專利名稱：使用脂酶由羧酸合成伯酰胺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種借助于第一種試劑A和第二種試劑B在溶劑中的酶催化反應(yīng)制備反應(yīng)產(chǎn)物的方法，第一種試劑A和第二種試劑B各自溶于所述溶劑且第一種試劑A和第二種試劑B能夠形成在該溶劑中沉淀的鹽AB。
這類方法受到沉淀的底物A和B不能被催化A與B之間的反應(yīng)的酶利用這一事實(shí)的阻礙。就所述酶的熱不穩(wěn)定性而言，在有機(jī)化學(xué)中通常切實(shí)可行的升高溶劑的溫度以便有助于試劑A、B的溶解這一方法通常僅能夠達(dá)到有限的程度。
本發(fā)明的目的是提供一種在前言中所述類型的方法，該方法可加速A和B的轉(zhuǎn)化。
為了這一目的，本發(fā)明方法的特征在于對(duì)第一種試劑A和第二種試劑B的濃度進(jìn)行選擇以使它們滿足公式(I)[A]T=[B]T+(F-1)·KF]]>其中[A]T代表第一種試劑A相對(duì)于試劑A、B和溶劑所占的總體積的濃度；[B]T代表第二種試劑A相對(duì)于試劑A、B和溶劑所占的總體積的濃度；K是第一種試劑A和第二種試劑B之間形成的鹽AB的溶度積；且F是1/10-10之間的因數(shù)。
在化學(xué)中，試劑基本上以化學(xué)計(jì)算量混合在一起?？赡艽嬖诿撾x該機(jī)理的原因，例如，為了抑制副反應(yīng)。此外，如果反應(yīng)產(chǎn)率不接近于100％，那么對(duì)有關(guān)成本的考慮可能導(dǎo)致添加過量最廉價(jià)的試劑。然而，實(shí)際上當(dāng)確實(shí)涉及化學(xué)計(jì)算量時(shí)，與最佳化學(xué)計(jì)算比例之間始終存在偏差。申請(qǐng)人已經(jīng)令人意外地發(fā)現(xiàn)就試劑A與B通過酶轉(zhuǎn)化的速率而言，試劑A與B之間比例的極小偏差具有明顯的后果。選擇A和B的濃度以使它們?cè)诒景l(fā)明因數(shù)F所定義的范圍內(nèi)證明以更快的速度產(chǎn)生了良好的產(chǎn)率。
本申請(qǐng)中的術(shù)語濃度指的是摩爾濃度。此外，在所述公式中僅包括試劑，條件是它們可用于沉淀成鹽AB或條件是它們可作為鹽AB存在。本發(fā)明特別將它們用于某些反應(yīng)，其中鹽AB具有的溶度積為例如低于10-3M2、諸如低于3×10-4M2且特別是低于10-4M2或3×10-5M2。
為了避免試劑作為鹽沉淀的難題，現(xiàn)有技術(shù)中使用酶催化的反應(yīng)制備伯酰胺類的方法包括在使酯與銨化合物接觸前使羧酸酯化的步驟。
De Zoete等(參考文獻(xiàn)1)推定直接氨解(ammoniolysis)辛酸因形成鹽而不會(huì)產(chǎn)生辛酸酰胺。由于這一原因，他們通過辛酸乙酯進(jìn)行兩步反應(yīng)。
hrner等(參考文獻(xiàn)2)描述了辛酸可能導(dǎo)致形成不需要的鹽，這就是他們?yōu)槭裁匆彩褂眯了嵋阴サ脑颉?br> 伯酰胺類的形成是本方法的一個(gè)重要應(yīng)用。
按照有利的實(shí)施方案，F(xiàn)在1/5-5之間、優(yōu)選1/3-3且更優(yōu)選1/2-2。
選擇這樣有限的范圍可以使轉(zhuǎn)化速率更快。然而，應(yīng)注意就兩種試劑的濃度而言，在上述范圍內(nèi)可能是反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方面導(dǎo)致與F為1的最佳值之間存在偏差，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
按照有利的實(shí)施方案，將第一種試劑A和第二種試劑B以其鹽加入。這是一種簡(jiǎn)便而有效的達(dá)到F值為1的方式。
本發(fā)明方法的一個(gè)重要應(yīng)用涉及制備一種反應(yīng)產(chǎn)物，其中第一種試劑A是一種酸性試劑而第二種試劑B是一種堿性試劑。它們易于在有機(jī)溶劑中沉淀。如果該反應(yīng)是一種縮合反應(yīng)，那么優(yōu)選溶劑基本上不含在縮合反應(yīng)中釋放成諸如水這樣的簡(jiǎn)單分子且可以起溶劑作用(或作為輔助溶解的介質(zhì))的化合物。
按照優(yōu)選的實(shí)施方案，第一種酸性試劑A是一種羧酸且第二種堿性試劑B是一種選自包括i)氨和ii)伯胺的組的化合物。
按照有意義的實(shí)施方案，將氨以碳酸氫銨、氨基甲酸銨、脲或載氨的離子交換樹脂的形式加入。
在這種方式中，氨更逐步地進(jìn)入反應(yīng)。例如，通過酶水解應(yīng)用作為氨來源的脲的有意義的方面在于在縮合反應(yīng)過程中釋放的水被除去，這一過程可促進(jìn)酰胺的形成。每消除一個(gè)水分子則釋放兩個(gè)分子的氨，這意味著對(duì)于氨的釋放存在一定程度的控制。如果需要，可以給在本申請(qǐng)中描述的這種或另一種實(shí)施方案提供一種氨傳感器或這些實(shí)施方案可以應(yīng)用層析技術(shù)來測(cè)定游離氨的濃度。
作為酶，可以使用一種選自脂酶類、酯酶類和肽酶類的酶，諸如優(yōu)選脂酶Candida antarctica脂酶B。
這是一種形成伯酰胺的有效方式。
現(xiàn)在通過參照下列典型實(shí)施方案來闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1在35℃下，將在3埃分子篩上干燥的73mg丁酸溶于在3埃分子篩上干燥的10ml甲基異丁基酮所得到的溶液與80mg氨基甲酸銨(作為氨源)和15mg Candida antarctica脂酶B(Novozym 435，活性為11000 PLU/g，Novo Nordisk，Bagsvaerd，丹麥)一起攪拌。該溶液還包括10μl十二烷(doecanee)/ml溶液作為分析用內(nèi)標(biāo)。在不同的間隔取樣并在離心(14,300rpm、1分鐘)后立即借助于氣相色譜法進(jìn)行分析。3天后，起始為83mmol/l的丁酸濃度下降至7mM并形成75mM的丁酰胺。
實(shí)施例2將395mg丁酸和120μl十二烷(作為內(nèi)標(biāo))溶于在3埃分子篩上干燥的甲基異丁基酮所得到的4ml溶液與用下表中所示量的氨(230mM)飽和的干燥甲基異丁基酮混合并用干燥甲基異丁基酮加至30ml。因此，該溶液含有150mM丁酸且氨的濃度如表中所示。在25℃下，將該混懸液與45mg Candida antarctica脂酶B(Novozym 435，活性為11000 PLU/g，Novo Nordisk，Bagsvaerd，丹麥)一起攪拌。在這些條件下，K＝1.3·10-4M2。
*)干燥的甲基異丁基酮實(shí)驗(yàn)3和4是比較實(shí)驗(yàn)。在附圖
中，將產(chǎn)物濃度(丁酰胺)對(duì)時(shí)間(按小時(shí)計(jì))繪圖?？梢郧宄乜闯雠c化學(xué)計(jì)算比例的偏差顯著影響形成產(chǎn)物的比例。在實(shí)驗(yàn)3中，丁酸濃度為150mM且NH3濃度為184mM。盡管氨的濃度僅高21％，但是轉(zhuǎn)化率比實(shí)驗(yàn)1低1/2以上(F分別為0.09和0.8)。
實(shí)施例3乙酰胺的制備、以鹽的形式添加試劑在33ml的密閉玻璃容器中，將1.25mmol的乙酸銨(純度為98％，來自J.T.Baker)在25ml含有10μl/ml十二烷作為內(nèi)標(biāo)(F值約為1)的干燥的甲基異丁基酮中攪拌。通過添加25mg催化活性為11PLU/mg制品的固定化Candida antarctica脂酶B(Novozym 435)(它是NOVO Nordisk的一類贈(zèng)品。目前這種酶由Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany銷售)來啟動(dòng)該反應(yīng)。在35℃下，將反應(yīng)混合物攪拌3天。此后，通過隔板取樣、離心并通過GC進(jìn)行分析。正如從使用十二烷作為內(nèi)標(biāo)測(cè)定的乙酰胺濃度中確定的，產(chǎn)率為98％。GC步驟在帶有火焰離子化檢測(cè)器和Shimadzu AOC-17自動(dòng)注射器(0.5μl注射體積)的Shimadzu GC-17A氣相色譜儀上分析乙酰胺(標(biāo)準(zhǔn)品來自J.T.Baker)。以1∶100的分流比將氦用作載氣。所用的柱為帶有滯留帶的Hewlett Packard FFAP交聯(lián)聚乙二醇TPA柱(25m×0.32mm)。為了分析乙酸和乙酰胺，將柱溫保持在80℃下6分鐘且然后以15℃分鐘-1升至110℃。柱壓為1.2巴。
權(quán)利要求
1.一種借助于第一種試劑A和第二種試劑B在溶劑中的酶催化反應(yīng)制備反應(yīng)產(chǎn)物的方法，第一種試劑A和第二種試劑B各自溶于所述溶劑且第一種試劑A和第二種試劑B能夠形成在該溶劑中沉淀的鹽AB，其特征在于對(duì)第一種試劑A和第二種試劑B的濃度進(jìn)行選擇以使它們滿足公式(I)[A]T=[B]T+(F-1)·KF]]>其中[A]T代表第一種試劑A相對(duì)于試劑A、B和溶劑所占的總體積的濃度；[B]T代表第二種試劑A相對(duì)于試劑A、B和溶劑所占的總體積的濃度；K是第一種試劑A和第二種試劑B之間形成的鹽AB的溶度積；且F是1/10-10之間的因數(shù)。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于F在1/5-5之間、優(yōu)選1/3-3且更優(yōu)選1/2-2。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于將第一種試劑A和第二種試劑B以鹽AB的形式加入。
4.一種根據(jù)上述權(quán)利要求中之一的方法，其特征在于第一種試劑A是一種酸性試劑且第二種試劑B是一種堿性試劑，而所述溶劑是一種有機(jī)溶劑。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于第一種酸性試劑A是一種羧酸且第二種堿性試劑B是一種選自包括i)氨和ii)伯胺的組的化合物。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其特征在于將氨以碳酸氫銨、氨基甲酸銨、脲或載氨的離子交換樹脂的形式加入。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求4-6中之一的方法，其特征在于作為用于酶催化反應(yīng)的酶而言，使用選自脂酶類、酯酶類和肽酶類的酶。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求7的方法，特征在于所述脂酶是Candidaantarctica脂酶B。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種借助于兩種試劑A和B制備諸如伯酰胺這樣的反應(yīng)產(chǎn)物的方法,所述試劑形成阻止快速轉(zhuǎn)化的鹽。對(duì)試劑A和試劑B的濃度進(jìn)行選擇以使它們滿足公式(I),其中[A]
文檔編號(hào)C12P1/00GK1350588SQ00807326
公開日2002年5月22日 申請(qǐng)日期2000年3月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月29日
發(fā)明者M·J·J·里特詹斯, A·J·J·斯特拉索夫, J·A·瓊格簡(jiǎn), J·J·海吉楠 申請(qǐng)人:代爾夫特工業(yè)大學(xué)