單端孢烯3-O-乙?；D移酶的導入是否會以否定乙?；D移酶的任何積極貢獻的方式改變植物的生長和發(fā)育，例如通過妨礙植物的天然疾病抗性機制尚不確定。3ADON能否由植物新陳代謝成具有毒性作用的新的次級代謝物同樣不確定。如果由侵入真菌產(chǎn)生的DON有效轉變成3ADON，這種轉變是否會賦予植物以增強的病原體抗性甚至同樣不確定。上述只是在本發(fā)明之前技術中的一些不確定性。本發(fā)明的一個目的是提供包含異源多核苷酸的植物細胞或細胞，其中所述多核苷酸編碼在所述植物細胞中表達的基因產(chǎn)物，該基因產(chǎn)物具有單端孢烯抗性。本發(fā)明的另一個目的是提供包含上述植物細胞的植物，其中植物對單端孢烯具有抗性。本發(fā)明的另一個目的是提供對含C-3羥基的單端孢烯具有抗性的本發(fā)明植物。本發(fā)明的另一個目的是提供對產(chǎn)生單端孢烯，優(yōu)選產(chǎn)生含C-3羥基的單端孢烯的真菌具有抗性的本發(fā)明植物。本發(fā)明的另一個目的是提供對鐮孢屬、單端孢屬、或漆斑菌屬具有抗性的本發(fā)明植物。本發(fā)明的另一個目的是提供對鐮孢屬具有抗性的本發(fā)明植物，特別是(但不限于)禾本科鐮孢、大刀鐮孢、擬分枝孢鐮孢、早熟禾鐮孢、接骨木鐮孢、木賊鐮孢、尖圭鐮孢、桑磚紅鐮孢、和擬禾本科鐮孢(Fusariumpseudograminearum)。本發(fā)明的另一個目的是提供對禾本科鐮孢具有抗性的本發(fā)明植物。本發(fā)明的另一個目的是提供包含異源多核苷酸的本發(fā)明植物，其中由所述異源多核苷酸編碼在植物細胞中表達的基因產(chǎn)物，其中該基因產(chǎn)物具有單端孢烯抗性，其中異源多核苷酸是微生物多核苷酸，優(yōu)選酵母或真菌多核苷酸。本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明植物，其中真菌多核苷酸是鐮孢屬的多核苷酸，優(yōu)選禾本科鐮孢或擬分枝孢鐮孢多核苷酸。本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明植物，其中異源多核苷酸包含與SEQIDNO1、5、或7的核酸序列基本上相似的序列。本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明植物，其中異源多核苷酸包含SEQIDNO1、5、或7的核酸序列或其同源序列。本發(fā)明的另一個目的是提供包含異源多核苷酸的本發(fā)明植物，所述多核苷酸包含與SEQIDNO1、5、或7所述的連續(xù)80個堿基對部分序列上相同的至少連續(xù)80個堿基對部分，優(yōu)選與SEQIDNO1、5、或7所述的連續(xù)50個堿基對片段部分相同的至少連續(xù)50個堿基對部分，更優(yōu)選與SEQIDNO1、5、或7所述的連續(xù)21個堿基對部分序列上相同的至少連續(xù)21個堿基對部分，最優(yōu)選與SEQIDNO1、5、或7所述的連續(xù)18個堿基對部分序列相同的至少連續(xù)18個堿基對部分。本發(fā)明的另一個目的是提供對單端孢烯具有抗性的本發(fā)明植物，其中單端孢烯選自T-2毒素、HT-2毒素、異木霉菌醇、4，15-二乙酸基藨草鐮孢烯醇(diacetoxyscripenol)(以下“DAS”)、3-deacetylcalonectrin、3，15-dideacetylcalonectrin、藨草鐮孢烯三醇(scirpentriol)、新腐皮鐮孢醇(neosolaniol)；B型15-乙酰脫氧瓜蔞鐮孢醇、瓜蔞鐮孢醇、4-乙酰瓜蔞鐮孢醇(鐮孢酮(fusarenone)-X)、4，15-二乙酰瓜蔞鐮孢醇、4，7，15-乙酰瓜蔞鐮孢醇、和DON。本發(fā)明的另一個目的是提供對DAS或DON具有抗性的本發(fā)明植物。本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明植物，其中基因產(chǎn)物由本發(fā)明多核苷酸編碼。本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明植物，其中基因產(chǎn)物是3-O-乙?；D移酶。本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明植物，其中基因產(chǎn)物是包含與SEQIDNO2、6、或8基本上相似的序列的多肽。本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明的任一植物的種子。本發(fā)明的另一個目的是提供上述植物的任一項，其中植物是小麥、玉米、大麥、或稻。本發(fā)明的另一個目的是提供用于產(chǎn)生單端孢烯抗性植物的方法，包括下列步驟a)用異源基因轉化植物細胞，所述異源基因編碼增加單端孢烯抗性的基因產(chǎn)物；b)以生物學顯著水平表達基因產(chǎn)物；c)將植物細胞再生成植株；并d)選擇單端孢烯抗性增加的植株。本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法，還包括選擇植物上產(chǎn)生單端孢烯的真菌生長減少的植株的步驟。本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法，其中真菌屬于鐮孢屬。本發(fā)明的另一個目的是提供由上述方法獲得的單端孢烯抗性植物。本發(fā)明的另一個目的是提供由上述本發(fā)明植物通過自交或異型雜交產(chǎn)生的種子，其中由種子生長形成的植物具有增加的單端孢烯抗性。本發(fā)明的另一個目的是提供用于預防真菌毒素污染植物(包括植物種子)的方法，包括培養(yǎng)上述本發(fā)明植物，優(yōu)選在真菌侵染情況為中等至嚴重的地區(qū)，其中植物優(yōu)選農(nóng)作物。本發(fā)明的另一個目的是提供用于在植物上預防真菌生長，優(yōu)選鐮孢屬真菌的生長的方法，包括培養(yǎng)產(chǎn)生單端孢烯(優(yōu)選上述含C-3羥基的單端孢烯)的本發(fā)明植物，優(yōu)選在真菌侵染情況為中等至嚴重的地區(qū)，其中植物優(yōu)選農(nóng)作物。本發(fā)明的另一個目的是提供用于產(chǎn)生真菌抗性植物的方法，包括a)用異源基因轉化植物細胞，所述異源基因編碼的基因產(chǎn)物增加對單端孢烯抗性；b)以生物學顯著水平表達基因產(chǎn)物；c)將植物細胞再生成植株；d)選擇單端孢烯抗性增加的植株；并e)任選的，將步驟(d)中得到的植株進行自交或異型雜交。本發(fā)明的另一個目的是提供方法，其中真菌屬于鐮孢屬。本發(fā)明的另一個目的是提供用于產(chǎn)生種子的方法，其中由種子生長形成的植物具有真菌抗性，包括將本發(fā)明植物自交或異型雜交。本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法，其中種子對鐮孢屬的真菌具有抗性。本發(fā)明的另一個目的是提供用于選擇經(jīng)轉化的宿主細胞的方法，包括a)用編碼單端孢烯3-O-乙?；D移酶的核酸構建物轉化宿主細胞；并b)在存在單端孢烯選擇劑的情況下培養(yǎng)經(jīng)轉化宿主細胞。本發(fā)明的另一個目的是提供用于選擇經(jīng)轉化宿主細胞的方法，其中宿主細胞是植物細胞或微生物細胞，特別是微生物的真菌細胞。本發(fā)明的另一個目的是提供用于選擇經(jīng)轉化宿主細胞的上述方法，其中宿主細胞用第二種感興趣的多核苷酸進一步轉化。本發(fā)明的另一個目的是提供用于選擇經(jīng)轉化宿主細胞的方法，其中單端孢烯選自T-2毒素、HT-2毒素、異木霉菌醇、DAS、3-deacetylcalonectrin、3，15-dideacetylcalonectrin、藨草鐮孢烯三醇、新腐皮鐮孢醇；B型15-乙酰脫氧瓜蔞鐮孢醇、瓜蔞鐮孢醇、4-乙酰瓜蔞鐮孢醇(鐮孢酮-X)、4，15-二乙酰瓜蔞鐮孢醇、4，7，15-乙酰瓜蔞鐮孢醇、和DON。本發(fā)明的另一個目的是提供由本發(fā)明方法獲得的單端孢烯抗性植物。本發(fā)明的另一個目的是提供由本發(fā)明方法獲得的真菌抗性植物。本發(fā)明的另一個目的是提供由本發(fā)明方法獲得的植物種子。為了清楚起見，下文列出并定義了詳細說明書中所用的一些術語“表達”指植物中內(nèi)源基因或轉基因的轉錄和/或翻譯。在反義構建物的情況中，表達可以僅指反義DNA的轉錄?！翱刹僮鬟B接/相連”當用于指調(diào)控DNA序列與編碼RNA或蛋白質的DNA序列“可操作連接”或“可操作相連”時，指兩種序列的排列位置使得調(diào)控DNA序列可影響編碼DNA序列的表達。術語“異源多核苷酸”或“異源DNA”，如此處所用，指與其所導入的宿主細胞非天然相關的核酸分子，包括基因構建物，天然存在的核酸分子的非天然存在的多拷貝，和與非天然核酸分子可操作連接的其它同源核酸分子。因此，宿主細胞中的異源基因包括對于特定宿主細胞是內(nèi)源的、但是例如通過DNA改組(DNAshuffling)經(jīng)修飾的基因。因此，該術語涵蓋對于細胞是外來的或異源的DNA片段，或者對于細胞是同源的，但是所處宿主細胞核酸的位置非正常存在該元件。術語“核酸”或“多核苷酸”指脫氧核糖核酸或核糖核酸及其單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非明確限制，該術語涵蓋包含已知的天然核苷酸類似物、與參考核酸具有相似結合特性、且新陳代謝方式與天然存在的核苷酸相似的核酸。除非特別指出，正如明確指出的序列，特定核酸序列還不言而喻地涵蓋其保守性修飾變體(如簡并密碼子替代)和互補序列。具體的說，可以通過產(chǎn)生其中一個或多個選定(或所有)密碼子的第三位用混和堿基和/或脫氧次黃苷殘基替代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子替代(Batzer等人，核酸研究(NucleicAcidRes.)195081，1991；Ohtsuka等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)2602605-2608，1985；Rossolini等人，分子和細胞探針(Mol.Cell.Probes)891-98，1994。術語“核酸”或“核酸序列”或“多核苷酸”還可以與基因、cDNA、和由基因編碼的mRNA互換使用。當此處用于核酸分子時，術語“基本上相似”在其最廣泛的含義中指與參考核苷酸序列相應的核酸分子，其中相應的核酸分子編碼的多肽與參考核苷酸序列編碼的多肽具有基本上相同的結構和功能，如只有不影響多肽功能的氨基酸發(fā)生變化。希望基本上相似的核酸分子編碼由參考核苷酸序列編碼的多肽。術語“基本上相似”明確的意欲包括其序列經(jīng)修飾以優(yōu)化在特定細胞(如植物細胞)中的表達的核酸分子?；旧舷嗨频暮怂岱肿优c參考核苷酸序列之間的同一性百分比希望是至少45％，更希望是至少65％，更希望是至少75％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，依然更優(yōu)選至少95％，仍然更優(yōu)選至少99％。同一性百分比優(yōu)選跨越至少大約50個殘基的序列區(qū)域，更優(yōu)選跨越至少大約100個殘基的區(qū)域，最優(yōu)選跨越至少大約150個殘基的序列基本上相似。在最優(yōu)選的實施方案中，跨越完整編碼區(qū)的序列基本上相似?？梢允褂肧mith-Waterman序列排列算法進行序列比較，下文的描述更為詳細(參閱M.S.Waterman，《計算生物學導論圖譜、序列、和基因組)》(IntroductiontoComputationalBiologyMaps，sequencesandgenomes)，Chapman&Hall，倫敦，1995，ISBN0-412-99391-0，或者http//www-hto.usc.edu/softwares/seqaln/index.html)。以下列參數(shù)使用localS程序1.16版配對1，錯配罰0.33，開口罰2，延伸缺口罰2。是本發(fā)明核酸的基本上相似的核酸的另一種標志是該核酸序列與本發(fā)明核酸分子在嚴謹條件下發(fā)生雜交。短語“特異雜交”指當序列存在于復雜的混和(如總細胞)DNA或RNA中時，分子只與特定核苷酸序列在嚴謹條件下結合、形成雙鏈體、或發(fā)生雜交?！盎旧辖Y合”指探針核酸與靶核酸之間的互補雜交，并包括可以通過降低雜交介質的嚴謹度來包容較小的錯配以實現(xiàn)靶核酸序列的期望檢測。核酸雜交實驗(諸如Southern和Northern雜交)內(nèi)容中的“嚴謹雜交條件”和“嚴謹雜交清洗條件”具有序列依賴性，而且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。較長序列在較高溫度特異雜交。對于核酸雜交的廣泛指南見Tijssen，1993，《生化和分子生物學的實驗室技術-核酸探針的雜交》(LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes)，第一部分，第2章，雜交原理及核酸探針實驗策略概論，Elesvier，紐約。通常，高度嚴謹?shù)碾s交和清洗條件選擇比特定序列在定義的離子強度和pH下的熱熔點(Tm)低大約5℃。具有代表性的是，在“嚴謹條件”下，探針將與其靶亞序列而非其它序列發(fā)生雜交。Tm是在定義的離子強度和pH下50％的靶序列與完全配對的探針發(fā)生雜交的溫度。非常嚴謹?shù)臈l件選擇與特定探針的Tm相同。用于超過100個互補殘基的互補核酸在濾膜上進行Southern或Northern雜交的嚴謹雜交條件的范例是50％甲酰胺和1mg肝素，42℃，雜交過夜。高度嚴謹?shù)那逑礂l件的范例是0.15MNaCl，72℃，大約15分鐘。嚴謹清洗條件的范例是用0.2×SSC于65℃清洗15分鐘(參閱Sambrook，見下文，SSC緩沖液的描述)。通常，高度嚴謹?shù)那逑粗斑M行低度嚴謹?shù)那逑匆猿ケ尘疤结樞盘?。用于雙鏈體(如超過100個核苷酸)的中等嚴謹?shù)那逑词怯?×SSC于45℃清洗15分鐘。用于雙鏈體(如超過100個核苷酸)的低度嚴謹?shù)那逑吹姆独怯?-6×SSC于40℃清洗15分鐘。對于短探針(如大約10-50個核苷酸)，嚴謹條件通常包括鹽濃度低于大約1.0MNa離子，通常是Na離子(或其它鹽)濃度大約0.01-1.0M，pH7.0-8.3，溫度通常為至少大約30℃。嚴謹條件還可以通過加入去穩(wěn)定劑(諸如甲酰胺)來實現(xiàn)。通常，特定雜交實驗中觀察到的無關探針的2倍(或更高)信號-噪音比指示特異雜交的檢測。如果編碼的蛋白質基本上相似，那么在嚴謹條件下不相互雜交的核酸仍然基本上相似。如使用遺傳密碼允許的最大密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝。下文是可用于鑒定與本發(fā)明參考核苷酸序列基本上相似的同源核苷酸序列的雜交/清洗條件組的范例待測序列與參考核苷酸序列在7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中于50℃雜交，在2×SSC、0.1％SDS中于50℃清洗；更希望在7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中于50℃雜交，在1×SSC、0.1％SDS中于50℃清洗；依然更希望在7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中于50℃雜交，在0.5×SSC、0.1％SDS中于50℃清洗；優(yōu)選在7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中于50℃雜交，在0.1×SSC、0.1％SDS中于50℃清洗；更優(yōu)選在7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.5MNaPO4、1mMEDTA中于50℃雜交，在0.1×SSC、0.1％SDS中于65℃清洗。在上述條件下雜交的本發(fā)明多核苷酸優(yōu)選包含至少80個堿基對，更優(yōu)選至少50個堿基對，特別是至少21個堿基對，更特別是18個堿基對。本發(fā)明中所用的優(yōu)選同源物包括編碼據(jù)測量(使用下文所述參數(shù))與SEQIDNO2、6、或8至少45％同一的氨基酸序列的核酸分子，其中由同源物編碼的氨基酸序列具有單端孢烯抗性，如3-O-乙?；D移酶活性。當此處用于蛋白質時，術語“基本上相似”指與參考蛋白質相應的蛋白質，其中蛋白質與參考蛋白質具有基本上相同的結構和功能，如只有不影響多肽功能的氨基酸序列發(fā)生變化。當用于蛋白質或氨基酸序列時，基本上相似的蛋白質與參考蛋白質或氨基酸序列之間的同一性百分比希望是至少45％，更希望是至少65％，更希望是至少75％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％，依然更優(yōu)選至少95％，仍然更優(yōu)選至少99％，使用缺省BLAST分析參數(shù)，下文的描述更為詳細。本發(fā)明中所用的優(yōu)選多肽同源物包括那些所含氨基酸序列與SEQIDNO2、6、或8至少45％同一的多肽，其中由同源物編碼的氨基酸細胞具有單端孢烯抗性，如3-O-乙?；D移酶活性?？梢匀缟纤鲞M行用于比較核酸或蛋白質序列的最佳排列，如通過Smith和Waterman(應用數(shù)學進展(Adv.Appl.Math.)2482，1981)的局部同源性算法、通過Needleman和Wunsch(分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)48443，1970)的同源性排列算法、通過Pearson和Lipman(美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)852444，1988)的相似性搜尋方法、通過這些算法的計算機化執(zhí)行(威斯康辛遺傳學軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI)、或者通過視覺檢查(通常參閱Ausubel等人，見下文)。適用于測定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一個范例是由Altschul等人(分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)215403-410，1990)描述的BLAST算法。用于進行BLAST分析的軟件可以由國家生物技術信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)公開獲得。這種算法包括首先通過鑒定查詢序列中長度W的短詞來鑒定高得分序列對(HSP)，當與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的詞一起排列時，查詢序列匹配或滿足正閾值得分T。T指相鄰詞的得分閾值(Altschul等人，1990)。這些初始相鄰詞數(shù)據(jù)作為開始搜尋包含其之更長HSP的種子。然后將詞數(shù)據(jù)在每個序列上向兩個方向延伸，只要累積排列得分增加。使用參數(shù)M(一對匹配殘基的獎分；總是＞0)和N(錯配殘基的罰分；總是＜0)計算核苷酸序列的累積得分。對于氨基酸序列，使用得分矩陣計算累積得分。當累積排列得分由其達到的最大值下降數(shù)量X時，當由于一個或多個負得分殘基的排列，累積得分達到或低于零時，或者當達到任一序列的末端時，停止詞數(shù)據(jù)每個方向的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T、和X決定了算法的靈敏度和速度。以缺省值使用BLASTN程序(用于核苷酸序列)，詞長(W)11，期望值(E)10，截止100，M＝5，N＝-4，比較兩條鏈。對于氨基酸序列，以缺省值使用BLASTP程序，詞長(W)3，期望值(E)10，BLOSUM62得分矩陣(參閱Henikoff和Henikoff，美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910915，1989)。除了計算序列同一性百分比，BLAST算法還進行兩種序列之間的相似性統(tǒng)計分析(參閱Karlin和Altschul，美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905873-5787，1993)。由BLAST算法提供的一種相似性量度是最小總幾率(P(N))，指示兩種核苷酸或氨基酸序列之間發(fā)生偶然匹配的幾率。例如，如果待測核酸序列與參考核酸序列比較的最小總幾率小于大約0.1，更優(yōu)選小于大約0.01，最優(yōu)選小于大約0.001，那么認為待測核酸序列與參考序列相似。兩種核酸序列或蛋白質基本上相似的另一種標志是由第一種核酸編碼的蛋白質與由第二種核酸編碼的蛋白質發(fā)生免疫交叉反應或特異結合抗體。因此，當兩種蛋白質僅僅由于保守替換而不同時，這兩種蛋白質典型的基本上相似。當用于蛋白質或肽時，短語“特異(或選擇性)結合抗體”或“特異(或選擇性)免疫反應”指決定蛋白質或其它生物制劑的異質群中存在蛋白質的結合反應。因此，在指定的免疫實驗條件下，特定抗體結合特定蛋白質，且不以顯著量結合樣品中存在的其它蛋白質。在這些條件下與抗體特異結合可能需要根據(jù)其對特定蛋白質的特異性來選擇抗體。例如，針對具有由任何本發(fā)明核酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白質制備的抗體可以進行選擇，以獲得與這種蛋白質而非其它蛋白質(除了多形變體)發(fā)生特異免疫反應的抗體。各種免疫實驗形式可以用于選擇與特定蛋白質發(fā)生特異免疫反應的抗體。例如，固相ELISA免疫實驗、Western印跡、或免疫組織化學常規(guī)用于選擇與蛋白質發(fā)生特異免疫反應的單克隆抗體。可用于測定特異免疫反應性的免疫實驗形式和條件的描述參閱Harlow和Lane(1988，《抗體，實驗室手冊》(Antibodies，ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborPublications，紐約，“HarlowandLane”)。通常，特異性或選擇性反應至少是背景信號或噪音的兩倍，更典型的是高于背景10-100倍。特定核酸序列的“保守性修飾的變異”指那些編碼同一或基本上同一的氨基酸序列的核酸序列，或者當核酸序列不編碼氨基酸序列時，指基本上同一的序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能同一的核酸編碼任何給定的多肽。例如，密碼子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、和AGG都編碼精氨酸。因此，在由密碼子說明是精氨酸的每一個位置，密碼子可以變成此處所述任何相應密碼子而不改變所編碼的蛋白質。這些核酸變體是“保守性修飾的變異”的一種，“靜默變異”。此處所述編碼蛋白質的每一種核酸序列同樣描述了任何可能的靜默變異，除非特別注明。技術人員將認識到核酸中的每一個密碼子(除了ATG，通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)可以通過標準技術經(jīng)修飾產(chǎn)生功能同一的分子。因此，編碼蛋白質的核酸的每一種“靜默變異”隱含于每一種所述序列中。此外，本領域技術人員將認識到在所編碼的序列中改變、刪除、或添加單個氨基酸或小比例氨基酸(通常少于5％，更典型的少于1％)的個別替代、刪除、或添加是“保守性修飾的變異”，改變導致用化學上相似的氨基酸替代氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守替代表在本領域是眾所周知的。下列五組每組包含相互之間可以保守替代的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)；芳香族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；堿性精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)；酸性天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。還可以參閱Creighton(1984，《蛋白質》(Proteins)，W.H.FreemanandCompny)。另外，在所編碼的序列中改變、刪除、或添加單個氨基酸或小比率氨基酸的個別替代、刪除、或添加也是“保守性修飾的變異”。“亞序列”指包含較長核酸或氨基酸序列(如蛋白質)的一部分的核酸或氨基酸序列。當向核酸摻入額外核苷酸(或其它類似分子)時，核酸被“延長”。最常見的是，使用聚合酶(如DNA聚合酶)進行這種延長，如在核酸3’末端添加序列的聚合酶。當來自兩種核酸的序列在后代核酸中聯(lián)合時，兩種核酸“重組”。當兩種核酸作為重組底物時，兩種序列“直接”重組。當序列使用中間體(諸如交換寡核苷酸)重組時，兩種序列“間接”重組。對于直接重組，不超過一種序列作為重組底物，在某些情況中，沒有序列作為重組底物。兩種分子(例如配體與受體)之間的“特異結合親和力”指優(yōu)先結合分子混和物中的一種分子。如果結合親和力為大約1×104M-1至大約1×106M-1或更大，那么認為分子結合是特異的?！暗孜铩敝赣擅柑烊蛔R別并在酶天然發(fā)揮其功能的生化途徑中轉變成產(chǎn)物的分子，或分子的修飾形式，同樣由酶識別并在與天然反應相似的酶反應中由酶轉變成產(chǎn)物?！稗D化”指將異源DNA導入細胞、組織、或昆蟲的過程。經(jīng)轉化細胞、組織、或昆蟲理解為不僅包括轉化過程的終產(chǎn)物，還包括其轉基因后代?！敖?jīng)轉化的”、“轉基因的”、和“重組(體)的”宿主指導入了異源核酸分子的宿主生物，諸如細胞或植物。核酸分子可以穩(wěn)定整合到宿主基因組中，或者核酸分子也可以作為染色體外分子存在。這種染色體外分子可以自主復制。經(jīng)轉化細胞、組織、或植物理解為不僅包括轉化過程的終產(chǎn)物，還包括其轉基因后代?！拔崔D化的”、“非轉基因的”、或“未重組的”宿主指不包含異源核酸分子的野生型生物，如細菌或植物。本發(fā)明涉及轉基因宿主，特別是包含異源多核苷酸的轉基因植物、植物組織、植物種子、和植物細胞，其中由所述異源多核苷酸編碼的基因產(chǎn)物具有單端孢烯抗性，及其產(chǎn)生和使用方法。如此處所用，單端孢烯抗性指降低或抑制單端孢烯的植物毒性(特別是對真菌和/或植物)的活性，在本發(fā)明的特定實施方案中，單端孢烯抗性指向單端孢烯的C-3位置轉移乙酸的活性。本發(fā)明還涉及轉基因宿主，特別是表達異源多核苷酸的轉基因植物、植物組織、植物種子、和植物細胞，其中由所述異源多核苷酸編碼的基因產(chǎn)物具有單端孢烯抗性，基因產(chǎn)物特別是乙?；D移酶基因產(chǎn)物，更特別的是3-O-乙?；D移酶基因產(chǎn)物，更特別的是單端孢烯3-O-乙酰基轉移酶基因產(chǎn)物，及其產(chǎn)生和使用方法。本發(fā)明異源多核苷酸的表達包括RNA的合成，可以通過Northern印跡分析來檢測。具體而言，將由本發(fā)明異源多核苷酸(在特定實施方案中，指SEQIDNO1、5、或7)衍生的標記探針與由本發(fā)明轉基因植物分離得到的RNA在7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.5M磷酸鈉(pH7.0)、1mMEDTA、10mg/mlBSA中于65℃雜交，并在0.5％BSA(成分V)、5％SDS、40mM磷酸鈉(pH7.0)、1mMEDTA、0.25M氯化鈉中于65℃清洗，優(yōu)選在1％SDS、40mM磷酸鈉(pH7.0)、1mMEDTA、0.125M氯化鈉中于65℃清洗，優(yōu)選在1％SDS、40mM磷酸鈉(pH7.0)、1mmEDTA中于65℃清洗，由此可以檢測本發(fā)明異源多核苷酸的表達。本發(fā)明還涉及表達本發(fā)明異源多核苷酸的轉基因植物、植物組織、植物種子、和植物細胞，其中植物、植物細胞、植物組織、或植物種子具有單端孢烯抗性。如此處所用，當存在單端孢烯時(可以如下文實施例7所述測定)，單端孢烯抗性植物、植物細胞、植物組織、和植物種子能夠進行新陳代謝。在特定實施方案中，在飽和底物水平溫育15分鐘后，單端孢烯抗性植物、植物組織、植物細胞、和植物種子具有比野生型對照中天然存在的背景活性水平高至少10nmol三乙酰氧基藨草鐮孢烯醇(triacetoxyscirpenol)(以下“TAS”)/μg蛋白質的比酶活性，更特別的是至少5nmolTAS/mg蛋白質，更特別的是至少1nmolTAS/μg蛋白質，更特別的是至少0.8nmolTAS/μg蛋白質，更特別的是至少0.5nmolTAS/μg蛋白質，更特別的是至少0.25nmolTAS/μg蛋白質，更特別的是至少0.1nmolTAS/μg蛋白質，更特別的是至少0.05nmolTAS/μg蛋白質，甚至更特別的是至少0.01nmolTAS/μg蛋白質的比活性，測定實驗如下文實施例6所述。本發(fā)明的單端孢烯抗性植物包括那些當存在單端孢烯時，種子的發(fā)芽和生根百分率比野生型對照高的那些植物，其中存在的單端孢烯濃度為至少5μg/ml，更優(yōu)選至少10μg/ml，更優(yōu)選至少15μg/ml，更優(yōu)選至少20μg/ml，更優(yōu)選至少25μg/ml。在特定的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的單端孢烯抗性植物包括當存在單端孢烯時，種子的發(fā)芽和生根百分率比野生型對照的高至少10％，更優(yōu)選至少20％，更優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％的那些植物。單端孢烯通常分成幾個不同的結構組。本發(fā)明的特定實施方案致力于針對A組和B組單端孢烯的抗性。A組和B組包括鐮孢屬單端孢烯，并主要根據(jù)C-8處羰基官能團的存在與否(A組無，B組有)來區(qū)別。因此，B組單端孢烯DON在C-8處包含羰基。本發(fā)明更具體的致力于針對含C-3氫氧根的單端孢烯的抗性。這些單端孢烯包括T-2毒素、HT-2毒素、異木霉菌醇、DAS、3-deacetylcalonectrin、3，15-dideacetylcalonectrin、藨草鐮孢烯三醇、新腐皮鐮孢醇；15-乙酰脫氧瓜蔞鐮孢醇、瓜蔞鐮孢醇、4-乙酰瓜蔞鐮孢醇(鐮孢酮-X)、4，15-二乙酰瓜蔞鐮孢醇、4，7，15-乙酰瓜蔞鐮孢醇、和DON，及其各種乙?；苌?。在特定實施方案中，單端孢烯抗性植物及其細胞、組織、或種子對由產(chǎn)生單端孢烯的真菌(特別是鐮孢屬的真菌)具有抗性。如此處所用，真菌抗性指接種真菌后不發(fā)生感染，或者與野生型對照相比，接種真菌后感染的蔓延減少。在優(yōu)選實施方案中，具有真菌抗性的本發(fā)明轉基因植物是谷類植物，而且在真菌攻擊下，與野生型對照相比，包含較少的受感染谷粒或種子。與相同數(shù)目的評價的野生型對照的谷?；蚍N子相比，受感染谷?；蚍N子優(yōu)選減少至少10％，更優(yōu)選減少至少20％，更優(yōu)選減少至少40％，更優(yōu)選減少至少50％。具有真菌抗性的本發(fā)明轉基因谷類植物包括(但不限于)玉米、小麥、大麥、稻、和燕麥。在小麥中，可以如下文實施例9所述，通過對每個接種麥尖的有癥狀和無癥狀的麥穗進行計數(shù)，并計算每個麥尖有癥狀麥穗所占的百分比，從而評價真菌在麥尖的蔓延。在優(yōu)選實施方案中，在真菌攻擊下，本發(fā)明真菌抗性小麥受感染的麥穗比野生型對照少。與相同數(shù)目的評價的野生型對照的麥穗相比，受感染麥穗優(yōu)選減少至少10％，更優(yōu)選減少至少20％，更優(yōu)選減少至少40％，更優(yōu)選減少至少50％。在玉米中，可以如下文實施例9所述，通過視覺評價受感染谷粒所占百分比來評價真菌在穗中的蔓延。在優(yōu)選實施方案中，在真菌攻擊下，本發(fā)明真菌抗性玉米受感染的谷粒比野生型對照少。與相同數(shù)目的視覺評價的野生型對照的玉米穗相比，受感染谷粒優(yōu)選減少至少10％，更優(yōu)選減少至少20％，更優(yōu)選減少至少30％，更優(yōu)選減少至少40％，更優(yōu)選減少至少50％。在玉米中，可以通過劈開莖并評估變色的量來評價真菌在莖內(nèi)部的蔓延。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明轉基因玉米的莖內(nèi)部和/或外部變色比野生型對照少。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明真菌抗性植物包括當存在真菌攻擊時，種子發(fā)芽百分率比野生型對照高的那些植物。在特定的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明真菌抗性植物包括當存在鐮孢屬時種子發(fā)芽百分率比野生型對照的種子高至少10％，更優(yōu)選高至少20％，更優(yōu)選高至少30％，更優(yōu)選高至少40％，更優(yōu)選高至少50％，更優(yōu)選高至少60％，更優(yōu)選高至少70％，更優(yōu)選高至少80％，更優(yōu)選高至少90％，更優(yōu)選高至少100％，更優(yōu)選高至少150％的那些植物。在另一個優(yōu)選實施方案中，提供了具有真菌抗性的轉基因植物，所述轉基因植物所產(chǎn)生的種子或谷粒所含有的真菌毒素(如單端孢烯污染)比野生型對照的種子少。在特定的優(yōu)選實施方案中，提供了農(nóng)作物植物，更特別的是谷類植物，所述植物所產(chǎn)生的種子所含有的單端孢烯污染比野生型對照少至少10％，更優(yōu)選少至少20％，更優(yōu)選少至少30％，更優(yōu)選少至少40％，更優(yōu)選少至少50％，更優(yōu)選少至少60％，更優(yōu)選少至少70％，更優(yōu)選少至少80％。可以如下文實施例10所述測定單端孢烯污染。本發(fā)明中所用多核苷酸包括編碼乙酰基轉移酶的異源多核苷酸，特別是編碼能夠賦予單端孢烯抗性的乙酰基轉移酶，更特別的是編碼單端孢烯3-O-乙酰基轉移酶。在特定實施方案中，本發(fā)明的異源多核苷酸可以由(但不限于)真菌起源衍生，更具體具體的說是鐮孢屬、單端孢屬、和漆斑菌屬起源，更具體的說是鐮孢屬物種起源，諸如尖圭鐮孢、F.crookwellense、大刀鐮孢、木賊鐮孢、禾本科鐮孢(玉蜀黍赤霉)、桑磚紅鐮孢、早熟禾鐮孢、接骨木鐮孢(虱狀赤霉)、和擬分枝孢鐮孢。本發(fā)明中所用異源多核苷酸包括SEQIDNO1、5、和/或7及與SEQIDNO1、5、和/或7基本上相似的序列?？梢允褂脗鹘y(tǒng)的重組DNA技術將本發(fā)明中所用多核苷酸摻入宿主細胞，諸如植物、真菌、或細菌細胞。通常，這包括使用本領域知道的標準克隆步驟將多核苷酸插入對多核苷酸而言是異源的表達系統(tǒng)。載體包含在含該載體宿主細胞中轉錄和翻譯本發(fā)明中所用多核苷酸所需元件?？梢允褂帽绢I域知道的大量的載體系統(tǒng)，諸如質粒、噬菌體、病毒、和其它經(jīng)修飾病毒。還可以變更表達系統(tǒng)的成分以增加表達。例如，可以采用截短序列、核苷酸替代、核苷酸優(yōu)化、或其它修飾。事實上，在適當條件下可以將本領域知道的表達系統(tǒng)用于轉化任何農(nóng)作物植物細胞。本發(fā)明的異源多核苷酸優(yōu)選穩(wěn)定轉化并整合到宿主細胞基因組中。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的異源多核苷酸位于自主復制載體上。自主復制載體的范例是病毒，特別是雙生病毒。經(jīng)轉化細胞可以再生成完整植株，使得本發(fā)明多肽的選擇形式賦予轉基因植物以單端孢烯抗性。首先將意欲在轉基因植物中表達的本發(fā)明多核苷酸裝配到位于可在植物中表達的適當啟動子之后的表達盒中。表達盒還可以包含需要或選擇用于表達本發(fā)明異源多核苷酸的任何其它序列。這些序列包括(但不限于)轉錄終止子、用于增強表達的外來序列(諸如內(nèi)含子)、生存序列、和意欲使基因產(chǎn)物靶向特異細胞器和細胞區(qū)室的序列?？梢匀菀椎膶⑦@些表達盒轉移至下文所述植物轉化載體。下文是關于典型表達盒的各種成分的描述。表達盒中所用啟動子的選擇將決定本發(fā)明異源多核苷酸在經(jīng)轉化植物中的空間和時間表達模式。選擇的啟動子將在特定細胞類型(諸如葉表皮細胞、葉肉細胞、根外皮細胞)中或在特定組織或器官(諸如根、葉、或花)中表達本發(fā)明的異源多核苷酸，而且這一選擇將反映期望基因產(chǎn)物累積的位置。或者，選擇的啟動子可以在各種誘導條件下驅動基因的表達。不同的啟動子的強度(即啟動轉錄的能力)是不同的。根據(jù)利用的宿主細胞系統(tǒng)，可以使用本領域知道的大量的適當啟動子中的任一種。例如，對于組成型表達，可以使用CaMV35S啟動子、稻肌動蛋白啟動子、或遍在蛋白質啟動子。對于調(diào)控型表達，可以使用來自煙草或擬南芥的化學誘導的PR-1啟動子(參閱美國專利號5,689,044)。多種轉錄終止子可用于表達盒。它們負責本發(fā)明異源多核苷酸轉錄的終止及其正確的多聚腺苷酸化。適當?shù)霓D錄終止子是那些已知在植物中發(fā)揮功能的轉錄終止子，包括CaMV35S終止子、tml終止子、胭脂堿合酶終止子、和豌豆rbcSE9終止子。它們可以用于單子葉和雙子葉植物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量的序列能夠增強轉錄單位內(nèi)基因的表達，而且這些序列可以與本發(fā)明多核苷酸相連以增加它們在轉基因植物中的表達。例如，多種內(nèi)含子序列(諸如玉米AdhI基因的內(nèi)含子)顯示增強表達，特別是在單子葉細胞中。另外，還知道大量由病毒衍生的非翻譯前導序列能夠增強表達，而且它們在雙子葉細胞中特別有效。所選基因的編碼序列任選的通過改變編碼序列進行了基因工程改造，以優(yōu)化在感興趣的農(nóng)作物物種中的表達。眾所周知用于修飾編碼序列以實現(xiàn)特定農(nóng)作物物種中的最佳表達的方法(參閱Perlak等人，美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)883324，1991；Koziel等人，生物技術(Bio/technol.)11194，1993；Fennoy和Bailey-Serres，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)215294-5300，1993)。眾所周知通過考慮植物基因、高等植物、綠藻、和藍細菌中的密碼子使用率來修飾編碼序列的方法(參閱Murray等人，核酸研究(NucL.AcidsRes.)17477-498，1989中的表4；Campbell和Gowri，植物生理學(PlantPhysiol.)921-11，1990)。已知植物中存在使基因產(chǎn)物具有靶向的各種機制，而且已經(jīng)詳細鑒定了控制這些機制發(fā)揮功能的序列。例如，使基因產(chǎn)物靶向葉綠體受到在各種蛋白質氨基末端發(fā)現(xiàn)的信號序列的控制，這種信號序列在進入葉綠體的過程中被切除而產(chǎn)生成熟蛋白質(如Comai等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)26315104-15109，1988)。其它基因產(chǎn)物定位于其它細胞器，諸如線粒體和過氧化物酶體(如Unger等人，植物分子生物學(PlantMol.Biol.)13411-418，1989)。也可以對編碼這些產(chǎn)物的cDNA進行操作，從而將由DNA序列編碼的異源產(chǎn)物靶向這些細胞器。另外，已經(jīng)鑒定了引起由DNA序列編碼的產(chǎn)物靶向其它細胞分區(qū)的序列。氨基末端序列負責靶向ER、質外體、糊粉細胞的細胞外分泌(Koehler和Ho，植物細胞(PlantCell)2769-783，1990)。另外，氨基末端序列與羧基末端序列一起負責將基因產(chǎn)物靶向液泡(Shinshi等人，植物分子生物學(PlantMol.Biol.)14357-368，1990)。通過融合上述適當?shù)陌邢蛐蛄信c本發(fā)明的異源多核苷酸，將產(chǎn)生的產(chǎn)物定向任何細胞器或細胞分區(qū)是有可能的。植物轉化領域的普通技術人員知道大量的可用于植物轉化的轉化載體，與本發(fā)明有關的多核苷酸可以與這些載體的任一種一起使用。載體的選擇將取決于優(yōu)選的轉化技術和轉化的靶物種。對于某些靶物種，可能優(yōu)選不同的選擇標記。在轉化中常規(guī)使用的選擇標記包括賦予卡那霉素和相關抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因(Gene)19259-268，1982；Bevan等人，自然(Nature)304184-187，1983)、賦予除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)181062，1990；Spencer等人，理論和應用遺傳學(Theor.AppLGenet.)79625-631，1990)、賦予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子和細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)42929-2931)、賦予氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，歐洲分子生物學雜志(EMBOJ.)2(7)1099-1104，1983)、賦予草甘磷抗性的EPSPS基因(美國專利號4,940,935和5,188,642)、當存在甘露糖時賦予選擇性新陳代謝優(yōu)勢的磷酸甘露糖異構酶基因manA(美國專利號5,767,378，此處完整引用作為參考；和Miles和Guest，基因(Gene)3241-48，1984)、賦予BASTA抗性的PAT選擇標記(SungH.Park等人，體外細胞發(fā)育生物學-植物(InVitroCell.Dev.Biol.-Plant)34117-121，1998)。許多載體可用于使用根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的轉化。這些載體通常至少攜帶一個T-DNA邊界序列，包括諸如pBIN19(Bevan，核酸研究(Nucl.AcidsRes.)，1984)等載體。適用于土壤桿菌轉化的典型載體包括二元載體pCIB200和pCIB2001，以及二元載體pCIB10及其潮霉素選擇衍生物(參閱美國專利號5,639,949)。不使用根瘤土壤桿菌的轉化在選擇的轉化載體中不再需要T-DNA序列，因此，除了上述包含T-DNA序列的載體，還可以利用缺乏這些序列的載體。不依賴土壤桿菌的轉化技術包括微粒轟擊、原生質體攝取(如PEG和電穿孔)、和微注射。載體的選擇主要取決于待轉化物種的優(yōu)選選擇。適用于非土壤桿菌轉化的典型載體包括pCIB3064、pSOG19、和pSOG35(參閱美國專利號5,639,949)。一旦將感興趣的多核苷酸克隆到表達系統(tǒng)中，然后將其轉化到植物細胞中。本領域眾所周知用于植物轉化和再生的方法。例如，Ti質粒載體用于投遞外來DNA，以及直接DNA攝取、脂質體、電穿孔、微注射、和微彈另外，可以利用土壤桿菌屬的細菌來轉化植物細胞。本領域眾所周知用于雙子葉植物的轉化技術，包括基于土壤桿菌的技術和不需要土壤桿菌的技術。非土壤桿菌技術包括由原生質體或細胞直接攝取外源遺傳物質。這可以通過PEG或電穿孔介導的攝取、微粒轟擊介導的投遞、或微注射來實現(xiàn)。在每種情況中，使用本領域知道的標準技術，將經(jīng)轉化細胞再生成完整植株。大多數(shù)單子葉物種的轉化現(xiàn)在也已經(jīng)成為常規(guī)工作。優(yōu)選技術包括使用PEG或電穿孔技術將基因直接轉移到原生質體中，使用微粒轟擊將基因直接轉移到愈傷組織中，以及土壤桿菌介導的轉化。靶組織可以由這些來源衍生，如小麥栽培變種UC703或玉米基因型CG000526。例如，可以如美國專利申請09/089,111(相應的以WO98/54961發(fā)表)所述進行土壤桿菌介導的玉米轉化，此處完整引用作為參考；可以如下所述進行大麥的轉化M.Cho、J.Wong、C.Marx、W.Jiang、P.Lemaux、和B.Buchanan，硫氧還蛋白h在大麥谷粒中的過度表達導致淀粉脫支酶(支鏈淀粉酶)活性增強，美國國家科學院進展(PNAS)9614641-14646，1999；S.Zhang、M.Cho、T.Koprek、R.Yun、P.Bregitzer、和P.Lemaux，燕麥(AvaenasativaL.)和大麥(HordeumvulgareL.)的商業(yè)性栽培變種的基因轉化使用由發(fā)芽幼苗衍生的體外芽分生組織培養(yǎng)物，植物細胞報告(PlantCellRep.)18959-966，1999；P.Bregitzer、S.Harlbert、和P.Lemaux，轉基因大麥后代中的體細胞克隆變異，理論和應用遺傳學(TAG)96421-425，1998；M.Cho、W.Jiang、和P.Lemaux，通過改進再生性和減少白化病轉化難對付的大麥栽培變種，植物科學(PlantSci.)138229-244，1998；P.Lemaux、M.Cho、S.Zhang、和P.Bregitzer，轉基因谷類HordeumvulgareL.-當前的狀況及對未來的展望，在《谷類農(nóng)作物的分子改良》(MolecularImprovementofCerealCrops)中，I.Vasil和R.Phillips編，KluwerAcademicPubl，Dordrecht，荷蘭，pp255-316，1998；S.Zhang、R.Williams-Carrier、D.Jackson、和P.Lemaux，玉米(ZeamaysL.)和大麥中CDC2Zm和KNOTTED1在體外葉腋芽分生組織增殖過程和不定芽分生組織形成過程中的表達，植物(Planta)204542-549，1998；D.McElroy、J.Louwerse、S.McElroy、和P.Lemaux，Ac/Ds在完整大麥組織細胞中的簡單瞬時實驗的發(fā)展，植物雜志(PlantJ.)11157-165，1997；S.Tingay、D.McElroy、R.Kalla、S.Fieg、M.Wang、S.Thornton、和R.Brettell，根瘤土壤桿菌介導的大麥轉化，植物雜志(IhePlantJ.)111369-1376，1997；J.Qureshi、Z.Basri、R.Singh、R.Burton、M.Dalton、J.Kollmorgen、和G.Fincher，1988，土壤桿菌介導的兩種大麥變種的轉化，Proc.澳大利亞生化和分子生物學學會第42次會議，1998年9月28日至10月1日，Adelaide，澳大利亞；J.Qureshi、R.Singh、Z.Basri、R.Stewart、R.Burton、J.Kollmorgen、和G.Fincher，1997，用于elite澳大利亞大麥變種的遺傳轉化的策略，Proc.澳大利亞大麥技術8th.Aust.BarleyTechnicalsymp.，GoldCoast，Queensland，1997年9月7-12日，28.9-11；P.Lemaux、M.Cho、J.Louwerse、R.Williams、和Y.Wan，轟擊介導的大麥轉化方法，Bio-RadUS/EGBull20071-6，1996；T.Koprek、R.Hansch、A.Nerlich、R.Mendel、和J.Schulze，通過調(diào)整轟擊條件與組織應答獲得能育的轉基因大麥的不同栽培變種，植物科學(PlantSci.)11979-91，1996；T.Hagio、T.Hirabayashi、H.Machii、和H.Tomutsune，使用潮霉素抗性標記產(chǎn)生能育的轉基因大麥植株，植物細胞報告(PlantCellRep.)14329-334，1995；H.Funatsuki、H.Kuroda、M.Kihara、P.Lazzeri、E.Muller、H.Lorz、和LKishinami，通過將DNA直接轉移至原生質體而再生的能育的轉基因大麥，理論和應用遺傳學(TAG)91707-712，1995；A.Jahne、D.Becker、R.Brettschneider、和H.Lorz，由小孢子衍生的轉基因不育大麥的再生，理論和應用遺傳學(TAG)89525-533，1994；Y.Wan和P.Lemaux，大量獨立轉化的大麥能育植株的產(chǎn)生，植物生理學(PlantPhysiol.)10437-48，1994。本發(fā)明多核苷酸可用于賦予廣泛的植物細胞以單端孢烯抗性，包括裸子植物、單子葉植物、和雙子葉植物。雖然本發(fā)明的異源多核苷酸可以插入(如轉化)這些寬范圍綱中的任何植物細胞，但是它特別適用于農(nóng)作物植物細胞，諸如稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、燕麥、馬鈴薯、甘薯、蕪菁、南瓜、西葫蘆、小胡瓜、甜瓜、大豆、和高粱。賦予植物以單端孢烯抗性的本發(fā)明中所用多核苷酸可以與對產(chǎn)量和質量重要的其它特性一起使用?？梢酝ㄟ^本領域知道的育種方法和技術，將本發(fā)明多核苷酸摻入植物品系。當通過轉化到農(nóng)作物植物或轉化到可以再生成農(nóng)作物植物的植物細胞培養(yǎng)物獲得單端孢烯抗性基因的等位基因時，使用傳統(tǒng)育種技術將其轉移到商業(yè)性變種中以發(fā)展單端孢烯抗性農(nóng)作物，而不需要對等位基因進行基因工程改造和將其轉化到植物中。多種育種步驟的特征為詳細描述的人類介入，諸如選擇雜交系，指導親本系的授粉，或選擇適當?shù)暮蟠仓?。根?jù)期望的特性，選擇不同的育種措施。本領域眾所周知相關技術，包括(但不限于)雜交、近交、回交、多系育種、品種混合、種間雜交、非整倍體技術、等等。雜交技術還包括植物不育化以通過機械的、化學的、或生化的方法產(chǎn)生雄性或雌性不育植株。用不同品系的花粉對雄性不育植株進行交叉授粉，確保了雄性不育的基因組；但是，雌性能育植株將一律獲得雙親系的特性。因此，本發(fā)明的轉基因種子和植物可用于改良植物品系的育種，在植物、植物組織、或種子上不表現(xiàn)真菌生長或真菌生長減少，由此預防和/或減少所述植物、植物組織、或種子的真菌毒素污染。上述轉基因種子和植物經(jīng)改造獲得的單端孢烯抗性通過有性繁殖或營養(yǎng)生長獲得傳遞，由此可以在后代植株中獲得維持和傳播。通常所說的維持和傳播利用了發(fā)展用于特定目的(諸如耕作、播種、或收獲)的已知農(nóng)業(yè)方法。由于生長的農(nóng)作物易受昆蟲或感染引起的攻擊和傷害，需要采取措施來控制植物疾病、昆蟲、線蟲、和其它不利條件以提高產(chǎn)量。這些包括機械措施，諸如耕地或除去受感染植物，以及施用農(nóng)藥，諸如殺真菌劑、殺配子劑、殺線蟲劑、生長調(diào)節(jié)劑、成熟劑、和殺昆蟲劑。在種子生產(chǎn)中，種子的發(fā)芽質量和均一性是重要的產(chǎn)品特性，而由農(nóng)夫收獲并出售的種子的發(fā)芽質量和均一性并不重要。由于難以將已知農(nóng)作物與其它農(nóng)作物和雜草種子隔離，難以控制種子傳播疾病，難以產(chǎn)生發(fā)芽較好的種子，在培育、調(diào)節(jié)、和銷售純種子領域有經(jīng)驗的生產(chǎn)者已經(jīng)發(fā)展了相當廣泛且詳細描述的種子生產(chǎn)實踐。因此，購買達到特定質量標準的合格種子，而非使用由其自己的農(nóng)作物收獲的種子，對于農(nóng)夫來說是普通實踐。通常將所用繁殖物(如種子)用包含除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、滅螺藥、及其混和物的保護劑涂層進行處理。通常所用的保護劑涂層包含諸如克菌丹、萎銹靈、福美雙(TMTD)、methalaxyl(Apron)、和pirimiphos-methyl(Actellic)等化合物。如果希望，可以將這些化合物與配制領域通常采用的其它載體、保護劑或施用促進佐劑一起配制，從而針對由細菌、真菌、或動物害蟲一起的傷害提供保護?？梢酝ㄟ^將繁殖物在液體制劑中浸泡，或者通過涂上濕的或干的組合制劑，來施用保護劑涂層。其它施用方法也是有可能的，諸如針對芽或果的處理。本發(fā)明的另一個方面提供了新的農(nóng)業(yè)方法，諸如上文例示的方法，其特征為使用本發(fā)明的轉基因植物、轉基因植物材料、或轉基因種子。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及由轉基因植物獲得的轉基因植物細胞、組織、種子或植物部分。本發(fā)明還包括植物的轉基因后代，以及由后代獲得的轉基因植物細胞、組織、器官、種子、和植物部分。在另一個實施方案中，本發(fā)明中所用異源多核苷酸還可以作為轉化步驟中的選擇標記使用。在這方面，使用上文例示的、本領域知道的表達盒和轉化技術，用本發(fā)明的異源多核苷酸(編碼的基因產(chǎn)物具有單端孢烯抗性)以及感興趣的第二種異源多核苷酸轉化宿主細胞。轉化之后，根據(jù)暴露于單端孢烯(特別是DAS或DON或T-2毒素)的存活能力選擇經(jīng)轉化細胞。使用本領域知道的轉化和表達系統(tǒng)，宿主細胞可以是真核的或原核的宿主細胞。宿主細胞可以是植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、或昆蟲細胞。在本發(fā)明特定的優(yōu)選實施方案中，將所編碼的基因產(chǎn)物具有單端孢烯活性的多核苷酸在植物細胞轉化方法中作為選擇標記使用。例如，還可以轉化至少表達感興趣的第二種異源DNA序列的植物、植物組織、植物種子、或植物細胞，以表達所編碼的多肽包含與SEQIDNO2、6、或8基本上相似的序列的序列。將經(jīng)轉化細胞轉移至含足量植物毒素單端孢烯(特別是DAS和/或DON和/或T-2毒素)的培養(yǎng)基，以抑制不表達氨基酸序列與SEQIDNO2、6、或8基本上相似的多肽的植物細胞的生長或存活，其中只有經(jīng)轉化細胞將生長或不受阻礙。用于選擇表達氨基酸序列與SEQIDNO2、6、或8基本上相似的多肽的植物的單端孢烯濃度范圍為1-90μg/ml。這一方法可用于能夠表達所含核苷酸序列與SEQIDNO1、5、或7基本上相似的多核苷酸的任何植物細胞，而且可以與任何感興趣的異源DNA序列一起使用。第二種異源DNA序列和本發(fā)明異源多核苷酸的表達可以由在植物細胞中發(fā)揮功能的同一啟動子或不同啟動子驅動。序列的描述SEQIDNO1是來自擬分枝孢鐮孢、編碼具有單端孢烯抗性的本發(fā)明多肽的cDNA序列。SEQIDNO2是由SEQIDNO1編碼、具有單端孢烯抗性的本發(fā)明多肽。SEQIDNO3是DNA引物。SEQIDNO4是DNA引物。SEQIDNO5是來自禾本科鐮孢、編碼具有單端孢烯抗性的本發(fā)明多肽的DNA序列。SEQIDNO6是由SEQIDNO3編碼、具有單端孢烯抗性的多肽。SEQIDNO7是來自釀酒酵母、編碼具有單端孢烯抗性的本發(fā)明多肽的DNA序列。SEQIDNO8是由SEQIDNO5編碼、具有單端孢烯抗性的多肽。SEQIDNO9是pCIB9818的DNA序列。SEQIDNO10是pAgroTRlr的DNA序列。SEQIDNO11是pNOV1704的DNA序列。實施例下列實施例進一步描述了進行本發(fā)明所用的材料和方法，及隨后的結果。我們以例示的形式提供這些實施例，它們的敘述不應當理解為對本發(fā)明的限制。實施例1pNOV1700、pCIB9818、pAgroTRIr、和pNOV1704的組成1.pNOV1700pNOV1700根據(jù)布達佩斯條約于1999年5月19日收藏于北方研究機構保藏中心(NRRL)，1815NorthernUniversityStreet，Peoria，Illinois，61604，美國，編號NRRL-30117。pNOV1700包含與玉米遍在蛋白質啟動子(包括一部分外顯子和內(nèi)含子)和胭脂堿合酶多聚腺苷酸化信號可操作連接的SEQIDNO1。2.pCIB9818質粒pCIB9818是6111個堿基對的環(huán)狀質粒，包含SEQIDNO9的DNA序列。包括一部分外顯子(第896-1011位堿基)和內(nèi)含子(第1047-1993位堿基)的玉米遍在蛋白質啟動子(SEQIDNO9的第12-1993位堿基)與磷酸甘露糖異構酶選擇標記(第2090-3193位堿基對)、反向PEPC內(nèi)含子#9(第3248-3355位堿基)、和CaMV35S基因的終止序列(第3357-3434位堿基)可操作連接。3.pAgroTRIr質粒pAgroTRIr是13737個堿基對的環(huán)狀二元載體，包含SEQIDNO10的DNA序列。pAgroTRIr包含與啟動子和終止序列可操作連接的選擇標記，以及SEQIDNO1的多核苷酸區(qū)，其位于擬南芥(Arabidopsisthaliana)UBI3啟動子(S.Norris、S.Meyer、和J.Callus，植物分子生物學(PlantMolecularBiology)22895-906，1993)之后且讀碼框一致，位于nos多聚腺苷酸化信號之前且讀碼框一致。4.pNOV1704質粒pNOV1704是12949個堿基對的環(huán)狀二元載體，包含SEQIDNO11的DNA序列。包括外顯子1(第895-1010位)和內(nèi)含子1(第1046-1992位)的玉米遍在蛋白質啟動子(SEQIDNO11的第11-1992位堿基)與磷酸甘露糖異構酶選擇標記(第2089-3192位堿基)和胭脂堿合酶終止序列(第3557-3688位堿基)可操作連接。pNOV1704還包含與SEQIDNO1的單端孢烯3-O-乙酰基轉移酶序列(第11234-12662位堿基)和nos終止序列(第12667-12935位)可操作連接的玉米遍在蛋白質啟動子(第9218-11218位堿基，包含外顯子1第10110-10224位和內(nèi)含子110225-11218位)。實施例2小麥的轉化、選擇、和再生轉化由表面消毒的小麥穎果(10％Chlorox，10分鐘)分離未成熟合子胚(0.75-1.25mm)，然后將盾片朝上置于基于MS的培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，植物生理學(Physiol.Plant)15437-439，1962)上，培養(yǎng)基添加3％蔗糖、3mg/ml2，4-D(二氯苯氧乙酸)、150mg/ml谷氨酰胺、75mg/ml天冬酰胺，并用0.7％植物用瓊脂(3MS3S培養(yǎng)基)固化。在進行轟擊之前，將胚在黑暗中于28℃溫育5-10天。轟擊的最佳時間是鋪板后6-7天。轟擊前4小時，將胚置于質壁分離培養(yǎng)基(與上述培養(yǎng)基相同，只是加入了15％麥芽糖而非蔗糖)上，并將盾片朝上排列成直徑2.5cm的圈。用PvuII和XmnI消化上文實施例1中所述pNOV1700，并分離包含具有SEQIDNO1的序列的多核苷酸區(qū)以及遍在蛋白質啟動子和nos多聚腺苷酸化信號的4117bp片段。用AscI消化上文實施例1中所述pCIB9818，并分離包含UBI玉米啟動子、選擇標記、和CaMV35S終止序列的4246bp片段。使用標準Sanford法，將分離得到的DNA片段沉淀在0.3μm金微粒上。在持續(xù)振蕩中，向裝有50μl50％甘油和3mg金微粒的Eppendorf管中加入5μg每種DNA構建物的分離片段、50μl2.5MCaCl2、和20μl0.1M亞精胺。將DNA/金微?；旌衔镉靡掖记逑磧纱巍Ｗ詈笠淮吻逑礂壢ド锨逡汉?，加入乙醇至終體積70μl。每管金微粒/DNA可以提供6次發(fā)射。對靶板發(fā)射兩次，使得向每個靶板投遞了大約3μgDNA(如果兩種構建物都使用了5μg，這是通常的情況)和1.0mg金微粒。所用破裂壓是1100psi。轟擊后，將靶板回到黑暗中放置過夜。質壁分離大約24小時后，將胚轉移至3MS3S，并回到黑暗中放置3周，進行愈傷組織起始。在此過程中不進行傳代培養(yǎng)。選擇/再生與非胚發(fā)生組織相分離在3周起始期間形成的胚發(fā)生組織，并置于再生/選擇培養(yǎng)基上?；镜脑偕囵B(yǎng)基是3MS3S，不含2，4-D，但是加入1mg/lGA3(赤霉素A3)和NAA(1-萘乙酸)(稱為NG培養(yǎng)基)。加入10g/l甘露糖和5g/l蔗糖(NG1M.5S)。將組織進行這一再生和選擇初始階段2周。對于這兩周的大部分時間，將組織置于光照室中。芽和根的發(fā)育在這一階段開始，2周后，將所有組織帶入下一階段。對于使用甘露糖選擇的再生和選擇的第二階段，將甘露糖降至5g/l，而將蔗糖升至20g/l(MS2S.5M)。通常將組織在這些培養(yǎng)基上放置大約4周時間，在此過程中，發(fā)生芽和根的發(fā)育。將板中旺盛生長、顏色鮮艷、根與芽發(fā)育的幼苗從板上轉移至較大容器GA7。這是選擇和再生的最后階段。培養(yǎng)基只含1/2MS鹽和15g/l甘露糖。植物已被轉化的最好指示是觀察到根積極生長到培養(yǎng)基中。收集活潑生長幼苗的葉組織，并在轉移至溫室之前，對感興趣的基因和選擇標記都進行PCR。讓植物生長大約3-4周，然后停止?jié)菜?周。收集莢果，并在干燥室中干燥大約1周半。播種并生長大約2周。向植物噴灑選擇劑，2天后和4天后再次噴灑。大約3天后，將存活植物轉移至新盆。實施例4玉米的biolistic轉化由來自溫室生長物的1.5-2.0mm未成熟玉米胚起始I型胚發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)(Green等人，1983，玉米中的體細胞遺傳系統(tǒng)，A.Fazelahmad、K.Downey、J.Schultz、RWVoellmy編，《基因技術進展植物和動物的分子遺傳學》(AdvancesinGeneTechnologyMolecularGeneticsofPlantsandAnimals)，邁阿密冬季系列座談會，第20卷，AcademicPress，NY)。授粉后大約14天，由表面消毒的玉米穗無菌分離胚。將胚置于添加了2％蔗糖和5mg/L氯氨苯的D愈傷組織起始培養(yǎng)基(Duncanet等人，植物(Planta)165322-332，1985)。隨后在黑暗中培養(yǎng)胚和胚發(fā)生培養(yǎng)物。大約14天后由外植體切下胚發(fā)生應答。將應答置于添加了2％蔗糖和0.5mg/L2，4-D的D愈傷組織維持培養(yǎng)基上。每周用新鮮的維持培養(yǎng)基進行選擇性傳代培養(yǎng)，大約6周后，建立了高質量的緊密胚發(fā)生培養(yǎng)物。選擇積極生長的胚發(fā)生愈傷組織塊作為基因投遞的靶組織。基因投遞前大約4小時，將愈傷組織塊置于裝有添加了12％蔗糖的維持培養(yǎng)基的靶板中。將愈傷組織塊排列成圈，據(jù)靶板中心的直徑為8和10mm。用PvuII和XmnI消化上文實施例1中所述pNOV1700，并分離包含具有序列SEQIDNO1的多核苷酸以及啟動子和多聚腺苷酸化信號的4117bp片段。用AscI消化上文實施例1中所述pCIB9818，并分離包含標記基因、啟動子、和終止信號的4246bp片段。如DuPontBiolistics手冊所述，將分離得到的DNA片段沉淀在金微載體上。6次微載體制劑發(fā)射中每次使用2-3μg每種質粒。使用PDS-1000HeBiolistics設備，將本發(fā)明多核苷酸投遞給靶組織細胞。Biolistics設備上的設置如下破裂盤和微載體之間相距8mm，微載體和終止屏之間相距10mm，終止屏和靶之間相距7cm。使用650psi破裂盤對每個靶板發(fā)射2次。將200×200不銹鋼網(wǎng)(McMasterCarr，NewBrundwick，NJ)置于終止屏和靶組織之間?；蛲哆f后7天，將靶組織塊由高滲透壓培養(yǎng)基轉移至選擇培養(yǎng)基。將靶組織置于不含蔗糖、含1％甘露糖的維持培養(yǎng)基上。3-5周后，用不含蔗糖、含1.5％甘露糖的維持培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)生長中的愈傷組織塊。每2周對在選擇培養(yǎng)基上生長的胚發(fā)生愈傷組織進行傳代培養(yǎng)，6-10周，直到產(chǎn)生的愈傷組織足以產(chǎn)生10-20株植物。將原始靶組織塊經(jīng)歷選擇后殘存的組織以單集落傳代培養(yǎng)，并命名為獨立的轉化事件。將集落轉移至經(jīng)修改的MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，用于煙草組織培養(yǎng)物的快速生長和生物實驗的修正培養(yǎng)基，植物生理學(Physiol.Plant)15473-497，1962)，含2％蔗糖和1％甘露糖(MS2S+1M)，添加0.25mg/L環(huán)丙嘧啶醇和0.5mg/L激動素。2周后，將再生集落轉移至不含激素的MS2S+1M。將所有集落的有根或無根的再生苗轉移至裝有MS3S培養(yǎng)基的Magenta盒，回收有根的小植株并轉移至溫室土壤。實施例5轉基因植物表達的分析a.PCR分析對來自經(jīng)轉化植物的組織分析包含序列SEQIDNO1的多核苷酸的存在。按照標準方案，由經(jīng)轉化植物提取并進行PCR分析。用于擴增基因構建物的引物是(5＇-acgaatcattcaccgaggag-3′)(SEQIDNO3)和(5′-ctcacactctcaggcttacc-3′)(SEQIDNO4)。檢測到上文實施例2中獲得的小麥序列SEQIDNO1中的650nt片段。b.Northern分析通過Northern印跡雜交，對經(jīng)轉化植物分析RNA的存在。對于Northrn印跡分析，將由植物組織提取的RNA進行大小分離，并轉移到尼龍膜上。隨后將該膜與由SEQIDNO1的多核苷酸的429ntStyI片段衍生的放射性探針雜交。檢測按照上文實施例2和3轉化的小麥和擬南芥中的RNA。實施例6用于鑒定單端孢烯3-O-乙?；D移酶活性的酶實驗a)用于酶實驗的植物組織的提取選擇來自本發(fā)明轉基因植物(包括按照上文實施例2-4轉化和再生的植物)的3片1×1/8英寸葉片(大約50mg)。b)玻璃珠研磨將組織置于2ml圓底管中，關上蓋子。將管子浸入液氮，并于-80℃保溫過夜。將管子在saws-all上振搖24秒鐘，加入0.4ml磷酸鈉緩沖液。將管子振蕩10秒鐘，并置于冰上。將管子再振蕩5分鐘，然后以14,000rpm在Eppendorf離心機中離心5分鐘。經(jīng)上清液轉移至干凈的管中?；旌拖铝谐煞謫味随呦┑孜?，2μlDAS(20％丙酮，50mM磷酸鈉緩沖液，pH7.0)。也可以使用DON。乙酰輔酶A底物，2μl[14C]-乙酰輔酶ANEN產(chǎn)品目錄號NEC313(60mCi/mmol和0.02mCi/ml)。緩沖液，磷酸鈉緩沖液(pH7.0)至終體積50μl。加入下面的酶制劑來起始實驗，并于30℃溫育15分鐘。酶制劑，10μl溶于磷酸鈉緩沖液(pH7.0)的植物提取物15分鐘后，加入100μl乙酸乙酯，并經(jīng)管子振蕩2次，每次數(shù)秒種。將管子以14,000rpm在Eppendorf離心機中離心2分鐘。將50μl乙酸乙酯相轉移至裝有閃爍混合液的小瓶中。使用閃爍計數(shù)器對管子計數(shù)2分鐘。按照上文實施例2獲得20株分離的小麥植株，鑒定的比活性為0.60-13.4nmol乙酰化產(chǎn)物/μg蛋白質/15分鐘。經(jīng)轉化小麥植株的比活性顯著高于陰性對照。陰性對照是未轉化的小麥栽培變種，其比活性為0.1-0.2nmol乙?；a(chǎn)物/μg蛋白質/15分鐘。按照上文實施例3獲得5株分離的擬南芥植株，鑒定的比活性范圍為3.8-28nmol乙?；a(chǎn)物/μg蛋白質/15分鐘。經(jīng)轉化植株的比活性顯著高于陰性對照。陰性對照是用用于表達選擇標記的核酸構建物轉化的擬南芥哥倫比亞變種，其比活性低于0.1nmol乙?；a(chǎn)物/μg蛋白質/15分鐘。鑒定了來自按照上文實施例4獲得的至少2株不同轉化體的玉米植株，其比活性范圍為11.1-17.9nmol乙酰化產(chǎn)物/μg蛋白質/15分鐘。經(jīng)轉化植株的比活性顯著高于陰性對照。陰性對照是未轉化的玉米基因型，其比活性低于0.2nmol乙?；a(chǎn)物/μg蛋白質/15分鐘。鑒定了來自使用土壤桿菌介導的pNOV1704轉化獲得的至少16株不同轉化體的玉米植株，其比活性范圍為17-183nmol乙?；a(chǎn)物/μg蛋白質/15分鐘。實施例7用于鑒定轉基因植物中的單端孢烯抗性的生物實驗配制250ml包含下列成分的CPR培養(yǎng)基，并用KOH將pH調(diào)至6.51/2MS鹽0.54g1/2MS維生素1.25ml1％蔗糖(任選)2.50g。向上述培養(yǎng)基中加入瓊脂糖至1％(2.50g)，并將培養(yǎng)基高壓滅菌。向高壓滅菌后的培養(yǎng)基中加入25ml50mg/ml氯酚紅。當培養(yǎng)基維持在55℃時，以各種濃度加入溶于丙酮的DAS或DON(即每1.7ml加入10mg/mlDON4、8、或16μl或者50mg/mlDAS2、4、或6μl)。向48孔微量滴定板的每個孔中加入大約0.5ml培養(yǎng)基。向微量滴定板的孔中加入1/3×1/8英寸的經(jīng)轉化植物組織以及來自未轉化野生型對照的對照組織。將葉片放在培養(yǎng)皿中，并用鑷子推入微量滴定板孔的培養(yǎng)基中。將微量滴定板于20℃光照下溫育2-4天。葉片新陳代謝導致顏色由紅色變成黃色(pH下降)。轉化體具有對單端孢烯抗性或對單端孢烯的敏感性降低，導致存在DAS或DON的孔中的培養(yǎng)基變成黃色。與保持紅色的對照相比，在本發(fā)明的小麥和玉米植物中觀察到由紅色到黃色的顏色變化。此外，個別葉片的萎黃病顯著少于相應對照。將由按照上文實施例3獲得的植物的擬南芥種子在含DAS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到大量根和芽都發(fā)育的植株。當在添加了DAS的培養(yǎng)基中生長時，對照種子(擬南芥親本系，哥倫比亞變種)發(fā)芽情況很差，沒有形成根。在不含DAS的同一培養(yǎng)基中，沒有觀察到經(jīng)轉化種子與對照種子之間的差異。B.用于檢測幼苗枯萎病抗性的真菌抗性發(fā)芽實驗1.小麥的真菌抗性發(fā)芽實驗基本上如R.H.Proctor、T.M.Hohn、和S.P.McCormick(單端孢烯毒素生物合成基因的斷裂導致玉蜀黍赤霉的毒性降低，植物與微生物之間的分子相互作用(Mol.Plant-MicrobeInteract.)8(4)593-601，1995)所述進行小麥的真菌抗性發(fā)芽實驗，此處完整引用作為參考。接種物包含禾本科鐮孢的大型分生孢子，用水稀釋至1×106個分生孢子/ml。通過清洗來自在白光和近紫外熒光燈下生長7-10天的V-8汁瓊脂培養(yǎng)物的大型分生孢子來制備接種物。在幼苗實驗中，通過在10％漂白劑和0.05％吐溫溶液中清洗大約15分鐘，并用無菌蒸餾水漂洗5次，對自上文實施例2的2株不同的轉基因小麥事件的種子和野生型對照進行表面消毒。將種子在大型分生孢子懸浮液中浸泡大約10分鐘，然后播種于裝在10cm塑料盆的蛭石中，每盆20粒種子。播種前，將盆用蛭石裝大約3/4滿，澆水2-4cm，直至蛭石表面也濕了。播種后，用另外1-2cm蛭石覆蓋種子，將盆單個置于塑料袋中，并在生長間中于22℃溫育1周，光照16小時，黑暗8小時。大約1周后，將盆由袋中取出，2周后，通過計數(shù)每個盆中出現(xiàn)的幼苗數(shù)目來評價疾病情況。如上所述處理對照，除了將種子在無菌水中浸泡40秒。與用水處理的相同轉基因種子相比，來自2株不同的轉基因植物事件的種子有50％和43％發(fā)芽；而與用水處理的相同種子相比，野生型對照有17％發(fā)芽了。2.玉米的真菌抗性發(fā)芽實驗由在綠豆瓊脂(用煮沸綠豆汁制成)上、光照與黑暗12小時更替、于25℃生長的禾本科鐮孢培養(yǎng)物制備接種物。首先向板中注入無菌水，然后用玻璃棒刮板，由此收獲孢子。收集溶液，并于接種當天用無菌雙蒸水將孢子濃度調(diào)至1×106個/ml。5升盆中的每升土壤接種1ml孢子溶液，土壤為土壤、泥煤、和蛭石的無菌混和物，將接種后的土壤在水泥攪拌器中進行攪拌，每個裝載量2分鐘。對照處理包括未感染的土壤。在盆中種植30粒本發(fā)明的轉基因種子或野生型對照，并于保持在55F的生長間中在半飽和土壤條件下溫育4周。光照水平為種植后14天保持24小時黑暗，種植后第15-24天為12小時光照。向盆中插入標記樁，然后將盆移至生長間并隨機化。植物一出現(xiàn)就開始計數(shù)，每天或隔天進行，直至不再有變化。測定視覺變色的癥狀和出土幼苗的腐爛，用于描述相對于野生型對照的植物抗性程度。選擇視覺變色和/或出土幼苗腐爛比野生型少的植株。實施例9真菌抗性實驗A.轉基因小麥植物的測試小麥麥尖枯萎病或麥尖斑點病由禾本科鐮孢(有性型玉蜀黍赤霉)引起。在V-8瓊脂培養(yǎng)基(用V-8汁制成)或綠豆瓊脂(用煮沸綠豆汁制成)上，在光照與黑暗12小時更替下，于25℃培養(yǎng)禾本科鐮孢培養(yǎng)物。首先向板中注入無菌水，然后用玻璃棒刮板，由此收獲孢子。收集溶液，并于接種當天用無菌雙蒸水將孢子濃度調(diào)至5×104個/ml。由上文實施例2所述獲得轉基因植物，可以在溫室中培養(yǎng)對照植株直至開花或抽穗。通過在每個穗頭近中部的一朵花的外稃和內(nèi)稃之間接種20μl(大約1000個孢子)接種物來進行穗頭接種。留一些穗頭不接種或用無菌水接種作為對照。然后將植物移至生長間，并在高濕度下溫育21天，或者首先將植物在霧室中于65-70°F溫育72小時，然后在溫室中再溫育18天。也可以在田間培養(yǎng)本發(fā)明的轉基因植物和對照植物，通過噴灑進行接種。通過在有代表性數(shù)目的轉基因穗頭和野生型對照穗頭上計數(shù)每個接種穗頭中有癥狀和無癥狀的小穗，并計算每個穗頭上有癥狀小穗所占百分比，由此評價疾病。癥狀包括相對于對照植物早熟和某些情況中的小穗壞死。選擇有癥狀小穗比野生型少的植株。在根據(jù)Southern數(shù)據(jù)具有不同的SEQIDNO1拷貝數(shù)和不同的插入位點數(shù)目的6株不同的轉基因植物中，每個穗頭的有癥狀小穗的平均百分比范圍為10.40％-31.20％，而野生型對照為44.75％，如上所述，轉基因植物和對照在溫室中溫育。這些相同的轉基因植物具有范圍為0.874-29.1nmol/μg/15min的酶活性，如上文實施例6所述測量。B.轉基因玉米植物的測試(玉米穗腐爛實驗)玉米穗腐爛由禾本科鐮孢(有性型玉蜀黍赤霉)引起。在V-8瓊脂培養(yǎng)基(用V-8汁制成)上，在光照與黑暗12小時更替下，于25℃培養(yǎng)禾本科鐮孢培養(yǎng)物。首先向板中注入無菌水，然后用玻璃棒刮板，由此收獲孢子。收集溶液，并于接種當天用無菌雙蒸水將孢子濃度調(diào)至5×105個/ml。在溫室或田間培養(yǎng)轉基因植株和對照植株。當在溫室中培養(yǎng)時，穗絲出現(xiàn)后，向穗絲溝(外殼腔內(nèi)，穗軸以上)中注入2ml孢子懸浮液，并將轉基因植株和對照植株在溫室中再維持4-7天。使用裝配好的18號不銹鋼皮下注射器針頭和大注射器進行這一步。除了穗絲溝接種，谷粒接種法也可用于測定疾病抗性。谷粒接種包括使用裝配好的18號針頭和注射器對一組4粒谷粒多次注射孢子懸浮液(大約0.4ml)。通過對接種后5-7周收獲的玉米穗視覺檢查可見的受感染谷粒來評價疾病。去殼玉米穗的發(fā)病率標準是基于下面的玉米穗上可見的受感染谷粒所占百分比的視覺評價1是0％；2是1-3％；3是4-10％；4是11-25％；5是26-50％；6是51-75％；7是76-100％。選擇可見的受感染谷粒所占百分比比野生型對照少的玉米植株。實施例10真菌毒素污染實驗如下制備用于真菌毒素濃度分析的樣品。由本發(fā)明的轉基因植物收集種子，一起稱重量、量體積。當測定小麥種子時，由相同的本發(fā)明轉基因植物的穗頭收集小麥種子，一起稱重量、量體積。當測定轉基因玉米時，將玉米穗干燥至低含水量水平，將玉米穗手工脫粒，并將來自相同的轉基因植物的玉米穗的谷粒一起稱重量、量體積。將每份種子或谷粒樣品充分攪拌，以促進種子的隨機分布。將50g種子或谷粒樣品用磨(如ZM1型Retsch超速離心磨，Brinkman設備公司，Rexdale，Ontario，RomerSeriesIIMill，Union，Missouri，USA)磨成細粉。然后使用商品化測試(諸如DONtestTAGTM真菌毒素測試系統(tǒng)，VICAM，LP，313PleasantStreet，Watertown，MA02472)測定感興趣的真菌毒素(諸如DON)的濃度，或者通過商業(yè)分析公司(如RomerLabs公司，Union，Missouri，美國；或TrilogyAnalyticalLaboratory公司，Beaufort，Missouri，美國)進行分析。分析的所有方面都遵循制造商的指示。對于DONtestTAGTM真菌毒素測試系統(tǒng)，對DON進行最終的熒光測量。選擇真菌毒素(諸如DON)比野生型對照少的產(chǎn)生種子或谷粒的植株。實施例11使用SEQIDNO1的多核苷酸作為選擇標記A.真菌細胞中的選擇標記使用標準真菌轉化技術，用DNA構建物進行棉阿舒囊霉(Ashbyagossypi)轉化，該DNA構建物所含多核苷酸包含與半乳糖苷酶啟動子可操作連接的序列SEQIDNO1。在含DAS濃度范圍1.56ng/ml-196pg/ml的培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉化細胞，而未轉化的野生型真菌細胞的培養(yǎng)基不含DAS。B.植物細胞中的選擇標記將按照上文實施例3轉化但未進行選擇的擬南芥植株的種子置于含0、5、或10μg/mlDAS的0.1％瓊脂糖培養(yǎng)基中。在生長間于22℃溫育2周后(16小、時光照，8小時黑暗)，由DAS板轉種較大的、未受阻礙的植株，并由對照板轉種相應數(shù)目。生長2周后，對由5mg/ml板轉種的經(jīng)轉化擬南芥植株的葉按照實施例6測定酶活性，11株未受阻礙的植物中有11株顯示酶活性，而在同一實驗中，10株未受DAS選擇的植株中有9株為陰性。那株顯示酶活性的未選擇植株比測定的任一株DAS選擇植株的活性低得多。上文公開的實施方案是例示性的。本發(fā)明的此公開書將使本領域技術人員了解本發(fā)明的許多變異。所附權利要求意欲涵蓋所有這些明顯的且可預知的變異。SEQUENCELISTING<110>NovartisAG<120>TransgenicPlantandMethods<130>S-30884A/RTP2107<140><141><150>US09/282，995<151>1999-03-31<150>US09/502,852<151>2000-02-11<160>11<170>PatentInVer.2.0<210>1<211>1403<212>DNA<213>Fusariumsporotrichioides<400>1atcaaaatggccgcaacaagcagcacaagcagccagtcttttgacatagagctcgacatc60atcggccagcaaccgcctcttctttcaatctacacccagatcagtctcgtttaccccgtc120tctgatccctcccagtatcccaccatcgtcagcacccttgaggaaggcctaaaacgcctc180tctcaaaccttcccatgggtcgcgggccaggtcaagaccgagggcatcagcgaaggaaac240acaggaacttccaagatcattccatatgaggagacaccccgtcttgtggtgaaagacctc300cgtgatgattcctcagcgccaacgatcgaggggttgagaaaggcgggtttccccttagag360atgtttgacgagaacgtcgtcgctccgaggaagacattagctatcggacctggcaatggc420cccaacgacccgaagcctgtgttgctattgcagctcaacttcattaagggcggactcatt480ctcaccgtcaacggacaacatggtgctatggacatgacaggacaagatgcaattattcgt540cttctctccaaggcgtgccgcaacgaatcattcaccgaggaggaaatctcggccatgaac600ctcgatcgcaagacggtagtccctctccttgaaaactacaaagttggtcctgagctagac660caccagatcgccaaacctgcgcctgctggcgacgctccacccgcaccggccaaggcaagc720tgggcgttcttttcattcactcccaaggccctctcggagctgaaagacgcagccacaaag780actcttgacgcgtcgtccaagtttgtgtcaactgatgatgctctttcggcgtttatctgg840caatcaacctcgcgcgtacgtctcgcaagattggatgcttccacacctactgaattctgc900cgcgctgtcgacatgcggggcccaatgggcgtatcaagcacatacccaggccttcttcaa960aacatgacctaccatgactcgaccgtcgccgaaatcgccaacgaaccacttggcgcaaca1020gcatcacgcctgcgctcggaactcaacagtgatcgtttgcgcagacgaacacaagctttg1080gcgacgtacatgcatggcctgcctgacaagtcgagcgtctccctgaccgccgatgcgaat1140ccgtcaagcagcatcatgctgagttcctgggccaaggtgggatgctgggagtatgacttt1200gggtttggactgggtaagcctgagagtgtgagaagacctcgctttgaaccttttgagagt1260ttgatgtactttatgcccaagaagcctgatggggagtttacggcgtccatttctctgagg1320gatgaggatatggagagactaaaggcggatgaggagtggacaaagtacgcaaagtatatt1380gggtagatagtttactagactac1403<210>2<211>459<212>PRT<213>Fusariumsporotrichioides<400>2MetAlaAlaThrSerSerThrSerSerGlnSerPheAspIleGluLeu151015AspIleIleGlyGlnGlnProProLeuLeuSerIleTyrThrGlnIle202530SerLeuValTyrProValSerAspProSerGlnTyrProThrIleVal354045SerThrLeuGluGluGlyLeuLysArgLeuSerGlnThrPheProTrp505560ValAlaGlyGlnValLysThrGluGlyIleSerGluGlyAsnThrGly65707580ThrSerLysIleIleProTyrGluGluThrProArgLeuValValLys859095AspLeuArgAspAspSerSerAlaProThrIleGluGlyLeuArgLys100105110AlaGlyPheProLeuGluMetPheAspGluAsnValValAlaProArg115120125LysThrLeuAlaIleGlyProGlyAsnGlyProAsnAspProLysPro130135140ValLeuLeuLeuGlnLeuAsnPheIleLysGlyGlyLeuIleLeuThr145150155160ValAsnGlyGlnHisGlyAlaMetAspMetThrGlyGlnAspAlaIle165170175IleArgLeuLeuSerLysAlaCysArgAsnGluSerPheThrGluGlu180185190GluIleSerAlaMetAsnLeuAspArgLysThrValValProLeuLeu195200205GluAsnTyrLysValGlyProGluLeuAspHisGlnIleAlaLysPro210215220AlaProAlaGlyAspAlaProProAlaProAlaLysAlaSerTrpAla225230235240PhePheSerPheThrProLysAlaLeuSerGluLeuLysAspAlaAla245250255ThrLysThrLeuAspAlaSerSerLysPheValSerThrAspAspAla260265270LeuSerAlaPheIleTrpGlnSerThrSerArgValArgLeuAlaArg275280285LeuAspAlaSerThrProThrGluPheCysArgAlaValAspMetArg290295300GlyProMetGlyValSerSerThrTyrProGlyLeuLeuGlnAsnMet305310315320ThrTyrHisAspSerThrValAlaGluIleAlaAsnGluProLeuGly325330335AlaThrAlaSerArgLeuArgSerGluLeuAsnSerAspArgLeuArg340345350ArgArgThrGlnAlaLeuAlaThrTyrMetHisGlyLeuProAspLys355360365SerSerValSerLeuThrAlaAspAlaAsnProSerSerSerIleMet370375380LeuSerSerTrpAlaLysValGlyCysTrpGluTyrAspPheGlyPhe385390395400GlyLeuGlyLysProGluSerValArgArgProArgPheGluProPhe405410415GluSerLeuMetTyrPheMetProLysLysProAspGlyGluPheThr420425430AlaSerIleSerLeuArgAspGluAspMetGluArgLeuLysAlaAsp435440445GluGluTrpThrLysTyrAlaLysTyrIleGly450455<210>3<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>DescriptionofArtificialSequenceDNAPrimer<400>3acgaatcattcaccgaggag20<210>4<211>20<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>DescriptionofArtificialSequenceDNAPrimer<400>4ctcacactctcaggcttacc-20<210>5<211>1356<212>DNA<213>Fusariumgraminearum<400>5atggctttcaagatacagctcgacaccctcggccagctaccaggcctcctttcgatctac60acccaaatcagtctcctctaccccgtctctgattcctctcaatatcccactattgtcagc120accttcgagcaaggtcttaagcgcttctccgaagccgtcccatgggtcgcaggccaggtc180aaagccgagggcattagcgagggaaacacaggaacttcctttatcgtcccttttgaggac240gttcctcgtgttgtagtgaaagacctccgcgatgatccttcagcgcccacgatcgagggt300atgagaaaggcgggataccctatggcgatgtttgacgagaacatcatcgcgccaaggaag360acgttacctattggacctggtactggtcccgacgacccaaagcctgtaattctattgcag420ctcaacttcatcaagggcggactcatcctcactgtcaacggacagcacggtgctatggat480atggtaggccaagatgcggtgatccgtctactctccaaggcgtgccgtaacgacccattc540accgaagaggaaatgacggccatgaacctcgatcgcaagacgatagttccttaccttgaa600aactatacgattggccccgaggtagatcatcagattgtcaaagctgatgtagctggtggt660gacgctgttctcacgccggtcagtgcaagctgggcgttcttcacattcagccccaaggcc720atgtcagagctcaaggatgctgctaccaagactcttgacgcatcaacaaagttcgtgtcg780actgacgatgctctttcggcgttcatctggaaatcggcctctcgcgtgcgtctcgaaaga840atcgatggctctgcacctaccgagttctgccgtgctgttgatgctc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