專利名稱：新甘露糖異構(gòu)酶及其編碼的dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)、編碼蛋白質(zhì)的DNA、包含該DNA的重組DNA、攜帶重組DNA的轉(zhuǎn)化子、用轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生甘露糖異構(gòu)酶的方法，以及產(chǎn)生果糖、甘露糖、木酮糖和來蘇糖的方法。
已純化了來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的甘露糖異構(gòu)酶，并對其特性進行了研究[普通微生物學(xué)雜志，124，219(1981)]，但尚未分析其氨基酸序列。由于大腸桿菌染色體DNA的核苷酸序列已被確定[科學(xué)(Science)，277，1453(1997)]，根據(jù)耶魯大學(xué)數(shù)據(jù)庫，大腸桿菌基因原種中心(http//cgsc.biology.yale.edu)，可以推斷甘露糖異構(gòu)酶基因大約存在于染色體的87.6分鐘附近。但是，該基因尚未被確定或分離。
關(guān)于用甘露糖異構(gòu)酶產(chǎn)生糖類，用來自假單胞菌屬的細(xì)菌的甘露糖異構(gòu)酶產(chǎn)生甘露糖(日本公開未審專利申請No.292587/94)及用來自不動桿菌屬的細(xì)菌的甘露糖異構(gòu)酶產(chǎn)生甘露糖(日本公布的未檢驗專利申請No.9986/96)均有公知的方法。但是，由于每個細(xì)胞的酶活性低，這些方法需要的反應(yīng)時間長，不適于甘露糖的工業(yè)生產(chǎn)。
至今，用甘露糖異構(gòu)酶有效地產(chǎn)生糖類的方法仍未知。
為達(dá)到這個目的本發(fā)明者進行了深入研究。最終，他們成功地從埃希氏菌屬的微生物中分離到了編碼甘露糖異構(gòu)酶的DNA，并發(fā)現(xiàn)用分離到的DNA有效生產(chǎn)糖類如甘露糖是可能的。本發(fā)明是在這個結(jié)果的基礎(chǔ)上完成的。
本發(fā)明涉及下述的(1)-(14)。
(1)一種由氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，其中SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基被刪除、替換或添加，并且具有甘露糖異構(gòu)酶活性。根據(jù)分子克隆，實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989)(下文用分子克隆，第二版指代)；分子生物學(xué)最新方法(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley & Sons(1987-1997)(下文用分子生物學(xué)最新方法指代)；核酸研究(Nucleic Acids Research)，10，6487(1982)；核酸研究，13，4431(1985)；美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，79，6409(1982)；美國國家科學(xué)院院報，82，488(1985)；基因(Gene)，34，315(1985)等描述的定點誘變方法產(chǎn)生這樣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)包含的氨基酸序列中一個或多個氨基酸殘基被刪除、替換或添加，并且具有甘露糖異構(gòu)酶活性。
根據(jù)上述方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的實例為那些通過將編碼具SEQ IDNO1所示的氨基酸序列之蛋白質(zhì)的DNA中導(dǎo)入一種定點誘變，從而獲得的蛋白質(zhì)。
對被刪除、替換或添加的氨基酸殘基數(shù)沒有明確的限制，但是優(yōu)選的范圍為一至幾十個氨基酸，更優(yōu)選的為一至幾個氨基酸。
(2)一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，其中蛋白質(zhì)由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成。
(3)一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，蛋白質(zhì)包括一種氨基酸序列，其中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基被刪除、替換或添加，并且具有甘露糖異構(gòu)酶活性。
(4)一種DNA，其具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
(5)一種DNA，其在嚴(yán)格條件下可與根據(jù)上述(2)-(4)中任意一項所述的DNA雜交，并且編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
此處所用的表述“可在嚴(yán)格條件下雜交的DNA”指的是以上述(2)-(4)中任意一項所述的DNA作為探針，通過集落雜交、空斑雜交、Southern雜交等而得到的DNA。這樣的DNA可如下鑒定例如，在65℃、0.7-1.0M NaCl存在時，與固定有集落-或者空斑-來源之DNA的濾膜雜交，然后用0.1至2倍濃度的SSC溶液65℃洗膜(1倍濃度的SSC溶液150mM氯化鈉和15mM檸檬酸鈉)。
通過實驗室手冊中描述的方法進行雜交，如分子克隆，第二版；分子生物學(xué)最新方法；以及DNA克隆1核心技術(shù)，實用方法，第二版，牛津大學(xué)(DNA Cloning 1Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，Oxford University)(1995)?？呻s交的DNA是例如，與SEQ ID NO2所示的核苷酸序列至少有80％同源性的DNA，優(yōu)選地95％或更高同源性的DNA。
(6)一種重組DNA，其通過將上述(2)-(5)中任意一項所述的DNA插入載體而獲得。
(7)一種轉(zhuǎn)化子，其通過將上述(6)的重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞而獲得。
(8)根據(jù)上述(7)的轉(zhuǎn)化子，其為大腸桿菌。
(9)一種產(chǎn)生具甘露糖異構(gòu)酶活性之蛋白質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)上述(7)或(8)之轉(zhuǎn)化子，在培養(yǎng)物中形成并累積具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，以及從培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)。
(10)一種產(chǎn)生果糖的方法，其包括使水性培養(yǎng)基中存在以轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物或其處理物作為酶源以及甘露糖，從而在水性培養(yǎng)基中形成并累積果糖，以及從水性培養(yǎng)基中回收果糖；其中所述轉(zhuǎn)化子是通過導(dǎo)入編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA而獲得的。
(11)一種產(chǎn)生甘露糖的方法，其包括使水性培養(yǎng)基中存在以轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物或其處理物作為酶源以及果糖，從而在水性培養(yǎng)基中形成并累積甘露糖，以及從水性培養(yǎng)基中回收甘露糖；其中所述轉(zhuǎn)化子是通過導(dǎo)入編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA而獲得的。
(12)一種產(chǎn)生木酮糖的方法，其包括使水性培養(yǎng)基中存在以轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物或其處理物作為酶源以及來蘇糖，從而在水性培養(yǎng)基中形成并累積木酮糖，以及從水性培養(yǎng)基中回收木酮糖；其中所述轉(zhuǎn)化子是通過導(dǎo)入編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA而獲得的。
(13)一種產(chǎn)生來蘇糖的方法，其包括使水性培養(yǎng)基中存在以轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物或其處理物作為酶源以及木酮糖，從而在水性培養(yǎng)基中形成并累積來蘇糖，以及從水性培養(yǎng)基中回收來蘇糖；其中所述轉(zhuǎn)化子是通過導(dǎo)入編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA而獲得的。
(14)根據(jù)上述(10)-(13)中任意一項所述的方法，其中轉(zhuǎn)化子是根據(jù)上述(7)或(8)的轉(zhuǎn)化子。
對本發(fā)明的詳述如下。
制備編碼甘露糖異構(gòu)酶的DNA編碼甘露糖異構(gòu)酶的DNA可從埃希氏菌屬的微生物中制備。合適的埃希氏菌屬的微生物實例有大腸桿菌、蟑螂埃希氏菌(Escherichiablattae)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫曼氏埃希氏菌(Escherichia hermannii)、中間埃希氏菌(Escherichiaintermedia)、傷口埃希氏菌(Escherichia vulneris)等，尤其是大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110(ATCC 27325)、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、蟑螂埃希氏菌ATCC33430、弗格森埃希氏菌ATCC 35473、赫曼氏埃希氏菌ATCC 33652、中間埃希氏菌ATCC 20173、傷口埃希氏菌ATCC 39368等。
根據(jù)公知的方法(例如分子生物學(xué)最新方法)培養(yǎng)埃希氏菌屬的微生物，并且分離、純化微生物的染色體DNA。
由于大腸桿菌染色體DNA的序列已被確定[科學(xué)，277，1453(1997)]，根據(jù)耶魯大學(xué)數(shù)據(jù)庫，大腸桿菌基因原種中心(http//cgsc.biology.Yale.edu)，可以推斷甘露糖異構(gòu)酶基因大約存在于染色體的87.6分鐘處。
在上述信息的基礎(chǔ)上，包含編碼來自埃希氏菌屬微生物的甘露糖異構(gòu)酶之DNA片段可通過PCR獲得[PCR方法(PCR Protocols)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)(1990)]，所用引物根據(jù)大腸桿菌染色體上約87.6分鐘處的核苷酸序列制備，模板為基因組DNA。
以根據(jù)基因組核苷酸序列設(shè)計的合成DNA作為探針，也可通過例如，雜交獲得編碼甘露糖異構(gòu)酶的DNA。
將所獲得的DNA(如原樣或用合適的限制性酶切割后)用傳統(tǒng)方法插入載體，然后用通常的核苷酸序列分析方法測定DNA的核苷酸序列，例如，用373A DNA測序儀(Perkin-Elmer公司)或類似儀器雙脫氧法測序[美國國家科學(xué)院院報，74，5463(1977)]。
可插入上述DNA的合適載體包括pBluescript KS+(Strategene)、pDIRECT[核酸研究，18，6069(1990)]、pCR-Script Amp SK+(Strategene)、pT7Blue(Novagen)、pCR II(Invitrogen)、pCR-TRAP(GenHunter)、pNotAT7(5Prime→3Prime)等。
通過上述方法獲得的具核苷酸序列的DNA的實例為具SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA。
攜帶包含SEQ ID NO2所示序列之DNA的質(zhì)粒的大腸桿菌菌株的一個實例為大腸桿菌NM522/pYP27。
根據(jù)已測定的DNA核苷酸序列，也可使用DNA合成儀(例如，DNASynthesizer Model 8905，PerSeptive Biosystems)，用化學(xué)合成法制備靶DNA。
可按照任一將DNA導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞的方法進行重組DNA的導(dǎo)入，例如，鈣離子法[美國國家科學(xué)院院報，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(日本公開未審專利申請No.248394/88)以及電穿孔法[核酸研究，16，6127(1988)]。
制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)例如，按照以下方法，通過在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的DNA而產(chǎn)生具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，其中DNA如上述[1]描述的方法獲得。
基于編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA，并且如上述[1]描述的方法，獲得的DNA，根據(jù)需要來制備合適長度的DNA片段，其包含編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的區(qū)域。
進一步地，用于提高具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)生產(chǎn)效率的DNA可如下制備通過對編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)區(qū)域的核苷酸序列中進行核苷酸置換，以獲得最適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的密碼子。
將上述DNA片段或者全長的DNA插入合適的表達(dá)載體之啟動子的下游，構(gòu)建重組DNA。
然后，將重組DNA導(dǎo)入適合于表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，由此可獲得轉(zhuǎn)化子，它可產(chǎn)生具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
至于宿主細(xì)胞，任何表達(dá)目標(biāo)基因的原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等均可使用。動物和植物也可用作宿主。
可使用的表達(dá)載體是那些能在上述宿主細(xì)胞中自主復(fù)制或能整合于上述宿主細(xì)胞的染色體中的載體，并且包含一種啟動子，其所在位置適于轉(zhuǎn)錄編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA。
當(dāng)原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞用作宿主時，表達(dá)上述DNA的表達(dá)載體優(yōu)選是能在原核細(xì)胞中自主復(fù)制的表達(dá)載體，其中還包含啟動子、核糖體結(jié)合序列、上述DNA和轉(zhuǎn)錄終止序列。進一步地，載體還包含調(diào)節(jié)啟動子的基因。
合適的表達(dá)載體的實例為pBTrp2、pBTac1和pBTac2(均可從Boehringer Mannheim購得)、pKK233-2(Pharmacia)、pSE280(Invitrogen)、pGEMEX-1(Promega)、pQE-8(QIAGEN)、PQE-30(QIAGEN)、pKYP10(日本公布的未檢驗專利申請No.110600/83)、pKYP200[農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)，48，669(1984)]、pLSA1[農(nóng)業(yè)與生物化學(xué)，53，277(1989)]、pGEL1[美國國家科學(xué)院院報，82，4306(1985)]、pBluescript II SK+(Stratagene)、pBluescript IISK-(Stratagene)、pTrs30(FERM BP-5407)、pTrs32(FERM BP-5408)、pGHA2(FERM BP-400)、pGKA2(FERM BP-6798)、pTerm2(日本公開未審專利申請No.22979/91，US4686191，US4939094，US5160735)，pEG400[細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)，172，2392(1990)]、pGEX(Pharmacia)、pET系統(tǒng)(Novagen)、pSupex、pUBl10、pTP5、pC194、pTrxFus(Invitrogen)、pMAL-c2(New England Biolabs)、pUC18[基因(Gene)，33，103(1985)]、pUC19[基因，33，103(1985)]、pSTV29(Takara Shuzo Co.，Ltd.)、pSTV28(Takara Shuzo Co.，Ltd.)、pUC118(Takara Shuzo Co.，Ltd.)和pPA1(日本公開未審專利申請No.233798/88)。
作為啟動子，可用任一能在宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動子。例如，來自大腸桿菌或者噬菌體的啟動子，如trp啟動子(Ptrp)、1ac啟動子(Plac)、PL啟動子、PR啟動子和PSE啟動子、SPO1啟動子、SPO2啟動子和penP啟動子。也可用經(jīng)人工修飾的啟動子，如將兩個Ptrps串聯(lián)后得到的啟動子(Ptrp×2)、tac啟動子、1acT7啟動子和1etI啟動子等。
已將SD序列(核糖體結(jié)合序列)與起始密碼子之間的距離調(diào)節(jié)至合適長度(例如，6-18個堿基)的質(zhì)粒為優(yōu)選使用的質(zhì)粒。
轉(zhuǎn)錄終止序列對表達(dá)目的DNA并不關(guān)鍵，但是優(yōu)選轉(zhuǎn)錄終止序列緊緊位于結(jié)構(gòu)基因的下游。
合適的宿主細(xì)胞的實例為屬于埃希氏菌屬、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、脂環(huán)酸桿菌屬(Alicyclobacillus)、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬(Anabaena)、組囊藍(lán)細(xì)菌屬(Anacystis)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azobacter)、著色菌屬(Chromatium)、歐文氏菌屬(Erwinia)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、席藍(lán)細(xì)菌屬(Phormidium)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅螺菌屬(Rhodospirillum)、Scenedesmun、鏈霉菌屬(Streptomyces)、Synnecoccus和發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的微生物細(xì)胞。優(yōu)選屬于埃希氏菌屬、芽胞桿菌屬、短桿菌屬、棒桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、脂環(huán)酸桿菌屬、魚腥藍(lán)細(xì)菌屬、組囊藍(lán)細(xì)菌屬、節(jié)桿菌屬、固氮菌屬、著色菌屬、歐文氏菌屬、甲基桿菌屬、席藍(lán)細(xì)菌屬、紅細(xì)菌屬、紅假單胞菌屬、紅螺菌屬、Scenedesmun、鏈霉菌屬、Synnecoccus和發(fā)酵單胞菌屬的微生物細(xì)胞。
上述微生物的特定實例為大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌MP347、大腸桿菌NM522、無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC 6872、Brevibacterium immariophilumATCC 14068、解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869、谷氨酸棒桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020、玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)ATCC 13825、生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)ATCC 19240、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032、谷氨酸棒桿菌ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870、醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC15806、美棒桿菌(Corynebacterium callunae)ATCC 15991、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium lilium)ATCC 15990、Corynebacterium melassecola ATCC 17965、嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354、假單胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110、放射形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)、發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)、懸鉤子土壤桿菌(Agrobacterium rubi)、柱孢魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaenacylindrica)、桶形魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena doliolum)、水華魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaena flos-aquae)、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacteraurescens)、檸檬節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globformis)、Arthrobacterhydrocarboglutamicus、邁索爾節(jié)桿菌(Arthrobacter mysorens)、煙草節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotianae)、石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacterparaffineus)、原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae)、玫瑰色石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacter roseoparaffinus)、硫磺節(jié)桿菌(Arthrobacter sulfureus)、產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacterureafaciens)、巴氏著色菌(Chromatium buderi)、微溫著色菌(Chromatium tepidum)、酒色著色菌(Chromatium vinosum)、沃氏著色菌(Chromatium warmingii)、(Chromatium fluviatile)、噬夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwiniacarotovora)、菠蘿歐文氏菌(Erwinia ananas)、草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)、Erwinia punctata、Erwinia terreus、羅得西亞甲基桿菌(Methylobacterium rhodesianum)、扭脫甲基桿菌(Meylobacterium extorquens)、席藍(lán)細(xì)菌(Phormidium sp.)ATCC29409、莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)、類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)、生芽紅假單胞菌(Rhodopseudomonasblastica)、海紅紅假單胞菌(Rhodopseudomonas marina)、血色紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、需鹽紅螺菌(Rhodospirillumsalexigens)、鹽廠紅螺菌(Rhodospirillum salinarum)、產(chǎn)二素鏈霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)、金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)、殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)、橄欖灰鏈霉菌(Streptomycesolivogriseus)、枝鏈霉菌(Streptomyces rameus)、田無鏈霉菌(Streptomyces tanashienesis)、葡萄色鏈霉菌(Streptomycesvinaceus)和運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)。
采用任一將DNA導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞的方法進行重組DNA的導(dǎo)入，例如，電穿孔法[核酸研究，16，6127(1988)]、鈣離子法[美國國家科學(xué)院院報，69，2110(1972)]、原生質(zhì)體法(日本公布的未檢驗專利申請No.248394/88)以及在基因，17，107(1982)和分子與普通遺傳學(xué)(Molecular&General Genetics.)，168，111(1979)中描述的方法。
當(dāng)酵母細(xì)胞用作宿主細(xì)胞時，可用YEp13(ATCC 37115)、YEp24(ATCC 37051)、YCp50(ATCC 37419)、pHS19、pHS15等作為表達(dá)載體。
作為啟動子，可用任一能在酵母細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動子。合適的啟動子包括PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal 1啟動子、gal 10啟動子、熱休克蛋白啟動子、MFα1啟動子、CUP1啟動子等。
合適的宿主細(xì)胞的實例為屬于酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)等的酵母菌株細(xì)胞。尤其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、茁芽絲孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸許旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)。
采用任一將DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞的方法進行重組DNA的導(dǎo)入，例如電穿孔法[酶學(xué)方法(Methods in Enzymol.)，194，182(1990)]、原生質(zhì)體法[美國國家科學(xué)院院報，75，1929(1978)]、醋酸鋰法[細(xì)菌學(xué)雜志，153，163(1983)]以及在美國國家科學(xué)院院報，75，1929(1978)]中描述的方法。
當(dāng)動物細(xì)胞用作宿主細(xì)胞時，可用pcDNA I/Amp、pcDNA I和pDM8(均可從Funakoshi獲得)、pAGE107[日本公開未審專利申請No.22979/91；細(xì)胞技術(shù)(Cytotechnology)，3，133(1990)]、pREP4(Invitrogen)、pAGE103[生物化學(xué)雜志(J.Biochem.)，101，1307(1987)]、pAGE210、pAMo、pAMoA[生物學(xué)和化學(xué)雜志，268，22782-227879(1993)，另一名稱pAMoPRSA(日本公開未審專利申請No.336963/93)]、pAS3-3(日本公開未審專利申請No.227075/90)等作為表達(dá)載體。
作為啟動子，可用任一能在動物細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動子。合適的啟動子包括巨細(xì)胞病毒(人CMV)IE(即時早期)基因的啟動子、SV40早期啟動子、莫洛尼鼠類白血病病毒的長末端重復(fù)啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子、金屬硫蛋白啟動子等。人CMV IE基因的增強子可與啟動子聯(lián)合使用。
合適的宿主細(xì)胞的實例為小鼠骨髓瘤細(xì)胞、大鼠骨髓瘤細(xì)胞、小鼠雜交瘤細(xì)胞、中國倉鼠來源的CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞、人源Namalwa細(xì)胞和Namalwa KJM-1細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞、人白血病細(xì)胞、HBT5637(日本公開未審專利申請No.299/88)和人大腸腫瘤細(xì)胞株。
小鼠骨髓瘤細(xì)胞包括SP2/0、NSO等；大鼠骨髓瘤細(xì)胞包括YB2/0等；人胚胎腎細(xì)胞包括HEK293(ATCCCRL-1573)等；人白血病細(xì)胞包括BALL-1等；非洲綠猴腎細(xì)胞包括COS-1、COS-7等；人大腸腫瘤細(xì)胞株包括HCT-15等。
可根據(jù)任一將DNA導(dǎo)入動物細(xì)胞的方法將重組DNA導(dǎo)入動物細(xì)胞，例如，電穿孔法[細(xì)胞技術(shù)，3，133(1990)]、磷酸鈣法(日本公布的未檢驗專利申請No.227075/90)、脂質(zhì)體法[美國國家科學(xué)院院報，84，7413(1987)]以及在病毒學(xué)(Virology)，52，456(1973)中描述的方法。
當(dāng)昆蟲細(xì)胞被用作宿主細(xì)胞時，可使用在桿狀病毒表達(dá)載體，實驗室手冊(Baculavirus Expression Vectors，A LaboratoryManual)，W.H.Freeman和Company，紐約(1992)；分子生物學(xué)，實驗室手冊；分子生物學(xué)最新方法，增刊1-38；生物/技術(shù)(Bio/Technology)，6，47(1988)等中描述的方法表達(dá)蛋白質(zhì)。
就是說，將重組基因轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒共轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞后，在昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中，可獲得重組病毒，然后用重組病毒感染昆蟲細(xì)胞，由此蛋白質(zhì)可被表達(dá)。
適用于這種方法的基因轉(zhuǎn)移載體的實例有pVL1392、pVL1393和pBlueBacIII(Invitrogen產(chǎn)品)。
桿狀病毒的實例為苜蓿尺蠖核型多角體病毒(Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus)，它屬于Barathra科的一種可感染昆蟲的病毒。
昆蟲細(xì)胞的實例為秋粘蟲(Spodoptera frugiperdade)卵巢細(xì)胞、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)卵巢細(xì)胞以及蠶卵巢來源的細(xì)胞系。
秋粘蟲卵巢細(xì)胞包括sf9、sf21(桿狀病毒表達(dá)載體，實驗室手冊)等；粉紋夜蛾卵巢細(xì)胞包括High 5、BTI-TN-5B1-4(Invitrogen)等；以及蠶卵巢來源的細(xì)胞系包括Bombyx mori N4等。
采用磷酸鈣法(日本公開未審專利申請No.227075/90)、脂質(zhì)體法[美國國家科學(xué)院院報，84，7413(1987)]等將上述重組基因轉(zhuǎn)移載體和上述桿狀病毒共轉(zhuǎn)染入昆蟲細(xì)胞，制備重組病毒。
采用將DNA導(dǎo)入動物細(xì)胞同樣的方法也可將DNA導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞。例如，電穿孔法[細(xì)胞技術(shù)，3，133(1990)]、磷酸鈣法(日本公布的未檢驗專利申請No.227075/90)和脂質(zhì)體法[美國國家科學(xué)院院報，84，7413(1987)]。
當(dāng)植物細(xì)胞或植物用作宿主時，可根據(jù)公知的方法產(chǎn)生蛋白質(zhì)[組織培養(yǎng)(Soshiki Baiyo)，20(1994)；組織培養(yǎng)，21(1995)；生物技術(shù)趨勢(Trends in Biotechnology)，15，45(1997)].
有用的表達(dá)載體包括Ti質(zhì)粒、煙草花葉病毒載體等。
作為基因表達(dá)的啟動子，可用任一能在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用的啟動子。合適的啟動子包括花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaicvirus；CaMV)35S啟動子、稻肌動蛋白1啟動子等?？赏ㄟ^在啟動子和欲表達(dá)基因之間插入玉米乙醇脫氫酶基因的內(nèi)含子I或類似物增加基因的表達(dá)效率。
合適的宿主細(xì)胞的實例為土豆、煙草、玉米、水稻、油菜、黃豆作物、番茄、胡蘿卜、小麥、大麥、燕麥、苜蓿和亞麻等植物的細(xì)胞。
采用任一將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法進行重組DNA的導(dǎo)入。例如，土壤桿菌屬法(Agrobacterium)(日本公開未審專利申請No.251887/85)以及使用粒子槍(基因槍)的方法(日本專利Nos.2606856和2517813)。
可用罐式(jar)發(fā)酵器大量培養(yǎng)攜帶有導(dǎo)入基因的植物細(xì)胞或器官。
用于培養(yǎng)的合適的培養(yǎng)基包括常用的培養(yǎng)基，如Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基和White培養(yǎng)基，以及向這些培養(yǎng)基中加入植物激素(如生長素和細(xì)胞分裂素)而制備的培養(yǎng)基。
通常在pH5-9、20-40℃下，培養(yǎng)3-60天。
如果有必要的話，在培養(yǎng)過程中，可將抗生素(如卡那霉素和潮霉素)加至培養(yǎng)基中。
進一步地，可以使攜帶有導(dǎo)入基因的植物細(xì)胞再分化從而產(chǎn)生具有導(dǎo)入基因的植物(轉(zhuǎn)基因植物)。
用動物產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)也是可能的。例如，根據(jù)公知的方法[美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志(American Journal of ClinicalNutrition)，63，639S(1996)；美國臨床營養(yǎng)學(xué)雜志，63，627S(1996)；生物/技術(shù)，9，830(1991)]，攜帶有導(dǎo)入基因的動物可產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)。
作為啟動子，可用任一能在動物中發(fā)揮作用的啟動子。優(yōu)選的啟動子包括乳腺細(xì)胞特異的啟動子，例如α酪蛋白啟動子、β酪蛋白啟動子、β乳球蛋白啟動子和乳清酸性蛋白啟動子。
可根據(jù)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，通過培養(yǎng)攜帶有包含編碼蛋白質(zhì)之DNA的重組載體的轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)可形成并累積，從培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)，其中轉(zhuǎn)化子源自微生物、動物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
當(dāng)轉(zhuǎn)化子是動物或植物時，可通過常用方式培育或培養(yǎng)動物或植物，產(chǎn)生蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)在體內(nèi)形成并累積，然后從動物或植物中回收蛋白質(zhì)。
在是動物的情況下，可產(chǎn)生具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，方法是例如，通過培育攜帶編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA的非人轉(zhuǎn)基因動物，使得在動物中形成并累積重組DNA編碼的蛋白質(zhì)，從動物中回收蛋白質(zhì)。形成并累積蛋白質(zhì)的地方包括動物的乳、卵等。
在是植物的情況下，可產(chǎn)生具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，方法是例如，通過培養(yǎng)攜帶編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA的轉(zhuǎn)基因植物，使得在植物中形成并累積重組DNA編碼的蛋白質(zhì)，從植物中回收蛋白質(zhì)。
當(dāng)用于產(chǎn)生本發(fā)明之具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化子為原核生物，如大腸桿菌；或為真核生物，如酵母時，可通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，并使具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)在培養(yǎng)物中形成并累積，從培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
可用培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子宿主的傳統(tǒng)方法培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子。
當(dāng)培養(yǎng)以原核生物(如大腸桿菌)或真核生物(如酵母)作為宿主而制備的轉(zhuǎn)化子時，可用至今所用的任一天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基，只要培養(yǎng)基適于轉(zhuǎn)化子的有效培養(yǎng)，含有可被所用宿主同化的碳源、氮源、無機鹽等即可。
作為碳源，可用任一可被宿主同化的碳源。合適的碳源的實例包括糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它們的糖漿、淀粉和淀粉水解物；有機酸，如乙酸和丙酸；以及醇類，如乙醇和丙醇。
作為氮源，可用氨、多種有機酸或無機酸的銨鹽，如氯化銨、硫酸銨、乙酸銨和磷酸銨、以及其它含氮化合物，還可用蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆餅、大豆餅水解物和各種發(fā)酵過的微生物細(xì)胞和其消化產(chǎn)物。
無機鹽的實例包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅和碳酸鈣。
例如，于15-40℃在有氧條件下振蕩培養(yǎng)或者在通氣情況下浸沒旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，通常培養(yǎng)5小時至7天。培養(yǎng)過程中，pH維持在3.0-9.0。通過使用有機酸或無機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等對pH進行調(diào)節(jié)。
如果有必要的話，在培養(yǎng)過程中，可將抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素和氯霉素加至培養(yǎng)基中。
當(dāng)培養(yǎng)用包含可誘導(dǎo)的啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時，如果有必要的話，可向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。例如，當(dāng)微生物是用包含1ac啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化時，可向培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或其類似物；當(dāng)微生物是用包含trp啟動子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化時，可向培養(yǎng)基中加入吲哚乙酸(IAA)或其類似物。
當(dāng)培養(yǎng)以動物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞而制備的轉(zhuǎn)化子時，常用的培養(yǎng)基如RPMI 1640培養(yǎng)基[美國醫(yī)學(xué)協(xié)會雜志(The Journal of theAmerican Medical Association)，199，519(1967)、Eagle’s MEM[科學(xué)，122，501(1952)]、DMEM[病毒學(xué)，8，396(1959)]和199培養(yǎng)基[生物醫(yī)學(xué)學(xué)會報告(Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine)，73，1(1950)]、向這些培養(yǎng)基中加入胎牛血清或類似物制備的培養(yǎng)基等均可用作培養(yǎng)基。
通常在5％CO2存在下，于pH6-8，25-40℃培養(yǎng)1-7天。
如果有必要的話，在培養(yǎng)過程中，可將抗生素如卡那霉素、青霉素和鏈霉素加至培養(yǎng)基中。
當(dāng)培養(yǎng)以昆蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞而制備的轉(zhuǎn)化子時，常用的培養(yǎng)基如TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmingen)、Sf-900II SFM培養(yǎng)基(Gibco BRL)、ExCell 400和ExCell 405(JRH Biosciences)以及Grace’s InsevtMedium[Grace，T.C.C.，自然(Nature)，195，788(1962)]均可用作培養(yǎng)基。
通常在pH6-7，25-30℃培養(yǎng)1-5天。
如果有必要的話，在培養(yǎng)過程中，可將抗生素如慶大霉素加至培養(yǎng)基中。
上述的具甘露糖異構(gòu)酶活性的全長蛋白質(zhì)或者包含具甘露糖異構(gòu)酶活性區(qū)(催化域)的部分多肽可根據(jù)分子克隆，第二版等描述的方法直接表達(dá)為分泌蛋白質(zhì)或者融合蛋白質(zhì)。被融合的蛋白質(zhì)的實例包括β-半乳糖苷酶、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)A的IgG結(jié)合區(qū)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、蛋白質(zhì)G、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、多聚組氨酸鏈(His-標(biāo)簽)、S-肽、DNA結(jié)合蛋白域、Tac抗原、硫氧還蛋白、綠色熒光蛋白以及任一抗體表位[AkioYamakawa，實驗醫(yī)學(xué)(Jikken Igaku)，13，469-474(1995)]。
具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)可以在宿主細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生、也可分泌至細(xì)胞外或產(chǎn)生在宿主細(xì)胞的外膜上。可根據(jù)所用宿主細(xì)胞的種類或者通過對具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行改變來選擇這些產(chǎn)生方式。
當(dāng)具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)生在宿主細(xì)胞內(nèi)或產(chǎn)生在宿主細(xì)胞的外膜上時，根據(jù)Paulson等人的方法[生物與化學(xué)雜志，264，17619(1989)]、Lowe等人的方法[美國國家科學(xué)院院報，86，8227(1989)；基因進展(Genes Develop.)，4，1288(1990)]或者日本公開未審專利申請No.336963/93，WO94/23021等描述的方法，可能會使具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)分泌至胞外。
就是說，通過重組DNA技術(shù)，將信號肽加至包含具甘露糖異構(gòu)酶活性之蛋白質(zhì)活性位點的多肽的上游，能引起宿主細(xì)胞對具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的胞外分泌。進一步地，也可將用于純化和檢測的標(biāo)簽添加在信號肽和包含催化域的多肽之間，或者添加在包含催化域的多肽的C端。
適用于純化和檢測的標(biāo)簽包括β-半乳糖苷酶、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)A的IgG結(jié)合區(qū)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、多聚精氨酸、多聚谷氨酸、蛋白質(zhì)G、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、多聚組氨酸鏈(His-標(biāo)簽)、S-肽、DNA結(jié)合蛋白域、Tac抗原、硫氧還蛋白、綠色熒光蛋白以及任一抗體表位[Akio Yamakawa，實驗醫(yī)學(xué)，13，469-474(1995)]。
根據(jù)日本公開未審專利申請No.227075/90中描述的方法，使用二氫葉酸還原酶基因或類似的基因擴增系統(tǒng)可能提高蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
用傳統(tǒng)的分離和純化酶的方法，可從產(chǎn)生具甘露糖異構(gòu)酶活性之蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物中分離和純化本發(fā)明的多肽。
例如，當(dāng)具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)以可溶形式累積在轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中時，通過離心并且洗滌，從培養(yǎng)物收獲細(xì)胞，然后用超聲波儀、弗氏壓碎儀、Manton Gaulin勻漿器、Dynomill或類似裝置獲得無細(xì)胞提取液。
離心無細(xì)胞提取液，取上清，然后將上清用溶劑提取，硫酸銨鹽析等，脫鹽，用有機溶劑沉淀，用樹脂如二乙氨乙基-瓊脂糖(DEAE-Sepharose)和DIAION HPA-75(Mitsubishi Kasei Corporation)陰離子交換層析、用樹脂如S-瓊脂糖FF(S-Sepharose FF)(Pharmacia)陽離子交換層析、用樹脂如丁基瓊脂糖和苯基瓊脂糖疏水層析、用分子篩進行凝膠過濾、親和層析、層析聚焦、電泳如等電聚焦等等，可獲得純化的蛋白質(zhì)制品。
當(dāng)具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)以包涵體形式表達(dá)，對細(xì)胞進行相似的收獲和破碎，然后離心，獲得沉淀部分。用常規(guī)方法從沉淀部分回收具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)后，將具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的包涵體用蛋白質(zhì)變性劑溶解。將已溶解蛋白質(zhì)的溶液用不包含蛋白質(zhì)變性劑的溶液稀釋，或透析，或用含低濃度、不至于引起蛋白質(zhì)變性的蛋白質(zhì)變性劑溶液稀釋或透析，由此使具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)恢復(fù)正常的三級結(jié)構(gòu)。然后，用上述同樣的分離和純化步驟可得到純化的蛋白質(zhì)制品。
當(dāng)具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)分泌至胞外時，通過如離心處理培養(yǎng)物，得到可溶性部分。用上述的從無細(xì)胞提取液上清中分離和純化同樣的方式，從可溶性部分可得到具甘露糖異構(gòu)酶活性的純化的蛋白質(zhì)制品。
本發(fā)明也可產(chǎn)生多肽，如與另一個蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)，且利用與融合蛋白質(zhì)有親和性的底物進行親和層析，純化此蛋白質(zhì)[AkioYamakawa，實驗醫(yī)學(xué)，13，469-474(1995)]。
例如，根據(jù)Lowe等人的方法[美國國家科學(xué)院院報，86，8227(1989)；基因進展(Genes Develop.)，4，1288(1990)]以及日本公開未審專利申請No.336963/93，WO94/23021等描述的方法，具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)可與蛋白質(zhì)A以融合蛋白質(zhì)的形式產(chǎn)生，并可用免疫球蛋白G進行親和層析而純化。
進一步地，具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)可與FLAG肽以融合蛋白質(zhì)的形式產(chǎn)生，并可用抗FLAG抗體進行親和層析純化[美國國家科學(xué)院院報，86，8227(1989)；基因進展，4，1288(1990)]。
具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)也可用抗該蛋白質(zhì)自身的抗體親和層析純化。
根據(jù)公知的方法[J.Biomolecular NMR，6，129(1995)；科學(xué)，242，1162(1988)；生物化學(xué)雜志，110，166(1991)]，用體外轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)也可產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。
基于上述獲得的具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的氨基酸信息，可用化學(xué)合成方法產(chǎn)生具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，如Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)。
進一步地，可用Advanced ChemTech、Perkin-Elmer、PharmaciaBiotech、Protein Technology Instrument、Synthecell-Vega、PerSeptive、Shimadzu Corporation等生產(chǎn)的肽合成儀化學(xué)合成蛋白質(zhì)。
果糖、甘露糖、木酮糖和來蘇糖的生產(chǎn)根據(jù)上述[2]描述的培養(yǎng)而獲得的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物或其處理物可作為酶源，分別在水性培養(yǎng)基中生產(chǎn)果糖、甘露糖、木酮糖和來蘇糖(此后有時稱為本發(fā)明的生產(chǎn))。
培養(yǎng)物的處理物包括濃縮的培養(yǎng)物、干燥的培養(yǎng)物、培養(yǎng)物離心收獲的細(xì)胞、用各種方法處理細(xì)胞得到的產(chǎn)物，如干燥、冷凍干燥、表面活性劑處理、超聲處理、機械摩擦處理、溶劑處理、酶處理、蛋白質(zhì)分級分離和固定、提取細(xì)胞獲得酶制品等。
在本發(fā)明的生產(chǎn)時，使用的酶源濃度為1mU/l-1000U/l，優(yōu)選地10mU/l-100U/l，1單位(U)定義為37℃下1分鐘內(nèi)形成1毫摩爾的果糖、甘露糖、木酮糖和來蘇糖的活性。
本發(fā)明的生產(chǎn)使用的水性培養(yǎng)基包括水；緩沖液，如磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、檸檬酸酸鹽緩沖液和Tris緩沖液；醇類，如甲醇、乙醇；酯類，如乙酸乙酯；酮類，如丙酮；酰胺類，如乙酰胺等。用作酶源的微生物培養(yǎng)物也可用作水性培養(yǎng)基。
如果有必要的話，在本發(fā)明的生產(chǎn)時，可加入表面活性劑或者有機溶劑。任一促進果糖、甘露糖、木酮糖和來蘇糖形成的表面活性劑均可用。合適的表面活性劑包括非離子型表面活性劑，如聚氧乙烯十八烷基胺(例如，Nymeen S-215，NOF Corporation)、陽離子型表面活性劑如鯨蠟三甲基溴化銨和烷基二甲基芐基氯化銨(例如，CationF2-40E，NOF Corporation)、陰離子型表面活性劑如月桂酰肌氨酸酯和叔胺如烷基二甲基胺(例如，Tertiary Amine FB，NOF Corporation)，它們可以單獨使用或聯(lián)合使用。表面活性劑的常用濃度為0.1-50g/l。至于有機溶劑，可使用如二甲苯、甲苯、脂族醇、丙酮、乙酸乙酯等，常用濃度為0.1-50ml/l。
在pH5-10的水性培養(yǎng)基中進行本發(fā)明的生產(chǎn)反應(yīng)，優(yōu)選地，在pH6-8，20-60℃下反應(yīng)1-96小時。如果有必要的話，可向反應(yīng)中加入無機鹽(例如MgCl2)等。
用糖分析系統(tǒng)(Dionex)或類似系統(tǒng)[生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem)，189，151(1990)]測定水性培養(yǎng)基中形成的果糖、甘露糖、木酮糖和來蘇糖。
用活性炭、離子交換層析等常規(guī)方法從反應(yīng)混合物中回收所形成的果糖、甘露糖、木酮糖和來蘇糖。
進行本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明的實施例如下所示。本發(fā)明的范圍不限于用于解釋的這些根據(jù)公知的方法[例如，分子生物學(xué)最新方法，John Wiley &Sons(1987-1997)]培養(yǎng)大腸桿菌W3110(ATCC 27325)，分離并純化其染色體DNA。
基于已知的大腸桿菌染色體DNA的核苷酸序列信息[科學(xué)，277，1453(1997)]，耶魯大學(xué)推斷的甘露糖異構(gòu)酶基因在染色體上的定位信息和一個未知功能的基因位于大腸桿菌染色體的87.7分鐘處的信息，用DNA合成儀(Model 8905，PerSeptive Biosystems)合成DNA引物，一條具SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，另一條具SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
用上述合成的DNA作為一對引物，以大腸桿菌W3110的染色體DNA作為模板進行PCR。
就是說，PCR進行30個循環(huán)，每個循環(huán)由94℃反應(yīng)1分鐘，42℃反應(yīng)2分鐘，72℃反應(yīng)3分鐘組成。所用的40μl反應(yīng)混合液包含0.1μg染色體DNA、每條引物0.5μmol/l、2.5單位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)、4μl Pfu DNA聚合酶緩沖液(10-倍)(Stratagene)以及每種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)分別200μmol/l。
取所得反應(yīng)混合液的十分之一用于瓊脂糖凝膠電泳，以確證基于引物的DNA片段被擴增。然后，將剩余的反應(yīng)混合液與等體積的TE[10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/l EDTA]飽和的酚/氯仿(1體積/1體積)混勻。
對所得混合液進行離心，取上層，與兩倍體積的冷乙醇混勻，于-80℃放置30分鐘。
對所得混合液進行離心，獲得DNA沉淀。
將DNA沉淀溶于20μl TE，取5μl溶液用于DNA的切割反應(yīng)，限制性酶為Cla I和BamH I，瓊脂糖電泳分離DNA片段，用Gene CleanII試劑盒回收1.3kb的片段。pTrS30 DNA(0.2μg)用限制性酶Cla I和BamH I酶切，瓊脂糖電泳分離DNA片段，以同樣方式回收4.2kb的片段。
用連接試劑盒將上面得到的1.3kb片段和4.2kb片段于16℃，連接16小時。根據(jù)上述公知的方法，用連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522，涂布于含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，于30℃過夜培養(yǎng)。
根據(jù)上述公知的方法，從生長在培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化子菌落提取質(zhì)粒，由此獲得表達(dá)質(zhì)粒pYP27。通過限制性酶消化證實所得到的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)是正確的(


圖1)。此后將攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子稱為大腸桿菌NM522/pYP27。
實施例2甘露糖、果糖、木酮糖和來蘇糖的生產(chǎn)將實施例1得到的大腸桿菌NM522/pYP27接種于大試管中的8ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)17小時。
所得到的培養(yǎng)物按1％的量接種于大試管中的8ml含50μg/ml氨芐青霉素的M9培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)7小時。
所得到的培養(yǎng)物離心，收獲濕細(xì)胞。
濕細(xì)胞可貯存在-20℃，并可根據(jù)需要，融化后使用。
向包含100mmol/l Tris-HCl(pH7.5)，50mmol/l MgCl2和0.4％Nymeen S-215的溶液中，分別加入100mmol/l果糖制備生產(chǎn)甘露糖的反應(yīng)混合液，加入100mmol/l甘露糖制備生產(chǎn)果糖的反應(yīng)混合液，加入100mmol/l來蘇糖制備生產(chǎn)木酮糖的反應(yīng)混合液，以及加入100mmol/l木酮糖制備生產(chǎn)來蘇糖的反應(yīng)混合液。
向0.1ml每個制備好的反應(yīng)混合液中加入上面所獲得的濕細(xì)胞，使其終濃度為60mg/ml，然后37℃反應(yīng)1小時。
反應(yīng)結(jié)束后，用糖分析系統(tǒng)(DX-500，Dionex)分析反應(yīng)產(chǎn)物。
在各自的反應(yīng)混合物中，分別形成并累積了21.9mmol/l甘露糖、74.4mmol/l果糖、70.4mmol/l木酮糖、24.4mmol/l來蘇糖。
只攜帶載體的大腸桿菌NM522/pTrS30沒有形成任何糖類。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，通過重組DNA技術(shù)可大量生產(chǎn)甘露糖異構(gòu)酶。用該酶可有效生產(chǎn)甘露糖、果糖、木酮糖和來蘇糖。
SEQ ID NO3-對人造序列的描述合成DNA。SEQ ID NO4-對人造序列的描述合成DNA。
權(quán)利要求
1.一種由氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，其中SEQ ID NO1所示氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基被刪除、替換或添加，并且具有甘露糖異構(gòu)酶活性。
2.一種編碼蛋白質(zhì)的DNA，其中蛋白質(zhì)由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列組成。
3.一種編碼由氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)之DNA，其中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基被刪除、替換或添加，并且具有甘露糖異構(gòu)酶活性。
4.一種DNA，其具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
5.一種DNA，其在嚴(yán)格條件下可與根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項所述的DNA雜交，并且編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
6.一種重組DNA，其通過將權(quán)利要求2-5中任意一項所述的DNA插入載體而獲得。
7.一種轉(zhuǎn)化子，其通過將權(quán)利要求6的重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞而獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的轉(zhuǎn)化子，其為大腸桿菌。
9.一種產(chǎn)生具甘露糖異構(gòu)酶活性之蛋白質(zhì)的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求7或8的轉(zhuǎn)化子，使得在培養(yǎng)物中形成并累積具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)，以及從培養(yǎng)物中回收蛋白質(zhì)。
10.一種產(chǎn)生果糖的方法，其包括使水性培養(yǎng)基中存在以轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物或其處理物作為酶源以及甘露糖，從而在水性培養(yǎng)基中形成并累積果糖，以及從水性培養(yǎng)基中回收果糖；其中所述轉(zhuǎn)化子是通過導(dǎo)入編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA而獲得的。
11.一種產(chǎn)生甘露糖的方法，其包括使水性培養(yǎng)基中存在以轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物或其處理物作為酶源以及果糖，從而在水性培養(yǎng)基中形成并累積甘露糖，以及從水性培養(yǎng)基中回收甘露糖；其中所述轉(zhuǎn)化子是通過導(dǎo)入編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA而獲得的。
12.一種產(chǎn)生木酮糖的方法，其包括使水性培養(yǎng)基中存在以轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物或其處理物作為酶源以及來蘇糖，從而在水性培養(yǎng)基中形成并累積木酮糖，以及從水性培養(yǎng)基中回收木酮糖；其中所述轉(zhuǎn)化子是通過導(dǎo)入編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA而獲得的。
13.一種產(chǎn)生來蘇糖的方法，其包括使水性培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物或其處理物作為酶源以及木酮糖，從而在水性培養(yǎng)基中形成并累積來蘇糖，以及從水性培養(yǎng)基中回收來蘇糖；其中所述轉(zhuǎn)化子是通過導(dǎo)入編碼具甘露糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)之DNA而獲得的。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13中任意一項所述的方法，其中轉(zhuǎn)化子是根據(jù)權(quán)利要求7或8的轉(zhuǎn)化子。
全文摘要
本發(fā)明提供了具甘露糖異構(gòu)酶活性的新蛋白質(zhì)、編碼蛋白質(zhì)的DNA、包含DNA的重組載體、將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞而得到的轉(zhuǎn)化子,以及用轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生上述蛋白質(zhì)、甘露糖、果糖、木酮糖和來蘇糖的方法。
文檔編號C12N9/90GK1347455SQ00806537
公開日2002年5月1日 申請日期2000年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月22日
發(fā)明者小泉聰司, 遠(yuǎn)藤徹夫, 田畑和彥, 尾崎明夫 申請人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社