專利名稱：頭部創(chuàng)傷誘導(dǎo)的胞質(zhì)鈣結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類急性神經(jīng)元的誘導(dǎo)的鈣結(jié)合蛋白和鑒定及編碼該蛋白質(zhì)的多聚核苷酸(ANIC-BP)。本發(fā)明還提供了表達(dá)載體，宿主細(xì)胞和抗體。此外，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的方法及治療和預(yù)防與該蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)的疾病。本發(fā)明還涉及抑制或者激活這種多聚核苷酸和多肽的作用。
背景技術(shù)：
中風(fēng)和急性頭部創(chuàng)傷，多發(fā)性硬化以及脊髓傷害是迄今為止沒有任何現(xiàn)成療法的疾病。中風(fēng)是第三大死亡原因，對患者以及社會負(fù)擔(dān)巨大。如果發(fā)生占中風(fēng)大部分的局部中風(fēng)的話，腦部血管堵塞是初發(fā)事件。頭創(chuàng)傷事故是西方世界年青人的主要疾病，很少數(shù)量的病人受由機(jī)械撞擊和動脈破裂引起的出血性中風(fēng)的影響，一個(gè)共有的特征是批準(zhǔn)的藥物很少可供使用。當(dāng)前可供使用的治療方法是建立在病理生理概念之上的，該概念來源于病灶性大腦局部缺血的實(shí)驗(yàn)工作。這些方法包括動脈再造管術(shù)，對炎癥過程的抑制和神經(jīng)保護(hù)的藥理學(xué)策略。用動脈再灌注策略的進(jìn)一步研究正在進(jìn)行之中。正在完成用依賴于多形核白細(xì)胞的內(nèi)皮粘連受體拮抗藥的早期臨床研究，但尚需提出策略。然而，只解決局部缺血級聯(lián)過程中單一步驟的任何策略可能僅僅產(chǎn)生一個(gè)不大的療效。因此，未來的療法最適當(dāng)?shù)貙⒒诮Y(jié)合療法。低劑量的乙酰水楊酸和釋放改進(jìn)的雙嘧達(dá)氨醇的結(jié)合在中風(fēng)的次級預(yù)防中已表明具有累加效應(yīng)。(Tijssen等.國際臨床學(xué)業(yè)者雜志增刊。91，14-16，1997)。目前提出的供臨床評價(jià)的另一組合是tPA加上一種有效的神經(jīng)保護(hù)因子。然而，這些研究的結(jié)果還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不是非常有效的。因此，急需了解更多的病理生理機(jī)制以便提供藥物目標(biāo)，該目標(biāo)可被用來研制新的藥物和建立更通用的治療患有急性神經(jīng)損傷和疾病如多發(fā)性硬化的患者的方法。
本發(fā)明確實(shí)是集中于Ca2+鈣結(jié)合蛋白質(zhì)，因?yàn)閷a2+結(jié)合蛋白質(zhì)在神經(jīng)保護(hù)中的作用有大量的證據(jù)。雖然鈣結(jié)合蛋白質(zhì)(CaBPs)的精確功能還不肯定，但已提出了鈣結(jié)合蛋白的作用是可緩沖細(xì)胞間Ca2+的水平(濃度)。由于鈣離子的過度負(fù)荷激活了導(dǎo)致蛋白水解作用和線粒體功能紊亂的生化過程，鈣結(jié)合蛋白的這一緩沖能力對興奮中毒的神經(jīng)元損傷可能有保護(hù)效果(Heizmann等TINS，15，259-64，1992)。存在各種各樣的證據(jù)，支持鈣結(jié)合蛋白的這一假設(shè)的、在鈣水平的調(diào)節(jié)中和神經(jīng)保護(hù)中的作用。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的(小白蛋白(pavalbumin)，鈣結(jié)合蛋白-D28K，和鈣視網(wǎng)膜蛋白)主要Ca2+結(jié)合蛋白(CaBPs)在各種神經(jīng)元群體中具有十分不尋常的和選擇性的表達(dá)模式。在確實(shí)表達(dá)CaBPs的神經(jīng)元中，大部分只表達(dá)一種類型，雖然少量的神經(jīng)元表達(dá)不止一種的主要鈣結(jié)合蛋白。有不斷增加的證據(jù)表明，在特殊的細(xì)胞類型中，存在或者缺乏鈣結(jié)合蛋白(CaBPs)是構(gòu)成被稱為選擇易受傷性這一現(xiàn)象的基礎(chǔ)。選擇易受傷性是一種特殊類型的神經(jīng)元對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷反應(yīng)而死亡的性質(zhì)。例如，CA1海馬神經(jīng)元是有選擇地易受球面局部缺血的損傷，小腦浦肯野氏(purkinje)細(xì)胞有選擇地易受頭部創(chuàng)傷，中風(fēng)，胎兒酒精暴露的損傷，同時(shí)在黑質(zhì)中的神經(jīng)元在帕金森疾病中是有選擇地易受損傷的。已經(jīng)努力地把選擇性的神經(jīng)元易受傷性與各種CaBPs表達(dá)模式聯(lián)系起來，有些作者報(bào)告在選擇性地易受損傷的神經(jīng)元的群體中發(fā)現(xiàn)了高濃度的CaBPs，而其它則報(bào)告對損傷選擇性抵抗的神經(jīng)元群體中有較高濃度的CaBP。例如，據(jù)報(bào)導(dǎo)，高水平表達(dá)的小白蛋白(parvalbumin)的神經(jīng)元選擇性地易受AMPA-誘導(dǎo)的毒性的損傷(Weiss等.神經(jīng)學(xué)，40，1288-1292，1990)，而表達(dá)高水平的鈣結(jié)合蛋白-D28K的培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元據(jù)報(bào)導(dǎo)對谷氨酸誘導(dǎo)的毒性有選擇性的抵抗性(Baimbridge等.TINS，15，303-8，1992)。類似地，表達(dá)高水平的鈣視網(wǎng)膜蛋白的海馬神經(jīng)元能抵抗有毒性劑量的興奮毒素谷氨酸，NMDA，紅藻酸和使君子氨酸((Winsky等，在《新的鈣結(jié)合蛋白質(zhì)》中，277-300，1991)。
CaBPs也被發(fā)現(xiàn)在各種CNS疾病狀態(tài)下的表達(dá)被改變，但是，關(guān)于CaBP的表達(dá)是否與選擇性的易受傷性或?qū)Φ倪x擇性的抵抗性有關(guān)，結(jié)果也不一致。表達(dá)鈣結(jié)合蛋白-D28K的神經(jīng)元據(jù)報(bào)導(dǎo)在阿爾茨海默(Alzheimers)病中(lacopino等，PNAS，87，4078-82，1990，Hof等，實(shí)驗(yàn)神經(jīng)學(xué)，111，293-301，1991)和亨廷頓舞蹈(Huntington)病中(Kiyama等.大腦研究，526，303-07，1990)是有選擇地易受損傷的，雖然在帕金森病中，在黑質(zhì)中的表達(dá)鈣結(jié)合蛋白-D28K的神經(jīng)元不是有選擇地易受損傷的(Yamada等.大腦研究，526，303-07，1990)。在球面局部缺血的沙土鼠模型中，一定的海馬細(xì)胞類型中小白蛋白的存在表明了與存活呈正相關(guān)(Tortosa等.神經(jīng)科學(xué).1，33-43，1993)，雖然其它的研究提出表達(dá)海馬神經(jīng)元的小白蛋白在阿爾茨海默(Alzheimer)病中是有選擇地易受損傷的(Brady等.神經(jīng)科學(xué)，80，1113-25，1997)。
鈣結(jié)合蛋白基因失效的小鼠表現(xiàn)出功能缺陷(例如共濟(jì)失調(diào))，表明正常表達(dá)這一CaBP的神經(jīng)元中的嚴(yán)重功能失調(diào)(例如，小腦浦肯野細(xì)胞)，盡管這些神經(jīng)元在形態(tài)上似乎是正常的。這一發(fā)現(xiàn)表明CaBPs對細(xì)胞活動模式是至關(guān)重要的(Airaksinen等，PNAS，94，1488-93，1997)。此外，具有鈣結(jié)合蛋白-D28k的運(yùn)動神經(jīng)元的逆轉(zhuǎn)病毒侵染表明對由肌萎縮的側(cè)硬化病人的IgG誘導(dǎo)的毒性具有神經(jīng)保護(hù)作用(Ho等，PNAS，93，6796-801)，用鈣結(jié)合蛋白-D28k進(jìn)行的轉(zhuǎn)染表明可保護(hù)PC12細(xì)胞免于因血清提取，谷氨酸暴露和神經(jīng)毒素MPP+而產(chǎn)生的毒性作用(McMahon等，分子大腦研究，526，303-07，1998)。
總之，關(guān)于鈣結(jié)合蛋白質(zhì)在神經(jīng)退化中的作用有大量的信息?？梢钥隙ǖ氖悄承〤aBPs提供保護(hù)，其它的CaBPs則造成選擇性的易受傷性，然而，尚不清楚的是，在不同神經(jīng)元群體中，一定的CaBPs的表達(dá)是否導(dǎo)致一種給定的CaBP的不同功能反應(yīng)。另一種觀察后的意見認(rèn)為不同類型的CNS傷害的嚴(yán)重度可以影響CaBPs的明顯的神經(jīng)保護(hù)功效，即在包括溫和損傷的損傷模型中，CaBP可以賦予抵抗力，但在更嚴(yán)重的CNS損傷中，不能緩沖Ca2+的增加。因此，有相當(dāng)?shù)淖C據(jù)表明，在CNS損傷過程中，CaBPs既可賦予抵抗力，也可賦予易受傷性，但這種復(fù)雜情況的機(jī)制和反應(yīng)的調(diào)節(jié)還需要研究。
最近從小鼠來源的cDNA文庫中分離了包含功能尚未鑒定的基因(MO25)的一個(gè)基因家族(Miyamoto等.分子繁殖發(fā)育，34，1-7，1993)。該文庫是由從一種早期胚胎小鼠中分離的RNA進(jìn)行構(gòu)建的。對MO25預(yù)測的氨基酸序列揭示MO25基因與鈣結(jié)合蛋白具有結(jié)構(gòu)上的同源性，缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域，表明該蛋白可能參與了未受精卵的胞液發(fā)育。然而，該蛋白質(zhì)的真正的功能仍然是未知的。另一種類似于Mo25的基因已經(jīng)從果蠅的cDNA文庫中克隆出來(Nozaki等，DNA細(xì)胞生物學(xué)，15，505-09，1996)。其推導(dǎo)的Mo25 cDNA的氨基酸序列與鼠MO25的同系物有69.3％的同源性。釀酒酵母中的一種同源染色體在鈣調(diào)磷酸酶B亞基基因附近的一個(gè)可讀框內(nèi)編碼。最近，另一種基因從曲霉屬的hym A突變體中分離出來(Karos等，Mol.Gen Genet，260，510-521，1999)，結(jié)果顯示該基因?qū)?yīng)于酵母，植物，蠅類，蠕蟲，魚類，鼠和人類的同源染色體。在任何描述的生物中還沒有定義Hym蛋白的細(xì)胞功能。至于只是部分地理解其功能的很多其它的蛋白質(zhì)，藥物發(fā)現(xiàn)的過程當(dāng)前正在經(jīng)歷一個(gè)基本的革命，因?yàn)樗肮δ苄曰蚪M學(xué)”，即，高通量的基因組或基于基因的生物學(xué)。該方法作為鑒定基因和作為治療靶標(biāo)的基因產(chǎn)物的一種手段，正在迅速地超過早期的基于“定位克隆”的方法?？梢澡b定出表現(xiàn)型，即一種生物學(xué)功能或遺傳疾病，再根據(jù)其遺傳圖譜位置可把這一結(jié)果追索到其相應(yīng)的基因。功能基因組學(xué)主要依賴于高通量DNA測序技術(shù)和生物信息學(xué)各種工具，從目前可供使用的很多分子生物學(xué)數(shù)據(jù)庫來鑒定具有潛在意義的基因序列。繼續(xù)需要鑒定和進(jìn)一步描述基因的以及它們的作為藥物發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)的相關(guān)多肽/蛋白質(zhì)的特征。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及ANIC-BP，具體地說涉及ANIC-BP多肽和ANIC-BP多聚核苷酸，重組材料以及它們的產(chǎn)生方法。對這些多肽和多聚核苷酸的興趣在于其與一定疾病的治療方法有關(guān)，這些疾病包括但不限于中風(fēng)和急性頭部創(chuàng)傷，多發(fā)性硬化和脊髓損傷，在下文稱作＂本發(fā)明的疾?。ⅰＡ硪环矫?，本發(fā)明涉及利用本發(fā)明所提供的材料鑒定興奮劑和拮抗劑(如，抑制劑)和用被鑒定的化合物治療與ANIC-BP不平衡相關(guān)的疾病。另一方面，本發(fā)明還涉及檢測與不適當(dāng)?shù)腁NIC-BP活性或者水平相關(guān)的疾病的診斷分析。發(fā)明描述一方面，本發(fā)明涉及ANIC-BP多肽，這樣的多肽包括(a)一種由包含SEQ ID NO1序列的多聚核苷酸編碼的分離多肽；(b)一種分離多肽，該多肽包含與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的多肽序列；(c)一種包含SEQ ID NO2的多肽序列的分離多肽；(d)一種與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的分離多肽；(e)SEQ ID NO2的多肽序列；和(f)一種分離多肽，該多肽與SEQ ID NO2的多肽序列相比，具有或包含同源性指數(shù)為0.95，0.96，0.97，0.98或0.99的多肽序列；(g)(a)至(f)中這種多肽的片段或變異體。
本發(fā)明的多肽被認(rèn)為是鈣結(jié)合蛋白多肽家族的成員。因此它們具有意義是因?yàn)樗鼈兡茏鳛橐粋€(gè)新奇的藥物靶子。
ANIC-BP的生物學(xué)性質(zhì)在下文稱作＂ANIC-BP的生物學(xué)活性＂或者＂ANIC-BP活性＂。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽顯示至少一種ANIC-BP的生物活性。
本發(fā)明多肽也包括前面提到的多肽的變異體，包括所有的等位形式和剪接變異體。這種多肽通過可以是保守的或非保守的、或任意結(jié)合的插入，缺失和替換與參照多肽有所不同。特別優(yōu)選的變異是那些其中幾個(gè)氨基酸，例如，從50到30，從30到20，從20至10，從10至5，從5至3，從3至2，從2至1種或者1個(gè)氨基酸被插入，替換或缺失或其任意結(jié)合的變異體。
本發(fā)明多肽的優(yōu)選片段包括一種包含具有至少30個(gè)，50個(gè)或者100個(gè)SEQ ID NO2氨基酸序列中的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的分離多肽，或者包括一種包含具有至少30個(gè)，50個(gè)或者100個(gè)從SEQ ID NO2的氨基酸序列中截短或缺失的、連續(xù)氨基酸的氨基酸序列的分離多肽。優(yōu)選片段是介導(dǎo)ANIC-BP的生物活性的生物活性的片段，包括那些具有相似活性或活性提高，或降低的不理想的活性的片段。優(yōu)選片段還包括那些在動物中，尤其是在人體中具有抗原作用或致免疫性的片段。
通過肽的合成，本發(fā)明的多肽片段可以被用來產(chǎn)生相應(yīng)的全長多肽；因此，這些變異體可以被用作產(chǎn)生本發(fā)明的全長多肽的中間體。本發(fā)明的多肽可以以＂成熟＂蛋白質(zhì)的形式或者可以是更大的蛋白質(zhì)的一部分，如前體物或者融合蛋白質(zhì)。包含附加的氨基酸序列常常是很有利的，該附加的氨基酸序列包含分泌或引導(dǎo)序列，前序列，或者是有助于提純的序列，例如多個(gè)組氨酸殘基，或者是為了增加在重組生產(chǎn)期間的穩(wěn)定性的附加序列。
本發(fā)明的多肽能以任何合適的方式進(jìn)行制備，例如，從自然存在的來源中分離，從包含表達(dá)系統(tǒng)(見下文)的遺傳工程宿主細(xì)胞中分離，或通過化學(xué)合成，例如用自動肽合成儀合成，或者這些方法的結(jié)合。制備這些多肽的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
另一方面，本發(fā)明涉及ANIC-BP多聚核苷酸。這樣的多聚核苷酸包括(a)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包含與SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的多聚核苷酸序列；(b)一種包含SEQ ID NO1的多聚核苷酸的分離多聚核苷酸；(c)一種與SEQ ID NO1的多聚核苷酸具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的分離多聚核苷酸；(d)SEQ ID NO1的分離多聚核苷酸；(e)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包含編碼與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的多肽序列的多聚核苷酸序列；和(f)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO2的多肽的多聚核苷酸；
(g)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸具有編碼與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％，96％，97％，98％或者99％同源性的多肽序列的多聚核苷酸序列；和(h)編碼SEQ ID NO2多肽的分離多聚核苷酸序列；(i)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸與SEQ ID NO2的多聚核苷酸序列相比，具有或包含同源性指數(shù)為0.95，0.96，0.97，0.98或0.99的多聚核苷酸序列；(j)一種具有或包含多聚核苷酸序列的分離多聚核苷酸，該多聚核苷酸序列編碼的多肽序列與SEQ ID NO2的多肽序列相比具有0.95，0.96，0.97，0.98或0.99的同源性指數(shù)；以及上面提到的多聚核苷酸的片段或變異體的多聚核苷酸、或者是與上面提到的多聚核苷酸的全長互補(bǔ)的多聚核苷酸。
本發(fā)明的優(yōu)選聚核苷酸片斷包括一種含有具有至少15，30，50或100個(gè)來源于SEQ ID NO1序列的連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的分離多聚核苷酸，或一種含有至少30，50或100個(gè)來源于SEQ ID NO1序列的截短的或缺失的連續(xù)核苷酸的序列的分離多聚核苷酸。
本發(fā)明多聚核苷酸的優(yōu)選變異體包括拼接變異體，等位變異體和多態(tài)性，包括具有一種或更多種單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的多聚核苷酸。
本發(fā)明的多聚核苷酸還包括編碼多肽變異體的多聚核苷酸，該多肽變異體含有SEQ ID NO2的氨基酸序列和其中幾個(gè)氨基酸殘基，例如從50到30，從30到20，從20至10，從10至5，從5至3，從3至2，從2至1種或者1個(gè)氨基酸可以被替換，缺失，或插入或以任何組合的形式。
另一方面，本發(fā)明提供了為本發(fā)明DNA序列的RNA轉(zhuǎn)錄物的多聚核苷酸。因此，提供一種RNA多聚核苷酸(a)包含一種編碼SEQ ID NO2多肽序列的DNA序列的RNA轉(zhuǎn)錄物；(b)是編碼SEQ ID NO2多肽序列的DNA序列的RNA轉(zhuǎn)錄物；(c)包含一種SEQ ID NO1的DNA序列的RNA轉(zhuǎn)錄物；或(d)是SEQ ID NO1的DNA序列的RNA轉(zhuǎn)錄物；和與其互補(bǔ)的RNA多聚核苷酸。
SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列顯示與Hym A(Nozaki等，DNA細(xì)胞生物學(xué)，15，505-09，1996)和Mo25(Karos等.普通分子遺傳學(xué)(Mo1.Gen.Genet)，260，510-521，1999)的同源性。SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列是編碼SEQ ID NO2多肽的cDNA序列。編碼SEQ ID NO2多肽的多聚核苷酸序列與編碼多肽的SEQ ID NO1序列可能是完全相同的，或者可能是除SEQ ID NO1之外的序列，該序列由于遺傳密碼的豐余性(簡并性)也編碼SEQ ID NO2的多肽。該SEQ ID NO2的多肽與鈣結(jié)合蛋白家族的其它蛋白有關(guān)，具有與Hym A蛋白和Mo25蛋白的同源性和/或結(jié)構(gòu)相似性。
本發(fā)明的優(yōu)選多肽和多聚核苷酸預(yù)期特別具有與其同源多肽和多聚核苷酸相似的生物學(xué)功能/性質(zhì)。此外，本發(fā)明的優(yōu)選多肽和多聚核苷酸至少具有ANIC-BP活性。
利用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選技術(shù)，從來源于人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的mRNA細(xì)胞的cDNA文庫可以獲得本發(fā)明的多聚核苷酸，(參見例如，Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989))。從自然來源中如基因組DNA文庫也可獲得、或者利用熟知的或市售的技術(shù)能夠合成本發(fā)明的多聚核苷酸。
當(dāng)本發(fā)明的多聚核苷酸被用于本發(fā)明的多肽的重組生產(chǎn)時(shí)，多聚核苷酸本身可以包括成熟多肽的編碼序列，或帶有其它編碼序列的閱讀框中的成熟多肽的編碼序列，如編碼引導(dǎo)或分泌序列，前蛋白，原蛋白或前原蛋白序列或其它的融合肽部分的編碼序列。例如，可以編碼有利于提純?nèi)诤隙嚯牡臉?biāo)記序列。在本發(fā)明這一方面的一定的優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是一種六個(gè)組氨酸肽，如同pQE載體中提供的(Qiagen公司)和Gentzt等描述的(美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)(1989)86821-824)，或者是HA標(biāo)記物。多聚核苷酸也可以包含非編碼的5′端和3′端序列，如轉(zhuǎn)錄的，非翻譯的序列，拼接的和聚腺苷酸化的信號序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)和穩(wěn)定mRNA的序列。
完全相同的，或者與SEQ ID NO1多聚核苷酸序列有充分的同源性的多聚核苷酸可被用作cDNA和基因組DNA的雜交探針，或用為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物(例如，PCR)。這些探針和引物可以用來分離本發(fā)明的全長cDNA和編碼多肽的基因組克隆，并且分離其它基因的cDNA和基因組克隆(包括編碼從人類來源的共生同源基因產(chǎn)物(paralogs)和除人以外的其它物種來源的直向同源基因產(chǎn)物(orthologs)和共生同源基因產(chǎn)物(paralogs)的基因)，該其它基因與SEQ ID NO1有很高的序列相似性，典型地至少有95％的同源性。優(yōu)選的探針和引物一般包括至少15個(gè)核苷酸，優(yōu)選地至少30個(gè)核苷酸，如果不是至少100個(gè)核苷酸的話，可能具有至少50個(gè)核苷酸。特別優(yōu)選的探針將在30個(gè)和50個(gè)核苷酸之間。特別優(yōu)選的的引物將在20和25核苷酸之間。
編碼本發(fā)明多肽的一種多聚核苷酸，包括除人以外的物種來源的同系物，可以由包含下列步驟的方法獲得在嚴(yán)緊的雜交條件下，用一種具有SEQ ID NO1的序列或其片段，優(yōu)選地具有至少15個(gè)核苷酸的片段的標(biāo)記探針篩選文庫；和分離包含所說的多聚核苷酸序列的全長cDNA和基因組克隆。這種雜交技術(shù)是技術(shù)人員熟知的。優(yōu)選的嚴(yán)緊雜交條件包括在42℃下在包含以下成分的溶液中過夜培養(yǎng)50％的甲酰胺，5倍的SSC(150mM的氯化鈉，15mM的檸檬酸三鈉)，50mM的磷酸鈉(pH7.6)，5倍的Denhard’t溶液，10％的葡聚糖硫酸鹽，和20微克/毫升的變性的、剪切的鮭精DNA；緊接著在0.1×SSC中、于大約65℃下洗滌濾膜。這樣，本發(fā)明也包括所分離的多聚核苷酸，優(yōu)選地是具有至少100個(gè)核苷酸的核苷酸序列，在嚴(yán)緊的雜交條件下，用具有SEQ ID NO1的序列或其片段，優(yōu)選地具有至少15核苷酸的片段的標(biāo)記探針篩選文庫可獲得這些多聚核苷酸。
熟練的技術(shù)人員將意識到，在許多情況之下，一種分離的cDNA序列將是不完全的，因?yàn)榫幋a多肽的區(qū)域并不一直延伸至5′端。這是逆轉(zhuǎn)錄酶，一種本質(zhì)上具有較低的“持續(xù)合成能力”(在聚合反應(yīng)過程中，酶保持附著在模板上的能力測定)的酶，在第一條鏈的cDNA合成期間不能完成mRNA模板的一個(gè)DNA拷貝的結(jié)果。
有可供使用和本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的幾個(gè)方法獲得全長的cDNA，或者延伸的短cDNA，例如根據(jù)cDNA末端快速擴(kuò)增的方法(RACE)獲得的那些方法(例如，參見Frohman等，美國國家科學(xué)院院刊85，8998-9002，1988)。例如，以馬拉松(Marathon)(商標(biāo))技術(shù)(Clontech實(shí)驗(yàn)室公司)為例的該技術(shù)最近的改進(jìn)明顯地簡化了對較長的cDNA的搜索。在馬拉松(商標(biāo))技術(shù)中，由從選擇的組織中提取的mRNA和連接到兩端的“接頭”序列制備cDNA。然后用基因特異的和接頭特異的寡聚核苷酸引物組合進(jìn)行核酸擴(kuò)增以擴(kuò)增“丟失的”cDNA 5′端。然后用“嵌套”引物，即在擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)設(shè)計(jì)用于退火的引物(典型地，在接頭序列的3′進(jìn)一步退火的接頭特異引物，和在已知基因序列的5′進(jìn)一步退火的基因特異引物)重復(fù)PCR反應(yīng)。然后通過DNA序列測定和全長的cDNA可分析該反應(yīng)的產(chǎn)物，該全長的cDNA的構(gòu)建可通過把產(chǎn)物直接地連接到現(xiàn)有的cDNA以產(chǎn)生一完整的序列或者用為5′引物設(shè)計(jì)的新的序列信息進(jìn)行單獨(dú)的全長PCR。
由本領(lǐng)域中熟知的方法，從包含表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程宿主細(xì)胞中可以制備本發(fā)明的重組多肽。因此，另一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的多聚核苷酸或多種多聚核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，涉及經(jīng)遺傳工程改構(gòu)的含有這些表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞，和涉及通過重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。也可以使用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，用來源于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA產(chǎn)生這樣的蛋白質(zhì)。
為了重組生產(chǎn)，宿主細(xì)胞可通過遺傳工程方法插入用于本發(fā)明的多聚核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)或其部分。用在許多標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊中描述的方法，可把多聚核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞，如Davis等，分子生物學(xué)的基本方法(1986)，以及Sambrook等(出處同上)。把多聚核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的優(yōu)選的方法包括，例如，磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)位，微注射，陽離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，刮削輸入(scrape loading)，基因槍導(dǎo)入或者感染。
適當(dāng)?shù)乃拗鞯拇砝影?xì)菌細(xì)胞，如鏈球菌，金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，鏈霉菌和枯草桿菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞和曲霉屬細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，如果蠅S2細(xì)胞和夜蛾Sf9細(xì)胞；動物細(xì)胞如CHO，COS，海拉細(xì)胞，C127，3T3，BHK，HEK 293和Bowes黑瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞。
可以利用各種各樣的表達(dá)系統(tǒng)，例如，染色體的，附加型的和病毒來源的系統(tǒng)，例如，從細(xì)菌質(zhì)粒來源的載體，從噬菌體，從轉(zhuǎn)座子，從酵母附加體，從插入因子，從酵母染色體因子，從病毒如桿狀病毒，乳多空病毒，如SV40，牛痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病毒和逆轉(zhuǎn)病毒，以及由其組合來源的載體，如來源于質(zhì)粒和噬菌體遺傳因子的載體，如粘粒和噬菌粒。表達(dá)系統(tǒng)可以包含調(diào)節(jié)和產(chǎn)生表達(dá)的控制區(qū)域。一般地，可以使用任何能夠維持，繁殖或者表達(dá)多聚核苷酸、以在宿主中產(chǎn)生多肽的系統(tǒng)或者載體。通過任何多種多樣的熟知的和常規(guī)操作技術(shù)，例如，象Sambrook等(出處同上)陳述的那些技術(shù)，可把合適的多聚核苷酸序列可以插入到表達(dá)系統(tǒng)中。合適的分泌信號可以滲入到所需的多肽中，以使翻譯的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，周質(zhì)空間或胞外環(huán)境中。這些信號可以是該多肽內(nèi)生的，或者它們可以是異源的信號。
如果本發(fā)明的多肽準(zhǔn)備表達(dá)用于篩選分析，一般優(yōu)選的是在細(xì)胞的表面產(chǎn)生該多肽。在這種情況下，可以在篩選分析使用之前收獲這些細(xì)胞。如果多肽是分泌到培養(yǎng)基中，可以去除培養(yǎng)基以便回收和提純多肽。如果這些多肽是產(chǎn)生在細(xì)胞內(nèi)的，回收多肽之前必須對細(xì)胞進(jìn)行裂解。
通過熟知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中可以回收和純化本發(fā)明的多肽，這些方法包括硫酸胺或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選的是，使用高效液相色譜提純多肽。在細(xì)胞內(nèi)合成，分離和/或提純多肽的過程中，當(dāng)多肽被變性時(shí)，可以用一些熟知的重新折疊蛋白的技術(shù)產(chǎn)生有活性的構(gòu)象。
通過檢測相關(guān)基因的突變，本發(fā)明的多聚核苷酸可以用作診斷的試劑。對在cDNA和基因組序列中的具有SEQ ID NO1的多聚核苷酸特征的突變形式基因(該基因與功能失調(diào)有關(guān))的檢測，可以提供診斷工具，該診斷工具能增加對，或限定疾病的診斷，或?qū)膊〉囊赘行栽\斷，該疾病是因?yàn)樵摶蜻^低的表達(dá)，或過高的表達(dá)，或改變的時(shí)空表達(dá)引起的。
通過多種本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，可以在DNA水平上檢測攜帶基因突變的個(gè)體。
供診斷的核酸可以從一個(gè)受實(shí)驗(yàn)者的細(xì)胞中獲得，如從血，尿，唾液，活組織檢查或尸體解剖材料中獲得。基因組DNA可直接用于檢測，或者在分析之前，通過PCR，優(yōu)選地用RT-PCR，或其他的擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA或cDNA也可以類似的方式使用。與正常的基因型相比，通過擴(kuò)增產(chǎn)物大小的變化可以檢測缺失和插入。通過把擴(kuò)增的DNA與標(biāo)記的ANIC-BP核苷酸序列雜交，能夠鑒定點(diǎn)突變。通過RNA酶消化或熔點(diǎn)溫度的區(qū)別可以從錯(cuò)配的雙螺旋中區(qū)別開完美匹配的序列。通過加有或沒有變性劑的凝膠上DNA片段電泳遷移率的改變，或者通過直接的DNA序列測定(例如，參見，Myers等，科學(xué)(1985)2301242)也可以檢測DNA序列的差異。通過核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)，如RNA酶和S1核酸酶保護(hù)或化學(xué)切割方法(參見Cotton等，美國國家科學(xué)院院刊(1985)854397-4401)也可以揭示特定位置的序列變化。
可以構(gòu)建一組陣列的包含ANIC-BP多聚核苷酸序列或者其片段的寡聚核苷酸探針，來進(jìn)行有效的篩選，如遺傳突變的篩選。這些陣列優(yōu)選地是高密度的陣列或柵格。陣列技術(shù)方法是熟知的，而且具有一般的適用性，可以用來解決分子遺傳學(xué)上各種各樣的問題，包括基因表達(dá)，遺傳連鎖，和遺傳變異性，參見，例如，M.Chee等，科學(xué)，274，610-613(1996)和其中引用的其它參考文獻(xiàn)。
多肽或者mRNA表達(dá)水平不正常的減少或增加的檢測也可用于診斷或測定一個(gè)受實(shí)驗(yàn)者對本發(fā)明的疾病的敏感性。利用任何本領(lǐng)域熟知的定量分析多聚核苷酸方法，例如，象核酸擴(kuò)增，如PCR，RT-PCR，RNA酶保護(hù)，Northern印跡和其它的雜交方法，在RNA水平可以測定減少的或者增加的表達(dá)。
能夠用來測定來源于宿主的樣品中的蛋白質(zhì)水平，如本發(fā)明的多肽的分析技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。這些分析方法包括放射免疫分析，競爭結(jié)合分析，Western印跡分析，和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)分析。
因此，另一方面，本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，它包括
(a)一種本發(fā)明的多聚核苷酸，優(yōu)選地為SEQ ID NO1的核苷酸序列，或者是它的片段或RNA轉(zhuǎn)錄物；(b)一種與(a)的多聚核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)一種本發(fā)明的多肽，優(yōu)選地為SEQ ID NO2的多肽或其片段；(d)一種本發(fā)明的多肽的抗體，優(yōu)選地為SEQ ID NO2的多肽的抗體。
可以理解的是，在任何這樣的試劑盒中，(a)，(b)，(c)或(d)可以包括一個(gè)實(shí)質(zhì)上的組成部分。這種試劑盒在診斷疾病或?qū)膊〉拿舾行詴r(shí)，尤其是本發(fā)明的一些疾病中將具有用途。
本發(fā)明的多聚核苷酸序列對染色體定位研究是有價(jià)值的，該序列特異性地瞄準(zhǔn)單個(gè)人體染色體上面的特定位置，并且能與其雜交。把一些相關(guān)序列作圖到本發(fā)明的染色體上，在研究那些序列與基因相聯(lián)系的疾病的相關(guān)性方面是重要的第一步。一旦一種序列作圖到染色體的精確位置上，該序列在染色體上的物理位置能夠與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相互聯(lián)系起來。例如，在人類的V.McKusick，孟得爾遺傳中發(fā)現(xiàn)了這樣的數(shù)據(jù)(通過JohnsHopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書館網(wǎng)上可查到)。然后通過連鎖分析(物理位置上鄰近的基因的共遺傳)鑒定已作圖到相同的染色體區(qū)域的基因與疾病的相互關(guān)系。使用輻射雜合體(RH)作圖(Walter，M.Spillett，D.，Thomas，P.，Weissenbach，J.，以及Goodfellow，P.，(1994)用于構(gòu)建整個(gè)基因組的輻射雜合體作圖的方法，自然遺傳學(xué)，7，22-28)可以確定基因組序列(基因片段，等等)的準(zhǔn)確的人類染色體定位。從美國遺傳研究所(Huntsville，美國阿拉巴馬洲)可以得到一些輻射雜合體作圖面板，例如GeneBridge4輻射雜合體作圖面板(人類分子遺傳學(xué)，1996，3月；5(3)339-46，人類基因組的輻射雜合體作圖。Gyapay G，Schmitt K，F(xiàn)izames C，Jones H，Vega-Czarny N，Spillett D，MuseletD，Prud Homme JF，Dib C，Auffray C，Morissette J，Weissenbach J，Goodfellow PN)。利用這一面板為了確定基因的染色體位置，利用由RHDNAs的目的基因設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行93次PCR。每種這些DNA含有保持在倉鼠背景下(人/倉鼠雜合體細(xì)胞系)的隨機(jī)的人類基因組片段。這些PCR產(chǎn)生93個(gè)結(jié)果，表明目的基因的PCR產(chǎn)物的存在或者缺乏。把這些結(jié)果與利用已知位置的基因組序列來源的PCR產(chǎn)物的結(jié)果進(jìn)行比較。該比較可以在http//www.genome.wi.mit.edu上進(jìn)行。
本發(fā)明的多聚核苷酸序列對組織表達(dá)研究也是有價(jià)值的工具。這些研究可以測定本發(fā)明的多聚核苷酸的表達(dá)類型，通過檢測編碼這些多肽的mRNA，該測定指明組織中編碼的多肽的表達(dá)類型。這些使用的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，包括在柵格上排列的克隆雜交技術(shù)，如cDNA微陣列雜交(Schena等，科學(xué)，270，467-470，1995以及Shalon等，基因組研究(Genome Res)，6，639-645，1996)和核苷酸擴(kuò)增技術(shù)如PCR。一種優(yōu)選的方法是利用由Perkin Elmer公司提供的TAQMAN(商標(biāo))技術(shù)。這些研究結(jié)果可以表明生物體中的多肽的正常功能。此外，通過與另一種形式的相同基因編碼的mRNA的表達(dá)模式(例如，在編碼潛在的或一種調(diào)節(jié)的突變的多肽方面有改變的基因)比較研究mRNAs的正常表達(dá)模式，可以深刻地理解本發(fā)明的多肽的作用，或者它們在疾病中不合適的表達(dá)所起的作用。這種不合適的表達(dá)可以是時(shí)空性的，或者只是定量性質(zhì)的。本發(fā)明的多肽在人腦中表達(dá)。
本發(fā)明的另一方面涉及抗體。本發(fā)明的多肽或者它們的片段，或者表達(dá)它們的細(xì)胞，可以用作免疫原來產(chǎn)生對本發(fā)明多肽具有免疫特異性的多種抗體。術(shù)語“免疫特異性的”是指與對現(xiàn)有技術(shù)中的其它相關(guān)多肽的親和性相比，所述抗體對本發(fā)明的多肽本質(zhì)上有更大的親和性。
利用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)流程，通過向一種動物，優(yōu)選地為非人類的動物施用多肽或攜帶抗原決定族的片段或細(xì)胞，可以獲得針對本發(fā)明的多肽產(chǎn)生的抗體。為了制備單克隆抗體，可以使用任何能提供由連續(xù)不斷的細(xì)胞系培養(yǎng)產(chǎn)生的抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G，Milstein，C，自然(1975)256495-497)，trioma技術(shù)，人類B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，當(dāng)代免疫學(xué)(Immunology Today)(1983)472)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，單克隆抗體以及癌療法，77-96，Alan R.Liss公司，1985)。
用于單鏈抗體產(chǎn)生的技術(shù)，如在美國專利4,946,778中描述的那些技術(shù)，也可適用于產(chǎn)生針對本發(fā)明多肽的單鏈抗體。也可使用轉(zhuǎn)基因鼠或其它生物，包括其它哺乳動物來表達(dá)人源化抗體。
以上描述的抗體可被用來分離或鑒定表達(dá)多肽的克隆，或者通過親和層析提純多肽。也可用本發(fā)明多肽的抗體治療本發(fā)明中的疾病。
本發(fā)明的多肽和多聚核苷酸也可以用作為疫苗。因此，另一方面，本發(fā)明涉及在哺乳動物中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，該方法包括用本發(fā)明的多肽接種哺乳動物，足以產(chǎn)生抗體和/或者T細(xì)胞免疫的反應(yīng)，包括，例如產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞或者細(xì)胞毒性T細(xì)胞，以便使所述動物免于疾病，不管那種疾病是否已經(jīng)建立在個(gè)體之內(nèi)。哺乳動物中的免疫反應(yīng)也可通過這樣一種方法誘導(dǎo)，該方法包括通過在活體內(nèi)指導(dǎo)多肽表達(dá)和編碼多肽的載體提供本發(fā)明的多肽，以誘導(dǎo)這樣的免疫反應(yīng)來產(chǎn)生抗體保護(hù)所說的動物不受本發(fā)明的疾病的侵染。給動物施用該載體的方法是在粒子顆粒上涂一層膜、使之加速進(jìn)入所需的細(xì)胞中，或者是其它方法。這樣的核酸載體可以包括DNA，RNA，修飾的核酸，或者DNA/RNA雜合體。為了用作疫苗，通常地多肽或核酸載體以疫苗的配方劑型提供(組合物)。該配方還可以包含一個(gè)合適的載體。由于多肽可以在胃中分解，優(yōu)選地是不經(jīng)過腸道施藥(例如，皮下注射，肌內(nèi)注射，靜脈注射或皮內(nèi)注射)。適合于非腸道施用的配方劑型包括水溶液和非水溶液的無菌注射液，該注射液可包含提供與受體血液等滲的劑型的抗氧化劑，緩沖液，制菌劑以及溶質(zhì)；以及水溶液和非水溶液的無菌懸浮液，該懸浮液包括懸浮劑和增稠劑。這些配方劑型盛裝在一個(gè)單位劑量或多種單位劑量的容器中，例如，密封的安瓿和小瓶并且可在冷凍干燥的條件下儲藏，只需要在使用之前直接添加無菌的液體載體。疫苗配方也包括增強(qiáng)配方免疫原性的佐劑系統(tǒng)，如水包油系統(tǒng)和其它的本領(lǐng)域中熟知的系統(tǒng)。劑量將取決于疫苗的比活性，并且可以通過日常的實(shí)驗(yàn)方法迅速地予以測定。
本發(fā)明的多肽有一種或多種生物學(xué)功能，該生物學(xué)功能在一種或多種疾病狀態(tài)方面，特別是上文論及的本發(fā)明的疾病方面具有相關(guān)性。因此，鑒定刺激或者抑制多肽的功能或者水平的化合物是有用的。因此，另一方面，本發(fā)明提供篩選化合物的、以確定刺激或者抑制多肽的功能或者水平的方法。這些方法鑒定可用作治療和預(yù)防上文論及的本發(fā)明的這些疾病的興奮劑和拮抗劑。從各種各樣來源可以鑒定化合物，例如，細(xì)胞，無細(xì)胞的制備物，化合物文庫，收集的化合物，和天然產(chǎn)物混合物。通過這樣鑒定的興奮劑或拮抗劑可以是天然的或修飾的底物，配體，受體，酶，等等，如，可以是多肽，其結(jié)構(gòu)的或功能的模擬物(參見Coligan等，免疫學(xué)現(xiàn)代流程1(2)第5章(1991))或者一個(gè)小的分子。
篩選方法可以借助于直接或者間接地與候選化合物相結(jié)合的標(biāo)記，簡單地測量候選化合物與多肽，或細(xì)胞或攜帶多肽的膜，或其融合蛋白的結(jié)合能力?；蛘撸Y選方法可以包括測量或檢測(定性地和定量地)候選化合物與標(biāo)記的競爭物(例如，興奮劑或拮抗劑)對多肽的競爭結(jié)合。此外，利用對攜帶多肽的細(xì)胞合適的檢測系統(tǒng)，這些篩選方法可以檢驗(yàn)候選化合物是否導(dǎo)致由于多肽的激活或者抑制而產(chǎn)生的信號。一般地，在已知的興奮劑存在的情況下分析激活作用的抑制劑，并且通過在候選化合物存在時(shí)觀察興奮劑對激活作用的影響。此外，篩選方法可以簡單地包括以下步驟把候選化合物與包含本發(fā)明多肽的溶液相混合，形成混合物，和在混合物中測量ANIC-BP活性，并且把混合物的ANIC-BP活性與不包含任何候選化合物的對照混合物相比較。
本發(fā)明的多肽可以被用于常規(guī)的低容量篩選方法中，也可以高通量的篩選(HTS)形式使用。這些高通量的篩選(HTS)形式不僅包括已公認(rèn)的96孔微板的使用，最近，還包括384個(gè)孔的微量滴定板的使用，而且還包括一些新出現(xiàn)的方法，如Schullek等描述的納孔(毫微孔)方法(AnalBiochem，246，20-29，(1997)).
融合蛋白質(zhì)，如由Fc部分和在上文描述的ANIC-BP多肽制備的那些融合蛋白質(zhì)也可以用于高通量的篩選分析，以鑒定本發(fā)明的多肽的拮抗劑(參見D.Bennett等，分子識別雜志，852-58(1995)；和K.Johanson等，生物化學(xué)雜志，270(16)9459-9471(1995))。篩選方法多聚核苷酸，多肽和本發(fā)明多肽的抗體也可以用于具體的篩選方法，來檢測附加的化合物對細(xì)胞中mRNA和多肽的產(chǎn)生的效應(yīng)。例如，用在本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，利用單克隆和多克隆抗體，可以構(gòu)建ELISA分析，以便測量分泌的或者細(xì)胞相關(guān)水平的多肽。這可以用來發(fā)現(xiàn)一些介質(zhì)，該介質(zhì)可能抑制或者提高(也分別稱為拮抗劑或興奮劑)從合適地操縱的細(xì)胞或者組織產(chǎn)生的多肽。
通過在本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)的受體結(jié)合技術(shù)，如果有的話，可以用本發(fā)明的多肽來鑒定膜結(jié)合的或者可溶解的受體。這些技術(shù)包括，但不限于，配體結(jié)合和交聯(lián)分析，其中多肽被標(biāo)記上放射性同位素(例如125I)，被化學(xué)修飾(例如，生物素化的)，或融合到適宜于檢測或提純的多肽序列上，和與一定來源的可能受體(細(xì)胞，細(xì)胞膜，細(xì)胞上清液，組織提取液，體液)培養(yǎng)。其它方法包括生物物理技術(shù)如胞質(zhì)基因共振和光譜學(xué)。如果有任何的話，這些篩選方法也可以用來鑒定多肽的興奮劑和拮抗劑，這些興奮劑和拮抗劑與多肽結(jié)合到其受體上競爭。進(jìn)行這樣的分析的標(biāo)準(zhǔn)方法在本領(lǐng)域中是熟知的技術(shù)。
本發(fā)明多肽的拮抗劑的例子包括抗體，或者，在某些情況下，包括寡聚核苷酸或蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與配體、底物、受體、酶等緊密相關(guān)，如同有的情況，是關(guān)于多肽的，例如，配體、底物、受體、酶等的一個(gè)片段；或者是結(jié)合到本發(fā)明多肽上，但不引發(fā)反應(yīng)的一個(gè)小分子，因此可抑制該多肽的活性。
篩選方法也可以包括利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和ANIC-BP基因。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)已充分建立。例如，ANIC-BP基因通過微型注射可以導(dǎo)入受精卵母細(xì)胞的雄性原核中，通過逆轉(zhuǎn)病毒轉(zhuǎn)移至移植前的胚或移植的后胚中，或者通過遺傳上修飾的注射，如電穿孔，把胚胎干細(xì)胞注射到宿主的胚泡中。特別有用的轉(zhuǎn)基因動物是所謂的“knock-in”動物，在該動物中，一個(gè)動物基因在該動物基因組內(nèi)被人類等同的基因所取代。knock-in轉(zhuǎn)基因動物在藥物發(fā)現(xiàn)過程中對作用靶標(biāo)的證實(shí)是有用的，化合物對人體的靶標(biāo)作用是特異性的。其它有用的轉(zhuǎn)基因動物是所謂的＂基因失效(knock-out)＂動物，在該動物中，本發(fā)明多肽的動物直向同源基因的表達(dá)和細(xì)胞中內(nèi)源DNA序列編碼基因表達(dá)被部分地或者完全廢止失效。基因失效可瞄準(zhǔn)特定的細(xì)胞或組織，由于該技術(shù)的局限性的，基因失效可能只在一定的細(xì)胞或者組織之中發(fā)生，或者在所有的或基本上所有的動物細(xì)胞中發(fā)生。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)也提供一個(gè)完整的動物表達(dá)克隆系統(tǒng)，其中導(dǎo)入的基因被表達(dá)，產(chǎn)生大量的本發(fā)明的多肽。
用于上述方法的篩選試劑盒構(gòu)成本發(fā)明的另一方面，這樣的篩選試劑盒包括(a)一種本發(fā)明的多肽；(b)一種表達(dá)本發(fā)明的多肽的重組細(xì)胞；(c)一種表達(dá)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞膜；或(d)一種本發(fā)明的多肽的抗體；其中，多肽優(yōu)選地是SEQ ID NO2的多肽。
可充分理解的是，在任何這樣的試劑盒中，(a)，(b)，(c)，或(d)可包含一種實(shí)質(zhì)上的組成部分。術(shù)語解釋提供下列定義以便理解在上文中經(jīng)常使用的某種術(shù)語。
本文所使用的＂抗體＂包括多克隆抗體和單克隆抗體，嵌合的，單鏈，和人源化的抗體，以及Fab片段，包括Fab或者另一種免疫球蛋白表達(dá)文庫的產(chǎn)物。
＂分離的＂是指從自然狀態(tài)中，“通過人的手”改變的，即，如果它存在于自然界，從它的原來的環(huán)境中已經(jīng)被改變或者被撤走，或者兼有這兩種情況。例如，在一個(gè)活著的生物體中天然存在的多聚核苷酸或者多肽不是＂分離的＂，但是從其天然狀態(tài)共存的材料中分離出來的相同的多聚核苷酸或者多肽是＂分離＂的，正如此處使用的術(shù)語一樣。而且，通過轉(zhuǎn)化，遺傳操作或通過任何其它的重組方法導(dǎo)入到生物體的多聚核苷酸或者多肽是＂分離＂的，即使它還存在于所說的生物體中，該有機(jī)體可以是存活著的或者非存活的。
＂多聚核苷酸＂一般地是指任何多聚核糖核苷酸(RNA)或多聚脫氧核糖核苷酸(DNA)，它們可以是沒有修飾的或者是修飾的RNA或DNA。＂多聚核苷酸＂包括，但沒有限制，單鏈的和雙鏈的DNA，單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的DNA，單鏈的和雙鏈的RNA，單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的RNA，以及包含DNA和RNA的雜合分子，該DNA和RNA可以是單鏈的，更典型地是雙鏈的、或者是單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物。此外，＂多聚核苷酸＂是指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)域。術(shù)語＂多聚核苷酸＂也包括含有一種或多種的修飾堿基的DNA或RNA，和為穩(wěn)定性或其它原因帶有修飾的主鏈(骨架)的DNA或RNA?！靶揎椀摹眽A基包括，例如，三苯甲基化的堿基和稀有堿基，如次黃嘌呤核苷。對DNA和RNA可進(jìn)行多種多樣的修飾，因此，＂多聚核苷酸＂包括化學(xué)上地，酶促地，代謝上的修飾形式的、如同自然界發(fā)現(xiàn)的多聚核苷酸，以及具有病毒和細(xì)胞特征的DNA和RNA的化學(xué)形式。＂多聚核苷酸＂也包括相對較短的多聚核苷酸，經(jīng)常稱作寡聚核苷酸。
＂多肽＂是指包含兩種或者多種通過肽鍵或修飾的肽鍵、即同位的肽鍵彼此相連的氨基酸的任何多肽。＂多肽＂還涉及短鏈，一般地稱作肽，寡肽或寡聚體，和長鏈，一般地稱作蛋白質(zhì)。多肽可以含有除20種基因-編碼的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通過自然過程修飾的，如翻譯后加工或者本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。這些修飾作用在基本的教科書和更詳細(xì)的專著，以及大量的研究文獻(xiàn)中有充分的描述。修飾作用可以在多肽中的任何地方發(fā)生，包括肽的主鏈，氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。將充分理解的是，同一類型的修飾可以相同或不同程度存在于的給定的多肽的幾個(gè)位置。還有，一種給定的多肽可以包含多種類型的修飾。多肽因遍在蛋白化作用可以分支，并且它們可以是環(huán)狀的，有或者沒有分支。環(huán)狀的，分支的或者分支環(huán)狀的多肽可能因翻譯后的自然加工或者通過合成的方法產(chǎn)生。修飾作用包括乙?；饔茫；饔?，ADP-核糖基化作用，酰胺化作用，生物素化作用，黃素的共價(jià)連接，血紅素部分的共價(jià)連接，一個(gè)核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接，脂類或脂類衍生物的共價(jià)連接，磷脂酰肌醇的共價(jià)連接，交聯(lián)作用，環(huán)化作用，二硫鍵形成，脫甲基作用，共價(jià)交聯(lián)的形成，胱氨酸的形成，焦谷氨酸的形成，甲?；饔茫?羧化作用，糖基化作用，GP1錨狀物形成，羥基化作用，碘化作用，甲基化作用，豆蔻?；饔茫趸饔?，蛋白質(zhì)的水解加工，磷酸化作用，異戊烯化作用，消旋作用，硒代化作用，硫酸脂化作用，轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的氨基酸向蛋白質(zhì)的添加，如精氨?；饔煤捅樵诘鞍谆饔?參見，例如，蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)和分子特性，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，紐約，1993；Wold，F(xiàn).，翻譯后蛋白質(zhì)的修飾觀點(diǎn)和展望，1-12，蛋白質(zhì)的翻譯后共價(jià)修飾，B.C.Johnson，編輯，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1983；Seifter等，＂蛋白質(zhì)的修飾和非蛋白質(zhì)共因子的分析＂，酶學(xué)方法學(xué)，182，626-646，1990，以及Rattan等，“蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和衰老”，紐約學(xué)術(shù)科學(xué)年報(bào)(Ann NY Acad Sci)，663，48-62，1992)。
多肽序列的＂片段＂是指比參考序列更短，但保持與參考序列基本上相同的生物功能或者活性的多肽序列。多聚核苷酸的＂片段＂是指比SEQ IDNO1的參考序列短的多聚核苷酸序列。
＂變異體＂是指不同于參考多聚核苷酸或者多肽，但保持其基本特性的多聚核苷酸或者多肽。多聚核苷酸的典型的變異體在核苷酸序列方面不同于參考多聚核苷酸。變異體的核苷酸序列的變化可能或者不能改變參考多聚核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。正如下面所討論的，核苷酸的改變可以導(dǎo)致參考序列編碼的多肽中氨基酸的替換，添加，缺失，融合和截短。多肽的典型變異體在氨基酸序列方面不同于參考多肽。一般地，這些改變是有限的，因此，參考多肽和變異體的序列總體上是密切類似的，在很多區(qū)域是相同。變異體和參考多肽在氨基酸序列方面通過任何組合形式中的一種或多種的替換，插入，缺失而表現(xiàn)不同。替換的或插入的氨基酸殘基可以是或者不是遺傳密碼編碼的。典型的保守替換包括甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。多聚核苷酸或者多肽的變異體可以是如等位基因天然存在的，或者也可以是尚不知道的天然存在的變異體。非天然存在的多聚核苷酸和多肽的變異體可通過突變技術(shù)或通過直接合成產(chǎn)生。作為變異體還包括具有一種或多種的翻譯后的修飾，例如，糖基化作用，磷酸化作用，甲基化作用，ADP核糖基化作用，等等。實(shí)施方案包括N-端氨基酸的甲基化作用，絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化作用，以及C-端的甘氨酸的修飾。
＂等位基因＂是指存在于基因組中一個(gè)給定基因座的基因的兩種或更多種替換形式中的一個(gè)。
＂多態(tài)性＂是指一個(gè)種群中，在基因組中一個(gè)給定位置上的核苷酸序列(和編碼的多肽序列，如果有關(guān)的話)的變異。
＂單核苷酸多態(tài)性＂(SNP)指在一個(gè)種群中，基因組中單核苷酸位置上的核苷酸變異性的發(fā)生。在一個(gè)基因之內(nèi)或在基因組的基因間區(qū)域內(nèi)可以存在一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)。利用等位基因特異的擴(kuò)增(ASA)能夠分析SNP。該過程至少需要3種引物。普通的引物被用于對被分析的多態(tài)性的逆互補(bǔ)。該普通引物可以是來自多態(tài)性堿基的介于50到1500個(gè)堿基對之間。其它兩種(或多種)引物彼此相同，除最后的3′堿基擺動以便與兩個(gè)(或多個(gè))構(gòu)成多態(tài)性的等位基因中的一個(gè)匹配之外。然后對樣品DNA，進(jìn)行兩種(或多種)PCR反應(yīng)，每種反應(yīng)用普通引物和其中等位基因特異引物。
本文所使用的＂剪接變異體＂指最初從相同的基因組DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA分子中產(chǎn)生的cDNA分子，但它經(jīng)歷了可供選擇的RNA剪接方式。當(dāng)最初的RNA轉(zhuǎn)錄物一般為了去掉內(nèi)含子而經(jīng)歷剪接，產(chǎn)生不止一種mRNA分子，每種mRNA分子編碼不同的氨基酸序列時(shí)，即出現(xiàn)了另一種RNA剪接。術(shù)語剪接變異體也指上面cDNA分子編碼的蛋白質(zhì)。
＂同一性＂反映兩個(gè)或多個(gè)多肽序列，或者兩個(gè)或多個(gè)多聚核苷酸序列之間的相互關(guān)系，這種相互關(guān)系是通過比較序列而確定的。一般來說，同一性分別指兩種多聚核苷酸序列或兩種多肽序列在其被比較的序列長度上的準(zhǔn)確的核苷酸對核苷酸或氨基酸對氨基酸的對應(yīng)性。
＂％同一性＂-對沒有準(zhǔn)確對應(yīng)性的序列，可以測定＂％同一性＂。一般來說，要比較的兩種序列進(jìn)行排列對比，產(chǎn)生最大的序列之間的相關(guān)性。這可以包括在一個(gè)或兩個(gè)序列中插入的“缺口”，以增加排列對比的程度。在每種被比較的整個(gè)長度序列上可以測定＂％同一性＂(所謂的完全排成一行)，這特別合適于相同的或者長度十分相似的序列，或者在較短的，限定的長度序列上測定＂％同一性＂(所謂的局部排成一行)，這更合適于長度不相等的的序列。
＂相似性＂是進(jìn)一步的，更復(fù)雜地測定兩個(gè)多肽序列之間的相互關(guān)系。一般來說，＂相似性＂是指比較兩個(gè)多肽鏈的氨基酸，在殘基對殘基的基礎(chǔ)上，不僅考慮每種比較(對同一性)序列的一對殘基之間的準(zhǔn)確對應(yīng)性，也考慮在沒有準(zhǔn)確對應(yīng)性的地方，是否在進(jìn)化的基礎(chǔ)上，一種殘基可能替換其它的殘基。這種可能性有相關(guān)聯(lián)的“得分”，然后從其中可以確定兩種序列的＂％相似性＂。
比較兩種或多種序列同一性和相似性的方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，在一整套威斯康星序列分析軟件中可供使用的程序，9.1版本(Devereux Jeta等，核酸研究，12，387-395，1984，由遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(集團(tuán))提供，Madison，威斯康星，美國)，和例如BESTFIT和GAP程序，可用來測定兩種多聚核苷酸之間的％同一性和兩種多肽序列之間的％同一性和％相似性。BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性＂算法(分子生物學(xué)雜志，147，195-197，1981，應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展，2，482-489，1981)并且尋找兩種序列之間的相似性的最佳單一區(qū)域。BESTFIT更適宜于比較長度不相似的兩種多聚核苷酸或者兩種多肽序列，該程序假定較短的序列代表較長序列的一部分。GAP是把兩種序列排成行對比，根據(jù)Neddleman和Wunsch的算法(分子生物學(xué)雜志，48，443-453，1970)，尋找＂最大限度的相似性＂。GAP更適合于比較長度大致相同的序列，并預(yù)期在遍及整個(gè)長度的序列上進(jìn)行排列對比。優(yōu)選地，用于每個(gè)程序中的參數(shù)＂缺口權(quán)重＂和＂長度權(quán)重＂對于多聚核苷酸序列和對于多肽序列分別是50和3，以及12和4。優(yōu)選地，當(dāng)所比較的兩種序列最適地的排成隊(duì)列時(shí)，對％同一性和相似性進(jìn)行測定。
其它的測定序列之間的同一性和/或相似性的程序在本領(lǐng)域中也是熟知的，例如BLAST程序家族(Altschul S F等，分子生物學(xué)雜志，215，403-410，1990，Altschul S F等，核酸研究，25389-3402，1997，由國家生物工程信息中心(NCBI)提供，Bethesda，馬里蘭，美國和通過NCBI的主頁www.ncbi.nlm.nih.gov也可進(jìn)入)和FASTA(Pearson W R，酶學(xué)中的方法，183，63-99，1990；Pearson W R和Lipman D J，美國國家科學(xué)院院刊，85，2444-2448，1988，可以提供作為威斯康星序列分析軟件包的一部分)。
優(yōu)選地，BLOSUM62氨基酸替換矩陣(Henikoff S和Henikoff J G，美國國家科學(xué)院院刊，89，10915-10919，1992)被用于多肽序列比較，包括在比較之前，核苷酸序列首先地被翻譯為氨基酸序列的地方。
優(yōu)選地，程序BESTFIT被用來測定疑問多聚核苷酸或者多肽序列與參考多聚核苷酸或多肽序列的％同一性，疑問和參考序列進(jìn)行了最佳排列比較，且如上文中描述的，該程序的參數(shù)設(shè)定了違約值(default value)。
＂同一性指數(shù)＂是序列相關(guān)性的度量，它可以用來比較候選序列(多聚核苷酸或者多肽)和參考序列。例如，與參考多聚核苷酸序列相比，具有0.95同一性指數(shù)的候選多聚核苷酸序列，除了候選多聚核苷酸序列可以包括每100個(gè)參考序列的多聚核苷酸中平均多達(dá)5個(gè)核苷酸差異之外，與參考序列相比是相同的。這些差異選自下組至少一種核苷酸的缺失，替換，包括轉(zhuǎn)換和顛換，或插入。這些差異可發(fā)生在參考多聚核苷酸序列的5′或3′端位置，或者是介于這些末端位置的任何地方，單獨(dú)散布在參考序列的核苷酸之中，或者在參考序列之內(nèi)的一種或多種鄰接的集團(tuán)中。換句話說，正如上文所描述的，與參考多聚核苷酸序列相比，要獲得有0.95的同一性指數(shù)的多聚核苷酸序列，在參考序列的每100個(gè)核苷酸中平均多達(dá)5個(gè)核苷酸可以被缺失，替換，或者插入，或者它們的任何組合。在細(xì)節(jié)上已作必要的修正，同樣的情形也實(shí)用于同一性指數(shù)的其它值，例如0.96，0.97，0.98，0.99。
同樣地，對于多肽，例如，與參考多肽序列相比，具有0.95的同一性指數(shù)的候選多肽序列，除了可以包括每100個(gè)參考序列的氨基酸中平均多達(dá)5個(gè)氨基酸差異之外，與參考序列相比是相同的。這些差異選自下組至少一種氨基酸缺失，替換，包括保守的非保守的替換，或者插入。這些差異可發(fā)生在參考多肽序列的氨基端或羧基端的位置，或者是介于這些末端位置的任何地方，單獨(dú)散布在參考序列的氨基酸之中，或者在參考序列之內(nèi)的一種或多種鄰接的集團(tuán)中。換句話說，正如上文所描述的，與參考多多肽序列相比，要獲得0.95的同一性指數(shù)的多態(tài)序列，在參考序列的每100個(gè)氨基酸中平均多達(dá)5個(gè)氨基酸可以被缺失，替換，或者插入，或者它們的任何組合。在細(xì)節(jié)上已作必要的修正，同樣的情形也實(shí)用于同一性指數(shù)的其它值，例如0.96，0.97，0.98，0.99。
核苷酸或氨基酸差異的數(shù)量和同一性指數(shù)之間的相互關(guān)系可以以下列方程表示na≤xa-(xa·I)其中na是核苷酸或氨基酸差異的數(shù)量，xa分別是SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的核苷酸或者氨基酸的總數(shù)量。
I是同一性指數(shù)，·是乘法的符號，和其中，xa和I的任何非整數(shù)的積在從xa減去之前四舍五入為最近的整數(shù)。
＂同系物＂是用于本領(lǐng)域來表明具有與參考序列高度的序列相關(guān)性的多聚核苷酸或者多肽序列的一個(gè)普通術(shù)語。這樣的相關(guān)性可以通過測定如上文解釋的兩種序列之間的同一性和/或相似性的程度作定量分析。屬于這一普通術(shù)語的還有術(shù)語＂直向同源物＂，以及＂共生同源物＂。＂直向同源物＂指與另一物種中的多聚核苷酸或者多肽的功能對等的多聚核苷酸或者多肽。＂共生同源物＂指同一物種之內(nèi)功能相似的多聚核苷酸或者多肽。
＂融合蛋白質(zhì)＂指由兩個(gè)不相關(guān)的，融合的基因或其片段編碼的蛋白質(zhì)。在專利US 5541087，US 5726044，EP 574395，EP 493418，以及EP 0232 262中公開了一些實(shí)施例。對Fc-ANIC-BP來說，使用免疫球蛋白Fc區(qū)域作為融合蛋白的一部分對完成Fc-ANIC-BP的功能表達(dá)是有利的，當(dāng)用于治療時(shí)以提高這樣一種融合蛋白質(zhì)的藥物動力學(xué)性質(zhì)，以及產(chǎn)生二聚體的Fc-ANIC-BP。Fc-ANIC-BP DNA構(gòu)建體在5′到3′方向，包含分泌盒，即從哺乳動物細(xì)胞激發(fā)起輸出的信號序列，編碼作為融合伙伴的免疫球蛋白的Fc區(qū)域片段的DNA，和編碼Fc-ANIC-BP的DNA。在某些用途方面，非常理想的是通過突變功能性Fc的側(cè)面，而不觸動該融合蛋白的其它部分，或者在表達(dá)之后完全缺失掉Fc部分，能夠改變內(nèi)在的功能性質(zhì)(補(bǔ)體結(jié)合，F(xiàn)c-受體結(jié)合)。
本說明書引用的所有的出版物與參考文獻(xiàn)，包括但不限于專利和專利申請，被本文全面一并參考，既使每種個(gè)別的出版物或參考文獻(xiàn)正如已充分陳述的、本文具體地或單獨(dú)地予以參考。被本申請要求了優(yōu)先權(quán)的專利申請以上述描述的出版物和參考文獻(xiàn)的方式在此一并參考。


圖1在小腦半球損傷側(cè)面的對側(cè)中、顯示差異調(diào)節(jié)條帶的代表性mRNA的差別顯示凝膠。箭頭指差異表達(dá)的條帶。圖2大鼠Mo25小腦的270個(gè)堿基對基因片段在TBI(創(chuàng)傷的腦部損傷)之后分別在5，10，15，20，25和30個(gè)循環(huán)的RT-PCR。注意第2泳道在20，25，和30個(gè)循環(huán)的強(qiáng)烈表達(dá)。
L2TBI大鼠非損傷側(cè)面的cDNA；R2TBI大鼠損傷側(cè)面的cDNA。圖3經(jīng)TBI之后，用放射性32P標(biāo)記大鼠Mo25小腦mRNA的270個(gè)堿基對基因片段的斑點(diǎn)印跡分析。
檢查了六只單獨(dú)的大鼠，3個(gè)創(chuàng)傷的腦部損傷處理的和3個(gè)模擬手術(shù)動物。圖4用放射性32P標(biāo)記的大鼠Mo25的270個(gè)堿基對基因片段在8個(gè)大鼠組織上雜交的多個(gè)組織的Northern印跡(Clontech實(shí)驗(yàn)室公司，PaloAlto，美國加州)。圖5大鼠腦橫切片的原位雜交。利用對SICCBP和Mo25特異的正義和反義探針。用反義探針監(jiān)測到的照亮有髓神經(jīng)束(胼胝體，視束，嗅束中間體，小腦前連合)的強(qiáng)烈信號。圖6大鼠腦部損傷7天之后，ANIC-BP的實(shí)時(shí)TaqMan PCR表達(dá)。比較模擬手術(shù)的大鼠大腦和實(shí)驗(yàn)之后死亡7天的腦組織中的非損傷的皮層側(cè)面，損傷的皮層側(cè)面和小腦。誤差條是標(biāo)準(zhǔn)的平均誤差(S.E.M.)。
更多的實(shí)施例實(shí)施例1創(chuàng)傷的腦部損傷模型用側(cè)面流體方法在大鼠中研究對創(chuàng)傷的腦部損傷(TBI)反應(yīng)過程中的上或下調(diào)節(jié)基因的鑒定。在雄性Sprague-Dawley大鼠中用側(cè)面流體撞擊方法誘導(dǎo)集中于右側(cè)膜皮層的溫和創(chuàng)傷的腦部損傷。創(chuàng)傷的腦部損傷5天之后，大鼠死亡，并用差別顯示分析解剖的腦組織。用RT-PCR證實(shí)創(chuàng)傷腦部的小腦中的蛋白質(zhì)的上調(diào)節(jié)。
對照大鼠進(jìn)行麻醉，并且縮回顳肌，但不實(shí)行開顱手術(shù)。存活5天后，麻醉并殺死所有的大鼠，解剖大鼠的大腦，并于液氮中冷凍。
第2組TBI處理的老鼠用于組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色。在TBI(創(chuàng)傷的腦部損傷)后一周，麻醉這些老鼠，并灌注鹽水，再灌注3％的多聚甲醛。腦組織在一個(gè)冷凍切片機(jī)上切成30微米的冠狀切片。實(shí)施例2免疫組織化學(xué)小腦切片用鈣結(jié)合蛋白質(zhì)的單克隆抗體標(biāo)記。免疫復(fù)合物用親和素-生物素/DAB方法觀測。作為正對照，鈣結(jié)合蛋白質(zhì)-D(28KD)被用作小腦浦肯野氏細(xì)胞的可靠的標(biāo)記。實(shí)施例3原位雜交根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)計(jì)選自序列No.1(正義，反義)的寡聚脫氧核苷酸。根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的方法，這些探針用于老鼠腦組織切片的原位雜交。在柯達(dá)BioMax膠片上曝光5天后觀察放射自顯影。實(shí)施例4從創(chuàng)傷的腦部損傷的大鼠中提取RNAmRNA差式顯示被研發(fā)作為鑒定和分析任何真核細(xì)胞中mRNA水平上改變的基因表達(dá)的方法(Liang和Pardee，科學(xué)257，967，1992)。在本發(fā)明中，我們利用這一方法來研究對創(chuàng)傷的腦部損傷反應(yīng)中的上調(diào)和下調(diào)基因，以便對CNS傷害的分子影響獲得更好的了解(den Daas等，美國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會會議，華盛頓D.C.，美國，1998)。創(chuàng)傷的腦部損傷的動物模型稱為側(cè)面流體撞擊模型，并且實(shí)施如下在雄性Sprague-Dawley大鼠中用側(cè)面流體撞擊方法誘導(dǎo)集中于大腦右側(cè)膜皮層的溫和創(chuàng)傷的腦部損傷。對照大鼠被麻醉，并且縮回顳肌，但不實(shí)行開顱手術(shù)。經(jīng)存活5天后，麻醉并殺死所有的大鼠，解剖大鼠的大腦，并于液氮中冷凍。研磨勻漿整個(gè)腦部組織，提取總RNA(Sambrook等，1989).差式顯示通過RNA差式顯示分析獲得的RNA。用具有兩種另外核苷酸的、以所有可能組合方式的寡聚-dT引物(下游引物；13節(jié))對mRNAs進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而把反應(yīng)固定在聚腺苷酸尾的前端。用相同的3′端引物和第二個(gè)具有十個(gè)堿基的隨機(jī)的5′引物進(jìn)行cDNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在非變性的10％的聚丙烯酰胺凝膠(Amersham Pharmacia Biotech，德國)上分析。DNA通過銀染色觀察。染色之后，凝膠在室溫下干燥一小時(shí)(圖1)。從凝膠上切下差式表達(dá)的條帶。把DNA洗脫下來，再擴(kuò)增并亞克隆到pCR2.1載體上(Invitrogen，美國)。亞克隆片段通過Sanger法(SangerF.，等，PNAS，美國74，5463-5467)進(jìn)行序列分析，并且把其序列與基因組數(shù)據(jù)庫相比較。用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)驗(yàn)證獲得的基因片段。為了證實(shí)差式表達(dá)的大鼠Mo25，用特異的19節(jié)和21節(jié)引物，利用大力神試管(Titan one tube)RT-PCR系統(tǒng)(Boehringer曼海姆，德國)通過RT-PCR分析序列。一微克的從對照和TBI處理的動物中提取的總RNA用于RT-PCR。用大鼠Mo25的探針進(jìn)行點(diǎn)雜交技術(shù)和人的Mo25探針進(jìn)行Northern印跡分析可以驗(yàn)證更多的基因。逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)為了證實(shí)差式表達(dá)的中風(fēng)誘導(dǎo)的鈣結(jié)合蛋白質(zhì)，用特異的19節(jié)和21節(jié)引物，利用大力神試管RT-PCR系統(tǒng)(Boehringer曼海姆，德國)通過RT-PCR分析序列。一微克的從對照和TBI處理的動物中提取的總RNA用于RT-PCR。實(shí)時(shí)PCR用實(shí)時(shí)TaqMan PCR技術(shù)在ABI棱晶7700序列檢測系統(tǒng)(PE，應(yīng)用生物系統(tǒng)，德國)中檢查頭部創(chuàng)傷之后ANIC-BP在大鼠大腦中的分布。利用這一技術(shù)，可以高靈敏度地測定mRNA的絕對濃度。設(shè)計(jì)了具有25和29個(gè)堿基對長度的引物以及一種32節(jié)的TaqMan探針(報(bào)告染料FAM/猝滅劑染料TAMRA)。Ca2+結(jié)合由SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被印跡到硝酸纖維素膜上，并用Maruyama等(J.Biochem.95511-519，1984)描述的方法分析放射性標(biāo)記的Ca2+的結(jié)合。經(jīng)溫育之后，洗去多余的同位素，把膜曝光于柯達(dá)XOMAT.TM膠片上一段合適的時(shí)間。在結(jié)合蛋白的位置上顯影出一個(gè)條帶。通過使用對結(jié)合蛋白特異的抗體和通過Western印跡的方法施用抗體證實(shí)結(jié)合蛋白的存在，該方法是本領(lǐng)域熟知的技術(shù)。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>急性神經(jīng)元鈣結(jié)合蛋白<130>ANICBPJDDWS<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1026<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(1)..(1026)<400>1atg ccg ttc ccg ttt ggg aag tct cac aaa tct cca gca gac att gtg 48Met Pro Phe Pro Phe Gly Lys Ser His Lys Ser Pro Ala Asp Ile Val1 5 10 15aag aat ctg aag gag agc atg gct gtt ctg gaa aag caa gac att tct 96Lys Asn Leu Lys Glu Ser Met Ala Val Leu Glu Lys Gln Asp Ile Ser20 25 30gat aaa aaa gca gaa aag gct aca gaa gaa gtt tcc aaa aat ctg gtt 144Asp Lys Lys Ala Glu Lys Ala Thr Glu Glu Val Ser Lys Asn Leu Val35 40 45gcc atg aaa gaa att ctg tat ggc aca aat gaa aaa gag cct cag aca 192Ala Met Lys Glu Ile Leu Tyr Gly Thr Asn Glu Lys Glu Pro Gln Thr50 55 60gaa gca gta gct caa ctt gct caa gaa ctc tat aat agt ggg ctc ctt 240Glu Ala Val Ala Gln Leu Ala Gln Glu Leu Tyr Asn Ser Gly Leu Leu65 70 75 80agc acc ctg gta gct gat tta cag ctc att gac ttt gag ggc aaa aaa 288Ser Thr Leu Val Ala Asp Leu Gln Leu Ile Asp Phe Glu Gly Lys Lys85 90 95gac gtg gct caa att ttc aac aat att ctc aga aga caa att ggt acg 336Asp Val Ala Gln Ile Phe Asn Asn Ile Leu Arg Arg Gln Ile Gly Thr100 105 110aga act cct act gtt gaa tac atc tgc acc caa cag aat att ttg ttc 384Arg Thr Pro Thr Val Glu Tyr Ile Cys Thr Gln Gln Asn Ile Leu Phe115 120 125atg tta ttg aaa ggg tat gaa tct cca gaa ata gct cta aat tgt gga 432Met Leu Leu Lys Gly Tyr Glu Ser Pro Glu Ile Ala Leu Asn Cys Gly130 135 140ata atg tta aga gaa tgc atc aga cat gaa cca ctt gca aaa atc att 480Ile Met Leu Arg Glu Cys Ile Arg His Glu Pro Leu Ala Lys Ile Ile145 150 155 160ttg tgg tcg gaa cag ttt tat gat ttc ttc aga tat gtc gaa atg tca 528Leu Trp Ser Glu Gln Phe Tyr Asp Phe Phe Arg Tyr Val Glu Met Ser165 170 175aca ttt gac ata gct tca gat gca ttt gcc aca ttc aag gat tta ctt 576Thr Phe Asp Ile Ala Ser Asp Ala Phe Ala Thr Phe Lys Asp Leu Leu180 185 190aca aga cat aaa ttg ctc agt gca gaa ttt ttg gaa cag cat tat gat 624Thr Arg His Lys Leu Leu Ser Ala Glu Phe Leu Glu Gln His Tyr Asp195 200 205aga ttt ttc agt gaa tat gag aag tta ctt cat tca gaa aat tat gtg 672Arg Phe Phe Ser Glu Tyr Glu Lys Leu Leu His Ser Glu Asn Tyr Val210 215 220aca aaa aga cag tca ctg aag ctt ctc ggt gaa cta cta cta gat aga 720Thr Lys Arg Gln Ser Leu Lys Leu Leu Gly Glu Leu Leu Leu Asp Arg225 230 235 240cac aac ttc aca att atg aca aaa tac atc agt aaa cct gag aac ctc 768His Asn Phe Thr Ile Met Thr Lys Tyr Ile Ser Lys Pro Glu Asn Leu245 250 255aaa tta atg atg aac ctg ctg cga gac aaa agt cgc aac atc cag ttt 816Lys Leu Met Met Asn Leu Leu Arg Asp Lys Ser Arg Asn Ile Gln Phe260 265 270gag gcc ttt cac gtt ttt aag gtg ttt gta gcc aat cct aac aag acg 864Glu Ala Phe His Val Phe Lys Val Phe Val Ala Asn Pro Asn Lys Thr275 280 285cag ccc atc cta gac atc ctc ctc aag aac cag gcc aaa ctc ata gag 912Gln Pro Ile Leu Asp Ile Leu Leu Lys Asn Gln Ala Lys Leu Ile Glu290 295 300ttc ctc agc aag ttt cag aac gac agg acg gag gat gag cag ttt aac 960Phe Leu Ser Lys Phe Gln Asn Asp Arg Thr Glu Asp Glu Gln Phe Asn305 310 315 320gac gag aag acc tat tta gtt aaa cag atc agg gat ttg aag aga cca 1008Asp Glu Lys Thr Tyr Leu Val Lys Gln Ile Arg Asp Leu Lys Arg Pro325 330 335gct cag caa gaa gct taa 1026Ala Gln Gln Glu Ala340<210>2<211>341<212>PRT<213>人類<400>2Met Pro Phe Pro Phe Gly Lys Ser His Lys Ser Pro Ala Asp Ile Val1 5 10 15Lys Asn Leu Lys Glu Ser Met Ala Val Leu Glu Lys Gln Asp Ile Ser20 25 30Asp Lys Lys Ala Glu Lys Ala Thr Glu Glu Val Ser Lys Asn Leu Val35 40 45Ala Met Lys Glu Ile Leu Tyr Gly Thr Asn Glu Lys Glu Pro Gln Thr50 55 60Glu Ala Val Ala Gln Leu Ala Gln Glu Leu Tyr Asn Ser Gly Leu Leu65 70 75 80Ser Thr Leu Val Ala Asp Leu Gln Leu Ile Asp Phe Glu Gly Lys Lys85 90 95Asp Val Ala Gln Ile Phe Asn Asn Ile Leu Arg Arg Gln Ile Gly Thr100 105 110Arg Thr Pro Thr Val Glu Tyr Ile Cys Thr Gln Gln Asn Ile Leu Phe115 120 125Met Leu Leu Lys Gly Tyr Glu Ser Pro Glu Ile Ala Leu Asn Cys Gly130 135 140Ile Met Leu Arg Glu Cys Ile Arg His Glu Pro Leu Ala Lys Ile Ile145 150 155 160Leu Trp Ser Glu Gln Phe Tyr Asp Phe Phe Arg Tyr Val Glu Met Ser165 170 175Thr Phe Asp Ile Ala Ser Asp Ala Phe Ala Thr Phe Lys Asp Leu Leu180 185 190Thr Arg His Lys Leu Leu Ser Ala Giu Phe Leu Glu Gln His Tyr Asp195 200 205Arg Phe Phe Ser Glu Tyr Glu Lys Leu Leu His Ser Glu Asn Tyr Val210 215 220Thr Lys Arg Gln Ser Leu Lys Leu Leu Gly Glu Leu Leu Leu Asp Arg225 230 235 240His Asn Phe Thr Ile Met Thr Lys Tyr Ile Ser Lys Pro Glu Asn Leu245 250 255Lys Leu Met Met Asn Leu Leu Arg Asp Lys Ser Arg Asn Ile Gln Phe260 265 270Glu Ala Phe His Val Phe Lys Val Phe Val Ala Ash Pro Ash Lys Thr275 280 285Gln Pro Ile Leu Asp Ile Leu Leu Lys Asn Gln Ala Lys Leu Ile Glu290 295 300Phe Leu Ser Lys Phe Gln Ash Asp Arg Thr Glu Asp Glu Gln Phe Asn305 310 315 320Asp Glu Lys Thr Tyr Leu Val Lys Gln Ile Arg Asp Leu Lys Arg Pro325 330 335Ala Gln Gln Glu Ala340
權(quán)利要求
1.一種選自下組的分離的多肽(a)一種由包含SEQ ID NO1序列的多聚核苷酸編碼的分離多肽；(b)一種包含與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％的等同性的多肽序列的分離多肽；(c)一種與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％的等同性的分離多肽；(d)SEQ ID NO2的多肽序列，和(e)(a)至(d)中這些多肽的片段或變異體。
2.如權(quán)利要求1所要求的分離多肽，其包含SEQ ID NO2的多肽序列。
3.如權(quán)利要求1所要求的分離多肽，該多肽是SEQ ID NO2的多肽序列。
4.一種選自下組的分離的多聚核苷酸(a)一種分離的多聚核苷酸，它含有與SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列具有至少95％的等同性的多聚核苷酸序列；(b)一種與SEQ ID NO1的多聚核苷酸具有至少95％的等同性的分離多聚核苷酸；(c)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸包含編碼與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％的等同性的多肽序列的多聚核苷酸序列；(d)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸具有編碼與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少95％的等同性的多肽序列的多聚核苷酸序列；(e)一種分離的具有至少100個(gè)核苷酸的核酸序列的多聚核苷酸，該分離的多聚核苷酸是在嚴(yán)緊雜交條件下，用標(biāo)記的、具有SEQ ID NO1序列的或具有它的至少15個(gè)核苷酸片段的探針通過篩選文庫而獲得的；(f)一種多聚核苷酸，該多聚核苷酸是(a)至(e)中的多聚核苷酸對等的RNA；或者是與所說的分離的多聚核苷酸互補(bǔ)的多聚核苷酸，以及上面提到的多聚核苷酸的變異體和片段的多聚核苷酸，或者是與上面提到的多聚核苷酸在其全長范圍上互補(bǔ)的多聚核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所要求的分離的多聚核苷酸、其選自下組(a)一種包含SEQ ID NO1多聚核苷酸的分離的多聚核苷酸；(b)SEQ ID NO1的分離的多聚核苷酸；(c)一種分離的多聚核苷酸，該多聚核苷酸含有編碼SEQ ID NO2的多肽的多聚核苷酸；和(d)一種分離的編碼SEQ ID NO2的多肽的多聚核苷酸。
6.一種表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)所說的載體存在于相容的宿主細(xì)胞中時(shí)，該表達(dá)系統(tǒng)含有能夠產(chǎn)生權(quán)利要求1的多肽的多聚核苷酸。
7.一種含有權(quán)利要求6的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞或者一種表達(dá)權(quán)利要求1的多肽的該細(xì)胞膜。
8.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1的多肽的方法，該方法包括在可充分產(chǎn)生所說的多肽和從培養(yǎng)基中回收該多肽的條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求7中限定的宿主細(xì)胞的步驟。
9.一種由免疫球蛋白Fc-區(qū)和權(quán)利要求1的任何一種多肽組成的融合蛋白。
10.一種對權(quán)利要求1至3之任一權(quán)利要求的多肽具有免疫特異性的抗體。
11.一種用于篩選以便鑒定能夠刺激或者抑制權(quán)利要求1的多肽的功能或水平的化合物的方法，該方法包括選自下組的方法(a)直接或間接地通過一種與候選化合物相關(guān)的標(biāo)記，定量或定性地測量或檢測候選化合物與多肽(或與表達(dá)該多肽的細(xì)胞或膜)或與它的一種融合蛋白的結(jié)合；(b)在一種標(biāo)記的競爭劑存在的情況下，測量一種候選化合物與多肽(或與表達(dá)該多肽的細(xì)胞或膜)或與它的一種融合蛋白的結(jié)合；(c)利用對表達(dá)該多肽的細(xì)胞或細(xì)胞膜合適的檢測系統(tǒng)，檢驗(yàn)候選化合物是否導(dǎo)致由該多肽激活作用或抑制作用產(chǎn)生的信號；(d)把含有權(quán)利要求1的多肽的一種溶液與候選化合物混合，以形成混合物，測定該混合物中多肽的活性，以及與不含候選化合物的對照混合物比較該混合物的活性；或(e)檢測候選化合物對編碼所述多肽的mRNA或細(xì)胞中所述多肽產(chǎn)生的影響效果，例如，用ELISA分析，以及(f)按照生物工程或化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)所說的化合物。
全文摘要
本文公開了ANIC－BP多肽和多聚核苷酸以及通過重組技術(shù)產(chǎn)生這樣的多肽的方法,也公開了在診斷試驗(yàn)中利用ANIC－BP多肽和多聚核苷酸的方法。
文檔編號C12P21/02GK1357041SQ00809310
公開日2002年7月3日 申請日期2000年6月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月22日
發(fā)明者I·丹達(dá)阿斯, V·費(fèi)施爾, C·賽費(fèi)爾德, L·溫枚爾啻尼爾 申請人:默克專利股份有限公司