專利名稱：在細(xì)胞培養(yǎng)物中增強(qiáng)細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在細(xì)胞培養(yǎng)物中，通過PKR的過表達(dá)，用于增強(qiáng)細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法。
已經(jīng)表明，PKR通過其磷酸化蛋白質(zhì)合成起始因子eIF2以及I-κB(NF-κB的抑制劑；Kumar A等人，1994)和其它底物的能力，在翻譯、轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)中，扮演著多種重要的角色。
PKR的表征得最清楚的體內(nèi)底物是真核生物起始因子2的α亞基(eIF-2α)，一旦它被磷酸化，它最終導(dǎo)致細(xì)胞和病毒性蛋白質(zhì)合成的抑制(Hershey，1991)。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)PKR被雙鏈RNA激活時(shí)，它在體外磷酸化起始因子eIF-2(Chong等人，1992)。
歸屬到PKR的活性，包括它在下面三過程中扮演的角色(1)介導(dǎo)IFN-α和IFN-β的抗病毒和抗增殖活性，(2)未感染細(xì)胞對生理應(yīng)激反應(yīng)的應(yīng)答，和(3)細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)(Clemens MJ和Elia A，1997；Zamanian-Daryoush M等人，1999)另已建議PKR可以作為腫瘤抑制劑和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑而發(fā)揮功能(見，例如，Clemens MJ和Bommer UA，1999；Yeung，Lau等人，1996；Koromilas等人，1992)，最近的結(jié)果表明活性形式PKR的表達(dá)，很可能是通過Fas受體的去調(diào)節(jié)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡(Donze O等人，1999)。
已進(jìn)一步地表明當(dāng)用編碼PKR的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染具有產(chǎn)生干擾素能力的細(xì)胞系時(shí)，PKR的過表達(dá)誘導(dǎo)出更多的干擾素產(chǎn)生(WO97/08324)。干擾素蛋白質(zhì)家族是細(xì)胞因子的原型，而且已表明它們在免疫防御抵抗病原和癌性組織中扮演著關(guān)鍵角色。
細(xì)胞因子是表現(xiàn)出一系列生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)性分子，并作用于廣泛的靶細(xì)胞(見，例如，Balkwill FR和Burke，1989；Wong G和Clark S，1988；Clark S和Kamen R，1987)。
一般地，當(dāng)前是通過在昆蟲、細(xì)菌和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)重組的蛋白質(zhì)，生產(chǎn)細(xì)胞因子。
通過從哺乳動(dòng)物細(xì)胞系純化天然的細(xì)胞因子或者在昆蟲、微生物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重組生產(chǎn)細(xì)胞因子，而將細(xì)胞因子用于多種治療性用途。優(yōu)選天然的細(xì)胞因子，這是由于已知它們含有某一給定細(xì)胞因子之天然形式的全部組成部分并且具有恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)，但是它們很昂貴而且生產(chǎn)起來很費(fèi)時(shí)間。
重組生產(chǎn)的細(xì)胞因子制造起來相對便宜，但是隨來源的不同，可能含有外源抗原，從而使施用了它們的對象產(chǎn)生免疫反應(yīng)，或者由于與天然形式有結(jié)構(gòu)差異，例如糖基化型式不同，而可能具有較低的活性。
因而，能夠用于增強(qiáng)天然細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法，從而使它們不再那么昂貴，將是有優(yōu)越性的。
目前的方法是采用在微生物系統(tǒng)中表達(dá)細(xì)胞因子，它們不能夠?qū)⒓?xì)胞因子蛋白質(zhì)糖基化和天然折疊，或者在人細(xì)胞中表達(dá)細(xì)胞因子，一般地這些人細(xì)胞產(chǎn)生的重組細(xì)胞因子的水平非常低。
本發(fā)明涉及驚人的發(fā)現(xiàn)，即通過操作某些基因的表達(dá)，使得在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中細(xì)胞因子的產(chǎn)生得到增強(qiáng)。
一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)細(xì)胞因子的方法，即通過培養(yǎng)已以一種方式被修飾的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，所采用的修飾方式能夠?qū)е录?xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過表達(dá)，并且對所說的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行了處理，從而有效地產(chǎn)生細(xì)胞因子，接著收集由培養(yǎng)的、經(jīng)處理的細(xì)胞系產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子是PKR。
在一個(gè)方法中，用具有啟動(dòng)子片段的表達(dá)載體對哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染，該啟動(dòng)子片段能夠在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能并且與編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的DNA片段可操作地連接，這樣以來，在細(xì)胞系中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子被過表達(dá)。
通過引發(fā)(priming)和誘導(dǎo)，例如采用佛波酯諸如乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)引發(fā)和采用dsRNA諸如poly r(I)∶poly r(C)誘導(dǎo)可以對細(xì)胞系進(jìn)行處理，從而有效地產(chǎn)生細(xì)胞因子。引發(fā)是一種眾所周知的現(xiàn)象，因此采用細(xì)胞因子或者其它化合物對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，會導(dǎo)致相同的和/或另外的細(xì)胞因子在隨后的刺激之后產(chǎn)生得到增強(qiáng)。
用本發(fā)明方法可以增加的細(xì)胞因子表達(dá)的實(shí)例包括但不限于白細(xì)胞介素(IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4至8)，腫瘤壞死因子α和β(TNF-β)，集落刺激因子(粒細(xì)胞集落刺激因子，G-CSF；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，GM-CSF；以及IL-3)，血管生成因子(成纖維細(xì)胞生長因子，F(xiàn)GF；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，VEGF；以及血小板衍生的生長因子1和2(PDGF-1和-2)和抗-血管生成因子(制管張素(angiostatin)和內(nèi)皮抑素(endostatin))。
可以在可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子或四環(huán)素(TRE)啟動(dòng)子，或者組成型啟動(dòng)子例如CMV啟動(dòng)子的控制之下，表達(dá)細(xì)胞因子。
本發(fā)明進(jìn)一步地提供了細(xì)胞系組合物，其特征在于細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子例如PKR的高于正常表達(dá)以及細(xì)胞因子例如白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)或者腫瘤壞死因子β(TNF-β)的高于正常表達(dá)。
當(dāng)閱讀了下面的本發(fā)明詳述并結(jié)合所附的附圖和實(shí)施例后，本發(fā)明的這些和其它目的及特性將會變得更加充分明顯。
圖2表示在未被轉(zhuǎn)化的Namalwa以及過表達(dá)PKR的Namalwa細(xì)胞中，白細(xì)胞介素8(IL-8)的產(chǎn)生，除了對培養(yǎng)上清液采用ELISA，根據(jù)ELISA試劑盒供應(yīng)商(R&D Systems)提供的方法，分析其中IL-8的產(chǎn)生外，完全按
圖1中所描述出的方法進(jìn)行。
圖3表示在未被轉(zhuǎn)化的Namalwa以及過表達(dá)PKR的Namalwa細(xì)胞中，腫瘤壞死因子β(TNF-β)的產(chǎn)生，除了對培養(yǎng)上清液采用ELISA，根據(jù)ELISA試劑盒供應(yīng)商(R&D Systems)提供的方法，分析其中TNF-β的產(chǎn)生外，完全按
圖1中所描述出的方法進(jìn)行。
發(fā)明詳述I.定義術(shù)語“載體”指能夠同化新核酸并且在合適的宿主中能夠繁殖那些新序列的核苷酸序列。載體包括但不限于重組的質(zhì)粒和病毒。本發(fā)明的載體(例如質(zhì)?；蛑亟M的病毒)，可以是處于一種攜帶體中，例如，與蛋白質(zhì)復(fù)合的質(zhì)粒，與基于脂質(zhì)的核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)復(fù)合的質(zhì)粒，或者其它非病毒性攜帶體系統(tǒng)。
表達(dá)載體可以包含另外一些元件，例如，表達(dá)載體可以具有兩種復(fù)制系統(tǒng)，從而允許其能夠在兩種生物體中保持，例如在哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中保持存在以表達(dá)以及在原核宿主中保持存在以克隆和擴(kuò)增。
無論是表達(dá)載體還是克隆載體，它們均包含能夠使載體在一種或多種被選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。對于多種細(xì)菌、酵母和病毒，這樣的序列眾所周知。而且，對于整合型表達(dá)載體，表達(dá)載體含有至少一個(gè)與宿主細(xì)胞基因組同源的序列，優(yōu)選地含有兩個(gè)位于表達(dá)構(gòu)建體側(cè)翼的同源序列。通過選擇合適的同源序列并將其插入到載體中，就可以將整合型載體導(dǎo)向宿主細(xì)胞中的特定位點(diǎn)。整合型載體的構(gòu)建體為本領(lǐng)域所公知。
表達(dá)和克隆載體一般含有選擇性的標(biāo)記基因，它編碼這樣的蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其它毒素，例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素，的抗性(b)互補(bǔ)營養(yǎng)缺陷型，或者(c)提供無法從復(fù)合培養(yǎng)基中獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，例如，編碼桿菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因。
在載體中，必須將核酸編碼序列“可操作地連接”，這可通過將其置于與另一核酸序列處于功能關(guān)系之中而實(shí)現(xiàn)。例如，如果編碼前序列(presequence)或分泌性前導(dǎo)序列(leader)的DNA被表達(dá)為參與多肽分泌的一種前蛋白質(zhì)(preprotein)，那么它就是與編碼多肽的DNA進(jìn)行了可操作地連接；如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是與編碼序列進(jìn)行了可操作地連接；或者，如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于促進(jìn)翻譯的部位，那么它就是與編碼序列進(jìn)行了可操作地連接。通常地，“可操作地連接”的DNA序列是緊鄰(contiguous)的，并且，在分泌性前導(dǎo)序列的情況下也是連續(xù)的并處于閱讀框架中。然而，增強(qiáng)子卻并不一定是緊鄰的。連接是通過將方便的限制位點(diǎn)連接而完成的。如果不存在這樣的位點(diǎn)，那么可以根據(jù)常規(guī)方法，使用合成的寡核苷酸連接物(adaptor)或接頭(linker)。
術(shù)語“控制序列”指在某一特定的宿主生物體中表達(dá)可操作地連接的編碼序列所必需的DNA序列。適于原核細(xì)胞的控制序列包括，例如，啟動(dòng)子、任選地操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號和增強(qiáng)子。
啟動(dòng)子序列編碼組成型或者可誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以是天然存在的啟動(dòng)子或者雜合的啟動(dòng)子。雜合的啟動(dòng)子將多于一種啟動(dòng)子的元件結(jié)合在一起，它們一般為本領(lǐng)域所公知，并用于本發(fā)明的實(shí)施之中。
正如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)”指細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)物包括前體RNA、mRNA、多肽、經(jīng)翻譯后加工的多肽，和它們的衍生物，其中包括來自諸如鼠或猿猴的酶類的其它非人類物種的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子。正如本文所用，術(shù)語“PKR表達(dá)”指PKR基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)物包括前體RNA、mRNA、多肽、經(jīng)翻譯后加工的多肽和它們的衍生物，其中包括來自諸如鼠或猿猴的酶類的其它非人類物種的PKR。
正如本文所用，術(shù)語“PKR的生物學(xué)活性”和“具有生物學(xué)活性的PKR”指與PKR或者PKR的任何片段、衍生物或類似物相關(guān)的任何生物學(xué)活性，諸如酶活性，具體包括自體磷酸化活性、真核細(xì)胞翻譯起始因子2(eIF-2)磷酸化活性或者導(dǎo)致蛋白質(zhì)諸如細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄被增強(qiáng)的激酶活性。所以，某一給定的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的生物學(xué)活性是指由本領(lǐng)域技術(shù)人員所一般賦予該因子的任何生物學(xué)活性。
正如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性的正常水平”，“細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)的正常水平”，其分別被簡稱為“PKR活性的正常水平”和“PKR表達(dá)的正常水平”，是指細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子例如PKR的活性或表達(dá)的水平，經(jīng)確定其存在于未受刺激或未受感染的某一特定類型細(xì)胞例如某一特定細(xì)胞系中。應(yīng)當(dāng)理解的是，這樣的“正常的”細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)，一般是在未用編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的載體轉(zhuǎn)染、未受刺激(沒有受到誘導(dǎo)或被引發(fā))和未受感染的某一給定類型的細(xì)胞中所觀察到的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性或表達(dá)的一個(gè)范圍，并且可能會依培養(yǎng)條件而有所變化。
例如，U937細(xì)胞系所具有的PKR活性的正常范圍，可能與U937、T98G或Namalwa細(xì)胞系所具有的PKR活性的正常范圍不同。因此，某一給定細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子例如PKR的過表達(dá)，就意味著其表達(dá)水平，高于在未用編碼PKR的載體轉(zhuǎn)染、未受刺激(沒有受到誘導(dǎo)、預(yù)處理或被引發(fā))和未受感染的某一給定類型的細(xì)胞中所一般觀察到的PKR表達(dá)的正常水平。
類似地，正如本文所用，術(shù)語“細(xì)胞因子活性的正常水平”和“細(xì)胞因子表達(dá)的正常水平”，是指細(xì)胞因子活性或表達(dá)的水平，經(jīng)確定其存在于沒有過表達(dá)某一給定的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子例如PKR的某一特定類型細(xì)胞中，諸如正常地產(chǎn)生或者具有產(chǎn)生某一給定細(xì)胞因子能力的未受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。應(yīng)當(dāng)理解的是，這樣的“正常的”細(xì)胞因子活性或表達(dá)，一般是在沒有過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的某一給定類型的細(xì)胞中所觀察到的細(xì)胞因子活性或表達(dá)的一個(gè)范圍，并且可能會依培養(yǎng)條件而有所變化。
例如，沒有過表達(dá)PKR的某一給定細(xì)胞系可以具有正常的細(xì)胞因子活性范圍，它與用PKR轉(zhuǎn)染或者過表達(dá)PKR的該相同細(xì)胞系所具有的細(xì)胞因子活性范圍不同。II.發(fā)明方法本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)物中，通過對某些蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，可以將細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平提高，這些蛋白質(zhì)在正常情況下調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的體內(nèi)表達(dá)。
這些因子包括細(xì)胞因子特異的調(diào)節(jié)因子，例如干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF-1、IRF-3和IRF-7)、細(xì)胞因子受體、核因子κB(NF-κB)、激活子蛋白質(zhì)-1(AP-1)、核因子IL-6(NF-IL6)、蛋白質(zhì)激酶C、p38 MAPK、STAT/Jak激酶系統(tǒng)因子，以及尤其是PKR。
增強(qiáng)任何這些調(diào)節(jié)因子的表達(dá)或活性，將會導(dǎo)致編碼一種或多種細(xì)胞因子基因的高于正常水平的表達(dá)。如此增強(qiáng)的細(xì)胞因子表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞因子的生產(chǎn)效率更高、生產(chǎn)成本更低。
在本文中，PKR被用作一個(gè)具有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)能力的蛋白質(zhì)例子，但是應(yīng)該明白，可以使用其它的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子例如PMA、蛋白質(zhì)激酶C(PKC)誘導(dǎo)物、干擾素-γ、干擾素-α、干擾素-β、TNF-α、GM-CSF、EGF和PDGF，來取代PKR。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，通過提高細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子例如PKR的表達(dá)/活性，能夠?qū)⒓?xì)胞因子的生產(chǎn)水平提高。因而，將這樣的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物用于生產(chǎn)細(xì)胞因子，它們組成型地表達(dá)較高水平的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子，或者其中的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)可被誘導(dǎo)至更高水平。
該方法依賴于這樣可使用的細(xì)胞，它們過表達(dá)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的蛋白質(zhì)(細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子)，例如包括但不限于PKR，作為細(xì)胞因子的來源，除了一般使用了非微生物誘導(dǎo)物之外，而并不需要特定的方法來過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子。但是，在某些情況下，結(jié)合丁酸鈉處理、使用了例如病毒性誘導(dǎo)。
具體地，該方法包括(a)在能夠足夠地過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的條件下，培養(yǎng)具有過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子或其類似物或其同源物之能力的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和(b)合適地處理細(xì)胞培養(yǎng)物以誘導(dǎo)細(xì)胞因子基因的表達(dá)。
用于生產(chǎn)某一給定細(xì)胞因子的細(xì)胞能夠過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子，例如來自任何哺乳動(dòng)物源的PKR，諸如在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞、多種小鼠組織或人外周血液單核細(xì)胞中所通常發(fā)現(xiàn)的PKR。分別在相應(yīng)的鼠或人的細(xì)胞培養(yǎng)物中，優(yōu)選地將鼠p65激酶(Feng，G.S等人，1992)和最優(yōu)選地p68激酶(Meurs，E等人，1990；GenBank Accession No.NM 002759)過表達(dá)。
在某些情況下，被過表達(dá)的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子是天然細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的類似物，例如PKR的類似物諸如能夠介導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的dsRNA激活(通常是通過對編碼天然PKR蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行修飾而獲得)的非天然蛋白質(zhì)激酶。
具有過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子能力的哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以由本領(lǐng)域所公知的若干方法中的任何獲得，或者可以從商業(yè)來源物獲得。
用于獲得過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子細(xì)胞方法的實(shí)例包括選擇表達(dá)更高水平細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞，用編碼在啟動(dòng)子控制下的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，以及導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的表達(dá)比起正常水平來被提高的其它方法。
另外一些方法包括失活PKR-抑制因子p58或減低其水平，p58在正常情況下可抑制PKR的活性。p58的突變、修飾或靶向基因切除將導(dǎo)致PKR活性的增強(qiáng)(Barber，G.N.等人，1994)。
另一個(gè)例子包括能夠增強(qiáng)PKR表達(dá)的PKR之天然、合成或重組激活劑，例如，PKR激活劑蛋白質(zhì)、PACT(Patel，R.C和Sen，G.C.，1998)。
本發(fā)明提供了適于轉(zhuǎn)化人細(xì)胞的載體，例如，含有多核苷酸的重組表達(dá)載體，該多核苷酸編碼蛋白質(zhì)以有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)，而該蛋白質(zhì)與調(diào)節(jié)元件可操作地連接，從而使調(diào)節(jié)元件對該蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系中表達(dá)發(fā)揮作用。優(yōu)選的編碼序列包括p68(人)或p65(鼠)激酶的編碼序列。在一個(gè)相關(guān)的方面中，本發(fā)明包括含有載體的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的方法中，載體包含一個(gè)多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼蛋白質(zhì)，有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，而細(xì)胞因子又與另外的編碼序列諸如融合蛋白質(zhì)或信號肽編碼序列在一起，其中還結(jié)合有非編碼序列諸如內(nèi)含子和控制元件，諸如啟動(dòng)子和終止子元件或者5’和/或3’非翻譯區(qū)，這些非編碼序列對編碼序列在合適的宿主和/或在載體和宿主環(huán)境中表達(dá)起作用，而其中的編碼序列是異源基因?！爱愒碊NA”和“異源基因”就是指這樣的核苷酸，它們與將它們包含在其中的細(xì)胞或基因組的部分不是同源的。一般地，通過轉(zhuǎn)染、同源重組、顯微注射、電穿孔等，將這樣的核苷酸加入到細(xì)胞。表達(dá)載體也含有用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止子。載體也可以包含用于增強(qiáng)表達(dá)的合適的序列。另外，表達(dá)載體優(yōu)選地含有一種或多種選擇標(biāo)志基因，從而為選擇被轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞提供表型性狀。
對本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來講，已知有大量的合適載體和啟動(dòng)子，并可商業(yè)獲得。用于人細(xì)胞的合適的克隆和表達(dá)載體，在Sambrook等人(1989)的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(第二版)，冷泉港出版社(ColdSpring Harbor Press)，Plainview，N.Y.以及Ausubel FM等人現(xiàn)代分子生物學(xué)方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，New York，N.Y.中也有描述，此處特別引用作為參考。啟動(dòng)子的實(shí)例既包括組成型啟動(dòng)子又包括可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中的例子包括CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、EF-1α啟動(dòng)子、含有tet應(yīng)答元件(TRE)的啟動(dòng)子和金屬硫蛋白啟動(dòng)子。
可以將這樣的異源核酸序列，其中含有編碼有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的蛋白質(zhì)之編碼序列，包含在表達(dá)多肽的多種表達(dá)載體中的任何一種之內(nèi)。任何載體，只要能夠在引入載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制和存活，就都可以使用。可以通過多種方法將合適的DNA序列插入到載體中。一般地，是通過標(biāo)準(zhǔn)方法將DNA序列插入到合適的一種或多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)之中。這樣的方法以及相關(guān)的亞克隆方法，被認(rèn)為是在本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
可以將含有如上所述的合適DNA序列以及合適啟動(dòng)子或控制序列的載體，用于轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，以允許細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)，從而增強(qiáng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(1ipofectamine)或脂質(zhì)轉(zhuǎn)染-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔，可以將載體引入到宿主細(xì)胞中(Davis，L.，Dibner，M.和Battey，I.分子生物學(xué)基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)，1986)。為了長期、高產(chǎn)重組細(xì)胞因子，對穩(wěn)定表達(dá)予以優(yōu)選。因此，任何有效地產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的方法，均可以用于實(shí)施本發(fā)明。
本發(fā)明也提供了已經(jīng)用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。培養(yǎng)條件，諸如溫度、pH等，與前面所用的在選擇表達(dá)用宿主細(xì)胞時(shí)的那些條件相同，并且它們對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
用于表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的合適的克隆細(xì)胞系的例子，包括但不限于Namalwa、U937、Vero、MRC-5、WI-38細(xì)胞、Flow 1000細(xì)胞、Flow 4000細(xì)胞、FS-4和FS-7細(xì)胞、MG-63細(xì)胞、CCRT-SB細(xì)胞、CCRF-CEM細(xì)胞以及T98G細(xì)胞。用于表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的合適的初級細(xì)胞類型的例子，包括但不限于單核/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞、包括T-和B-細(xì)胞的淋巴細(xì)胞系的細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、成骨細(xì)胞衍生的細(xì)胞、黑素細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、多種其它免疫系統(tǒng)細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及源自這些細(xì)胞類型的腫瘤細(xì)胞。
優(yōu)選地，過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞培養(yǎng)物可誘導(dǎo)地過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子，從而調(diào)節(jié)可用于細(xì)胞因子誘導(dǎo)的因子的水平。
細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的過表達(dá)，是指高于正常水平的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子活性。細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的“正?！被钚曰虮磉_(dá)，是指細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的活性或表達(dá)的一個(gè)范圍，它一般在這樣的給定細(xì)胞類型中觀察到，該細(xì)胞類型還沒有用編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的載體轉(zhuǎn)染、沒有受到刺激(沒有受到誘導(dǎo)或被引發(fā))和感染。應(yīng)當(dāng)明白，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的正?；钚苑秶鷷S特定的因子、細(xì)胞類型而變化，并且對于某一給定的細(xì)胞類型也會隨培養(yǎng)條件的變化而有所不同。
高于正常水平含義是它為在采用特定培養(yǎng)條件下的一給定細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子之正常水平的優(yōu)選地至少150％、更優(yōu)選地至少200％或300％、最優(yōu)選地至少500％。過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞培養(yǎng)物可以是組成型地過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子或者可誘導(dǎo)型地過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子。
在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子是PKR，過表達(dá)PKR的細(xì)胞培養(yǎng)物可誘導(dǎo)型地過表達(dá)PKR，從而調(diào)節(jié)可用于誘導(dǎo)細(xì)胞因子的PKR水平。若干已知的細(xì)胞類型中的任何，都可以用于產(chǎn)生過表達(dá)PKR的細(xì)胞系，并且上面已給出了一些特定例子。
通過本領(lǐng)域公知的方法，能夠確定某一給定細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的活性。作為例子，PKR表達(dá)的測定法包括自體磷酸化測定法、eIF2α磷酸化測定法、蛋白質(zhì)水平Western印跡分析以及Northern印跡分析和PKR mRNA的逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。
一般地，需要采取添加步驟，以增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)。這樣的步驟包括一次或多次(1)在能夠有效地增強(qiáng)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)的條件下，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞，(2)用包括但不限于多肽、化學(xué)物質(zhì)或者核酸在內(nèi)的試劑，引發(fā)表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞，以及(3)處理表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的細(xì)胞，以誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生(誘導(dǎo))。
引發(fā)可以包括用引發(fā)劑例如乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)和其它佛波醇酯類、鈣離子載體類、干擾素-α、干擾素-γ、干擾素-β、G-CSF、GM-CSF、PDGF、TGF、EGF、丁酸鈉、激酶激活劑或轉(zhuǎn)錄激活劑來處理。
處理可以包括將微生物性(即，病毒性的)或非微生物性的誘導(dǎo)物添加于細(xì)胞培養(yǎng)物。一般地，誘導(dǎo)物是非微生物性誘導(dǎo)物，例如，poly(I)∶poly(C)或者poly r(I)∶poly r(C)。
一般地，優(yōu)選U937細(xì)胞，用于生產(chǎn)FGF和sTNF-R；優(yōu)選Jurkat細(xì)胞用于生產(chǎn)IL-3和TNF-β；優(yōu)選成纖維細(xì)胞用于生產(chǎn)FGF和制管張素(angiostatin)；優(yōu)選U937細(xì)胞用于生產(chǎn)IL-6及其類似物；優(yōu)選包括Jurkat和HUT在內(nèi)的CD-4表達(dá)細(xì)胞用于生產(chǎn)TNF-β；以及優(yōu)選包括Jurkat及Namalwa在內(nèi)的T-與B-細(xì)胞用于生產(chǎn)IL-8及其類似物。
一旦實(shí)現(xiàn)了某一給定細(xì)胞因子的增加表達(dá)，就可以將如此產(chǎn)生的細(xì)胞因子從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化出來。適用于這樣的純化方法包括如下抗體-親和柱層析，離子交換層析；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅膠或陽離子-交換樹脂諸如DEAE上的層析；聚焦層析；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；以及使用了例如Sephadex G-75的凝膠過濾?？梢圆捎眉兓鞍踪|(zhì)的多種方法，這樣的方法為本領(lǐng)域所公知，并且在例如Deutscher的酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)第182卷，1990；Scopes的蛋白質(zhì)純化原理與實(shí)踐(Protein PurificationPrinciples and Practice)，Springer-Verlag，New York，1982中予以了描述。所選擇的純化步驟將取決于，例如，所采用的生產(chǎn)方法以及所產(chǎn)生的特定細(xì)胞因子的特性。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面中，將培養(yǎng)條件、引發(fā)和處理結(jié)合起來，導(dǎo)致細(xì)胞因子產(chǎn)生的顯著增加，例如，至少增加2.5倍，優(yōu)選地增加10倍或更多。在某些情況下，本發(fā)明的方法導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加100到1000倍或更高。
在細(xì)胞培養(yǎng)中，一般與細(xì)胞因子產(chǎn)生相關(guān)的問題，例如非重組哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的低產(chǎn)率、微生物系統(tǒng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的不恰當(dāng)糖基化或誤折疊，在本發(fā)明的方法中被消除，這必將會對開發(fā)治療性蛋白質(zhì)發(fā)揮作用。III.細(xì)胞因子細(xì)胞因子是通過與它們的同族受體結(jié)合，隨后通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而導(dǎo)致對多種生化過程的刺激，從而激發(fā)出它們的生物學(xué)活性。在某些情況下，這些受體的表達(dá)受到特定信號的調(diào)節(jié)，例如細(xì)胞因子也許參與了正或負(fù)反饋回路，從而調(diào)節(jié)針對同一或不同細(xì)胞因子的受體的表達(dá)。這些受體可以是產(chǎn)生細(xì)胞因子的同一類型細(xì)胞或者是不同類型細(xì)胞。
細(xì)胞因子的作用是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫和炎癥應(yīng)答。一般地，細(xì)胞因子的產(chǎn)生是短暫的，并且其產(chǎn)生是發(fā)生在很短的轉(zhuǎn)錄期間，生成壽命也很短的mRNA轉(zhuǎn)錄本并隨后接受轉(zhuǎn)錄后控制機(jī)制。最近的研究已經(jīng)指出，多種細(xì)胞因子都采用了一種相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即“Jak/STAT”途徑(Abbas，AK等人，1997)。
應(yīng)當(dāng)意識到，來自細(xì)胞的細(xì)胞因子，各自具有其不同的特性，并且每種都能夠由多種廣泛不同的細(xì)胞類型產(chǎn)生。另外，一種給定的細(xì)胞因子(1)可以作用于多于一種類型的細(xì)胞，(2)對于同一細(xì)胞可以具有多于一種效應(yīng)，(3)可以具有與另一種細(xì)胞因子共享的活性，和(4)通過例如拮抗或協(xié)同其效應(yīng)，可以影響其它細(xì)胞因子的合成或效應(yīng)。
已經(jīng)觀察到重組的可溶性腫瘤壞死因子受體(sTNF-R)中和TNF并具有抗炎性質(zhì)。
sTNF-R目前是以重組蛋白質(zhì)的形式被生產(chǎn)。
用于產(chǎn)生sTNF-R的靶細(xì)胞包括單核/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
sTNF-R的臨床用途包括應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和膿毒癥以及多種研究性用途。
已知白細(xì)胞介素-2(IL-2)或“T-細(xì)胞生長因子”促進(jìn)T-細(xì)胞的生長和功能。當(dāng)用某些有絲分裂原刺激或者使T-細(xì)胞受體復(fù)合物與抗原/MHC復(fù)合物在抗原遞呈細(xì)胞的表面相互作用，而將T-輔助淋巴細(xì)胞激活時(shí)，IL-2以及IL-2受體被誘導(dǎo)出來，導(dǎo)致抗原特異T-細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增(見，例如，Smith，KA，1988；Dinarello，1994)。
目前，通過在多種不同類型的細(xì)胞中表達(dá)重組的IL-2，來生產(chǎn)IL-2。
用于生產(chǎn)IL-2的靶細(xì)胞包括T-細(xì)胞在內(nèi)。
IL-2的臨床用途包括抗癌和抗HIV應(yīng)用，以及多種研究性用途。
白細(xì)胞介素3(IL-3)作為一種刺激因子，參與若干類型的造血細(xì)胞形成，其中包括粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨核細(xì)胞和紅系細(xì)胞。
已觀察到IL-3對骨髓(BM)干細(xì)胞具有多種造血效應(yīng)，IL-3比G-CSF具有更多效應(yīng)。
目前在采用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)IL-3。
用于產(chǎn)生IL-3的靶細(xì)胞包括T-細(xì)胞和肥大細(xì)胞。
IL-3的臨床用途包括應(yīng)用于(1)T-和干細(xì)胞的離體擴(kuò)增，(2)體內(nèi)骨髓移植后，(3)骨髓衰竭(化療)，(4)血液不調(diào)和(5)各類血細(xì)胞減少癥，此外還有多種研究用途。
白細(xì)胞介素4(IL-4)，也稱為B細(xì)胞刺激因子或BSF-1，已觀察到它具有多種生物學(xué)效應(yīng)，其中包括(1)T-細(xì)胞、肥大細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞和紅細(xì)胞的共刺激，(2)誘導(dǎo)II型主要組織相容性復(fù)合物分子在靜息B細(xì)胞上的表達(dá)，(3)增強(qiáng)受刺激的B細(xì)胞分泌IgE和同型IgG1，和(4)抗炎癥特性。
已觀察到IL-4對II型輔助T-細(xì)胞(TH2)應(yīng)答具有效應(yīng)并且具有抗生長特性。
目前通過表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)IL-4。
用于產(chǎn)生IL-4的靶細(xì)胞包括T-細(xì)胞和肥大細(xì)胞。
IL-4的臨床用途包括應(yīng)用于干細(xì)胞的離體擴(kuò)增、抗癌癥策略以及治療實(shí)體腫瘤，此外還有多種研究用途。
白細(xì)胞介素5(IL-5)被認(rèn)為對抑制變態(tài)反應(yīng)性應(yīng)答以及抑制嗜酸性粒細(xì)胞有效應(yīng)。
目前通過表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)IL-5。
用于產(chǎn)生IL-5的靶細(xì)胞包括T-細(xì)胞和肥大細(xì)胞。
IL-4的臨床用途包括應(yīng)用于治療哮喘，此外還有多種研究用途。
白細(xì)胞介素6(IL-6)是一種多功能的細(xì)胞因子，由多種類型細(xì)胞產(chǎn)生，并且作為分化和生長因子作用于多種類型細(xì)胞，其中包括免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、造血雄蕊細(xì)胞(hematopoietic staminalcells)、角質(zhì)形成細(xì)胞和神經(jīng)元。
已觀察到IL-6在發(fā)炎中扮演了角色并具有抗生長特性。
目前通過表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)IL-6。
用于產(chǎn)生IL-6的靶細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、T-細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
IL-6的臨床用途包括應(yīng)用于治療乳癌和白血病，并且IL-6的抗炎癥特性也許在治療多種感染性疾病以及血栓形成障礙中有用途，此外還有多種研究用途。
白細(xì)胞介素7(IL-7)，以前稱為“淋巴細(xì)胞生成素-1”，最初是根據(jù)它能夠刺激源自長期骨髓培養(yǎng)物的前-B細(xì)胞(B220+細(xì)胞)增殖而定義的(Whitlock等人，1984)。已觀察到IL-7能夠刺激骨髓中B-和T-細(xì)胞的祖先生長，并在(1)皮膚中的細(xì)胞因子合成，(2)細(xì)胞毒T-淋巴細(xì)胞(CTL)活性的增加，和(3)天然殺傷(NK)細(xì)胞活性的增加中扮演角色。
目前通過表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)IL-7。
用于產(chǎn)生IL-7的靶細(xì)胞包括骨髓細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞。
IL-7的臨床用途包括應(yīng)用于治療黑素瘤，此外還有多種研究用途。
白細(xì)胞介素8(IL-8)是一種趨化性細(xì)胞因子，能夠引起人嗜中性粒細(xì)胞的去顆?；?，并由角質(zhì)形成細(xì)胞、上皮細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、肝細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，已知IL-8的生物學(xué)效應(yīng)是通過七次跨膜結(jié)構(gòu)域、G-蛋白-偶聯(lián)的受體所介導(dǎo)。
已觀察到IL-8是CXC趨化因子家族的一員，并具有趨化和生血管特性。
目前通過表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)IL-8。
用于產(chǎn)生IL-8的靶細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、T-細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
盡管IL-8的臨床研究還沒有完成，預(yù)計(jì)其用途包括應(yīng)用于細(xì)菌和病毒感染、癌癥治療和促進(jìn)血管生長，此外還有多種研究用途。
腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和腫瘤壞死因子-β(TNF-β；淋巴毒素)，主要是分別通過巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞而產(chǎn)生的。TNF-α具有多種生物學(xué)功能，其中包括移植性腫瘤的出血性壞死、細(xì)胞毒性、在內(nèi)毒素休克和在炎癥中的重要角色、免疫調(diào)節(jié)、增殖和抗病毒應(yīng)答。TNF-α和TNF-β共享相似的生物學(xué)活性譜。TNF-β對腫瘤性質(zhì)的細(xì)胞系表現(xiàn)出抗細(xì)胞活性，但是對初級細(xì)胞培養(yǎng)物和正常細(xì)胞系沒有抗細(xì)胞活性，這就提示它具有潛在的抗腫瘤活性。TNF-β在淋巴器官的發(fā)育中也扮演了重要的角色。TNF-α和TNF-β與相同的細(xì)胞表面受體結(jié)合，這與它們具有相似的活性相一致。
TNF-α和TNF-β的臨床用途包括應(yīng)用于抗-癌癥，尤其是與其它化療試劑或基因治療聯(lián)合起來使用。聯(lián)合治療可能是重要的，這樣，就可以只施用相當(dāng)?shù)蛣┝康腡NF(美國專利5976800，公開于11/2/99)。這些因子也許對于治療患有包括黑素瘤、骨肉瘤乳癌和淋巴瘤在內(nèi)的彌漫性腫瘤患者有用途。
粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，已觀察到它刺激嗜中性粒細(xì)胞前體的增殖和分化，并且在粒細(xì)胞的成熟和氧化性裂解中扮演了角色。
目前通過在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)G-CSF。
用于產(chǎn)生G-CSF的靶細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
G-CSF的臨床用途包括應(yīng)用于治療化療后的各類血細(xì)胞減少癥，骨髓移植后的治療，以及多種研究用途。
粒細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，已觀察到它能夠刺激粒細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞從它們的前體細(xì)胞產(chǎn)生克隆，并促進(jìn)多能祖先細(xì)胞的生長和分化。另外，GM-CSF看起來在粒細(xì)胞和巨嗜細(xì)胞的功能中扮演了效應(yīng)子角色。
目前通過在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)GM-CSF。
用于產(chǎn)生GM-CSF的靶細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和T-細(xì)胞。
GM-CSF的臨床用途包括廣泛應(yīng)用于治療化療后的各類血細(xì)胞減少癥，骨髓移植后的治療，以及多種研究用途。
成纖維細(xì)胞生因子(FGF)，已觀察到酸性和堿性兩種形式均在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞增殖中扮演角色。對培養(yǎng)物中重組FGF-5的研究顯示，它能夠促進(jìn)培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活，這表明FGF-5是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)營養(yǎng)因子。
目前通過表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)FGF。
用于產(chǎn)生FGF的靶細(xì)胞包括成血小板、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
FGF的用途包括應(yīng)用于治療缺血性心臟病、充血性心臟衰竭和多種涉及炎癥應(yīng)答的疾病，以及多種研究用途。
血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，是一種血管生成生長因子，它具有包括血管生成、氧化氮-介導(dǎo)的血管舒張、增加血管通透性、增加內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及游動(dòng)性在內(nèi)的多種生理效應(yīng)。已觀察到VEGF的表達(dá)被局部缺血顯著地去調(diào)節(jié)。
目前通過在細(xì)菌和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)VEGF。
用于產(chǎn)生VEGF的靶細(xì)胞包括多種免疫細(xì)胞。
VEGF的用途包括應(yīng)用于治療充血性心臟衰竭，以及多種研究用途。
血小板衍生的生長因子(PDGF-1和PDGF-2)，已觀察到它們作為生長因子而起作用并在血管生成中扮演了角色。已表明，純化后的人血小板衍生的生長因子(PDGF)是間充質(zhì)衍生的培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂原，并作為單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的趨化吸附劑起作用。
在體內(nèi)，PDGF存在于血小板的α顆粒以及內(nèi)皮細(xì)胞中，并且已表明它具有愈傷特性。
目前通過表達(dá)重組蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)PDGF-1和PDGF-2。
用于產(chǎn)生PDGF-1和PDGF-2的靶細(xì)胞包括血小板、內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
PDGF-1和PDGF-2的臨床用途包括應(yīng)用于治療缺血性心臟病，以及多種研究用途。
制管張素和內(nèi)皮抑素，已觀察到它們在抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長中扮演了角色。已觀察到制管張素和內(nèi)皮抑素在攜帶腫瘤動(dòng)物中作為血管生成的抑制劑起作用(Lannutti BJ等人，1997；O’Reilly MS等人，1997)。
用于產(chǎn)生制管張素和內(nèi)皮抑素的靶細(xì)胞包括多種免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。
制管張素和內(nèi)皮抑素的用途包括應(yīng)用于癌癥治療，以及多種研究用途。
另外一些細(xì)胞因子通過使用本發(fā)明的方法可以將其他示范性細(xì)胞因子的表達(dá)提高，這些示范性細(xì)胞因子包括但不限于上面提到的細(xì)胞因子的其它家族成員，諸如IL-6家族成員制瘤素M；IL-11，白血病抑制因子(LIF)；纖毛性神經(jīng)營養(yǎng)因子和心臟營養(yǎng)因子。另外，上面提到的細(xì)胞因子的同族受體，諸如TNF可溶性受體(sTNF-R)、Fas可溶性受體(sFas)以及IL-6家族受體可溶性糖蛋白130(gp130)，其表達(dá)可以被提高。通過使用本發(fā)明的方法可以將另外一些示范性細(xì)胞因子的表達(dá)提高，這些細(xì)胞因子的實(shí)例包括但不限于這樣一些細(xì)胞因子，它們的基因被PKR激活的轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)，其中包括NF-κB、IRF-1，3和7，以及Stat家族成員。IV.PKR在一個(gè)方法實(shí)例中，PKR是用于增強(qiáng)細(xì)胞因子產(chǎn)生的因子，并且用于實(shí)施本發(fā)明方法的細(xì)胞具有產(chǎn)生PKR的能力并在沒有被修飾時(shí)產(chǎn)生基線水平的PKR。
在一些情況下，通過測量PKR的自體磷酸化活性或者在磷酸化底物中的激酶活性，優(yōu)選地底物為真核細(xì)胞起始因子-2α(eIF-2α)或者另一種因子諸如核因子-кB(NF-кB)(Link等人，生物化學(xué)雜志(J.Bio.Chem.)267卷，239頁，1992)，或者通過生化測試，諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或用PKR專一性抗體進(jìn)行Weatern印跡，可以直接評價(jià)PKR的活性。
可以采用若干方法來增強(qiáng)PKR的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，采用包含編碼PKR序列，該序列有效地與啟動(dòng)子連接，以及含有在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)PKR所必需的控制序列的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染具有產(chǎn)生某一給定細(xì)胞因子能力的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，增強(qiáng)了PKR的表達(dá)。
可以將用編碼PKR的核苷酸序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，在適于在細(xì)胞中表達(dá)所編碼的PKR的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。正如本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所理解，能夠?qū)芯幋aPKR的多核苷酸的表達(dá)載體進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得由重組細(xì)胞所產(chǎn)生的PKR可以被分泌出來、結(jié)合到膜上或者包含在細(xì)胞內(nèi)，這取決于所使用的序列和/或載體。
在一些情況下，可以采取添加步驟以增強(qiáng)被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞表達(dá)PKR。這樣的步驟包括一次或多次(1)在能夠有效地增強(qiáng)PKR表達(dá)的條件下，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，(2)引發(fā)PKR-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以及(3)正如下面所進(jìn)一步描述，處理PKR-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將培養(yǎng)條件、引發(fā)和處理結(jié)合起來，導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生被顯著地增強(qiáng)，例如，至少2.5倍以及優(yōu)選地至少10倍的增加或者更多。在一些情況下，本發(fā)明的方法所導(dǎo)致的細(xì)胞因子產(chǎn)生的增加，為100至1000倍或者更高。V.細(xì)胞因子表達(dá)的評價(jià)為了對由過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子細(xì)胞系表達(dá)目的細(xì)胞因子進(jìn)行評價(jià)，可以在蛋白質(zhì)水平、RNA水平或者通過使用專門針對被表達(dá)的各個(gè)細(xì)胞因子的功能性生物測定法，進(jìn)行測定。
通過采用由本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員日常所使用的方法，可以進(jìn)行針對某一目的細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的免疫測定。這樣的免疫測定可用于定性和定量分析目的細(xì)胞因子的表達(dá)。
目的被關(guān)注的細(xì)胞因子的純化形式可以從天然來源物獲得，或者在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中重組產(chǎn)生并使用蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化。接著可以將純化的蛋白質(zhì)用于產(chǎn)生對所表達(dá)的蛋白質(zhì)特異的單克隆或多克隆抗體，然后就可以將這些抗體用于多種免疫測定(見，例如，Harlow和Lane，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港出版社，N.Y.，1988)。示范性的測定法包括ELISA、競爭性免疫測定法、放射性免疫測定法、Western印跡、間接免疫熒光測定法等。
一般地，這樣的抗體可商業(yè)獲得?？缮虡I(yè)獲得的細(xì)胞因子分析試劑盒一般用于已知細(xì)胞因子的表達(dá)水平的定量免疫測定。
在下面的實(shí)施例中，給出了上面所描述的操作步驟的具體例子。但是，對其進(jìn)行許多修改是非常可能的，這對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯而易見的，而且提供實(shí)施例的目的只是為了闡明，并不是為了限制本發(fā)明，除非特別指出。
實(shí)施例1過表達(dá)PKR的Namalwa細(xì)胞系的制備將編碼人的全長PKR分子的cDNA(551個(gè)氨基酸；Meurs，E等人，1990；GenBank Accession No.NM 002759)插入到真核細(xì)胞表達(dá)載體中，這樣做，使得PKR編碼序列在CMV啟動(dòng)子的控制下得到表達(dá)。該載體含有適于PKR轉(zhuǎn)錄的多種特性，其中包括i)來自人CMV(巨細(xì)胞病毒)立即早期基因的啟動(dòng)子序列，用于高水平mRNA表達(dá)；ii)來自β-球蛋白基因的多腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列，以增強(qiáng)RNA的穩(wěn)定性；iii)氨芐青霉素抗性基因；和iv)ColE1復(fù)制起點(diǎn)，用于在大腸桿菌(E.coli.)中的選擇和保持。第二種載體含有氨芐青霉素抗性基因和ColE1起點(diǎn)用于在大腸桿菌中的選擇和保持，以及G418抗性標(biāo)記(Neo)以便在共轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中后能夠?qū)υ撡|(zhì)粒進(jìn)行選擇和鑒定。
用15μg表達(dá)PKR的質(zhì)粒和15μg含有Neo的載體，在DMEM/F12(+10％FBS)中，采用Gene Pulser裝置(Bio-Rad)，在設(shè)定800μF、300V的條件下，電穿孔4×106個(gè)對數(shù)生長的Namalwa細(xì)胞。采用2mg/ml的基因菌素(geneticin)(Gibco-BRL)進(jìn)行選擇3-4周，獲得了大量穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子。通過有限稀釋性克隆化，隨后獲得了克隆系。對親代和PKR-轉(zhuǎn)染的Namalwa細(xì)胞中的PKR水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于親代Namalwa細(xì)胞，在PKR-轉(zhuǎn)染子中PKR的水平已提高了大約16倍。
將一個(gè)具有代表性的過表達(dá)PKR和克隆化的Namalwa細(xì)胞系選擇出來，將其指定為2A1.D1.G7。
在補(bǔ)充了10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于2.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升下培養(yǎng)2A1.D1.G7和親代Namalwa細(xì)胞。將細(xì)胞用20nM的PMA處理(引發(fā))20小時(shí)，然后用200μg/ml的poly r(I)∶poly r(C)處理(誘導(dǎo))3天。其中有一組細(xì)胞沒有作處理(未誘導(dǎo)的對照)。在處理之后，收集培養(yǎng)上清液，采用ELISA，根據(jù)ELISA試劑盒供應(yīng)商(R&DSystems)所提供的方法，分析其中的白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)和TNF-β的水平。
IL-6在多種條件下的產(chǎn)生情況見
圖1。在不存在引發(fā)劑(PMA)以及誘導(dǎo)劑〖poly r(I)∶poly r(C)〗時(shí)，親代Namalwa和2A1.D1.G7均不產(chǎn)生IL-6。用PMA和poly r(I)∶poly r(C)處理親代Namalwa細(xì)胞也沒有產(chǎn)生出可檢測水平的IL-6(所用測定法的最低可檢測水平為3pg/ml)。相比之下，用PMA和poly r(I)∶poly r(C)處理的2A1.D1.G7產(chǎn)生出高于300 pg/ml的IL-6。這就意味著，相對于未受處理的2A1.D1.G7以及用PMA和poly r(I)∶poly r(C)處理的親代Namalwa細(xì)胞，IL-6的產(chǎn)生提高了至少100倍。此外，過表達(dá)PKR的其它幾個(gè)克隆化的細(xì)胞系，在PMA和poly r(I)∶poly r(C)處理后，產(chǎn)生高于300 pg/ml的IL-6(數(shù)據(jù)未給出)。這些結(jié)果表示在Namalwa細(xì)胞中過表達(dá)PKR基因并隨后引發(fā)和激活，導(dǎo)致IL-6的過表達(dá)。
IL-8在多種條件下的產(chǎn)生情況見圖2。與所得到的針對IL-6的結(jié)果相一致，在不存在引發(fā)劑(PMA)以及誘導(dǎo)劑〖poly r(I)∶poly r(C)〗時(shí)，親代Namalwa和2A1.D1.G7均不產(chǎn)生IL-8。用PMA和poly r(I)∶polyr(C)處理親代Namalwa細(xì)胞也沒有產(chǎn)生出可檢測水平的IL-8(所用測定法的最低可檢測水平為31pg/ml)。相比之下，用PMA和poly r(I)∶polyr(C)處理的2A1.D1.G7產(chǎn)生出大約300 pg/ml的IL-8，這就意味著，相對于未受處理的細(xì)胞以及用PMA和poly r(I)∶poly r(C)處理的親代Namalwa細(xì)胞，提高了至少10倍。此外，過表達(dá)PKR的其它幾個(gè)克隆化的細(xì)胞系，在PMA和poly r(I)∶poly r(C)處理后，產(chǎn)生250-470 pg/ml的IL-8(數(shù)據(jù)未給出)。
TNF-β在多種條件下的產(chǎn)生情況見圖3。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在不存在引發(fā)劑和誘導(dǎo)劑時(shí)，親代Namalwa和2A1.D1.G7均不產(chǎn)生TNF-β。然而，在引發(fā)和誘導(dǎo)后，親代Namalwa細(xì)胞產(chǎn)生出大約800 pg/ml的TNF-β，而2A1.D1.G7細(xì)胞系產(chǎn)生出高于2000 pg/ml的TNF-β。在用PMA和poly r(I)∶poly r(C)處理后，過表達(dá)PKR的細(xì)胞系比親代細(xì)胞系又一次產(chǎn)生出更多的細(xì)胞因子(大約提高了2.5倍)。另外，過表達(dá)PKR的其它幾個(gè)克隆化的細(xì)胞系，在PMA和poly r(I)∶poly r(C)處理后，產(chǎn)生高于2000 pg/ml的TNF-β(數(shù)據(jù)未給出)。
本文所給出的結(jié)果表明，本發(fā)明提供了用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中增強(qiáng)細(xì)胞因子產(chǎn)生的有效方法。
權(quán)利要求
1.一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生細(xì)胞因子的方法，它包括(a)培養(yǎng)具有產(chǎn)生細(xì)胞因子能力的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系；(b)以在細(xì)胞系中有效地導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子過表達(dá)的方式，修飾所說的培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，其中在所說的細(xì)胞系中獲得了高于正常水平的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)能力的因子；(b)處理所說的培養(yǎng)的、過表達(dá)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，從而使細(xì)胞因子有效地產(chǎn)生；和(c)收集由培養(yǎng)的、經(jīng)處理的細(xì)胞系產(chǎn)生的所說的細(xì)胞因子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子是PKR。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所說的修飾是指在導(dǎo)致細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子在所說的被轉(zhuǎn)染細(xì)胞中過表達(dá)的條件下，用含有編碼細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的與啟動(dòng)子可操作地連接的DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所說的培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所說的處理包括引發(fā)步驟。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所說的處理進(jìn)一步地包括誘導(dǎo)步驟。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所說的引發(fā)是通過用佛波酯處理完成的。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所說的誘導(dǎo)是通過用poly r(I)∶poly r(C)處理完成的。
8.權(quán)利要求2的方法，其中所說的細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子β(TNF-β)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所說的啟動(dòng)子是可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所說的可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是金屬硫蛋白啟動(dòng)子或者四環(huán)素(TRE)啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所說的啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。
12.權(quán)利要求8的方法，其中所說的細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素6(IL-6)，并且哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是Namalwa。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所說的細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素8(IL-8)，并且哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是Namalwa。
14.權(quán)利要求8的方法，其中所說的細(xì)胞因子是腫瘤壞死因子β(TNF-β)，并且哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是Namalwa。
15.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的組合物，其特征在于PKR的高于正常表達(dá)以及白細(xì)胞介素6(IL-6)的高于正常表達(dá)。
16.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的組合物，其特征在于PKR的高于正常表達(dá)以及白細(xì)胞介素8(IL-8)的高于正常表達(dá)。
17.一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的組合物，其特征在于PKR的高于正常表達(dá)以及腫瘤壞死因子β(TNF-β)的高于正常表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中，通過修飾細(xì)胞中的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子的水平，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平被增強(qiáng)的方法。本發(fā)明進(jìn)一步地涉及這樣的細(xì)胞系，它們表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)因子表達(dá)和增強(qiáng)的細(xì)胞因子表達(dá)。
文檔編號C12N15/67GK1399681SQ00809023
公開日2003年2月26日 申請日期2000年6月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月15日
發(fā)明者A·S·勞, L·布朗寧 申請人:基因特羅生物治療公司