專利名稱：耐缺鐵性稻類的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐缺鐵性禾本科植物的生產(chǎn)方法、經(jīng)此法獲得的禾本科植物、種植所述禾本科植物的方法以及經(jīng)此法獲得的作物。
更具體而言，本發(fā)明涉及通過引入基因來生產(chǎn)耐缺鐵性禾本科植物，其中所述基因編碼禾本科植物的麥根酸(mugineic acid)合成途徑中的酶，更優(yōu)選所述酶是煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶。
背景技術(shù)：
地球上90％的土壤是存在某種問題的不良土壤。通常，不良土壤根本性地和在一定程度上缺乏植物生長所必需的元素，因此，植物生長受阻，或者因土壤含有大量重金屬而發(fā)生生長紊亂。典型的不良土壤是旱地鹽積土(salt accumulated soil)。在這種土壤中，因人為漫灌或長期干旱而積聚了NaCl和Na2CO3，或者在表土層中積聚了CaCO3或CaSO4。鹽成土引起鹽密度紊亂，石灰性土壤引起缺鐵紊亂。
地球上約30％的耕作土壤據(jù)說是潛在的缺鐵地區(qū)(Wallece等(1960))。半干旱地區(qū)的石灰性土壤具有因毛細(xì)管效應(yīng)從地心物質(zhì)中洗脫出的石灰質(zhì)成分，其積聚到地表面上。在此土壤中，pH升高成堿性，因此，土壤中的鐵以Fe(OH)3的形式存在并具有極低的溶解度。
在這些土壤中生長的植物具有缺鐵失綠癥，其生長受阻或者死亡。
高等植物的獲鐵體系分為兩類策略I體系和策略II體系。策略I體系是除禾本科植物外的高等植物的獲鐵體系，其中，土壤中不可溶的三價鐵被存在于根部細(xì)胞表面上的三價鐵還原酶還原，然后被二價鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸附。在具有該體系的那些植物中，有些具有如下體系，其釋放質(zhì)子到根圍中，通過降低根圍的pH來增加三價鐵還原酶的活性；有些具有如下體系，其釋放酚類化合物到根圍中，并通過Fe(III)-酚化合物螯合物來向細(xì)胞表面上的三價鐵還原酶提供Fe(III)。近期的研究分離了轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRTl(Eibe等(1996))，其特異性地出現(xiàn)在arabidopsis thaliana的根部，并分離了arabidopsis thaliana的三價鐵還原酶的基因(Robinson等(1997))。
策略II體系是僅在單子葉植物中的禾本科植物中觀察到的獲鐵體系。禾本科植物釋放出在缺鐵環(huán)境中具有三價鐵螯合活性的麥根酸，并從根吸收作為“Fe(III)-麥根酸”復(fù)合體的鐵(Takagi等(1984))。已知有7種麥根酸類(MA)麥根酸(MA)、2’-脫氧麥根酸(DMA)、3-羥基麥根酸(HMA)、3-表羥基麥根酸(epiHMA)、燕麥蛋白酸(avenin acid；AVA)、distichon acid和表羥基脫氧麥根酸(epiHDMA)。如


圖1所示，所有這些麥根酸(MA)都是用甲硫氨酸作為前體合成的(Shojima等(1999)，Ma等(1998))。
麥根酸的分泌具有晝夜節(jié)律(Takagi等，同上)，在日落后其分泌達(dá)到頂峰，而在夜間不分泌。此外，觀察到在缺鐵性大麥中在分泌前顆粒膨脹，在分泌后顆粒萎縮(Nishizawa等(1987))。因此相信，麥根酸是在所述顆粒中合成的。這些事實(shí)說明禾本科植物對缺鐵作出的反應(yīng)不僅是通過麥根酸的合成來形成的，而且還是通過一種復(fù)雜系統(tǒng)來形成的，所述復(fù)雜系統(tǒng)例如為缺鐵信號的傳遞和根部形狀的變化。
據(jù)報道，煙酰胺合成酶的基因已被分離且該基因是受缺鐵誘導(dǎo)的，所述煙酰胺合成酶是一種與麥根酸合成途徑相關(guān)的酶。(Higuchi等(1999))。此外，煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)基因已被分離且其是受缺鐵誘導(dǎo)的(Takahashi等(1997))。
此外，通過使用從缺鐵大麥根和對照大麥根中提取的mRNA進(jìn)行示差篩選，分離了專一地在缺鐵條件下被誘導(dǎo)出的基因Ids1、Ids2和Ids3。Ids1是編碼金屬硫蛋白的基因(Okumura等(1991))。Ids2是一個這樣的基因，其中從其遺傳序列推出的氨基酸序列與氫氧化酶是同源的(Okumura等(1994))。Ids3也是這樣一個基因，其中從其遺傳序列推出的氨基酸序列與氫氧化酶是同源的(Nakanishi等(1993))。在表羥基麥根酸合成途徑中存在兩種氫氧化物反應(yīng)，相信催化該反應(yīng)的酶是由此基因編碼的。
此外，由大麥根缺鐵所誘導(dǎo)的蛋白的例子是IDS3蛋白、腺嘌呤-核糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶(Itai等(1999))、甲酸脫氫酶(Suzuki等(1998))和36kDa蛋白(Irifune(1991))。禾本科植物在缺鐵條件下生物合成麥根酸。此時，相信根部所含的甲硫氨酸減少，以便在甲硫氨酸循環(huán)中合成了甲硫氨酸，同時為了將產(chǎn)生的腺嘌呤轉(zhuǎn)化成AMP，誘導(dǎo)出腺嘌呤-核糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶(Itai等，同上)。
甲酸脫氫酶分解在甲硫氨酸循環(huán)中產(chǎn)生的甲酸。據(jù)報道，缺鐵性禾本科植物的根部中的線粒體變形，電子傳輸系統(tǒng)的能量降低(Mori等(1991))。相信甲酸脫氫酶是受缺鐵產(chǎn)生的厭氧條件所誘導(dǎo)的，NADH是作為能量來源而被提供的。
隨著人口的增加，食物增產(chǎn)是未來人類生存條件的一個重要的問題。從古代以來，禾本科植物就是最重要的食物之一，但是，事實(shí)上，禾本科植物很難在缺鐵地區(qū)生長。如果有可能在缺鐵地區(qū)種植禾本科植物，食物增產(chǎn)將是可能的，因此，其作為一種增加食物產(chǎn)量的辦法已受到人們的關(guān)注。
發(fā)明公開本發(fā)明的一個目的是提供可在缺鐵地區(qū)生長的耐缺鐵性禾本科植物。
更具體而言，本發(fā)明的一個目的是通過將禾本科植物的麥根酸生物合成途徑中的一種酶的基因?qū)牒瘫究浦参镏衼硖峁┠腿辫F性禾本科植物，所述禾本科植物即使在石灰性堿性土壤中仍旺盛地生長。
本發(fā)明涉及通過將編碼麥根酸生物合成途徑中的酶的基因?qū)牒瘫究浦参飦砩a(chǎn)具有改善的鐵吸收性的禾本科植物的方法，更具體而言，涉及通過導(dǎo)入基因naat來生產(chǎn)具有改善的鐵吸收性的禾本科植物的方法，其中所述酶是煙酰胺(nicotianamine)氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)。
此外，本發(fā)明還涉及所述具有改善的鐵吸收性的禾本科植物的生長方法，以及經(jīng)所述生長獲得的作物。
附圖簡述
圖1顯示了缺鐵大麥根的麥根酸生物合成途徑及其根圍環(huán)境。
圖2顯示了用于禾本科植物轉(zhuǎn)化的雙元載體pIG121Hm的遺傳序列，其中插入了naat-A的cDNA。
圖3是照片而非圖片，其中顯示了通過Southern雜交方法檢測所導(dǎo)入的基因的結(jié)果。圖3中的WT顯示了野生型禾本科植物的情況，對照顯示了其中僅導(dǎo)入載體的對照禾本科植物。1-5、1-6、1-7、8-1和15-2顯示了具有35S啟動子的轉(zhuǎn)化子。
圖4顯示了測量在水培溶液中在含鐵(+Fe)和缺鐵(-Fe)條件下培育的根中的NAAT活性的結(jié)果。在圖4中，透明部分顯示了+Fe的情況，陰影部分顯示了-Fe的情況。WT顯示了野生型禾本科植物，1-5、1-6和1-7顯示的是轉(zhuǎn)化子的情形。
圖5是照片而非圖片，其中顯示了移植至堿性土8周后的各禾本科植物的生長狀態(tài)，圖5中的對照顯示了其中僅導(dǎo)入載體的對照禾本科植物，右邊的禾本科植物是被轉(zhuǎn)化的禾本科植物。
圖6是顯示移植至堿性土后的各禾本科植物的高度變化過程的圖。黑點(diǎn)顯示了轉(zhuǎn)化子15-2，黑正方形顯示了轉(zhuǎn)化子8-1，白點(diǎn)顯示了其中僅導(dǎo)入載體的對照禾本科植物。
圖7顯示了包括分離的基因組naat的噬菌體DNA的限制性酶圖譜。在圖7中，E表示EcoRI，H表示HindIII，B表示BamHI，N表示NotI。在兩個位置處的NotI位點(diǎn)是位于λFIXII臂上的NotI。
圖8顯示了用于禾本科植物轉(zhuǎn)化的雙元載體pBIGRZ1的遺傳序列，其中插入了NAAT基因組的片段。在圖8中，NPTII是卡那霉素抗性基因，HPT是潮霉素抗性基因，GUS是具有內(nèi)含子的β葡糖醛酸糖苷酶基因，LacZ是β半乳糖苷酶基因，35P是35S啟動子，NP是NOS啟動子，NT是NOS終止子，MCS是多克隆位點(diǎn)，Riori是Ri質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)。
圖9是顯示所得基因組naat的堿基序列的圖。
圖10是顯示通過比較naat cDNA序列和naat基因組序列而確定的naat堿基序列、naat-A和naat-B的5’上游、外顯子、內(nèi)含子和3’下游的堿基序列的圖。在
圖10中，大寫字母顯示了在cDNA上轉(zhuǎn)錄的外顯子部分，小寫字母顯示了其余的部分。
圖11是所得基因組片段的示意圖。在
圖11中，E是EcoRI，H是HindIII，B是BamHI。
圖12顯示了naat-A和naat-B的cDNA中的內(nèi)含子的大小。
圖13顯示了以單字母密碼表示的從cDNA推定的NAAT-A的氨基酸序列的氨基酸。
圖14顯示了以單字母密碼表示的從cDNA推定的NAAT-B的氨基酸序列的氨基酸。
圖15是照片而非圖片，其顯示了移植至堿性土后10周的各禾本科植物的生長狀態(tài)，在
圖15中，對照是其中僅導(dǎo)入了載體的對照禾本科植物，右邊的禾本科植物是用基因組naat轉(zhuǎn)化的禾本科植物。
圖16是顯示移植至堿性土后的其中導(dǎo)入了基因組naat的各禾本科植物的高度變化過程的圖。在
圖16中，左邊的禾本科植物是用naat轉(zhuǎn)化的禾本科植物，右邊的禾本科植物是其中僅導(dǎo)入了載體的對照禾本科植物。
發(fā)明的最佳實(shí)施方案所述策略II是在單子葉植物中僅在禾本科植物中觀察到獲鐵體系，其利用了生物合成并釋放麥根酸的方法來獲得鐵。因此，研究了提高麥根酸生物合成途徑(參見
圖1)中的酶的方法。
本發(fā)明人首先注意到了作為麥根酸合成途徑中的一個酶的煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)，然后努力導(dǎo)入基因naat。奇跡般地發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入了所述基因的禾本科植物即使在石灰性堿性土中仍能旺盛生長。
利用XbaI和SacI位點(diǎn)，將煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)naat-A的cDNA整合到pIG121Hm中，制備了圖2中所示的雙元載體。通過導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，所得載體被用于轉(zhuǎn)化。
禾本科植物的轉(zhuǎn)化按照Hiei等的方法進(jìn)行(Hiei等(1994))，并將“Tsukinohikari”用作所述材料。從胚盤中誘導(dǎo)出的愈傷組織沉浸入所述轉(zhuǎn)入的農(nóng)桿菌懸浮液中并在其中感染，獲得再生體(T1植物)。最后，從種子獲得34株經(jīng)轉(zhuǎn)化的禾本科植物。
通過Southern雜交方法檢測所導(dǎo)入的基因。結(jié)果如圖3所示。在圖3中，WT顯示了野生型禾本科植物的情況，對照顯示了其中僅導(dǎo)入載體的對照禾本科植物。1-5、1-6、1-7、8-1和15-2顯示了具有35S啟動子的轉(zhuǎn)化子。如圖3所示，所有轉(zhuǎn)化子具有過表達(dá)的naat-A。此外，發(fā)現(xiàn)在這些35S轉(zhuǎn)化的禾本科植物中，8-1和15-2分別具有所導(dǎo)入naat的至少5個拷貝和2個拷貝。
與野生型和其中僅導(dǎo)入載體的禾本科植物相比，導(dǎo)入了基因naat的禾本科植物被認(rèn)為存在煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)的過度釋放，由此，麥根酸合成途徑被激活，從而大量產(chǎn)生對于鐵攝取所必需的麥根酸。
因此，首先研究了這些植物種中的NAAT活性。發(fā)芽后3周的幼苗(T2)在水培溶液中在含鐵(+Fe)和缺鐵(-Fe)條件下培育2周。NAAT活性的測量結(jié)果如圖4所示。在圖4中，透明部分顯示了+Fe的情況，陰影部分顯示了-Fe的情況。WT顯示了野生型禾本科植物的情況，1-5、1-6和1-7顯示了轉(zhuǎn)化子的情況。
結(jié)果，對于+Fe和-Fe兩種情況，經(jīng)轉(zhuǎn)化的禾本科植物比非轉(zhuǎn)化的野生型禾本科植物(WT)具有較高的比活，此外，還發(fā)現(xiàn)在-Fe條件下所述比活進(jìn)一步增加。這說明基因?qū)氩粌H導(dǎo)致了高NAAT活性，而且在缺鐵條件或不可溶性鐵的條件下轉(zhuǎn)化子的NAAT活性得以顯著促進(jìn)。換言之，認(rèn)為它已成為對缺鐵環(huán)境或不可溶性鐵的環(huán)境具有高耐受性的物種。
基于以上描述，發(fā)現(xiàn)基因naat的導(dǎo)入提高了NAAT的活性。盡管如此，仍調(diào)查了這些轉(zhuǎn)化子是否能在實(shí)際缺鐵土壤中生長。當(dāng)將35S-naat-A轉(zhuǎn)化的禾本科植物移植至堿性土后，其葉子在移植后至多2周內(nèi)變黃，然而，在4-5周后，新葉子變成暗綠色并開始恢復(fù)。圖5是顯示移植至堿性土8周后的生長狀態(tài)的照片。在圖5中，對照顯示了其中僅導(dǎo)入載體的對照禾本科植物，右邊的禾本科植物是經(jīng)轉(zhuǎn)化的禾本科植物。發(fā)現(xiàn)與對照相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化的禾本科植物具有顯著較好的生長。此外，在圖6中顯示了移植至堿性土后的各禾本科植物的高度變化過程。在圖6中，Y軸顯示植物的高度(cm)，X軸顯示其移植至堿性土后的天數(shù)。黑點(diǎn)顯示轉(zhuǎn)化子15-2，黑正方形顯示轉(zhuǎn)化子8-1，白點(diǎn)顯示其中僅導(dǎo)入載體的對照禾本科植物。
如上所述，35S轉(zhuǎn)化的禾本科植物8-1具有所導(dǎo)入naat基因的至少5個拷貝，35S轉(zhuǎn)化的禾本科植物15-2具有所導(dǎo)入naat基因的至少2個拷貝。從圖6中的植物高度判斷，基因的拷貝數(shù)是不相關(guān)的，表示只要導(dǎo)入了所述基因，禾本科植物就獲得了耐缺鐵性。
如上所述，所述基因的導(dǎo)入提高了禾本科植物的麥根酸合成途徑中的酶的活性，此外還發(fā)現(xiàn)由此附加了耐缺鐵性。
對于在本發(fā)明麥根酸合成途徑中的酶，只要其是
圖1所示麥根酸生物合成途徑中的酶且編碼所述酶基因的導(dǎo)入增加其活性，就是可接受的。如上所述，在候選物中，煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)和煙酰胺合成酶是可取的。編碼本發(fā)明禾本科植物的麥根酸合成途徑中的酶的基因是cDNA或從基因組衍生的基因。如下文所述，基因組的應(yīng)用是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例。
因此，對于本發(fā)明的禾本科植物，只要其是可經(jīng)策略II體系吸收鐵的植物就是可接受的，且不限于理論意義上的禾本科植物。本發(fā)明禾本科植物的優(yōu)選實(shí)例是稻類植物、玉米、高粱、小麥、大麥和燕麥。這些禾本科植物可應(yīng)用本發(fā)明的方法而不論其品種，并可生產(chǎn)出具有所導(dǎo)入的靶基因的禾本科植物。
本發(fā)明的啟動子不受限制，只要其可產(chǎn)生靶酶?？墒褂?5S啟動子，更具體而言，可使用CaMV35S啟動子。
本發(fā)明的載體不受具體的限制，只要其可在轉(zhuǎn)化過程中被優(yōu)選使用。本發(fā)明轉(zhuǎn)化方法不限于所述使用農(nóng)桿菌方法的方法，可使用多種(例如，使用粒子槍)的轉(zhuǎn)化方法等。所形成的禾本科植物的細(xì)胞不限于來自所述愈傷組織的細(xì)胞，可使用各種細(xì)胞，但是，通常優(yōu)選使用來自愈傷組織的細(xì)胞。
本發(fā)明所述及的缺鐵性可以是其中缺乏鐵的一種狀態(tài)，但是優(yōu)選其是這樣一種狀態(tài)，其中鐵的存在形式很難被植物吸收，根據(jù)植物的類型，可確定其缺鐵與否。因此，本發(fā)明中的耐缺鐵性的定義是指受測植物對很難吸收土壤中的鐵這一困難環(huán)境的抵抗力。
然后，本發(fā)明人努力將基因組naat代替naat的cDNA來進(jìn)行導(dǎo)入。
對于基因組naat，使用利用從大麥(Horudeum vulgare L.var.Igri)中提取的基因組DNA來制備的文庫(由Stratagen Corp.生產(chǎn))。利用限制性酶Sau3AI部分切割所述文庫，并將其導(dǎo)入λFIXII載體的XhoI位點(diǎn)。對于探針，使用提前分離的naat-A的完整cDNA。將大腸桿菌XL1-Blue(大腸桿菌XL1-Blue MRA(P2))用作宿主。
作為篩選的結(jié)果，獲得了5個噬菌體。從中分離了各噬菌體DNA，并進(jìn)行限制性酶作圖。發(fā)現(xiàn)在所有情況下相同的片段增加。即，發(fā)現(xiàn)所得的5個噬菌體來自基因組的相同部分。其被認(rèn)為含有在探針中使用的naat。因此，測定其中之一的堿基序列，如圖7所示。
圖7所示的噬菌體DNA被插入到質(zhì)粒載體pBIGRZ1的NotI位點(diǎn)，其中可插入10kb或更大的片段，可使用農(nóng)桿菌進(jìn)行禾本科植物的轉(zhuǎn)化(參見圖8)。
此外，將圖7所示的至多11.0kb的片段分成4部分，即A-D，將它們導(dǎo)入質(zhì)粒載體pBluescript SK(-)的EcoRI位點(diǎn)(B、C)或NotI和EcoRI位點(diǎn)(A、D)。
對于片段A-D，使用基于質(zhì)粒上的序列的引物(M13正向引物，M13反向引物)從片段的兩端確定了堿基序列。為了確定DNA堿基序列，使用Shimadzu，Ltd.的DNA測序儀DSQ-2000L。
序列測定詳見實(shí)施例。
序列表中的SEQ ID NO1顯示了所確定的10966bp堿基序列。此外，完整序列如圖9所示(無堿基編號)。
基于所得的堿基序列，該10966bp基因被發(fā)現(xiàn)是編碼所獲得的naat-A和naat-B的大麥基因組的片段。其位次為naat-B、naat-A。
圖10中顯示了通過cDNA比較確定的naat-A和naat-B的5’上游、內(nèi)含子和3’下游。在
圖10中，大寫字母顯示了在cDNA上轉(zhuǎn)錄的外顯子部分，小寫字母顯示了其余的部分。外顯子部分的堿基編號見下。
圖11是所得基因組片段的示意圖。外顯子部分以陰影部分表示。兩個基因均包含6個內(nèi)含子和7個外顯子。此外，內(nèi)含子的插入位置對于各基因是同源的。
圖12顯示了內(nèi)含子在cDNA中的位置和內(nèi)含子的大小。
由cDNA推定的naat-A和naat-B的氨基酸序列分別如
圖13和14所示。
按照所述35S轉(zhuǎn)化的禾本科植物的轉(zhuǎn)化方法來進(jìn)行禾本科植物的轉(zhuǎn)化，其中將所得的大麥基因組naat導(dǎo)入。
然后，對導(dǎo)入所得基因組naat的禾本科植物的耐缺鐵性進(jìn)行檢查。在所得的再生體(T1)中，使用了39個植株和15個其中僅導(dǎo)入載體的對照，以與35S轉(zhuǎn)化的植物相似的方法進(jìn)行檢查。從移植后第5周起，每周或隔周測量植物的高度。每4-5周將它們兩次移植至其中土壤尺寸漸增的罐中。
到移植至堿性土后第2周，經(jīng)轉(zhuǎn)化的具有基因組naat的禾本科植物的葉子變黃，但在第4-5周，新葉子變成暗綠色并開始恢復(fù)，然后他們開始旺盛生長。與此相比，其中僅導(dǎo)入載體的對照組在很長的時間內(nèi)帶有黃葉，從約第8周，新葉開始變綠。
圖15是顯示移植至堿性土10周后的禾本科植物的生長狀態(tài)的照片。
圖15中的對照顯示的是其中僅導(dǎo)入了載體的對照禾本科植物。右邊的禾本科植物是用基因組naat轉(zhuǎn)化的禾本科植物。
圖16顯示移植至堿性土后的禾本科植物的高度變化過程。在
圖16中，Y軸顯示植物的高度(cm)，X軸顯示其移植至堿性土后的天數(shù)。在
圖16中，左邊的禾本科植物是用基因組naat轉(zhuǎn)化的禾本科植物，右邊的禾本科植物是其中僅導(dǎo)入了載體的對照禾本科植物。
基于以上描述，發(fā)現(xiàn)基因組naat的導(dǎo)入使得禾本科植物具有附加的耐缺鐵性。實(shí)施例使用以下實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例I禾本科植物的轉(zhuǎn)化方法，其中存在具有CaMV35S啟動子的過表達(dá)的Naat。
圖2所示的雙元載體是通過使用XbaI和SacI位點(diǎn)將遺傳naat的cDNA整合到pIGl21Hm中來制備的。將這些載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中用于轉(zhuǎn)化。
禾本科植物的轉(zhuǎn)化按照Hiei等的方法進(jìn)行(Hiei等(1994))，并將“Tsukmohikari”用作所述材料。首先，帶殼種子滅菌，在包含N6無機(jī)鹽、30g/L N6維生素、2mg/L蔗糖，2，4-D和2g/L脫乙酰吉蘭糖膠的愈傷組織誘導(dǎo)性培養(yǎng)基(pH5.8)上的種子在25℃下在60μmol/m2s和16小時光照/8小時避光條件下培養(yǎng)3周，從胚盤中誘導(dǎo)出愈傷組織。
在愈傷組織移植到新的培養(yǎng)基中在25℃下在光亮處培養(yǎng)3天后，用農(nóng)桿菌懸浮液培養(yǎng)基(pH5.8)(20g/L AA無機(jī)鹽、氨基酸、B5維生素、2mg/L蔗糖、0.2mg/L 2，4-D、10mg/L細(xì)胞分裂素和乙酰丁香酮)使愈傷組織沉浸入農(nóng)桿菌懸浮液中。然后，在用紙巾使其變干后，其在共存培養(yǎng)基(pH5.2)(30g/L N6無機(jī)鹽和N6維生素、10g/L蔗糖、2mg/L葡萄糖、10mg/L 2，4-D和2g/L乙酰丁香酮脫乙酰吉蘭糖膠)中在暗處于28℃感染3天。
然后，通過用含500mg/L Claforan的無菌洗滌溶液漂洗來去除農(nóng)桿菌，將愈傷組織放置到含50mg/L潮霉素(pH5.8)的選擇性培養(yǎng)基中(30g/L N6無機(jī)鹽和N6維生素、2mg/L蔗糖、2g/L 2，4-D、500mg/L脫乙酰吉蘭糖膠、50mg/L Claforan和潮霉素)，并在25℃下在光亮處培養(yǎng)3周。
培養(yǎng)后，將其轉(zhuǎn)移到再分化培養(yǎng)基(pH5.8)中(30g/L MS無機(jī)鹽和MS維生素、30g/L蔗糖、2g/L山梨糖醇、1mg/L水解酪蛋白氨基酸、2mg/L NAA、500mg/L BAP、50mg/L Claforan、4g/L潮霉素和脫乙酰吉蘭糖膠)，將在3-5周內(nèi)被再分化的再生體(T1植物)轉(zhuǎn)移至檢查培養(yǎng)基。檢查培養(yǎng)基(pH5.8)包含30g/L MS無機(jī)鹽和MS維生素、50mg/L蔗糖、8g/L潮霉素和瓊脂。
將生長至充滿培養(yǎng)皿的植物定植(establish)4-5天，轉(zhuǎn)移至混有1∶1比例的合成培養(yǎng)土(BONSOL 1，Sumitomo Chemical Co.，Ltd.)和蛭石的土壤中，獲取種子。從而獲得34株經(jīng)轉(zhuǎn)化的禾本科植物。實(shí)施例2使用Southern雜交方法檢測所導(dǎo)入的基因研磨在實(shí)施例1中獲得的T1植物的葉子，通過改進(jìn)的C-TAB方法提取基因組。用Hind III處理所提取的基因組，通過使用0.8％瓊脂糖凝膠電泳來進(jìn)行分離。將這些印跡到尼龍膜上。使用在探針上的naat內(nèi)部序列產(chǎn)生的引物，以及通過PCR用32P標(biāo)記的探針，進(jìn)行雜交。然后使用BAS 2000(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)檢測條帶。
Southern雜交方法的結(jié)果如圖3所示。在圖3中，WT顯示野生型禾本科植物，對照顯示其中僅導(dǎo)入載體的對照禾本科植物。1-5、1-6、1-7、8-1和15-2是其中具有35S啟動子的naat-A過表達(dá)的禾木科植物的情況。
基于圖3所示的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在35S轉(zhuǎn)化的禾本科植物中，至少5個naat拷貝和至少2個naat拷貝被分別引入到8-1和15-2中。實(shí)施例3使用堿性土檢查耐缺鐵性使用包括以下組合物的古殼層土(fossil shell soil)作為樣品土。
水含量 0.48％總磷酸鹽 0.12％總鉀 0.12％總硅酸鹽 22.79％總石灰 37.82％總鎂 0.91％總錳 0.018％總硼 0.003％堿 38.80％鹽酸不溶性物質(zhì) 28.88％氧化鐵 0.99％氧化鋁 5.59％鋅 0.002％所述土壤中的可溶性鐵含量是22ppm，pH是8.78，電阻是0.03mΩ。
如下進(jìn)行對35S轉(zhuǎn)化的植物的檢查，首先，從再生體(T1)獲得的種子播種在含50mg/L的MS固體培養(yǎng)基上并進(jìn)行篩選，在它們定植后，使用生長到20-25cm的幼苗植物(T2)。
對27個品種的34株植物中的16個進(jìn)行耐缺鐵性檢查。檢查方法如下將紙巾和濾紙剪成圓形，并放置到塑料黑罐(0.5L)的底部，用堿性土添滿。將植物轉(zhuǎn)移到罐中，然后從罐底部放入位于罐底2-3cm處的水培溶液(Kasugai溶液7×10-4M K2PO4，1×10-4M KCl，1×10-4MKH2PO4，2×10-3M Ca(NO3)2，5×10-4M MgSO4，1×10-5M H3BO3，5×10-7M MnSO4，5×10-7M ZnSO4，2×10-4M CuSO4，1×10-8M(NH4)3MoO24，1.5×10-4M Fe-EDTA)中，在溫室中生長，白天30℃，夜晚25℃。將堿性土在3-4周后增加至1L，在8-9周后增加至2L并轉(zhuǎn)移。從移植后第2周，每周或隔周測量植物高度。
對在+Fe(鐵存在)或-Fe(缺鐵)水培溶液中生長的經(jīng)轉(zhuǎn)化的禾本科植物(35S-naat禾本科植物)的NAAT比活的測量如下進(jìn)行。發(fā)芽后3周的幼苗植物(T2)在+Fe和-Fe水培溶液中生長，測量各植物根部的NAAT活性。結(jié)果如圖4所示。在圖4中，透明部分顯示了+Fe的情況，陰影部分顯示了-Fe的情況。WT顯示了野生型禾本科植物的情況，1-5、1-6和1-7顯示了轉(zhuǎn)化子的情況。
對于+Fe和-Fe兩種情況，經(jīng)轉(zhuǎn)化的禾本科植物比非轉(zhuǎn)化的野生型(WT)禾本科植物具有較高的比活，在-Fe條件下其比活甚至更高(參見圖4)。實(shí)施例4使用堿性土檢查耐缺鐵性將35S-naat-A轉(zhuǎn)化的禾本科植物轉(zhuǎn)移至堿性土并觀察其生長情況。
35S-naat-A轉(zhuǎn)化的禾本科植物葉子變黃，直至移植后第二周，然而，在第4-5周，新葉子變成暗綠色并開始恢復(fù)。因此發(fā)現(xiàn)naat的導(dǎo)入使禾本科植物具有耐缺鐵性。
圖5是顯示移植至所述土壤8周后的禾本科植物的生長狀態(tài)的照片。在圖5中，對照顯示了其中僅導(dǎo)入載體的對照禾本科植物，右邊的禾本科植物是經(jīng)轉(zhuǎn)化的禾本科植物。
圖6是顯示移植至堿性土后的禾本科植物的高度變化過程的圖。在圖6中，Y軸顯示植物的高度(cm)，X軸顯示其移植至堿性土后的天數(shù)。黑點(diǎn)顯示轉(zhuǎn)化子15-2，黑正方形顯示轉(zhuǎn)化子8-1，白點(diǎn)顯示其中僅導(dǎo)入載體的對照禾本科植物。
發(fā)現(xiàn)通過導(dǎo)入基因naat，可給禾本科植物添加耐缺鐵性(參見圖5和6)。實(shí)施例5分離naat-A和B基因組克隆按照“Cloning and Sequence”(Nosonbunka)進(jìn)行篩選。
將從Stratagnen Corp.購買的λFIXII文庫用作文庫。其是使用從大麥(Horudeum vulgare L.var.Igri)提取的基因組DNA制備的。基因組DNA用限制性酶部分切割并導(dǎo)入λFIXII載體的XhoI位點(diǎn)。文庫的插入片段大小是9-23kb。
(1)大腸桿菌(XL1-BLUE MRA(P2))在NZCYM液體培養(yǎng)基(10gNZ胺、5g NaCl、1g水解酪蛋白氨基酸、5g細(xì)菌用酵母抽提物、2gMgSO47H2O和約6mL 1N NaOH用1L蒸餾水(pH7.5)稀釋并用高壓滅菌)中培養(yǎng)過夜，然后離心，然后懸浮在20mL 10mM MgSO4溶液中。
(2)100mL的該大腸桿菌懸浮液和100mL的噬菌體稀釋液(其量在篩選平板(9cm×13cm)上產(chǎn)生25,000個噬斑進(jìn)行混合，37℃放置20分鐘，然后與8mL的50℃0.7％上層瓊脂(每100mL加入0.7g瓊脂糖)混合，并播種到篩選板上(9cm×13cm)。板放置在37℃，然后培養(yǎng)直至噬斑大小達(dá)到0.5mm。
(3)將尼龍膜HYBOND-N(Amersham Corp.)剪成板的大小，然后放置到上層瓊脂糖的上部30秒。將其放到用變性液(0.5M NaOH、1.5MNaCl)浸過的濾紙上，并使表面與噬斑的上面接觸。將另一膜放置到上層瓊脂上，放置1分鐘。類似地，將其放到用變性液浸過的濾紙上。在放置5分鐘后，將第二個膜移至用中和液(0.5M Tris-HCl，pH8.0，1.5MNaCl)浸過的濾紙上。在放置5分鐘后，用2xSSPE(0.02M NaH2PO4pH7.4、0.3M NaCl、2mM EDTA)充分洗滌兩次，然后干燥。
(4)為了使用提前分離的naat-A的全長cDNA，將位于質(zhì)粒載體pYH23的HindIII位點(diǎn)和NotI位點(diǎn)上的那些切下并純化。使用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒VER.2(Takara Shuzo CO.，Ltd))用[α-32P]dATP對其進(jìn)行標(biāo)記。
用預(yù)熱至65℃的30mL雜交緩沖液(6x SSPE、5x Denhart溶液、0.1％SDS、100mg/mL已變鮭精DNA)在65℃進(jìn)行預(yù)雜交1小時，然后更換為雜交緩沖液(25mL)。
將上述探針加入該溶液中，在65℃雜交12小時。膜用預(yù)熱至65℃的清洗液(5x SSPE)清洗兩次，共10分鐘，用65℃的高度嚴(yán)格清洗液(2 XSSPE、0.1％SDS)清洗一次。膜用莎倫包裝膜包裹，過夜顯影至成像板(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)，用影像分析儀(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)獲得結(jié)果。
使用的試劑為20 X SSPE(0.2M NaH2PO4pH7.4、3M NaCl和20mM EDTA)、50x denhart溶液、5g FICOLL 400、5g聚乙烯吡咯烷酮(MW 360,000)和5g小牛血清白蛋白，其溶解在500mL蒸餾水中，用0.45mm濾器過濾。
(5)將在兩種膜上均出現(xiàn)噬斑的情況確定為陽性，將與所述位置相符的噬斑從培養(yǎng)皿中切下。將切下的噬斑放入SM溶液(50mM Tris-HClpH7.5、0.1M NaCl、7mM MgSO4和0.01％明膠)，并在4℃下保存。然后，使用該噬菌體溶液以相似的方法進(jìn)行第二和第三次篩選。最后，得到5個噬菌體。
分離上述獲得的5個噬菌體中的每一個的DNA，并進(jìn)行限制性酶作圖。發(fā)現(xiàn)對于所有情況，相同的片段增加。即，發(fā)現(xiàn)所得的5個噬菌體來自基因組的相同部分。此外，其被認(rèn)為含有用于探針的naat。因此，測定其中之一的堿基序列，如圖7所示。在圖7中，E表示EcoRI，H表示HindIII，B表示BamHI，N表示NotI。在兩個位置處的NotI位點(diǎn)是位于λFIXII臂上的NotI。實(shí)施例6亞克隆化和堿基序列的確定(1)圖7所示的噬菌體DNA被插入到質(zhì)粒載體pBIGRZ1的NotI位點(diǎn)，其中可插入10kb或更大的片段，可使用農(nóng)桿菌進(jìn)行禾本科植物的轉(zhuǎn)化。將第1個NotI位點(diǎn)至圖7所示噬菌體DNA 11.0kb處的NotI位點(diǎn)的11.0kbp片段切下并插入質(zhì)粒載體pBIGRZ1的NotI位點(diǎn)(參見圖8)。在圖8中，NPTII是卡那霉素抗性基因，HPT是潮霉素抗性基因，GUS是具有內(nèi)含子的β葡糖醛酸糖苷酶基因，LacZ是β半乳糖苷酶基因，35P是35S啟動子，NP是NOS啟動子，NT是NOS終止子，MCS是多克隆位點(diǎn)，Riori是Ri質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)。
換言之，確定了該11.0kb片段的堿基序列。對于其余禾本科植物的轉(zhuǎn)化，使用由此產(chǎn)生的構(gòu)建體。
(2)pBIGRZ1穩(wěn)定地維持在大腸桿菌(XL1-BLUE)中。對含有該構(gòu)建體的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，使用質(zhì)粒調(diào)節(jié)劑PI-50α(KurashikiBoseki Co.，Ltd.)從中提取質(zhì)粒。
(3)將圖7所示至多11.0kb的片段分成4部分，即A-D，將它們導(dǎo)入質(zhì)粒載體pBluescript SK(-)的EcoRI位點(diǎn)(B、C)或NotI和EcoRI位點(diǎn)(A、D)。
(4)對于片段A-D，使用基于質(zhì)粒上的序列的引物(M13正向引物，M13反向引物)從片段的兩端確定堿基序列。使用Shimadzu，Ltd.的DNA測序儀DSQ-2000L來確定DNA堿基序列。
(5)對各片段確定對堿基序列的上述部分進(jìn)行進(jìn)一步讀碼的引物并制備該引物，制備用于證實(shí)已讀序列的反向引物，依次確定堿基序列。最后，從5’和3’端雙向確定所有片段的序列。用于確定各片段堿基序列的引物序列如下所示。
為應(yīng)用于DSQ-2000L，用異硫氰酸熒光素FITC在5’端標(biāo)記這些引物。片段A的引物名稱序列F-A1FFITC-5′-gct act agt agt att cct ggt gta g名稱序列F-A1RFITC-5′-gga gta cta cta gac tac acc agg a名稱序列F-A2FFITC-5′-aca tgc gca tgc atg aat tgc cg名稱序列F-A2RFITC-5′-caa ttc atg cat gcg cat gtg cc片段B的引物名稱序列F-B1FFITC-5′-ggt caa gta tgc agt atg ttg gaa c名稱序列F-B1RFITC-5′-gtt cca aca tac tgc ata ctt gac c名稱序列F-B2FFITC-5′-cta gaa gcc tat gga tgt ttc ttt tgg名稱序列F-B2RFITC-5′-cca aaa gaa aca tcc ata ggc ttc tag名稱序列F-B3FFITC-5′-agt tct tat caa ttt ccg aga tga c
名稱序列F-B3RFITC-5′-ata gtc atc tcg gaa att gat aag a名稱序列F-B4FFITC-5′-agt ggt cac cat gcg gac caa cac c名稱序列F-B4RF1TC-5′-ggt gtt ggt ccg cat ggt gac cac t片段C的引物名稱序列F-C1FFITC-5′-cac cgg cca gtt caa ctg cta cgc名稱序列F-C1RFITC-5′-gcg tag cag ttg aac tgg ccg gtg名稱序列F-C2FFITC-5′-ttt gga gga gat cca tga cga cat a名稱序列F-C2RFITC-5′-tat gtc gtc atg gat ctc ctc caa a名稱序列F-C3FFITC-5′-tct tct cat atg cta ctg tgg gga t名稱序列F-C3RFITC-5′-tga cat gca aca cag gga cat gag c片段D的引物名稱序列F-D1FFITC-5′-cat gct gac gaa gag cga ggt cat a名稱序列F-D1RFITC-5′-ccc agg ata tga cct tag tgg ttg g(6)對于不能完全確定的序列部分，使用ABI PRISMTM 310基因分析儀，新合成了以下引物，所述分析儀是PerkinElmer Japan，Inc.的自動DNA測序儀。片段B的引物名稱序列B5F5′-gaa tgg caa act ggg tcc gca tta c名稱序列B5R5′-gta atg cgg acc cag ttt gcc att c名稱序列B6F5′-ctg gtt gtt gtg gcc tgg acg aaa c名稱序列B6R5′-gtt tcg tcc agg cca caa caa cca 9名稱序列B7F5′-agc aca aac cct acc tat gtt agg c名稱序列B7R5′-gcc taa cat agg tag ggt ttg tgc t片段C的引物名稱序列C4F5′-tgg aat ttc gcc cgg ggc aag gac
名稱序列C4R5′-ccc tgt gac aag tgc tct gct acg名稱序列C5F5′-tct ggg atc tca gtg cat cca aca名稱序列C5R5′-gaa gca tat atc agt caa aca taa cc此外，為確定片段A和B間以及片段B和C間的連接區(qū)，制備了以下引物。使用PerkinElmer Japan，Inc.的自動DNA測序儀ABIPRISMTM 310基因分析儀確定了在(1)中所制備的構(gòu)建體的堿基序列。對于片段A和B間的邊界區(qū)名稱序列A-eF5′-cac atc ctt tgc ctt gct gaa tat gg名稱序列B-tR5′-cag tag tac taa tta atc acc tta gta gc對于片段B和C間的邊界區(qū)名稱序列B-eF5′-caC gat caa cca aag aat gtc ctc c名稱序列C-tR5′-tac ttg tat atgcag ctc cag cac(7)已確定的10,966bp堿基序列在序列表中SEQ ID NO1已顯示。完整的序列參見圖9(無堿基編號)。
基于所得的堿基序列，發(fā)現(xiàn)這10,966bp基因是迄今獲得的編碼naat-A和naat-B的大麥基因組的片段。次序是naat-B和naat-A。
圖10中顯示了通過與所示cDNA比較得以確定的naat-A和naat-B的5’上游、外顯子、內(nèi)含子和3’下游。在
圖10中，大寫字母表示在cDNA上轉(zhuǎn)錄的外顯子，小寫字母代表其余的部分。外顯子部分的堿基編號如下。naat-B第1外顯子579-1299(起始密碼子6518)
第2外顯子1483-1825第3外顯子1922-2140第4外顯子2244-2303第5外顯子2761-2916第6外顯子3263-3356第7外顯子3735-4033(終止密碼子3868)naat-A第1外顯子6457-6897(起始密碼子6518)第2外顯子7029-7371第3外顯子7479-7697第4外顯子7784-7843第5外顯子8285-8440第6外顯子8738-8831第7外顯子9414-9732(終止密碼子9547)示意圖如
圖11所示。陰影部分為外顯子部分。兩個基因均是由6個內(nèi)含子和7個外顯子形成的。此外，內(nèi)含子的插入位置是同源的。
圖12顯示了在cDNA中插入內(nèi)含子的位置和插入內(nèi)含子的大小。
圖13和14顯示了由cDNA推定的naat-A和naat-B的氨基酸序列。實(shí)施例7導(dǎo)入大麥基因組naat的禾本科植物的轉(zhuǎn)化方法除了以下(1)至(3)點(diǎn)之外，以與35S轉(zhuǎn)化的禾本科植物相似的方式實(shí)施上述實(shí)施例6中獲得的大麥基因組naat導(dǎo)入禾本科植物的轉(zhuǎn)化方法。
(1)愈傷組織的誘導(dǎo)在28℃在暗處進(jìn)行，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含0.3g/L N6無機(jī)鹽和N6維生素、30g/L水解酪蛋白氨基酸、2mg/L蔗糖、2.8g/L 2，4-D、4g/L脯氨酸和脫乙酰吉蘭糖膠(pH5.8)。
(2)其用農(nóng)桿菌在25℃感染，共存培養(yǎng)基包含30g/L N6無機(jī)鹽和N6維生素、10g/L蔗糖、1g/L葡萄糖、2mg/L水解酪蛋白氨基酸、20mg/L 2，4-D、2g/L乙酰丁香酮和脫乙酰吉蘭糖膠(pH5.2)。該過程是通過濾紙敷在上面而進(jìn)行。
(3)選擇時，使用選擇培養(yǎng)基，第1周含10mg/L潮霉素，第2周含30μg/L潮霉素，最后2周含50mg/L潮霉素，在28℃下在暗處培養(yǎng)。
使用包含1g/L N6無機(jī)鹽和N6維生素、水解酪蛋白氨基酸、30g/L蔗糖、2mg/L 2，4-D、250mg/L Claforan、10-50mg/L潮霉素和2g/L脫乙酰吉蘭糖膠(pH5.8)的選擇培養(yǎng)基，使用包含30g/L MS無機(jī)鹽和MS維生素、30g/L蔗糖、30g/L山梨糖醇、2g/L水解酪蛋白氨基酸、1.1g/LMES、2mg/L NAA、1mg/L細(xì)胞分裂素、250mg/L CLAFORAN、50mg/L潮霉素和4g/L脫乙酰吉蘭糖膠(pH5.8)的再分化培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)。實(shí)施例8檢查具有所導(dǎo)入的基因組Naat的禾本科植物的耐缺鐵性以與35S轉(zhuǎn)化的植物相似的方式，對所得再生體(T1)中具有所導(dǎo)入的基因組Naat的禾本科植物的39個植株和15個僅導(dǎo)入載體的對照進(jìn)行檢查，檢查它們的耐缺鐵性。從移植后的第5周起，每周或隔周測量植物的高度。每4-5周將它們兩次轉(zhuǎn)移到土壤尺寸漸增的罐中。
到移植至堿性土后第2周，經(jīng)轉(zhuǎn)化具有基因組naat的禾本科植物的葉子變黃，但在第4-5周，新葉子變成暗綠色并開始恢復(fù)，然后他們開始旺盛生長。與此相比，其中僅導(dǎo)入載體的對照組在很長的時間內(nèi)帶有黃葉，從約第8周，新葉開始變綠。基于這一事實(shí)，發(fā)現(xiàn)naat的導(dǎo)入使禾本科植物具有耐缺鐵性(參見
圖15和16)。
圖15是顯示移植至堿性土后的禾本科植物的生長狀態(tài)的照片。
圖15中的對照顯示了其中僅導(dǎo)入了載體的對照禾本科植物。右邊的禾本科植物是用基因組naat轉(zhuǎn)化的禾本科植物。
圖16顯示移植至堿性土后的禾本科植物的高度變化過程。在
圖16中，Y軸顯示植物的高度(cm)，X軸顯示其移植至堿性土后的天數(shù)。在
圖16中，左邊的禾本科植物是用基因組naat轉(zhuǎn)化了的禾本科植物，右邊的禾本科植物是其中僅導(dǎo)入了載體的對照禾本科植物。
基于這一事實(shí)，發(fā)現(xiàn)naat的導(dǎo)入使禾本科植物的耐缺鐵性增強(qiáng)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了具有耐缺鐵性的新禾本科植物，并提供了可在缺鐵栽培區(qū)生長的新禾本科植物。
此外，本發(fā)明提供了可通過向禾本科植物中導(dǎo)入編碼麥根酸合成途徑中的酶的基因來獲得的具有改善的鐵吸收性的禾本科植物的新技術(shù)。
序列表<110>科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團(tuán)(Japan Science and Technology Corporation)<120>在石灰性土壤中生產(chǎn)耐缺鐵性轉(zhuǎn)基因禾本科植物(Creation of the transgenicgraminaceous plants tolerant to Fe-deficiency in calcareous soils)<130>JA903969<150>JP11-190318<151>1999-07-05<160>1<210>1<211>10966<212>DNA<213>大麥(Horudeum vulgare L.var.Igri)<400>1ctcgatccca ttgcaatggt atgattagct atcaaacgaa agaaagagat ggcatgtgcc 60ctgtgtgtca tccctcactg gcttggcgaa tggcgatacc gagttaggta gagtgttttt 120ttagcatgat gtctgccggc actgccaaga aaactgcgtg cagcggactg caggagagtt 180gagcgatgca tgctttgtga tgagcggagc tgagtgggtg tcactaactg aacccaatca 240gcattgggtg agtcgagtcg agaagcatca tgcttcctgc gtcccgatcc gcttatcttt 300ttctcccaaa ttattaaaga gggatagatg atggtgtgct gggttgggta gagtacgtgc 360atagaaccaa agcgaggcgc cgaaaatatg ccggggataa tggtggcagg ccgcaacggc 420cacgcccgtc agctggcagc ggcgtgccag agcgtgccag agcgtgcgcg cgtgcgtgct 480tcttgctgcc ggccccggtt cgtgtgcggt cagagcaacg gctatatagg accgtcaatc 540accgctactc aatccgtccc caactcgttt cctattaccg ctactagtag tattcctggt 600gtagtctagt agtactcctc ctcctccttc tcctcctacc cgtttcctca tggccaccgt 660acgccagagc gacggagtcg ccgcgaacgg ccttgccgtg gccgcagccg cgaacggcaa 720gagcaacggc catggcgtgg ctgccgccgt gaacggcaag agcaacggcc atggcgtgga 780tgccgacgcg aacggcaaga gcaacggcca tggcgtggct gccgacgcga acggcaagag 840caacggccat gccgaggcca ctgcgaacgg ccacggcgag gccactgcga acggcaagac 900caacggccac cgcgagagca acggccatgc tgaggccgcc gacgcgaacg gcgagagcaa 960cgagcatgcc gaggactccg cggcgaacgg cgagagcaac gggcatgcgg cggcggcggc1020agaggaggag gaggcggtgg agtggaattt cgcgggtgcc aaggacggcg tgctggcggc1080gacgggggcg aacatgagca tccgggcgat acggtacaag atcagcgcga gcgtgcagga1140gaaggggccg cggcccgtgc tgccgctggc ccacggggac ccgtccgtgt tcccggcctt1200ccgcacggcc gtcgaggccg aggacgccgt cgccgccgcg ctgcgcaccg gccagttcaa1260ctgctacccc gccggcgtcg gcctccccgc cgcacgaagg taacaacaac aacaacacaa1320gaacaatttc cttttcgcgt gtcgtgtcgc gcggcaatcc atgcatgcgc atgtgccgct1380ttcacgtgtc cgtccgtccg tccaccgttc cttcctcctc cctacgccca 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1.生產(chǎn)禾本科植物的方法，包括導(dǎo)入編碼麥根酸生物合成途徑中的酶的基因的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)，其編碼基因是naat。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中啟動子是CaMV35S。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述基因是基因組基因。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述基因組是大麥基因組naat。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述基因的堿基序列是序列表中的SEQID NO1所示的堿基序列，或可在嚴(yán)格條件下與所述堿基序列雜交并有可能產(chǎn)生具有煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)活性的蛋白的堿基序列或其互補(bǔ)堿基序列。
7.一種耐缺鐵性禾本科植物，其是按照權(quán)利要求1-6中任一項的方法生產(chǎn)的。
8.一種種子，其是權(quán)利要求7的禾本科植物的種子。
9.一種細(xì)胞，其是權(quán)利要求7的禾本科植物的細(xì)胞。
10.一種在缺鐵地區(qū)種植禾本科植物的方法，其中所述禾本科植物是如權(quán)利要求7所述的禾本科植物。
11.一種禾本科作物，其是經(jīng)權(quán)利要求10的方法獲得的。
全文摘要
本發(fā)明公開了即使在缺鐵地區(qū)仍可生長的耐缺鐵性禾本科植物,更具體而言,耐缺鐵性且即使在石灰性堿性土壤中仍能旺盛生長的禾本科植物,其是通過將禾本科植物中麥根酸生物合成途徑中的酶的基因轉(zhuǎn)移到禾本科植物中來構(gòu)建的。本發(fā)明還公開了構(gòu)建具有改善的鐵吸收性的禾本科植物的方法,其包括將麥根酸生物合成途徑中的酶(優(yōu)選煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶;NAAT)的基因轉(zhuǎn)移到禾本科植物中。本發(fā)明亦公開了由上述方法構(gòu)建的禾本科植物;栽培上述具有改善的鐵吸收性的禾本科植物的方法;通過所述栽培獲得的作物。即,耐缺鐵性的新禾本科植物的構(gòu)建。
文檔編號C12N15/09GK1360466SQ00810004
公開日2002年7月24日 申請日期2000年7月4日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月5日
發(fā)明者森敏, 中西啟仁, 高橋美智子, 西澤直子 申請人:科學(xué)技術(shù)振興事業(yè)團(tuán)