專利名稱：經(jīng)擴增tkt基因發(fā)酵制備L－氨基酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用棒狀細菌經(jīng)發(fā)酵制備L-賴氨酸，L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的方法，在所述棒狀細菌中至少tkt基因是擴增的。
已知氨基酸可通過棒狀細菌菌株，尤其谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵而生產(chǎn)。由于L-氨基酸的極其重要性，已持續(xù)進行改良生產(chǎn)方法的嘗試。生產(chǎn)方法的改良可涉及發(fā)酵措施，如攪拌和供氧，或營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分如發(fā)酵期間的糖濃度，或產(chǎn)物形式的加工方法，例如通過離子交換層析，或微生物本身的固有生產(chǎn)性質(zhì)。
為改良這些微生物的生產(chǎn)性質(zhì)，可使用誘變，選擇及突變體選擇等方法，以此方法可獲得對抗代謝物如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥戊酸(AHV)有抗性或重要的調(diào)節(jié)氨基酸缺陷的并產(chǎn)生L-氨基酸的菌株。
一段時間以來，重組DNA技術的方法也用于改良生產(chǎn)L-氨基酸的谷氨酸棒桿菌菌株。
發(fā)明目的本發(fā)明目的是提供新的用棒狀細菌經(jīng)發(fā)酵制備L-賴氨酸，L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的改良方法。
當下文提及L-氨基酸時，指L-賴氨酸，L-蘇氨酸和L-異亮氨酸。
本發(fā)明提供了用棒狀細菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，在該棒狀細菌中編碼轉酮酶(EC2.2.1.1)的核苷酸序列(tkt基因)是擴增的，尤其是過表達的。
使用的菌株優(yōu)選在tkt基因擴增之前已產(chǎn)生L-氨基酸。
優(yōu)選的實施方案見于權利要求。
文中術語“擴增”是指微生物中由相應的DNA編碼的一或多種酶的胞內(nèi)活性的提高，例如通過提高基因的拷貝數(shù)，或使用強啟動子或編碼高活性相應酶的基因，及任選地組合使用這些方法。
本發(fā)明的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉，纖維素或從甘油和乙醇中生產(chǎn)L-氨基酸。所述微生物可以是棒狀細菌的代表菌，尤其是棒桿菌屬，在棒桿菌屬中尤其應提及的是谷氨酸棒桿菌，本領域技術人員已知其生產(chǎn)L-氨基酸的能力。
以下已知的野生型菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032醋谷棒桿菌ATCC15806嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌FERM BP-1539黃色短桿菌ATCC14067乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869和擴展短桿菌ATCC14020和從中獲得的生產(chǎn)L-氨基酸的突變株，如生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC21649黃色短桿菌BB69
黃色短桿菌DSM5399乳發(fā)酵短桿菌FERM-BP269乳發(fā)酵短桿菌TBB-10以及如生產(chǎn)L-異亮氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌ATCC14309谷氨酸棒桿菌ATCC14310谷氨酸棒桿菌ATCC14311谷氨酸棒桿菌ATCC15168產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6871以及如生產(chǎn)L-賴氨酸的菌株谷氨酸棒桿菌FERM-P1709黃色短桿菌FERM-P1708乳發(fā)酵短桿菌FERM-P1712谷氨酸棒桿菌FERM-P6463谷氨酸棒桿菌FERM-P6464谷氨酸棒桿菌ATCC13032谷氨酸棒桿菌DSM58-1谷氨酸棒桿菌DSM12866是棒桿菌屬，尤其谷氨酸棒桿菌合適菌株的實例。
已發(fā)現(xiàn)在編碼轉酮酶(EC2.2.1.1)的tkt基因過表達之后，棒狀細菌以改進方式生產(chǎn)L-氨基酸。
tkt基因的核苷酸序列見于歐洲分子生物學實驗室(EMBL，Heidelberg，德國)的數(shù)據(jù)庫，登記號AB023377。Ikeda等(應用分子生物學和生物技術51，201-206(1999))進一步闡述了tkt基因的擴增對L-色氨酸，L-酪氨酸和L-苯丙氨酸形成的作用。在提及的參考文獻中闡述的tkt基因根據(jù)本發(fā)明可以使用。遺傳密碼簡并或由于中性功能的有義突變導致的tkt基因的等位基因也可使用。
為獲得擴增(如過表達)，例如可提高相應基因的拷貝數(shù)，或可突變位于結構基因上游的啟動子和調(diào)節(jié)區(qū)或核糖體結合位點。摻入結構基因上游的表達盒以同樣方式工作。通過可誘導啟動子，在L-氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)期間增加表達也是可能的。延長mRNA壽命的措施也可改善表達。另外，通過防止酶蛋白的分解也可提高酶活性?；蚧蚧驑嫿w可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或可在染色體中整合與擴增?；蛘撸ㄟ^改變培養(yǎng)基的組分和培養(yǎng)條件，也可獲得相關基因的過表達。
本領域熟練技術人員從以下文獻中可發(fā)現(xiàn)對此的詳述，參見Martin等(生物/技術5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技術6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，歐洲專利說明書EPS0472869，美國專利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技術9，84-87(1991))，Reischeid等(應用及環(huán)境微生物學60，126-132(1994))，LaBarre等(細菌學雜志175，1001-1007(1993))，專利申請WO96/15246，Malurnbres等(基因134，15-24(1993))，日本特許公開JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技術及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物學綜述60512-538(1996)及已知關于遺傳及分子生物學的教材。
例如，轉酮酶借助于質(zhì)粒被過表達。為此使用


圖1所示的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。在將tkt基因摻入pEC-T18mob2及隨后校正攜帶tkt基因的DNA片段的方向之后，形成圖3所示的質(zhì)粒pMS82B。
能在谷氨酸棒桿菌中復制的其它質(zhì)粒載體如pEKExl(Eikmanns等，基因10293-98(1991))，或pZ8-1(EP-B-0375889)也可以同樣方式使用。
另外，除編碼轉酮酶的tkt基因之外，特定生物合成途徑，糖酵解，添補反應，或氨基酸輸出的一或多種酶的過表達，對L-氨基酸的生產(chǎn)可以是有益的。
因此，例如選自以下一組的一或多個基因可被擴增尤其是過表達以生產(chǎn)L-蘇氨酸·編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因(Peoples等，分子微生物學2，63-72(1988))，或編碼“反饋抗性”高絲氨酸脫氫酶的homdr等位基因(Archer等，基因107，53-59(1991))，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物學144915-927(1998))，·編碼蘋果酸∶醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，歐洲生物化學雜志254，395-403)·編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因(JP-A-09224661)·編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因(JP-A-9-224662)·編碼蘇氨酸輸出的thrE基因(DE 199 41 478.5；DSM12840)·zwal基因(DE 199 59 328.0；DSM13115)·編碼烯醇酶的eno基因(DE19947791.4)。
因此，例如選自以下一組的一或多個基因可被擴增優(yōu)選過表達以生產(chǎn)L-賴氨酸·編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，·編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遺傳學224317-324)，·編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，細菌學雜志174，6076-6086)，·編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，歐洲生物化學雜志254，395-403)，
·編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因(JP-A-09224661)，·編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因(JP-A-9-224662)，·編碼賴氨酸輸出的lysE基因(DE-A-195 48 222)，·zwal基因(DE 199 59 328.0，DSM13115)。
除擴增tkt基因之外，同時弱化選自以下一組的一或多個基因?qū)-氨基酸的生產(chǎn)也可以是有益的·編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，·編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)，·zwa 2基因(DE19959327.2，DSM13113)。
除過表達轉酮酶之外，消除非所需的副反應對L-氨基酸的生產(chǎn)也是有益的(Nakayama“生產(chǎn)氨基酸的微生物的育種”，微生物產(chǎn)物的過量產(chǎn)生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編輯)，學術出版社，倫敦，英國，1982)。
根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的微生物可連續(xù)培養(yǎng)或非連續(xù)地通過分批法，補料分批法或重復補料分批法培養(yǎng)，以生產(chǎn)L-氨基酸。已知培養(yǎng)法見于由Chmiel(生物方法技術學1，生物工程入門，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反應器及外周設備，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培養(yǎng)基必須以適當方式符合特定菌株的需求。關于各種微生物培養(yǎng)基的闡述見于美國細菌學會的“細菌學通用方法手冊”(華盛頓特區(qū)，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，淀粉和纖維素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕櫚酸，硬脂酸和亞油酸，醇如甘油和乙醇，及有機酸如乙酸。這些物質(zhì)可單獨或混合使用?？墒褂玫牡窗ê挠袡C化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麥芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或無機化合物如硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨。氮源可單獨或混合使用?？墒褂玫牧自窗姿幔姿岫溻浕蛄姿釟涠?，或相應鈉鹽。培養(yǎng)基另外還必須含有為生長所需的金屬鹽如硫酸鎂或硫酸鐵。最后，除了上述物質(zhì)之外，可使用生長必需物質(zhì)如氨基酸和維生素。此外，可將適當前體加入培養(yǎng)基中，上述物質(zhì)可以單批形式或在培養(yǎng)期間適當補加。
可以適當方式加入堿性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH值。抗泡沫劑例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫產(chǎn)生。適當?shù)倪x擇性作用物質(zhì)例如抗生素，可加入培養(yǎng)基中以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，氧氣或含氧混合氣，例如空氣，可充入培養(yǎng)物中以保持有氧條件。培養(yǎng)溫度通常在20℃～45℃，優(yōu)選25℃-40℃。持續(xù)培養(yǎng)直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小時范圍內(nèi)達到。
L-氨基酸的分析可通過陰離子交換層析，隨后經(jīng)過如Spackman等(分析化學30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用進行，或通過如Lindroth等(分析化學(1979)511167-1174)所述反相HPLC進行。
以下微生物根據(jù)布達佩斯條約，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不倫瑞克，德國)大腸桿菌K-12 DH5α/pEC-T18mob2，保藏號DSM13244。
本發(fā)明包括以下附圖
圖1質(zhì)粒pEC-T18mob2圖。
圖2質(zhì)粒pMS82圖。
圖3質(zhì)粒pMS82B圖。
圖4質(zhì)粒pCR2.1poxBint圖。
所述堿基對數(shù)是可重復獲得的大約值。
圖中所采用的縮寫和符號有如下含義
圖1Tet四環(huán)素抗性基因
oriV大腸桿菌的質(zhì)粒編碼的復制源點RP4mob轉移質(zhì)粒的mob區(qū)域rep谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒pGA1的質(zhì)粒編碼的復制源點perpGA1的控制拷貝數(shù)的基因lacZ-αβ-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)圖2和3Tet四環(huán)素抗性基因rep谷氨酸棒桿菌質(zhì)粒pGA1的質(zhì)粒編碼的復制源點perpGA1的控制拷貝數(shù)的基因lacZ來自pEC-T18mob2的lacZα基因片段的克隆殘存片段tkt轉酮酶基因圖4ColE1 ori質(zhì)粒ColE1的復制源點lacZlacZα基因片段的克隆殘存片段fl ori噬菌體f1的復制源點KmR卡那霉素抗性ApR氨芐青霉素抗性poxBintpoxB基因的內(nèi)部片段另外，使用以下縮寫AccI限制酶AccI的酶切位點BamHI限制酶BamHI的酶切位點EcoRI限制酶EcoRI的酶切位點HindIII限制酶HindIII的酶切位點KpnI限制酶KpnI的酶切位點PstI限制酶PstI的酶切位點PvuI限制酶PvuI的酶切位點SalI限制酶SalI的酶切位點SacI限制酶SacI的酶切位點SmaI限制酶SmaI的酶切位點
SphI限制酶SphI的酶切位點XbaI限制酶XabI的酶切位點XhoI限制酶XhoI的酶切位點所得的序列如SEQ ID NO1所示。對所得核苷酸序列進行分析揭示一2094個堿基對的開放讀框，命名為tkt基因，其編碼一個697個氨基酸的蛋白質(zhì)，如SEQ ID NO2所示。實施例3tkt基因的表達3.1穿梭載體pEC-T18mob2的制備根據(jù)現(xiàn)有技術構建大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2。
此載體含有質(zhì)粒pGA1的包括復制效應子per的復制區(qū)rep(US-A-5，175，108；Nesvera等，細菌學雜志179，1525-1532(1997))，質(zhì)粒pAG1的四環(huán)素抗性基因tetA(Z)(USA-5158891；國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的基因文庫，登記號AF121000)，質(zhì)粒pMB1(Sutcliffe，關于定量生物學的冷泉港討論會43，77-90(1979))的復制起點oriV，包括lac啟動子及多克隆位點(mcs)(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))的lacZα基因片段，和質(zhì)粒RP4(Simon等，(1983)生物/技術1784-791)的mob區(qū)域。
將此構建的載體轉化入大腸桿菌菌株DH5α中(Hanahan，DNA克隆實用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，華盛頓，美國)。通過將轉化混合物鋪板于補加5mg/l四環(huán)素的LB平板(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.)上，選擇攜帶質(zhì)粒的細胞。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制備試劑盒從轉化體中分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindHI限制，及隨后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)檢測。
此質(zhì)粒稱為pEC-T18mob2并示于
圖1。其以大腸桿菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，德國)，保藏號DSM13244。3.2大腸桿菌/谷氨酸穿梭載體pEC-T18mob2中tkt基因的克隆使用PCR擴增含有谷氨酸棒桿菌的全長tkt基因和兩側上游和下游區(qū)域的DNA片段。用設計自SEQ ID NO1的寡核苷酸引物進行PCR反應。根據(jù)Heery和Dunican所述(應用和環(huán)境微生物學59791-799(1993))，從谷氨酸棒桿菌ATCC13032中分離基因組DNA，并將大約150-220ng用作模板。所用引物是
tkt正向引物5’CTG ATC ATC GGA TCT AAC GAA3’tkt反向引物5’ATT GCC CCG GGT TGA AGC TAA3’PCR參數(shù)如下35次循環(huán) 95℃ 6分鐘94℃ 1分鐘55℃ 1分鐘72℃ 45秒1mM MgCl2將所得PCR產(chǎn)物克隆入購自Promega公司的pGEM-T載體(pGEM-T Easy Vector System 1，目錄號A1360，Promega UK，Southampton)中，用大腸桿菌菌株JM109(Yanisch-Perron等，基因33103-119(1985))作宿主。全長tkt基因隨后分離自pGEM-T載體的SphI/SalI片段，并克隆入大腸桿菌/谷氨酸棒桿菌穿梭載體pEC-T18mob2的lacZ SphI/SalI區(qū)域中(
圖1)，并稱之為pMS82(圖2)。用AccI(Boehringer Mannheim GmbH，德國)進行的限制酶分析顯示pEC-T18mob2的lacZα基因中tkt基因的錯誤方向。通過用EcoRI酶(Boehringer Mannheim GmbH，德國)限制酶切并再連接而校正方向。用AccI(Boehringer Mannheim GmbH，德國)進行的限制酶分析顯示pEC-T18mob2的lacZα基因(即lac啟動子的下游)中tkt基因的正確方向，并將此質(zhì)粒稱為pMS82B(圖3)。實施例4tkt基因過表達在各種賴氨酸生產(chǎn)菌株中的作用生產(chǎn)L-賴氨酸的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715見于EP-B-0435132所述，DSM12866見于DE-A-19931314.8所述。這兩個菌株根據(jù)布達佩斯條約均保藏在德意志微生物保藏中心(Braunschweig，德國)。4.1制備DSM5715/pMS82B和DSM12866/pMS82B菌株將菌株DSM5715和DSM12866用質(zhì)粒pMS82B，通過Libel等所述電穿孔方法(FEMS微生物學通信，53299-303(1989))轉化。在包含18.5/l腦心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨，2.5g/lBacto-酵母膏，5g/l NaCl，和18g/l Bacto-瓊脂，并已補加5mg/l四環(huán)素的LBHIS瓊脂上選擇轉化體。在33℃溫育2天。
在每種情況下，質(zhì)粒DNA是通過常規(guī)方法(Peter-Wendisch等，1998，微生物學，144，915-927)分離自轉化體，用限制性內(nèi)切酶AccI酶切，并通過隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒。以此方式獲得的菌株稱為DSM5715/pMS82B和DSM12866/pMS82B。4.2制備L-賴氨酸將實施例4.1中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715/pMS82B和DSM12866/pMS82B，在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃在具有適當抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環(huán)素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIIINaCl 2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
加入四環(huán)素(5mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預培養(yǎng)物16小時。此預培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/lMOPS(嗎啉代丙磺酸)20g/l
葡萄糖(單獨高壓滅菌)50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(過濾滅菌) 0.3mg/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實驗結果示于表1。
表1
實施例5制備谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組粘粒文庫如Tauch等(1995，質(zhì)粒33168-179)所述分離谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA，并用限制性內(nèi)切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AI，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。將得自Stratagene公司(La Jolla，USA，產(chǎn)品描述SuperCosl粘粒載體試劑盒，編碼251301)的粘粒載體SuperCosl(Wahl等，(1987)美國科學院院報842160-2164)的DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述XbaI編碼27-0948-02)酶切，并也用蝦堿性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的內(nèi)切酶BamHI(AmershamPharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，編碼27-0868-04)酶切。將以此方式處理的粘粒DNA與處理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4 DNA連接酶(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述T4-DNA-連接酶，編碼27-0870-04)處理。連接混合物然后用Gigapack II XL包裝提取物(Stratagene，La Jolla，USA，產(chǎn)品描述Gigapack II XL包裝提取物，編碼200217)包裝進噬菌體中。為感染大腸桿菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究161563-1575)，將細菌置于10mM MgSO4中并與噬菌體懸浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒文庫的感染和滴定，細胞在含100mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂(Lennox.1955，病毒學，1190)上鋪板。在37℃保溫過夜后，選擇重組克隆。實施例6poxB基因的分離與測序用Qiaprep Spin微量制備試劑盒(產(chǎn)品號27106，Qiagen，Hilden，德國)根據(jù)廠商指導分離單個菌落的粘粒DNA(實施例5)，并用限制性內(nèi)切酶Sau 3AI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述Sau3AJ，編碼27-0913-02)部分酶切。用蝦堿性磷酶酶(Roche分子生物化學，德國曼海姆，產(chǎn)品描述SAP，編碼1758250)將DNA片段去磷酸化。經(jīng)凝膠電泳分離后，用QiaExII凝膠提取試劑盒(產(chǎn)品號20021，Qiagen，Hilden，德國)分離大小范圍為1500-2000bp的粘粒片段。將得自Invitrogen公司(Groningen，荷蘭，產(chǎn)品描述Zero背景克隆試劑盒，產(chǎn)品號K2500-01)的測序載體pZero-1的DNA，用限制性內(nèi)切酶BamHI(Amersham Pharrnacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI(Amersham Pharmacia，F(xiàn)reiburg，德國，產(chǎn)品描述BamHI，產(chǎn)品號27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆實驗手冊，冷泉港)所述進行粘粒片段在測序載體pZero-1中的連接，將DNA混合物與T4連接酶(Pharmacia Biobech，F(xiàn)reiburg，德國)保溫過夜。然后將連接混合物電穿孔(Tauch等，1994，F(xiàn)EMS微生物學通信，123343-7)進大腸桿菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美國科學院院報874645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB瓊脂(Lennox，1955，病毒學，1190)上鋪板。重組克隆的質(zhì)粒制備用Biorobot 9600(產(chǎn)品號900200，Qiagen，Hilden，德國)進行。測序用Zimmermann等(1990，核酸研究181067)改良的Sanger等(1977，美國科學院院報745463-5467)的雙脫氧鏈終止法進行。使用得自PE應用生物系統(tǒng)公司的“RR羅丹明終止循環(huán)測序試劑盒”(產(chǎn)品號403044，Weiterstadt，德國)，在帶有購自PE應用生物系統(tǒng)公司(Weiterstadt，德國)的“ABI Prism377”測序儀的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/雙丙烯酰胺”凝膠(291)(產(chǎn)品號A124.1，Roth，Karlsruhe，德國)中，進行凝膠電泳分離和序列分析。
所得原始序列數(shù)據(jù)資料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14217-231)版本97-0處理。pZero-1衍生物的各個序列組裝成連續(xù)重疊群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14217-231)進行計算機輔助編碼區(qū)分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，253389-3402)對“國家生物技術信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余數(shù)據(jù)庫進行進一步分析。
獲得的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，對該核苷酸序列的分析顯示一1737堿基對的開放讀框，其被稱為poxB基因，poxB基因編碼579個氨基酸的多肽(SEQ ID NO4)。實施例7制備整合載體以整合誘變poxB基因從菌株ATCC13032中，通過Eikmanns等所述方法(微生物學1401817-1828(1994))分離染色體DNA?；趶膶嵤├?中已知的谷氨酸棒桿菌的poxB基因序列，選擇以下寡核苷酸進行聚合酶鏈反應poxBint15’TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG3’poxBint25’GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC3’所示引物是通過MWG Biotech(Ebersberg，德國)合成的，通過Innis等的標準PCR方法(PCR方案，方法指導和應用，1990，Academic出版社)，用Boehringer的Pwo-聚合酶進行PCR反應。借助于聚合酶鏈反應，分離大約0.9kb的DNA片段，其攜帶poxB基因的內(nèi)部片段，并如SEQ ID NO5所示。
將擴增的DNA片段用Invitrogen公司的TOPO TA克隆試劑盒(Carlsbad，CA，美國；Catalogue Number K4500-01)，連接在載體pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)，生物/技術9657-663)中。然后將連接混合物電穿孔入大腸桿菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆實用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，華盛頓DC，美國，1985)。將轉化混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇攜帶質(zhì)粒的細胞，所用LB瓊脂已補加25mg/ml卡那霉素。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制備試劑盒從轉化體中分離質(zhì)粒DNA，并通過限制酶EcoRI限制及隨后的瓊脂糖凝膠電泳(0.8％)檢測。此質(zhì)粒稱為pCR2.1poxBint(圖4)。
質(zhì)粒pCR2.1poxBint以大腸桿菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式，根據(jù)布達佩斯條約保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ；Braunschweig，德國)，保藏號DSM13114。實施例8在賴氨酸生產(chǎn)菌DSM5715中整合誘變poxB基因?qū)嵤├?中所述的載體pCR2.1poxBint，通過Tauch等的電穿孔方法(FEMS微生物學通信，123343-347(1994))，電穿孔入谷氨酸棒桿菌DSM5715中。菌株DSM5715是一種AEC抗性賴氨酸生產(chǎn)菌。載體pCR2.1poxBint在DSM5715中不能獨立復制，并只有已整合入DSM5715的染色體中時才能在細胞中保留。通過將電穿孔混合物鋪板于LB瓊脂(Sambrook等，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，選擇具有整合入染色體的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB瓊脂已補加15mg/l卡那霉素。為檢測整合情況，將poxBint片段用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒，通過Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim，德國，1993)的“進行濾膜雜交的DIG系統(tǒng)使用指導”進行標記。潛在整合子的染色體DNA是通過Eikmanns等的方法(微生物學1401817-1828(1994))分離的，并分別用限制酶SalI，SacI和HindIII酶切。形成的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離，并在68℃用Boehringer公司的Dig雜交試劑盒雜交。實施例9中所述的質(zhì)粒pCR2.1poxBint已插入DSM5715的染色體中的染色體poxB基因內(nèi)。此菌株稱為DSM5715∷pCR2.1poxBint。實施例9過表達tkt基因同時消除poxB基因?qū)嚢彼嶂苽涞淖饔?.1制備菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pMS82B通過Libel等所述電穿孔方法(FEMS微生物學通信，53299-303(1989))，將菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用質(zhì)粒pMS82B轉化。在含有18.5g/l腦心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl，和18g/l Bacto-瓊脂，并補加5mg/l四環(huán)素和25mg/l卡那霉素的LBHIS瓊脂上，選擇轉化體。在33℃溫育2天。
通過常規(guī)方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物學144，915-927)從轉化體中分離質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶AccI酶切，并通過隨后的瓊脂糖凝膠電泳檢測此質(zhì)粒。以此方式獲得的菌株稱為DSM5715∷pCR2.1poxBint/pMS82B。9.2制備L-賴氨酸將實施例9.1中所得的谷氨酸棒桿菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pMS82B，在適于生產(chǎn)賴氨酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并確定培養(yǎng)物上清中賴氨酸含量。
首先，在33℃在具有適當抗生素的瓊脂板(含5mg/l四環(huán)素和25mg/l卡那霉素的腦心瓊脂)上培養(yǎng)菌株24小時。此瓊脂板培養(yǎng)物用于接種預培養(yǎng)物(10ml培養(yǎng)基于100ml錐形瓶)。用于預培養(yǎng)的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基CgIII。
培養(yǎng)基CgIIINaCl 2.5g/lBacto-肽胨 10g/lBacto-酵母膏 10g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌) 2％(w/v)pH調(diào)節(jié)為7.4。
加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在搖床上于33℃以240rpm振蕩培養(yǎng)預培養(yǎng)物16小時。此預培養(yǎng)物接種主培養(yǎng)物，從而主培養(yǎng)物的起始OD(波長660nm)為0.1。培養(yǎng)基MM用作主培養(yǎng)物。
培養(yǎng)基MMCSL(玉米漿) 5g/l
MOPS(嗎啉代丙磺酸) 20g/l葡萄糖(單獨高壓滅菌)58g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O10mg/lMnSO4·H2O5.0mg/l生物素(過濾滅菌)0.3m/l硫胺素·HCl(過濾滅菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(過濾滅菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水將CSL，MOPS和鹽溶液調(diào)至PH7并高壓滅菌。然后加入無菌的底物和維生素溶液，并加入干態(tài)高壓滅菌的CaCO3。
以在具有檔板的100ml錐形瓶中的10ml體積進行培養(yǎng)。加入四環(huán)素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大氣濕度下進行培養(yǎng)。
72小時后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)測定在660nm波長的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析儀(漢堡，德國)經(jīng)離子交換層析和用茚三酮檢測柱后衍生化而確定賴氨酸生成量。
實驗結果示于表2。
表2
序列表<110>國立愛爾蘭大學戈爾韋分校德古薩-于爾斯股份公司<120>用棒狀細菌發(fā)酵制備L-氨基酸的方法<130>000019 BT<140><141><160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2350<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><221>CDS<222>(205)..(2295)<223>tkt<400>1cgggtcagat taagcaaaga ctactttcgg ggtagatcac ctttgccaaa tttgaaccaa 60ttaacctaag tcgtagatct gatcatcgga tctaacgaaa acgaaccaaa actttggtcc 120cggtttaacc caggaaggat tgaccaccta acgaaaacga accaaaactt tggtcccggt 180ttaacccagg aaggattgac cacc ttg acg ctg tca cct gaa ctt cag gcg 231Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala1 5ctc act gta cgc aat tac ccc tct gat tgg tcc gat gtg gac acc aag279Leu Thr Val Arg Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys10 15 20 25gct gta gac act gtt cgt gtc ctc gct gca gac gct gta gaa aac tgt327Ala Val Asp Thr Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys30 35 40ggc tcc ggc cac cca ggc acc gca atg agc ctg gct ccc ctt gca tac375Gly Ser Gly His Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr45 50 55acc ttg tac cag cgg gtt atg aac gta gat cca cag gac acc aac tgg423Thr Leu Tyr Gln Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp60 65 70gca ggc cgt gac cgc ttc gtt ctt tct tgt ggc cac tcc tct ttg acc471Ala Gly Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr75 80 85cag tac atc cag ctt tac ttg ggt gga ttc ggc ctt gag atg gat gac519Gln Tyr Ile Gln Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp90 95 100 105ctg aag gct ctg cgc acc tgg gat tcc ttg acc cca gga cac cct gag567Leu Lys Ala Leu Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu
110 115 120tac cgc cac acc aag ggc gtt gag atc acc act ggc cct ctt ggc cag 615Tyr Arg His Thr Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln125 130 135ggt ctt gca tct gca gtt ggt atg gcc atg gct gct cgt cgt gaq cgt 663Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg140 145 150ggc cta ttc gac cca acc gct gct gag ggc gaa tcc cca ttc gac cac 711Gly Leu Phe Asp Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His155 160 165cac atc tac gtc att gct tct gat ggt gac ctg cag gaa ggt gtc acc 759His Ile Tyr Val Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr170 175 180 185tct gag gca tcc tcc atc gct ggc acc cag cag ctg ggc aac ctc atc 807Ser Glu Ala Ser Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ile190 195 200gtg ttc tgg gat gac aac cgc atc tcc atc gaa gac aac act gag atc 855Val Phe Trp Asp Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu Ile205 210 215gct ttc aac gag gac gtt gtt gct cgt tac aag gct tac ggc tgg cag 903Ala Phe Asn Glu Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln220 225 230acc att gag gtt gag gct ggc gag gac gtt gca gca atc gaa gct gca 951Thr Ile Glu Val Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Ala235 240 245gtg gct gag gct aag aag gac acc aag cga oct acc ttc atc cgc gtt 999Val Ala Glu Ala Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg Val250 255 260 265cgc acc atc atc ggc ttc cca gct cca act atg atg aac acc ggt gct 1047Arg Thr Ile Ile Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala270 275 280gtg cac ggt gct gct ctt ggc gca cgt gaa gtt gca gca acc aag act 1095Val His Gly Ala Ala Leu Gly Ala Arg Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr285 290 295gag ctt gga ttc gat cct gag gct cac ttc gcg atc gac gat gag gtt 1143Glu Leu Gly Phe Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu Val300 305 310atc gct cac acc cgc tcc ctc gca gag cgc gct gca cag aag aag gct 1191Ile Ala His Thr Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala315 320 325gca tgg cag gtc aag ttc gat gag tgg gca gct gcc aac cct gag aac 1239Ala Trp Gln Val Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn330 335 340 345aag gct ctg ttc gat cgc ctg aac tcc cgt gag ctt cca gcg ggc tac 1287Lys Ala Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr350 355 360gct gac gag ctc cca aca tgg gat gca gat gag aag ggc gtc gca act 1335Ala Asp Glu Leu Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr
365 370 375cgt aag gct tcc gag gct gca ctt cag gca ctg ggc aag acc ctt cct 1383Arg Lys Ala Ser Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro380 385 390gag ctg tgg ggc ggt tcc gct gac ctc gca ggt tcc aac aac acc gtg 1431Glu Leu Trp Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val395 400 405atc aag ggc tcc cct tcc ttc ggc cct gag tcc atc tcc acc gag acc 1479Ile Lys Gly Ser Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu Thr410 415 420 425tgg tct gct gag cct tac ggc cgt aac ctg cac ttc ggt atc cgt gag 1527Trp Ser Ala Glu Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg Glu430 435 440cac gct atg gga tcc atc ctc aac ggc att tcc ctc cac ggt ggc acc 1575His Ala Met Gly Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Thr445 450 455cgc cca tac ggc gga acc ttc ctc atc ttc tcc gac tac atg cgt cct 1623Arg Pro Tyr Gly Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro460 465 470gca gtt cgt ctt gca gct ctc atg gag acc gac gct tac tac gtc tgg 1671Ala Val Arg Leu Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp475 480 485acc cac gac tcc atc ggt ctg ggc gaa gat ggc cca acc cac cag cct 1719Thr His Asp Ser Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro490 495 500 505gtt gaa acc ttg gct gca ctg cgc gcc atc cca ggt ctg tcc gtc ctg 1767Val Glu Thr Leu Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val Leu510 515 520cgt cct gca gat gcg aac gag acc gcc cag gct tgg gct gca gca ctt 1815Arg Pro Ala Asp Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu525 530 535gag tac aag gaa ggc cct aag ggt ctt gca ctg acc cgc cag aac gtt 1863Glu Tyr Lys Glu Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val540 545 550cct gtt ctg gaa ggc acc aag gag aag gct gct gaa ggc gtt cgc cgc 1911Pro Val Leu Glu Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg555 560 565ggt ggc tac gtc ctg gtt gag ggt tcc aag gaa acc cca gat gtg atc 1959Gly Gly Tyr Val Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val Ile570 575 580 585ctc atg ggc tcc ggc tcc gag gtt cag ctt gca gtt aac gct gcg aag 2007Leu Met Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys590 595 600gct ctg gaa gct gag ggc gtt gca gct cgc gtt gtt tcc gtt cct tgc 2055Ala Leu Glu Ala Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys605 610 615atg gat tgg ttc cag gag cag gac gca gag tac atc gag tcc gtt ctg 2103Met Asp Trp Phe Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val Leu
620 625 630cct gca gct gtg acc gct cgt gtg tct gtt gaa gct ggc atc gca atg 2151Pro Ala Ala Val Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala Met635 640 645cct tgg tac cgc ttc ttg ggc acc cag ggc cgt gct gtc tcc ctt gag 2199Pro Trp Tyr Arg Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu650 655 660 665cac ttc ggt gct tct gcg gat tac cag acc ctg ttt gag aag ttc ggc 2247His Phe Gly Ala Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly670 675 680atc acc acc gat gca gtc gtg gca gcg gcc aag gac tcc att aac ggt 2295Ile Thr Thr Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn Gly685 690 695taattgccct gctgttttta gcttcaaccc ggggcaatat gattctccgg aattt 2350<210>2<211>697<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌<400>2Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala Leu Thr Val Arg Asn Tyr Pro1 5 10 15Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys Ala Val Asp Thr Val Arg Val20 25 30Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys Gly Ser Gly His Pro Gly Thr35 40 45Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Gln Arg Val Met50 55 60Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp Ala Gly Arg Asp Arg Phe Val65 70 75 80Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr Gln Tyr Ile Gln Leu Tyr Leu85 90 95Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp Leu Lys Ala Leu Arg Thr Trp100 105 110Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu Tyr Arg His Thr Lys Gly Val115 120 125Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly130 135 140Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg Gly Leu Phe Asp Pro Thr Ala145 150 155 160Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His His Ile Tyr Val Ile Ala Ser165 170 175Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr Ser Glu Ala Ser Ser Ile Ala180 185 190Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ile Val Phe Trp Asp Asp Asn Arg
195 200 205Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu Ile Ala Phe Asn Glu Asp Val Val210 215 220Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln Thr Ile Glu Val Glu Ala Gly225 230 235 240Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Ala Val Ala Glu Ala Lys Lys Asp245 250 255Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg Val Arg Thr Ile Ile Gly Phe Pro260 265 270Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala Val His Gly Ala Ala Leu Gly275 280 285Ala Arg Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr Glu Leu Gly Phe Asp Pro Glu290 295 300Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu Val Ila Ala His Thr Arg Ser Leu305 310 315 320Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala Trp Gln Val Lys Phe Asp325 330 335Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Lys Ala Leu Phe Asp Arg Leu340 345 350Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Pro Thr Trp355 360 365Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr Arg Lys Ala Ser Glu Ala Ala370 375 380Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro Glu Leu Trp Gly Gly Ser Ala385 390 395 400Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val Ile Lys Gly Ser Pro Ser Phe405 410 415Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu Thr Trp Ser Ala Glu Pro Tyr Gly420 425 430Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg Glu His Ala Met Gly Ser Ile Leu435 440 445Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Thr Arg Pro Tyr Gly Gly Thr Phe450 455 460Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro Ala Val Arg Leu Ala Ala Leu465 470 475 480Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp Thr His Asp Ser Ile Gly Leu485 490 495Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Thr Leu Ala Ala Leu500 505 510Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val Leu Arg Pro Ala Asp Ala Asn Glu515 520 525Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Lys Glu Gly Pro Lys530 535 540Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val Pro Val Leu Glu Gly Thr Lys545 550 555 560Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Val Leu Val Glu565 570 575Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val Ile Leu Met Gly Ser Gly Ser Glu580 585 590Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Gly Val595 600 605Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys Met Asp Trp Phe Gln Glu Gln610 615 620Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val Leu Pro Ala 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1.一種通過發(fā)酵棒狀細菌制備L-氨基酸的方法，包括進行以下步驟a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L-氨基酸的細菌，該細菌中至少tkt基因是擴增的，b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的L-氨基酸，及c)分離產(chǎn)生的L-氨基酸。
2.權利要求1的方法，其中使用的細菌中，所需L-氨基酸的生物合成途徑的其它基因也被擴增，尤其是過表達。
3.權利要求1的方法，其中使用制備L-蘇氨酸，L-賴氨酸或L-異亮氨酸的棒狀細菌。
4.權利要求3的方法，其中使用制備L-賴氨酸的的棒狀細菌。
5.如權利要求2發(fā)酵制備L-賴氨酸的方法，其中在尤其已經(jīng)產(chǎn)生L-賴氨酸的棒狀微生物中，選自以下一組的一或多個基因被同時擴增或過表達5.1編碼二氫-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，5.2編碼反饋抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，5.3編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，5.4編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，5.5編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因，5.6編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因，5.7編碼賴氨酸輸出的lysE基因，5.8編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的mqo基因，5.9 zwal基因，5.10編碼烯醇化酶的eno基因。
6.如權利要求2發(fā)酵制備L-蘇氨酸的方法，其中在尤其已經(jīng)產(chǎn)生L-蘇氨酸的棒狀微生物中，選自以下一組的一或多個基因被同時擴增或過表達6.1編碼高絲氨酸脫氫酶的hom基因或編碼“反饋抗性”高絲氨酸脫氫酶的homdr等位基因，6.2編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的gap基因，6.3編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，6.4編碼蘋果酸∶醌氧化還原酶的mqo基因，6.5編碼葡糖-6-磷酸脫氫酶的zwf基因，6.6編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因，6.7編碼蘇氨酸輸出的thrE基因，6.8 zwal基因，6.9編碼烯醇化酶的eno基因。
7.權利要求2的方法，其中為制備L-氨基酸尤其L-賴氨酸或L-蘇氨酸，發(fā)酵這樣的細菌，該細菌中選自以下一組的一或多個基因被同時弱化7.1編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，7.2編碼葡糖-6-磷酸異構酶的pgi基因，7.3編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，7.4zwa2基因。
8.權利要求2-6任一項的方法，其中為實現(xiàn)擴增，所述基因或核苷酸序列的拷貝數(shù)，通過用攜帶這些基因或核苷酸序列的質(zhì)粒載體轉化微生物而提高。
9.
圖1所示的質(zhì)粒載體pEC-T18mob2，其以在K-12 DH5α中的形式保藏，保藏號DSM13244。
10.權利要求9的質(zhì)粒載體pEC-T18mob2，其另外還攜帶tkt基因。
11.一種通過導入權利要求10的質(zhì)粒載體轉化的棒狀微生物，尤其棒桿菌屬，其另外還含有tkt基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過發(fā)酵棒狀細菌制備L－氨基酸的方法,其包括進行以下步驟:a)發(fā)酵產(chǎn)生所需L－氨基酸的細菌,該細菌中至少tkt基因是擴增的,b)濃縮培養(yǎng)基或細菌細胞中的L－氨基酸,及c)分離產(chǎn)生的L－氨基酸。本發(fā)明還涉及攜帶tkt基因的載體。
文檔編號C12P13/08GK1350589SQ00807474
公開日2002年5月22日 申請日期2000年7月5日 優(yōu)先權日2000年3月17日
發(fā)明者L·K·杜尼肯(死亡), 阿什令·麥科麥克, 克里奧娜·斯特普爾頓, 凱文·伯克, 貝蒂娜·默克爾, 格奧爾格·蒂爾巴赫 申請人:德古薩股份公司, 國立愛爾蘭大學