專利名稱：L－表－2－肌醇單酮新的制備方法和表肌醇新的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-表-2-肌醇單酮的一步制備法，L-表-2-肌醇單酮本身具有生物活性，并且作為合成藥物和其它物質(zhì)的原料也具有很高的價(jià)值，在該方法中使用便宜的原料化合物內(nèi)消旋肌醇，并在不涉及任何化學(xué)合成方法的微生物作用下轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮。本發(fā)明還涉及表肌醇的有效制備方法，表肌醇本身具有生物活性，并且適于用作藥物，在該方法中，使L-表-2-肌醇單酮化學(xué)還原。
L-表-2-肌醇單酮是已知物質(zhì)，由下列平面結(jié)構(gòu)式(B)表示 或由下列立體結(jié)構(gòu)式(B′)表示 此外，已知表肌醇是化學(xué)合成物質(zhì)，由下列平面結(jié)構(gòu)式(C)表示 或由下列立體結(jié)構(gòu)式(C′)表示 表肌醇是內(nèi)消旋肌醇的一種立體異構(gòu)體。
通常已知，肌醇單酮(也稱作五羥基環(huán)己酮或脂環(huán)族己酮糖)已經(jīng)由下列方法合成肌醇的生物氧化[A.J.Kluyver和A.Boezaardt″Rec.Tray.Chim.″58，p.956(1939)]，肌醇的酶促氧化[L.Anderson等″Arch.Biochem.Biophys.″78，p.518(1958)]，在鉑催化劑存在下用空氣氧化肌醇[K.Heyns和H.Paulsen″Chem.Ber.″86，p.833(1953)]，或者用氧化劑例如硝酸氧化肌醇[T.Posternak″Helv.Chim.Acta″19，p.1333(1936)]。
已知的可以通過內(nèi)消旋肌醇(肌醇中的一種)的生物氧化或酶促氧化制備的肌醇單酮只有一種肌醇單酮，即青蟹肌糖(也稱作內(nèi)消旋肌單酮-2)[A.J.Kluyver和A.Boezaardt″Rec.Trav.Chim.″58，p.956(1939)；L.Anderson等″Arch.Biochem.Biophys.″78，p.518(1958)]。未見任何有關(guān)微生物能使內(nèi)消旋肌醇氧化成為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的報(bào)道。L-表-2-肌醇單酮適于用作合成D-手肌醇(縮寫為DCI)的原料[參見U.S.P No.5,406,005]。DCI適于用作治療胰島素耐藥性糖尿病的藥物(WO 90/10439)，并且預(yù)期可以用作改善多囊卵巢綜合征的藥物[J.A.Nestler等″NEW Engl.J.Med.″340，p.1314(1999)]。已知的有關(guān)L-表-2-肌醇單酮制備方法的報(bào)道有(1)合成L-表-2-肌醇單酮的方法在氧化鉑催化劑存在下，用硝酸將內(nèi)消旋肌醇氧化形成DL-表-2-肌醇單酮(即(±)-表-2-肌醇單酮)的外消旋混合物，然后在氧化鉑催化劑存在下用氫使所得外消旋混合物還原以生成表肌醇，并用微生物弱氧化醋桿菌(Acetobacter snboxydans)使表肌醇微生物氧化以產(chǎn)生L-表-2-肌醇單酮(T.Posternak″Helv.Chim.Acta″29，p.1991(1946))。還報(bào)道了(2)合成L-表-2-肌醇單酮的方法在由D-葡糖醛酸化學(xué)合成葡糖二醛糖(glucodialdose)后，通過偶姻-縮合可以制備該化合物中的一種(U.S.5,406,005)。
肌醇是由環(huán)己烷衍生的六元醇的通用名，并且肌醇包括九種立體異構(gòu)體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，天然存在的肌醇包括五種肌醇，即內(nèi)消旋肌醇、D-手肌醇(chiro-inositol)、L-手肌醇、粘液肌醇和青蟹肌醇(scyllo-inositol)。其他肌醇包括表肌醇、異肌醇(allo-inositol)、新肌醇(neo-inositol)和順肌醇(cis-inositol)。后四種肌醇是非天然存在的肌醇，它們是通過化學(xué)合成制備。在非天然存在的肌醇中，表肌醇預(yù)期可用作改善精神抑郁和焦慮綜合征的藥物[R.H.Belmaker等，WO 99/22727(PCT專利申請(qǐng)PCT/IL/00523)；和R.H.Belmaker等，″Int.J.Neuropsychopharmacol.″ Vol.1，p.31(1998)]。
已經(jīng)報(bào)道的已知的表肌醇的制備方法是(1)合成表肌醇的方法，包括用硝酸將內(nèi)消旋肌醇氧化形成D，L-表-2-肌醇單酮外消旋混合物，然后在氧化鉑催化劑存在下用氫還原[T.Posternak″Helv.Chim.Acta″29.p.1991(1946)]；(2)合成表肌醇的方法，包括用鋨酸將環(huán)己二烯的二元醇氧化[T.Tschamber等，″Helv.Chim.Acta″75，p.1052(1992)]；(3)合成表肌醇的方法，包括將四氫苯醌氫化[L.OdierEP專利申請(qǐng)公開524082]；和(4)合成表肌醇的方法，包括適當(dāng)保護(hù)粘液肌醇，然后將其被保護(hù)的衍生物聯(lián)合氧化與還原[K.E.Espelia等，″Carbohydrate Res.″46，p.53(1976)]。還有一種已知的合成表肌醇的方法，包括用合適的還原劑使葡萄糖或半乳糖聯(lián)合進(jìn)行Ferrier環(huán)化反應(yīng)和還原反應(yīng)[Takahashi等，″J.Org.Syn.Chem.Soc.，Japan″58，p.120(2000)]。
但是，這些已知的L-表-2-肌醇單酮和表肌醇的合成方法不能令人滿意地用于大規(guī)模制備表肌醇，因?yàn)橐阎姆椒ù嬖谌缦聠栴}它們操作復(fù)雜，涉及環(huán)境污染和/或造價(jià)太高。因此，一直需要尋求新的方法，該方法可以以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)L-表-2-肌醇單酮，容易操作、高效，并且該新的方法可以容易并高效地生產(chǎn)表肌醇。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供這樣新的制備L-表-2-肌醇單酮的方法和制備表肌醇的方法，它們滿足上述要求并且顯示出很多優(yōu)點(diǎn)，而且它們可以有效地生產(chǎn)L-表-2-肌醇單酮或表肌醇。
此外，我們調(diào)查了是否具有將內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮活性或能力的微生物廣泛存在于自然界中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，具有將內(nèi)消旋肌醇氧化并轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的高活性或能力的某些微生物菌株存在于下列許多分類學(xué)品種中屬于革蘭氏陰性菌的各種革蘭氏陰性菌，例如屬于假單胞菌科的黃單胞菌屬(Xanthomonas)或假單胞菌屬(Pseudomonas)的革蘭氏陰性菌；屬于醋酸桿菌科(Acetobacteraceae)的醋酸桿菌屬(Acetobacter)或葡糖桿菌屬(Gluconobacter)的細(xì)菌；屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細(xì)菌；屬于腸桿菌科(Enterobacteriacea)的歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)的細(xì)菌；以及屬于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的巴斯德氏菌屬(Pasteurella)或嗜血桿菌屬(Haemophilus)的細(xì)菌。在這些微生物菌株中，尤其可以提及的是上述黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB10119，它是具有將內(nèi)消旋肌醇氧化并轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的高活性或能力的微生物菌株的一個(gè)實(shí)例。還可以列舉的是假單胞菌屬菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215和歐文氏菌屬菌株(Erwiniasp.)10135，它們均是我們從土壤樣品中新近分離出來的。
根據(jù)本發(fā)明人的上述發(fā)現(xiàn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種L-表-2-肌醇單酮的新的制備方法，如下所述。因此，我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，當(dāng)微生物黃單胞菌(Xanthomonassp.)AB10119或假單胞菌屬菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215和歐文氏菌屬菌株(Erwinia sp.)10135或其他合適的菌株在需氧條件下，無論是在含有一定量?jī)?nèi)消旋肌醇、常用碳源和常用氮源的液體培養(yǎng)基中，或是在含有含有一定量?jī)?nèi)消旋肌醇(其中一部分可以用作碳源)并含有氮源(根據(jù)培養(yǎng)條件，如果所述的所用氮源是有機(jī)天然氮源，則一部分氮源也可以用作碳源)、而不含任何常用碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，均可以有效地由內(nèi)消旋肌醇產(chǎn)生L-表-2-肌醇單酮，并使L-表-2-肌醇單酮積聚在所得培養(yǎng)肉湯中。我們還發(fā)現(xiàn)，按照上述L-表-2-肌醇單酮新的制備方法，通過從所述培養(yǎng)肉湯中除去微生物的微生物細(xì)胞，可以使在所述培養(yǎng)肉湯中積聚的L-表-2-肌醇單酮保持溶解在培養(yǎng)肉湯上清液中，并且通過下述方法可以以高純度產(chǎn)物的形式、有效地回收L-表-2-肌醇單酮用離子交換樹脂如陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂等處理所述培養(yǎng)肉湯上清液，或者用活性炭處理所述培養(yǎng)肉湯上清液，或者處理所述培養(yǎng)肉湯上清液使L-表-2-肌醇單酮結(jié)晶，或者采用這些處理的任何組合方式。
此外，本發(fā)明人還進(jìn)行了另一項(xiàng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從上述含有L-表-2-肌醇單酮(該L-表-2-肌醇單酮是在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物產(chǎn)生和積聚的)的培養(yǎng)肉湯中除去微生物細(xì)胞，得到培養(yǎng)肉湯上清液，并向含有L-表-2-肌醇單酮的所得培養(yǎng)肉湯上清液中直接加入合適量的還原劑如硼氫化鈉或任何與硼氫化鈉等同的氫化物型還原劑，然后將L-表-2-肌醇單酮與還原劑反應(yīng)，可以有效地將L-表-2-肌醇單酮還原成表肌醇。換句話說，我們發(fā)現(xiàn)，通過在培養(yǎng)肉湯上清液中用所述還原劑使L-表-2-肌醇單酮還原，然后從所述培養(yǎng)肉湯上清液中分離L-表-肌醇單酮，可以將L-表-2-肌醇單酮有效地還原成表肌醇。
我們還進(jìn)行了以下各種試驗(yàn)用能夠通過使內(nèi)消旋肌醇氧化將內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的革蘭氏陰性菌、特別是上述黃單胞菌菌株(Xanthomonas sp.)AB 10119處理內(nèi)消旋肌醇的方法；以及無需從所述培養(yǎng)肉湯上清液中分離L-表-2-肌醇單酮，直接用合適的還原劑處理存在于培養(yǎng)肉湯上清液中的L-表-2-肌醇單酮，以在所述培養(yǎng)肉湯上清液中產(chǎn)生表肌醇的方法。由這些試驗(yàn)我們得到許多發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明是基于我們所得到的這些發(fā)現(xiàn)完成的。
本發(fā)明第一方面提供了L-表-2-肌醇單酮的制備方法，其特征在于該方法包括將內(nèi)消旋肌醇與能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物反應(yīng)，由此將內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮，以產(chǎn)生L-表-2-肌醇單酮。
按照本發(fā)明第一方面的L-表-2-肌醇單酮的制備方法可以通過下面所述的兩種方法(A)和(B)之一實(shí)施。
方法(A)包括在需氧條件下，在含有一定量?jī)?nèi)消旋肌醇、碳源和氮源的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，由此使所述微生物與內(nèi)消旋肌醇反應(yīng)，并在所得培養(yǎng)肉湯中產(chǎn)生和積聚L-表-2-肌醇單酮，然后收獲所述培養(yǎng)肉湯；以及從所得培養(yǎng)肉湯中除去所述微生物的微生物細(xì)胞，由此得到含有在其中產(chǎn)生并積聚的L表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯上清液，然后用離子交換樹脂、或者用活性炭處理所述培養(yǎng)肉湯上清液，或者處理所述培養(yǎng)肉湯上清液使L-表-2-肌醇單酮結(jié)晶，或者采用這些處理的任何組合方式，由所得培養(yǎng)肉湯上清液中回收L-表-2-肌醇單酮。
方法(B)包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，然后從所得培養(yǎng)肉湯中分離所述微生物的微生物細(xì)胞；將所分離的微生物細(xì)胞加至含有溶解于其中的一定量?jī)?nèi)消旋肌醇的緩沖液或液體培養(yǎng)基中，并使所加入的微生物細(xì)胞與在所述緩沖液或所述液體培養(yǎng)基中的內(nèi)消旋肌醇反應(yīng)，在所得反應(yīng)溶液或在所得培養(yǎng)肉湯中將內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮；以及通過用離子交換樹脂、或者用活性炭處理所述反應(yīng)溶液或所述培養(yǎng)肉湯，或者處理所述反應(yīng)溶液或所述培養(yǎng)肉湯使L-表-2-肌醇單酮結(jié)晶，或者采用這些處理的任何組合方式，回收在所述反應(yīng)溶液或所述培養(yǎng)肉湯中產(chǎn)生并積聚的L-表-2-肌醇單酮。
在本發(fā)明第一方面的方法中所用的微生物可以是任何微生物菌株，只要其具有使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的活性或能力。
如上所列舉的，有許多細(xì)菌可以由內(nèi)消旋肌醇產(chǎn)生L-表-2-肌醇單酮，如上文所述。例如如上面所解釋的、我們從土壤樣品中分離得到的菌株AB10119、菌株AB 10215和菌株AB 10135，并且它們是用于本發(fā)明方法中最有效的菌株。這三種菌株的微生物學(xué)性質(zhì)示于下面表1a、表1b、表1c和表1d中。
我們順便按照題為Shin Saikin Baichigaku Koza(2nd Edition，published by Kindai Shuppan)、《醫(yī)學(xué)微生物鑒定指南》(A Guide onIdentification of Medical Bacteria(2nd Edition，published by KindaiShuppan))和《細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》(A Manual on Practice of Bacteriology(published by Maruzen Publishing Company))的日本教科書的方法進(jìn)行了試驗(yàn)，以鑒別上述三種微生物。另外，參照Bergey′s Manual of SystematicBacteriology Vol.1(1984)的方法，對(duì)我們的上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，以識(shí)別所分離的細(xì)菌菌株。表1a-1


表1a-2


表1b


表1c



表1d


上述AB 10119菌株的形態(tài)學(xué)特征主要為該菌株是革蘭氏陰性柱狀，形成有黃色色素沉著的、0.4-0.6×0.6-4.0μm大小的菌落。該AB 10119菌株是催化酶陽性和氧化酶陰性的，并且在需氧條件下分解葡萄糖產(chǎn)生酸。該AB 10119菌株在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不良，但是向基本培養(yǎng)基中加入蛋氨酸則獲得該菌株的良好生長(zhǎng)。該AB 10119菌株不具有還原硝酸鹽的能力，并且對(duì)0.01％甲基綠和硫堇敏感。在菌株AB 10119細(xì)胞中的輔酶Q類型是Q8，并且DNA的GC含量是68％。
總結(jié)AB 10119菌株的這些形態(tài)學(xué)性質(zhì)，可以判斷該菌株是屬于黃單胞菌屬的微生物菌株。按照Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1，pp.119-210(1984)，已知的黃單胞菌屬細(xì)菌包括五種，即田野黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、草莓黃單胞菌(Xanthomonas frapariae)、甘蔗白紋病黃單胞菌(Xanthomonas albilineans)、地毯草黃單胞菌(Xanthomonas axonopodis)和葡萄酒黃單胞菌(Xanthomonas ampelina)。
將AB 10119菌株與上述五種已知菌株的形態(tài)學(xué)的性質(zhì)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，菌株AB 10119最類似于已知的田野黃單胞菌菌株。然而，由于該AB 10119菌株的形態(tài)學(xué)性質(zhì)與那些田野黃單胞菌菌株不完全一致，因此我們將這種新的菌株指定為黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119，以使其與已知的所述菌株區(qū)別開來，并且我們已經(jīng)將其保藏在經(jīng)認(rèn)可的日本保藏機(jī)構(gòu)，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，(National Institute of Bioscienceand Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，座落于1-3，1-chome，Higashi，Tsukuba-City，Ibaraki Prefecture，Japan)，保藏號(hào)為FERMP-17382(保藏日期是1999年5月7日)。然后，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該AB 10119菌株從2000年5月23日起以保藏號(hào)FERM BP-7168再保藏于同一保藏機(jī)構(gòu)。
上述AB 10215菌株的形態(tài)學(xué)特征主要為該菌株是革蘭氏陰性柱狀，形成有淡黃色色素沉著的、0.3-0.5×0.6-6.5μm大小的菌落。該AB 10215菌株是催化酶陽性和氧化酶陰性的，并且在需氧條件下分解葡萄糖產(chǎn)生酸。該AB 10215菌株在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，具有還原硝酸鹽的能力，并且對(duì)0.01％甲基綠和硫堇敏感。在菌株AB 10215細(xì)胞中的輔酶Q類型是Q8，并且DNA的GC含量是68％。
總結(jié)AB 10215菌株的這些形態(tài)學(xué)性質(zhì)，該菌株呈現(xiàn)為最類似于已知的Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1，pp.140-199(1984)中所述的嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia)菌株。然而，由于該AB10215菌株的形態(tài)學(xué)性質(zhì)與已知的嗜麥芽假單胞菌菌株不完全一致，因此我們將這種新的菌株指定為假單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10215，以使其與已知的所述菌株區(qū)別開來，并且我們已經(jīng)將其保藏在經(jīng)認(rèn)可的日本保藏機(jī)構(gòu)，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(座落于1-3，1-chome，Higashi，Tsukuba-City，Ibaraki Prefecture，Japan)，保藏號(hào)為FERM P-17804(保藏日期是2000年3月31日)。然后，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該AB 10215菌株從2000年5月23日起以保藏號(hào)FERM BP-7170再保藏于同一保藏機(jī)構(gòu)。
上述AB 10135菌株的形態(tài)學(xué)特征主要為該菌株是革蘭氏陰性柱狀，形成有乳白色色素沉著的、0.4-0.6×0.8-2.0μm大小的菌落。該AB 10135菌株在需氧和厭氧條件下均分解葡萄糖，但是與其在需氧條件下生長(zhǎng)相比，該AB 10135菌株在厭氧條件下生長(zhǎng)非常不好。此外，該AB 10135菌株是催化酶陽性和氧化酶陰性的，并且在需氧條件下分解葡萄糖產(chǎn)生酸。該AB10135菌株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)極差，但是在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中加入5％蔗糖可以獲得非常大量的生長(zhǎng)。在該菌株細(xì)胞中的輔酶Q類型是Q8，并且DNA的GC含量是68％。
總結(jié)AB 10135菌株的這些形態(tài)學(xué)性質(zhì)，可以判斷該菌株屬于歐文氏菌屬。按照Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology Vol.1，pp.469-476(1984)，已知的歐文氏菌屬細(xì)菌菌株分為15種，但是AB 10135菌株與任何一種已知的菌株均不完全一致，因此我們將這種新的菌株指定為歐文氏菌(Erwinia sp.)AB 10135，以使其與已知的歐文氏菌株區(qū)別開來，并且我們已經(jīng)將其保藏在經(jīng)認(rèn)可的日本保藏機(jī)構(gòu)，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，(座落于1-3，1-chome，Higashi，Tsukuba-City，Ibaraki Prefecture，Japan)，保藏號(hào)為FERM P-17803(保藏日期是2000年3月31日)。然后，根據(jù)布達(dá)佩斯條約，該AB 10135菌株從2000年5月23日起以保藏號(hào)FERMBP-7169再保藏于同一保藏機(jī)構(gòu)。
下面更詳細(xì)地描述本發(fā)明第一方面的兩種方法，即方法(A)和方法(B)。
在方法(A)中，第一步是在需氧條件下，在含有一定量?jī)?nèi)消旋肌醇、碳源和氮源的液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，以在所得培養(yǎng)肉湯中產(chǎn)生和積聚L-表-2-肌醇單酮。
對(duì)于該方法所述第一步中使用的液體培養(yǎng)基的組成沒有特別限制，只要其能夠達(dá)到預(yù)期的目的。所用液體培養(yǎng)基可以是任何培養(yǎng)基，其中含有一定量的內(nèi)消旋肌醇作為轉(zhuǎn)化成L-表-2-肌醇單酮的原料，此外，其中含有碳源、氮源、天然有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源、無機(jī)鹽及其他成分。既可以使用已知的合成培養(yǎng)基、也可以使用已知的天然培養(yǎng)基?？扇〉氖?，該步驟所用液體培養(yǎng)基含有0.1％-40％、優(yōu)選20％-30％內(nèi)消旋肌醇，含有0.1％-20％、優(yōu)選0.5％-5％葡萄糖、蔗糖、麥芽糖或淀粉作為碳源，并且含有0.01％-5.0％，優(yōu)選0.5％-2.0％酵母提取物、胨、酪蛋氨基酸、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨或尿素作為氮源等。此外，有益的是，如果需要，向該液體培養(yǎng)基中加入能夠產(chǎn)生鈉、鉀、鈣、鎂、鈷、錳、鋅、鐵、銅、鉬、磷酸根、硫酸根或其他離子的無機(jī)鹽。當(dāng)所用微生物在所得培養(yǎng)肉湯中氫離子的濃度調(diào)節(jié)至pH4-10、優(yōu)選5-9的條件下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以有效地產(chǎn)生L-表-2-肌醇單酮。
微生物的培養(yǎng)條件可以根據(jù)微生物菌株和所用培養(yǎng)基的性質(zhì)發(fā)生變化，但是培養(yǎng)溫度可以是5-40℃、優(yōu)選20-37℃。還優(yōu)選在需氧條件下，通過振搖液體培養(yǎng)基或向液體培養(yǎng)基中吹入空氣等方法對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)周期可以是內(nèi)消旋肌醇在所得培養(yǎng)肉湯中完全消耗、并且在所得培養(yǎng)肉湯中所產(chǎn)生和積聚的L-表-2-肌醇單酮的量達(dá)到最大的一段時(shí)間。培養(yǎng)周期通常為1-14天，優(yōu)選3-10天。因此，在上述方法的第一步中可以得到含有L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯。
然后進(jìn)行第二步驟，其中從培養(yǎng)肉湯中回收所需的L-表-2-肌醇單酮。為此回收目的，可以采用任何從培養(yǎng)肉湯中分離與純化任何普通水溶性和中性物質(zhì)的常用方法。因此，首先從含有L-表-2-肌醇單酮的所得培養(yǎng)肉湯中除去本發(fā)明所用微生物的微生物細(xì)胞，然后用活性炭或者用離子交換樹脂處理所得培養(yǎng)肉湯上清液，由此除了L-表-2-肌醇單酮之外，幾乎可以從培養(yǎng)肉湯上清液中除去所有雜質(zhì)。但是使用OH-型強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂不可能有效地進(jìn)行離子交換樹脂處理，因?yàn)镺H-型強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂可以使L-表-2-肌醇單酮化學(xué)分解。此后，可以從已經(jīng)用活性炭或離子交換樹脂處理過的培養(yǎng)肉湯上清液中分離所需的L-表-2-肌醇單酮，在經(jīng)過這種方式處理的所述培養(yǎng)肉湯上清液中，L-表-2-肌醇單酮可以從溶液中結(jié)晶出來，并且如果需要，可以進(jìn)一步重結(jié)晶。
為了從所述培養(yǎng)肉湯上清液中有效地回收L-表-2-肌醇單酮，更優(yōu)選的是采取下列步驟，包括將含有所積聚L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯上清液通過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂、例如Duolite(注冊(cè)商標(biāo))C-20(H+型)柱，以除去不需要的成分，收集柱流出液，用去離子水洗滌該柱，收集所得水洗液，將所述流出液與水洗液合并，將所得合并的溶液過弱堿性陰離子交換樹脂、例如Duolite(注冊(cè)商標(biāo))A368S(游離堿形式)柱，收集所得后一柱的流出液，用去離子水洗滌后一柱，收集所得水洗液，并將后一流出液與后一水洗液合并，得到含有L-表-2-肌醇單酮、而基本上不含任何雜質(zhì)的水溶液。然后可以將所得水溶液濃縮，得到L-表-2-肌醇單酮的濃縮溶液，然后向其中加入適當(dāng)量的乙醇。將含有L-表-2-肌醇單酮和乙醇的所得混合物在室溫或更低溫度下放置過夜，L-表-2-肌醇單酮可以以純的結(jié)晶形式結(jié)晶出來。在本發(fā)明第一方面的上述方法(B)中，進(jìn)行幾個(gè)步驟，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有所需能力的微生物，從所得培養(yǎng)肉湯中分離所述微生物的微生物細(xì)胞，并將分離的微生物細(xì)胞加至含有內(nèi)消旋肌醇的緩沖溶液或液體培養(yǎng)基中，然后使所述微生物細(xì)胞與內(nèi)消旋肌醇在所述緩沖溶液或所述液體培養(yǎng)基中反應(yīng)，以在由所述緩沖溶液或所述液體培養(yǎng)基得到的反應(yīng)溶液中產(chǎn)生L-表-2-肌醇單酮。
作為內(nèi)消旋肌醇與微生物細(xì)胞反應(yīng)步驟中所用的微生物細(xì)胞，可以使用從方法(A)的第一步驟得到的培養(yǎng)肉湯中分離收集的細(xì)胞，或者可以使用在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下、在獨(dú)立的步驟中培養(yǎng)所述微生物獲得的細(xì)胞。按照分離微生物細(xì)胞的已知方法，通過離心、過濾或采用其他方法處理培養(yǎng)肉湯，可以從培養(yǎng)肉湯中有效地收集微生物細(xì)胞。
作為內(nèi)消旋肌醇與微生物細(xì)胞反應(yīng)中所用的反應(yīng)培養(yǎng)基，既可以使用液體培養(yǎng)基，又可以使用緩沖溶液。作為所述液體培養(yǎng)基，可以使用與前述方法(A)第一步驟中所用的培養(yǎng)基具有類似組成的培養(yǎng)基。還可以使用如下的液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由所述培養(yǎng)肉湯上清液組成，所述培養(yǎng)肉湯上清液是通過在分離的步驟中培養(yǎng)所述微生物，然后從所得培養(yǎng)肉湯中除去微生物的微生物細(xì)胞獲得的?？梢允褂脻舛葹?0-500mM、優(yōu)選20-100mM的磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液或Good′s CHES緩沖液等作為所述的緩沖液。內(nèi)消旋肌醇在內(nèi)消旋肌醇溶解于緩沖液或液體培養(yǎng)基中的溶液中的起始濃度優(yōu)選為0.1-40％(重量)。
內(nèi)消旋肌醇與微生物細(xì)胞有效反應(yīng)的反應(yīng)條件可以根據(jù)所用微生物菌株和培養(yǎng)基或緩沖液的性質(zhì)而變化。通常，反應(yīng)溫度可以是5-60℃、優(yōu)選10-45℃，反應(yīng)時(shí)間可以是1-50小時(shí)，優(yōu)選3-48小時(shí)。液體培養(yǎng)基或緩沖液的pH可以是2-10，優(yōu)選3-9。
在內(nèi)消旋肌醇與微生物細(xì)胞的反應(yīng)完成后，可以按照與上述方法(A)第二步驟中所用同樣的方法，從所得反應(yīng)溶液中分離目的產(chǎn)物L(fēng)-表-2-肌醇單酮。
本發(fā)明第二方面提供了表肌醇的制備方法，其特征在于該方法包括在含水反應(yīng)介質(zhì)中，將能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物與內(nèi)消旋肌醇反應(yīng)，以在所述含水反應(yīng)培養(yǎng)基中生成L-表-2-肌醇單酮，由此得到含有所述微生物的微生物細(xì)胞的以及在其中產(chǎn)生的L-表-2-肌醇單酮的所得反應(yīng)溶液，從所述反應(yīng)溶液中除去微生物細(xì)胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的反應(yīng)溶液濾液，向含有L-表-2-肌醇單酮的所述反應(yīng)溶液濾液中直接加入適當(dāng)?shù)倪€原劑，并使還原劑與L-表-2-肌醇單酮反應(yīng)，生成表肌醇和內(nèi)消旋肌醇。
本發(fā)明第二方面的該方法在實(shí)踐中可以通過下列方法(C)、(D)和(E)三種方法之一進(jìn)行。
本發(fā)明第二方面的方法(C)包括步驟一(第一階段)，在需氧條件下、在由含有一定量?jī)?nèi)消旋肌醇、碳源和氮源的液體培養(yǎng)基組成的含水基質(zhì)中，按照與本發(fā)明第一方面方法的方法(A)中所述相同的培養(yǎng)微生物的步驟，培養(yǎng)能夠?qū)⒒钚詢?nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，以使內(nèi)消旋肌醇與所述微生物在液體反應(yīng)基質(zhì)或所得培養(yǎng)肉湯中反應(yīng)，由此將內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮，并在所述培養(yǎng)肉湯中產(chǎn)生和積聚L-表-2-肌醇單酮，如此得到培養(yǎng)肉湯，即含有所述微生物的微生物細(xì)胞和L-表-2-肌醇單酮的所得反應(yīng)溶液；和步驟二(第二階段)，從所得到的培養(yǎng)肉湯、即所述反應(yīng)溶液中除去所述微生物的微生物細(xì)胞，由此得到培養(yǎng)肉湯上清液，即含有所產(chǎn)生的L-表-2-肌醇單酮(無需進(jìn)行L-表-2-肌醇單酮的分離)的反應(yīng)溶液濾液；以及步驟三(第三階段)，向所得培養(yǎng)肉湯上清液(即所述反應(yīng)溶液濾液)中直接加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與該還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)，由此在所述培養(yǎng)肉湯上清液(即所述反應(yīng)溶液濾液)中產(chǎn)生表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；第四步(第四階段)，從所得還原反應(yīng)的反應(yīng)溶液、即含有所產(chǎn)生的表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的培養(yǎng)肉湯上清液中回收表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；以及第五步(第五階段)，將所回收的表肌醇與內(nèi)消旋肌醇彼此分離。
本發(fā)明第二方面的方法(D)包括步驟一(第一階段)，在需氧條件下、在含有碳源和氮源的液體培養(yǎng)基中，按照與本發(fā)明第一方面方法的方法(B)中所述相同的培養(yǎng)微生物的步驟，培養(yǎng)能夠?qū)⒒钚詢?nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，由此得到所述微生物的培養(yǎng)肉湯，然后從所得培養(yǎng)肉湯中分離所述微生物的微生物細(xì)胞；步驟二(第二階段)，在由含水緩沖液或液體培養(yǎng)基組成的含水反應(yīng)基質(zhì)中，將所分離的所述微生物的微生物細(xì)胞與內(nèi)消旋肌醇反應(yīng)，由此在所述液體反應(yīng)基質(zhì)中產(chǎn)生L-表-2-肌醇單酮；步驟三(第三階段)，從所得到的含有所述微生物的微生物細(xì)胞以及在其中生成的L-表-2-肌醇單酮的所得含水反應(yīng)溶液中除去所述微生物的微生物細(xì)胞，由此得到已經(jīng)除去微生物細(xì)胞、而L-表-2-肌醇單酮仍溶解于其中的所得反應(yīng)溶液濾液；步驟四(第四階段)，向所述反應(yīng)溶液濾液中加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L表-2-肌醇單酮與所述還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)，由此在所述反應(yīng)溶液濾液中產(chǎn)生表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；第五步(第五階段)，從所得含有所產(chǎn)生的表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的還原反應(yīng)的反應(yīng)溶液中回收表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；以及第六步(第六階段)，將所回收的表肌醇與內(nèi)消旋肌醇彼此分離。
本發(fā)明第二方面方法的方法(E)是上述方法(C)和(D)的改進(jìn)方法。方法(E)包括如下的方法，其中在L-表-2-肌醇單酮與所加入的還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)之前，進(jìn)行這樣一個(gè)預(yù)備步驟，即，將由含有L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯上清液或反應(yīng)溶液濾液組成的含水基質(zhì)的pH調(diào)至pH8-12的堿性pH范圍；然后進(jìn)行的步驟是，向含有L-表-2-肌醇單酮和pH8-12的該堿性含水介質(zhì)中加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與所述還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)。按照方法(E)，可以以表肌醇產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于副產(chǎn)物內(nèi)消旋肌醇產(chǎn)率的方式產(chǎn)生所需的表肌醇。
本發(fā)明第二方面的方法所用的微生物可以與本發(fā)明第一方面的方法所用的微生物相同，是能夠?qū)?nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物。
下面更詳細(xì)地解釋本發(fā)明第二方面方法的上述方法(C)和(E)。
簡(jiǎn)要地說，在本發(fā)明第二方面方法的方法(C)中，第一階段包括用具有所需能力的微生物接種含有一定量?jī)?nèi)消旋肌醇的營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，在需氧條件下培養(yǎng)接種的微生物，由此轉(zhuǎn)化內(nèi)消旋肌醇，并在所得培養(yǎng)肉湯中產(chǎn)生和積聚L-表-2-肌醇單酮，收獲含有所需L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯；第二階段包括從所收獲的培養(yǎng)肉湯中回收微生物細(xì)胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯上清液；第三階段包括向所述培養(yǎng)肉湯上清液中直接加入合適的還原劑、而不從培養(yǎng)肉湯上清液中分離L-表-2-肌醇單酮，然后進(jìn)行L-表-2-肌醇單酮的還原反應(yīng)；以及第四階段包括從所得反應(yīng)溶液中回收所產(chǎn)生的表肌醇。
因此，本發(fā)明第二方面方法的方法(C)由進(jìn)行第一階段開始，包括在含有一定量?jī)?nèi)消旋肌醇的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有所需能力的微生物，以使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化，并在所得培養(yǎng)肉湯中產(chǎn)生和積聚L-表-2-肌醇單酮，收獲含有L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯。該第一階段可以按照與前述方法(A)第一步驟完全相同的方式進(jìn)行。
在方法(C)的第二階段，從所述第一階段收獲的培養(yǎng)肉湯中回收所述微生物的微生物細(xì)胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯上清液。在隨后的第三階段，將氫化物作為還原劑直接加入所得培養(yǎng)肉湯上清液中之后進(jìn)行L-表-2-肌醇單酮的還原反應(yīng)，在所述培養(yǎng)肉湯上清液中產(chǎn)生表肌醇和內(nèi)消旋肌醇。所用還原劑可以是能夠使L-表-2-肌醇單酮在含水基質(zhì)中還原成表肌醇的那些。可取的還原劑是例如硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鉀、三甲氧基硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉。還原反應(yīng)可以在0℃至室溫的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。當(dāng)L-表-2-肌醇單酮完全消耗、或者所需反應(yīng)產(chǎn)物的量達(dá)到預(yù)期的適當(dāng)水平時(shí)，即為還原反應(yīng)的終點(diǎn)。因此，在該第三階段中，得到了含有所產(chǎn)生的表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的培養(yǎng)肉湯上清液作為還原反應(yīng)的反應(yīng)溶液。
然后進(jìn)行第四階段，即，從第三階段得到的作為還原反應(yīng)的反應(yīng)溶液的培養(yǎng)肉湯上清液中回收所產(chǎn)生的表肌醇和內(nèi)消旋肌醇。在該回收的第四階段中，優(yōu)選下列方法，包括將第三階段得到的所述含表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的培養(yǎng)肉湯上清液通過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂、例如Duolite(注冊(cè)商標(biāo))C-20(H+型)柱，以除去不需要的成分，收集柱流出液，用去離子水洗滌該陽離子交換樹脂柱，收集所得水洗液，將所述流出液與水洗液合并，將所得合并的溶液過弱堿性陰離子交換樹脂、例如Duolite(注冊(cè)商標(biāo))A113(OH-形式)柱，收集所得后一柱的流出液，用去離子水洗滌后一陰離子交換樹脂柱，收集所得水洗液，并將后一流出液與后一水洗液合并，得到含有表肌醇和內(nèi)消旋肌醇、而基本上不含任何雜質(zhì)的水溶液。
在方法(C)的最后一步(第五階段)中，從上述第四階段中得到的表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的水溶液中將表肌醇和內(nèi)消旋肌醇彼此分離出來。為了分離這些產(chǎn)物，優(yōu)選采取如下方法，該方法包括減壓濃縮所述表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的水溶液，使所得濃縮物通過強(qiáng)堿性陰離子樹脂、例如Amberlite(注冊(cè)商標(biāo))CG-400(OH-型)柱，然后用去離子水洗脫該陰離子樹脂柱，分別收集含有大部分內(nèi)消旋肌醇的洗出液餾分和含有所需表肌醇的洗出液餾分作為獨(dú)立的餾分。將含有表肌醇的水溶液(洗出液餾分)濃縮，向所得表肌醇濃縮溶液中加入適當(dāng)量的乙醇。將所得混合物在室溫或更低溫度下放置過夜，使純的L-表-2-肌醇單酮產(chǎn)物以結(jié)晶的形式結(jié)晶出來。
此外，對(duì)于方法(C)，如果方法(C)的第四階段是如下進(jìn)行，即含有還原反應(yīng)產(chǎn)生的表肌醇的培養(yǎng)肉湯上清液用系列排列的多個(gè)離子交換樹脂柱處理，則可以得到含有表肌醇和內(nèi)消旋肌醇、但是基本上不含雜質(zhì)的水溶液。根據(jù)我們的發(fā)現(xiàn)，如果按照下列方法進(jìn)行方法(C)的第五階段，可以將表肌醇與內(nèi)消旋肌醇有效地分離開，所述方法包括將上述含有表肌醇和內(nèi)消旋肌醇、但是基本上不含雜質(zhì)的水溶液濃縮；使所得濃縮液通過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂柱，該樹脂柱含有帶磺酸基作為離子交換基團(tuán)的苯乙烯聚合物(Ca2+型)、例如Diaion(注冊(cè)商標(biāo))UBK 520M(Ca2+型)；由此將表肌醇和內(nèi)消旋肌醇吸附在所述柱上；然后用去離子水洗脫該柱。
簡(jiǎn)要地說，在本發(fā)明第二方面方法的方法(D)中，第一階段包括在需氧條件下、在液體營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)具有所需能力的微生物，并從所得培養(yǎng)肉湯中分離所述微生物的微生物細(xì)胞，由此得到大量所述的微生物細(xì)胞；第二階段包括，在由含一定量溶解于其中的內(nèi)消旋肌醇的緩沖液或液體培養(yǎng)基組成的含水反應(yīng)基質(zhì)中，將所分離的微生物細(xì)胞與內(nèi)消旋肌醇反應(yīng)，由此在所述含水反應(yīng)基質(zhì)中產(chǎn)生L-表-2-肌醇單酮；第三階段包括，從所得反應(yīng)溶液中除去微生物細(xì)胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的反應(yīng)溶液濾液；第四階段包括，向所述反應(yīng)溶液濾液中加入合適的還原劑、而無需從所述反應(yīng)溶液濾液中分離L-表-2-肌醇單酮，使L-表-2-肌醇單酮還原，由此在所述濾液中產(chǎn)生表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；第五階段包括，從所得還原反應(yīng)溶液中回收所產(chǎn)生的表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；以及第六階段包括，將所回收的表肌醇與內(nèi)消旋肌醇彼此分離。
在方法(D)的第一階段中，在需氧條件下、在常用的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)能夠?qū)?nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，并從所得培養(yǎng)肉湯中分離所述微生物的微生物細(xì)胞。所分離的微生物細(xì)胞用于方法(D)的第二階段。作為所述微生物細(xì)胞，可以使用從前述方法(A)的第一步驟得到的培養(yǎng)肉湯中分離收集的該微生物細(xì)胞。也可以使用在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下、在獨(dú)立的步驟中培養(yǎng)該適用微生物獲得的該微生物細(xì)胞。通過離心、過濾或采用其他已知方法處理培養(yǎng)肉湯，可以有效地分離和收集微生物細(xì)胞。
在方法(D)的第二階段中，作為內(nèi)消旋肌醇與微生物細(xì)胞反應(yīng)中所用的液體反應(yīng)基質(zhì)，既可以使用含水緩沖液，又可以使用液體培養(yǎng)基。這里所用的液體培養(yǎng)基，可以使用與前述方法(A)第一步驟中所用的類似培養(yǎng)基?？梢允褂脻舛葹?0-500mM、優(yōu)選20-100mM的磷酸鹽緩沖液、Good′sCHES緩沖液等作為所述的緩沖液。內(nèi)消旋肌醇在所述含水反應(yīng)基質(zhì)中的濃度優(yōu)選為0.1-30％(重量)。微生物細(xì)胞與內(nèi)消旋肌醇反應(yīng)的條件可以根據(jù)所用微生物、緩沖液或液體培養(yǎng)基的性質(zhì)而變化。反應(yīng)溫度是5-60℃、優(yōu)選10-45℃，反應(yīng)時(shí)間是1-50小時(shí)，優(yōu)選3-48小時(shí)。用作含水反應(yīng)基質(zhì)的緩沖液或液體培養(yǎng)基的pH是2-10，優(yōu)選pH3-9。微生物細(xì)胞與內(nèi)消旋肌醇在第二階段的反應(yīng)得到了含有L-表-2-肌醇單酮的反應(yīng)溶液。
在方法(D)的第三階段，采用已知的方法如離心、分離等，從方法(D)第二階段得到的含L-表-2-肌醇單酮的反應(yīng)溶液中分離所述微生物的微生物細(xì)胞。由此得到含有L-表-2-肌醇單酮的反應(yīng)溶液濾液。在隨后的第四階段，將氫化物作為還原劑加入含有L-表-2-肌醇單酮的反應(yīng)溶液濾液中之后進(jìn)行L-表-2-肌醇單酮的還原反應(yīng)。由此產(chǎn)生表肌醇和內(nèi)消旋肌醇。該第四階段的還原反應(yīng)可以按照與方法(C)第三階段所述同樣的方式進(jìn)行。
然后進(jìn)行第五階段，即，從上述還原反應(yīng)所得的含有表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的反應(yīng)溶液中以水溶液形式回收表肌醇和內(nèi)消旋肌醇。然后進(jìn)行從含有表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的所述水溶液中回收表肌醇的第六階段。該方法(D)的第五和第六階段可以按照與方法(C)第四和第五階段所述同樣的方式進(jìn)行。
本發(fā)明第二方面方法的上述方法(E)以如下方式進(jìn)行在進(jìn)行本發(fā)明第二方面方法的方法(C)第二階段或方法(D)第四階段即向上述培養(yǎng)肉湯上清液或反應(yīng)溶液濾液中加入堿金屬硼氫化物型還原劑，使L-表-2-肌醇單酮還原之前，進(jìn)行一個(gè)預(yù)備步驟，即，通過加入氫氧化鈉或氫氧化鉀或碳酸鈉或碳酸鉀，將所述培養(yǎng)肉湯上清液或所述反應(yīng)溶液濾液的pH調(diào)至pH8-11、優(yōu)選9-10，在所述預(yù)備步驟之后，L-表-2-肌醇單酮與所加入的還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)。我們從另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)調(diào)節(jié)還原反應(yīng)的反應(yīng)基質(zhì)的pH、并且通常在pH5-7的反應(yīng)基質(zhì)中進(jìn)行的反應(yīng)相比，當(dāng)如上所建議將所述還原反應(yīng)的反應(yīng)基質(zhì)的pH調(diào)節(jié)至堿性pH時(shí)，由該還原反應(yīng)產(chǎn)生的表肌醇的產(chǎn)量增加1.3-1.5倍，而副產(chǎn)物內(nèi)消旋肌醇的產(chǎn)量減少1/2-1/4倍，所以在pH5-7進(jìn)行的L-表-2-肌醇單酮的還原反應(yīng)產(chǎn)生6-7份表肌醇/3-4份內(nèi)消旋肌醇。按照方法(E)，在pH8-11的含水反應(yīng)基質(zhì)中用氫化物試劑還原L-表-2-肌醇單酮，可以以表肌醇產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于副產(chǎn)物內(nèi)消旋肌醇產(chǎn)率的方式產(chǎn)生表肌醇。
上述菌株AB 10119、AB 10215和AB 10135是新的微生物，并且均適用于由內(nèi)消旋肌醇制備L-表-2-肌醇單酮。因此，本發(fā)明第三方面提供了新微生物黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119，該微生物能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮，并且已經(jīng)保藏在日本保藏機(jī)構(gòu)，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-7168。
本發(fā)明第四方面提供了新微生物假單胞菌(pseudomonas sp.)AB10215，該微生物能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮，并且已經(jīng)保藏在日本保藏機(jī)構(gòu)，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERMBP-7170。
本發(fā)明第五方面提供了新微生物歐文氏菌(Erwinia sp.)AB 10135，該微生物能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮，并且已經(jīng)保藏在日本保藏機(jī)構(gòu)，國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-7169。
按照本發(fā)明的第一和第二方面，可以工業(yè)規(guī)模和經(jīng)濟(jì)合算的快速生產(chǎn)高純度的L-表-2-肌醇單酮，該L-表-2-肌醇單酮適于用作合成藥物和農(nóng)業(yè)化學(xué)品、以及用作的藥物的表肌醇的原料。
該培養(yǎng)肉湯上清液經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析，測(cè)量條件如下所示。結(jié)果證明，在所述肉湯上清液中產(chǎn)生了濃度為66mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(由內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的轉(zhuǎn)化率為55.6％)。與此同時(shí)，在所得的上述肉湯上清液中未檢測(cè)到內(nèi)消旋肌醇。
上述由內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的轉(zhuǎn)化率是通過以下等式計(jì)算的L-表-2-肌醇單酮的轉(zhuǎn)化率(％)＝[1毫升肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數(shù)÷1毫升液體培養(yǎng)基中最初所含內(nèi)消旋肌醇的摩爾數(shù)]×100高效液相色譜分析的測(cè)量條件如下柱Wakosil 5NH24.6×350mm柱溫40℃監(jiān)測(cè)器RI DETECTOR ERC-7515A(ERMA CR.INC.)上清液的注入量20μl洗脫溶劑乙腈-水(4∶1)L-表-2-肌醇單酮的洗脫時(shí)間；6.7分鐘(2)制備L-表-2-肌醇單酮(第二個(gè)實(shí)驗(yàn))向每一只500毫升容量的折流板錐形瓶中倒入每份100毫升的液體培養(yǎng)基(總共400毫升)，其中含有25.0％(250mg/ml)內(nèi)消旋肌醇、1.0％葡萄糖和0.7％酵母提取物，未調(diào)節(jié)pH。然后，將含有培養(yǎng)基的燒瓶在高壓滅菌器中滅菌。在每只燒瓶經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)基中接種黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119菌株(保藏號(hào)為FERM BP-7168)，并在27℃和振搖下將接種的細(xì)菌菌株培養(yǎng)5天。離心(8000rpm，20分鐘)所得培養(yǎng)肉湯，得到培養(yǎng)肉湯上清液。
該培養(yǎng)肉湯上清液經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析，測(cè)量條件如上所示。結(jié)果證明，在所述肉湯上清液中產(chǎn)生了濃度為247mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(轉(zhuǎn)化率為99.9％)。與此同時(shí)，在所得的上述肉湯上清液中未檢測(cè)到內(nèi)消旋肌醇。
上述由內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的轉(zhuǎn)化率是通過上面給出的等式計(jì)算的。(3)制備L-表-2-肌醇單酮(第三個(gè)實(shí)驗(yàn))向每一只500毫升容量的折流板錐形瓶中倒入每份100毫升的液體培養(yǎng)基，其中含有4.0％(40mg/ml)內(nèi)消旋肌醇、0.2％酵母提取物、0.1％(NH4)2SO4、0.7％K2HPO4、0.2％KH2PO4和0.01％MgSO47H2O，并且pH為7。然后，將燒瓶在高壓滅菌器中滅菌。在每只燒瓶經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)基中接種歐文氏菌(Erwinia sp.)AB 10135菌株(保藏號(hào)為FERMBP-7169)，并在27℃和振搖下將接種的細(xì)菌菌株培養(yǎng)5天。離心(8000rpm，20分鐘)所得培養(yǎng)肉湯，得到培養(yǎng)肉湯上清液。
該培養(yǎng)肉湯上清液經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析，測(cè)量條件如上所示。結(jié)果證明，在所述肉湯上清液中產(chǎn)生了濃度為22mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(轉(zhuǎn)化率為55.6％)。與此同時(shí)，在所得的上述肉湯上清液中未檢測(cè)到內(nèi)消旋肌醇。
上述由內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的轉(zhuǎn)化率是通過上面給出的等式計(jì)算的。(4)制備L-表-2-肌醇單酮(第四個(gè)實(shí)驗(yàn))向每一只500毫升容量的折流板錐形瓶中倒入每份100毫升的液體培養(yǎng)基(總共400毫升)，其中含有25.0％(250mg/ml)內(nèi)消旋肌醇、1.0％葡萄糖和0.7％酵母提取物，未調(diào)節(jié)pH。然后，將燒瓶在高壓滅菌器中滅菌。在每只燒瓶經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)基中接種假單胞菌(Pseudomonas sp.)AB10215菌株(保藏號(hào)為FERM BP-7170)，并在27℃和振搖下將接種的細(xì)菌菌株培養(yǎng)5天。離心(8000rpm，20分鐘)所得培養(yǎng)肉湯，得到培養(yǎng)肉湯上清液。
該培養(yǎng)肉湯上清液經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析，測(cè)量條件如上所示。結(jié)果證明，在所述肉湯上清液中產(chǎn)生了濃度為244mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(轉(zhuǎn)化率為98.7％)。與此同時(shí)，在所得的上述肉湯上清液中未檢測(cè)到內(nèi)消旋肌醇。(b)回收和分離L-表-2-肌醇單酮將上述實(shí)施例1(2)得到的培養(yǎng)肉湯上清液通過裝有80毫升強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂Duolite(注冊(cè)商標(biāo))C-20(H+型)的柱(內(nèi)徑2cm×高30cm)。然后，用80ml離子交換水(即去離子水)沖洗該柱。之后，將培養(yǎng)肉湯上清液通過所述柱得到的流出液與用去離子水洗滌所述柱得到的水洗液合并。將所得合并的溶液通過含有160ml弱堿性陰離子交換樹脂Duolite(注冊(cè)商標(biāo))368S(游離堿形式)的柱(內(nèi)徑3cm×高30cm)，然后用160ml去離子水沖洗該陰離子交換樹脂柱。
將后一柱得到的流出液與所得水洗液合并在一起，得到水溶液。該水溶液含有L-表-2-肌醇單酮，但是基本上不含任何雜質(zhì)。
將上述得到的水溶液減壓濃縮至200毫升體積。向該濃縮溶液中加入3倍(以體積計(jì))乙醇，并將所得液體混合物放置過夜，由此得到60g純的L-表-2-肌醇單酮，為無色結(jié)晶。此時(shí)L-表-2-肌醇單酮純化產(chǎn)物的回收率是60.7％，而以起始內(nèi)消旋肌醇計(jì)，L-表-2-肌醇單酮的總回收率是60.6％。
上述L-表-2-肌醇單酮純化產(chǎn)物的回收率是通過下列計(jì)算等式計(jì)算的L-表-2-肌醇單酮純化產(chǎn)物的回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的量÷純化前在400毫升培養(yǎng)肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的量]×100上述L-表-2-肌醇單酮的總回收率是通過下列計(jì)算等式計(jì)算的。
L-表-2-肌醇單酮的總回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的摩爾數(shù)÷400毫升液體培養(yǎng)基中最初所含內(nèi)消旋肌醇的摩爾數(shù)]×100
該培養(yǎng)肉湯上清液經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析，測(cè)量條件與上述條件相似。結(jié)果證明，在所得肉湯上清液中產(chǎn)生了濃度為60mg/ml的L-表-2-肌醇單酮(轉(zhuǎn)化率為50.6％)。
按照與實(shí)施例1(b)中所述同樣的方式，從上述培養(yǎng)肉湯上清液中純化和分離L-表-2-肌醇單酮。由此得到114g結(jié)晶(純化L-表-2-肌醇單酮的回收率為76.0％)。此時(shí)，以內(nèi)消旋肌醇計(jì)，純化L-表-2-肌醇單酮的總回收率為38.4％。
上述L-表-2-肌醇單酮的轉(zhuǎn)化率是按照實(shí)施例1(b)中給出的計(jì)算等式計(jì)算的，而上述純化的L-表-2-肌醇單酮的回收率是按照下列計(jì)算等式計(jì)算的純化的L-表-2-肌醇單酮的回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的量÷純化前在2.5升培養(yǎng)肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的量]×100上述以內(nèi)消旋肌醇計(jì)的L-表-2-肌醇單酮的總回收率是通過下列計(jì)算等式計(jì)算的L-表-2-肌醇單酮的總回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的摩爾數(shù)÷2.5升液體培養(yǎng)基中最初所含內(nèi)消旋肌醇的摩爾數(shù)]×100
上述L-表-2-肌醇單酮的轉(zhuǎn)化率是按照與上述實(shí)施例1類似的方法計(jì)算的，而上述純化的L-表-2-肌醇單酮的回收率是按照下列計(jì)算等式計(jì)算的純化的L-表-2-肌醇單酮的回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的量÷純化前在400毫升反應(yīng)溶液中最初所含L-表-2-肌醇單酮的量]×100上述以內(nèi)消旋肌醇計(jì)的純化L-表-2-肌醇單酮的總回收率是通過下列計(jì)算等式計(jì)算的純化的L-表-2-肌醇單酮的總回收率(％)＝[所分離的純化L-表-2-肌醇單酮的摩爾數(shù)÷400毫升磷酸鹽緩沖液中最初加入的內(nèi)消旋肌醇的摩爾數(shù)]×100
按照本發(fā)明第二方面方法的方法(C)制備表肌醇的實(shí)施例(1)制備L-表-2-肌醇單酮向每一只500毫升容量的折流板錐形瓶中倒入每份100毫升的液體培養(yǎng)基(總共2升)，其中含有25.0％(500g)內(nèi)消旋肌醇、1.0％葡萄糖和2.5％酵母提取物，未調(diào)節(jié)pH。然后，將燒瓶在高壓滅菌器中滅菌。在每只燒瓶經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)基中接種黃單胞菌(Xanthomonas sp.)AB 10119菌株(FERM BP-7168)，并在27℃和振搖下將接種的細(xì)菌菌株培養(yǎng)5天。離心(8000rpm，20分鐘)所得培養(yǎng)肉湯，得到培養(yǎng)肉湯上清液。
按照與實(shí)施例1(1)類似的方法，對(duì)該培養(yǎng)肉湯上清液進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。結(jié)果證明，在所述培養(yǎng)肉湯上清液中產(chǎn)生了415g L-表-2-肌醇單酮(L-表-2-肌醇單酮的轉(zhuǎn)化率為83.9％)。(2)制備表肌醇向2升上述步驟(1)得到的含有L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯上清液中緩緩加入29.2g硼氫化鈉作為還原劑。在室溫進(jìn)行L-表-2-肌醇單酮的還原反應(yīng)。還原反應(yīng)完成后，在下列測(cè)量條件下，通過高效液相色譜對(duì)肉湯上清液(即，由還原反應(yīng)得到的反應(yīng)溶液)進(jìn)行分析。結(jié)果證明，由還原反應(yīng)得到的反應(yīng)溶液(即還原反應(yīng)后得到的肉湯上清液)含有235.8g所產(chǎn)生的表肌醇和102.4g副產(chǎn)物內(nèi)消旋肌醇(表肌醇加上內(nèi)消旋肌醇的總反應(yīng)產(chǎn)率為80.6％)。由L-表-2-肌醇單酮轉(zhuǎn)化為表肌醇的表肌醇的轉(zhuǎn)化率是56.2％。上述高效液相色譜的測(cè)量條件如下。
柱Wakosil 5NH24.6×250mm柱溫40℃
檢測(cè)器RI DETECTER ERC-7515A(ERMA CR.INC.)反應(yīng)溶液的注入量20μl洗脫溶劑乙腈-水(4∶1)表肌醇的洗脫時(shí)間8.5分鐘上述表肌醇加上內(nèi)消旋肌醇的總回收率(％)通過下列計(jì)算等式評(píng)價(jià)總回收率(％)＝[(在上述還原反應(yīng)后得到的肉湯上清液中所含表肌醇的摩爾數(shù)加上內(nèi)消旋肌醇的摩爾數(shù)之和)÷(在上述還原反應(yīng)前的肉湯上清液中最初所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數(shù))]×100上述由L-表-2-肌醇單酮轉(zhuǎn)化為表肌醇的表肌醇的轉(zhuǎn)化率通過下列計(jì)算等式評(píng)價(jià)表肌醇的轉(zhuǎn)化率(％)＝[在上述還原反應(yīng)后得到的肉湯上清液中所含表肌醇的摩爾數(shù)÷在上述還原反應(yīng)前的肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數(shù)]×100(3)回收和分離表肌醇的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)將上述步驟(2)得到的反應(yīng)溶液(即，還原反應(yīng)后得到的肉湯上清液)分成兩半。將其中一半所述反應(yīng)溶液通過含有300ml強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂Duolite(注冊(cè)商標(biāo))C-20(H+型)的柱(內(nèi)徑5cm×高30cm)，得到柱流出液。然后，用400ml去離子水沖洗該柱。將所得流出液與所得水洗液合并在一起，并使合并的溶液通過含有600ml強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂Duolite(注冊(cè)商標(biāo))A-113(OH-型)的柱(內(nèi)徑5cm×高60cm)，得到柱流出液。然后，用700ml去離子水沖洗該柱。
將所得柱流出液與所得水洗液合并在一起。如此合并得到的水溶液含有所產(chǎn)生的表肌醇和副產(chǎn)物內(nèi)消旋肌醇，但是基本上不含雜質(zhì)。
將上述合并得到的水溶液減壓濃縮至300毫升體積。取所得濃縮溶液(300ml)的1/4份(75ml)，使其通過含有1500ml強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂Amberlite(注冊(cè)商標(biāo))CG-400(OH-型)的柱(內(nèi)徑5cm×高200cm)，然后用去離子水沖洗該柱。對(duì)所得該柱的洗脫液區(qū)分主要含內(nèi)消旋肌醇的餾分和主要含所需表肌醇的餾分分別收集。濃縮溶液的剩余3/4份(225ml)用Amberlite CG-400(OH-型)柱進(jìn)行類似處理，由此得到僅含表肌醇的洗脫液餾分。將這些洗脫液餾分濃縮至干，得到73g表肌醇。此外，將該表肌醇溶解在水中，得到15％水溶液，向該水溶液中加入兩倍體積的乙醇。將所得液體混合物放置過夜使表肌醇重結(jié)晶。由此得到63g純表肌醇結(jié)晶(純化表肌醇的回收率為53.4％)。由內(nèi)消旋肌醇得到的表肌醇的總產(chǎn)率是25.2％。
上述表肌醇的回收率是通過下列計(jì)算等式評(píng)價(jià)的純化表肌醇的回收率(％)＝[所分離晶狀表肌醇的量/還原反應(yīng)后所得肉湯上清液中所含表肌醇的量]×100上述由內(nèi)消旋肌醇得到的表肌醇的總回收率是通過下列計(jì)算等式評(píng)價(jià)的表肌醇的總回收率(％)＝[所分離晶狀表肌醇的量/1升液體培養(yǎng)基中最初所含內(nèi)消旋肌醇的量]×100(4)回收和分離表肌醇的第二個(gè)實(shí)驗(yàn)將前面分出的上述步驟(3)的另一半反應(yīng)溶液(還原反應(yīng)后得到的肉湯上清液)通過含有300ml強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂Duolite(注冊(cè)商標(biāo))C-20(H+型)的柱(內(nèi)徑5cm×高30cm)，得到所述柱的流出液。然后，用400ml去離子水沖洗該柱。將所得流出液與所得水洗液合并在一起，并通過含有600ml強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂Duolite(注冊(cè)商標(biāo))A-113(OH-型)的柱(內(nèi)徑5cm×高60cm)，得到柱流出液。然后，用700ml去離子水沖洗該柱。
將所得后一柱流出液與所得水洗液也合并在一起。將所得水溶液減壓濃縮至300ml體積。將所得濃縮溶液(300ml)通過含有1500ml強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂Diaion(注冊(cè)商標(biāo))UBK 520M(Ca+型)的柱(內(nèi)徑5cm×高200cm)，得到流出液。用去離子水沖洗該柱。對(duì)所得該柱的洗脫液區(qū)分主要含內(nèi)消旋肌醇的餾分和主要含所需表肌醇的餾分分別收集。由該色譜方法得到75g表肌醇。此外，將該表肌醇溶解在水中，得到15％水溶液，向該水溶液中加入兩倍體積的乙醇。將所得液體混合物放置過夜使表肌醇重結(jié)晶。由此得到66g純表肌醇結(jié)晶(純化表肌醇的回收率為56.0％)。以內(nèi)消旋肌醇作為原料計(jì)，純化表肌醇的總產(chǎn)率是26.4％。
純化表肌醇的回收率和總回收率按照與上述步驟(3)同樣的方法計(jì)算。
按照與實(shí)施例1(1)類似的方法，對(duì)該培養(yǎng)肉湯上清液進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。結(jié)果證明，在所述肉湯上清液中產(chǎn)生了23g L-表-2-肌醇單酮(以內(nèi)消旋肌醇計(jì)，L-表-2-肌醇單酮的轉(zhuǎn)化率為93.0％)。(2)制備表肌醇向100毫升上述步驟(1)得到的含有L-表-2-肌醇單酮的肉湯上清液中加入5M氫氧化鈉水溶液，將上清液的pH調(diào)節(jié)至pH10。此后立即向該pH10的上清液中緩緩加入1.3g硼氫化鈉。然后在室溫進(jìn)行還原反應(yīng)。反應(yīng)完成后，在實(shí)施例4(2)所述測(cè)量條件下，通過高效液相色譜對(duì)肉湯上清液(即，由還原反應(yīng)得到的反應(yīng)溶液)進(jìn)行分析。結(jié)果證明，由還原反應(yīng)得到的反應(yīng)溶液(即還原反應(yīng)后得到的肉湯上清液)含有18.4g所產(chǎn)生的表肌醇和0.8g副產(chǎn)物內(nèi)消旋肌醇(表肌醇加上內(nèi)消旋肌醇的總反應(yīng)產(chǎn)率為82.6％)。由L-表-2-肌醇單酮轉(zhuǎn)化為表肌醇的表肌醇的轉(zhuǎn)化率是79.1％。
上述表肌醇加上內(nèi)消旋肌醇的總反應(yīng)產(chǎn)率(％)通過下列計(jì)算等式評(píng)價(jià)表肌醇加上內(nèi)消旋肌醇的總反應(yīng)產(chǎn)率＝[在還原反應(yīng)后得到的肉湯上清液中所含表肌醇摩爾數(shù)與內(nèi)消旋肌醇摩爾數(shù)之和÷在還原反應(yīng)前的肉湯上清液中最初所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數(shù))]×100上述由L-表-2-肌醇單酮轉(zhuǎn)化為表肌醇的表肌醇轉(zhuǎn)化率通過下列計(jì)算等式評(píng)價(jià)由L-表-2-肌醇單酮轉(zhuǎn)化為表肌醇的表肌醇轉(zhuǎn)化率(％)＝[在還原反應(yīng)后得到的肉湯上清液中所含表肌醇的摩爾數(shù)÷在還原反應(yīng)前的肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數(shù)]×100(3)回收和分離表肌醇按照與實(shí)施例4(4)所述同樣的方法，從還原反應(yīng)得到的所述反應(yīng)溶液中回收、純化和分離表肌醇。以結(jié)晶形式得到的表肌醇的產(chǎn)量是15.7g。此時(shí)，由最初在反應(yīng)溶液中所含的表肌醇得到的純化表肌醇的回收率是85.3％。以還原前最初在反應(yīng)溶液中所含的L-表-2-肌醇單酮計(jì)，表肌醇的產(chǎn)率是67.5％。以用作原料的內(nèi)消旋肌醇計(jì)，純化表肌醇的總回收率是62.8％。
以還原反應(yīng)后在反應(yīng)溶液中最初所含表肌醇計(jì)，上述純化表肌醇的回收率通過下列計(jì)算等式評(píng)價(jià)純化表肌醇的回收率(％)＝[所分離純化表肌醇的量÷還原反應(yīng)后在100ml反應(yīng)溶液、即肉湯上清液中最初所含表肌醇的量]×100以L-表-2-肌醇單酮計(jì)，上述純化表肌醇的產(chǎn)率通過下列計(jì)算等式評(píng)價(jià)純化表肌醇的產(chǎn)率(％)＝[所分離純化表肌醇的摩爾數(shù)÷還原反應(yīng)前在100ml肉湯上清液中所含L-表-2-肌醇單酮的摩爾數(shù)]×100上述由內(nèi)消旋肌醇得到的純化表肌醇的總回收率通過下列計(jì)算等式評(píng)價(jià)純化表肌醇的總回收率(％)＝[所分離純化表肌醇的量÷培養(yǎng)開始時(shí)100ml液體培養(yǎng)基中最初所含內(nèi)消旋肌醇的量]×100工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明，可以容易地和有效地由內(nèi)消旋肌醇制備L-表-2-肌醇單酮，后者是用于合成藥物的有用中間體。按照本發(fā)明，還可以通過將L-表-2-肌醇單酮還原，容易和有效地制備表肌醇，后者適于用作各種藥物。因此，本發(fā)明的方法適用于工業(yè)目的。
權(quán)利要求
1.L-表-2-肌醇單酮的制備方法，其特征在于該方法包括將內(nèi)消旋肌醇與能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物反應(yīng)，由此將內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮，以產(chǎn)生L-2-肌醇單酮。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所用能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物是細(xì)菌。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所用能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物是革蘭氏陰性菌。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所用能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物是選自下列的革蘭氏陰性菌屬于假單胞菌科的黃單胞菌屬(Xanthomonas)或假單胞菌屬(Pseudomonas)的革蘭氏陰性菌；屬于醋酸桿菌科(Acetobacteraceae)的醋酸桿菌屬(Acetobacter)或葡糖桿菌屬(Gluconobacter)的細(xì)菌；屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細(xì)菌；屬于腸桿菌科(Enterobacteriacea)的歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)的細(xì)菌；或者屬于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的巴斯德氏菌屬(Pasteurella)或嗜血桿菌屬(Haemophilus)的細(xì)菌。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所用能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物是黃單胞菌屬菌株(Xanthomonas sp.)AB10119(保藏號(hào)FERM BP-7168)或假單胞菌屬菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215(保藏號(hào)FERM BP-7170)和歐文氏菌屬菌株(Erwinia sp.)10135(保藏號(hào)FERMBP-7169)。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中在需氧條件下，在含有一定量?jī)?nèi)消旋肌醇、碳源和氮源的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，由此使所述內(nèi)消旋肌醇與所述微生物在培養(yǎng)基中反應(yīng)，并在所得培養(yǎng)肉湯中產(chǎn)生和積聚L-表-2-肌醇單酮。
7.權(quán)利要求1所述的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，從所得培養(yǎng)肉湯中分離所培養(yǎng)微生物的微生物細(xì)胞，將所分離的微生物細(xì)胞加至含有溶解于其中的一定量?jī)?nèi)消旋肌醇的緩沖液或液體培養(yǎng)基中，并使所加入的微生物細(xì)胞與在所述緩沖液或所述液體培養(yǎng)基中的內(nèi)消旋肌醇反應(yīng)，在所得反應(yīng)溶液或在所得培養(yǎng)肉湯中將內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中在權(quán)利要求6或7的方法中得到含有微生物細(xì)胞和所產(chǎn)生并積聚于其中的L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯或反應(yīng)溶液，然后從所述培養(yǎng)肉湯或所述反應(yīng)溶液中除去微生物的微生物細(xì)胞，并且一旦從含有L-表-2-肌醇單酮的所述培養(yǎng)肉湯或所述反應(yīng)溶液中除去微生物細(xì)胞即得到培養(yǎng)肉湯上清液或反應(yīng)溶液濾液，然后用離子交換樹脂或者活性炭處理該培養(yǎng)肉湯上清液或反應(yīng)溶液濾液，或者處理所述培養(yǎng)肉湯上清液或反應(yīng)溶液濾液使L-表-2-肌醇單酮結(jié)晶，或者采用這些處理的任何組合方式，由此從所述培養(yǎng)肉湯上清液或反應(yīng)溶液濾液中回收高純度的L-表-2-肌醇單酮。
9.表肌醇的制備方法，其特征在于該方法包括在含水反應(yīng)介質(zhì)中，將能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物與內(nèi)消旋肌醇反應(yīng)，以在所述含水反應(yīng)培養(yǎng)基中生成L-表-2-肌醇單酮，由此得到含有所述微生物的微生物細(xì)胞的以及在其中產(chǎn)生的L-表-2-肌醇單酮的所得反應(yīng)溶液，從所述反應(yīng)溶液中除去微生物細(xì)胞，得到含有L-表-2-肌醇單酮的反應(yīng)溶液濾液，向含有L-表-2-肌醇單酮的所述反應(yīng)溶液濾液中直接加入適當(dāng)?shù)倪€原劑，并使還原劑與L-表-2-肌醇單酮反應(yīng)，生成表肌醇和內(nèi)消旋肌醇。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所用能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物是細(xì)菌。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中所用能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物是革蘭氏陰性菌。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所用能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物是選自下列的革蘭氏陰性菌屬于假單胞菌科的黃單胞菌屬(Xanthomonas)或假單胞菌屬(Pseudomonas)的革蘭氏陰性菌；屬于醋酸桿菌科(Acetobacteraceae)的醋酸桿菌屬(Acetobacter)或葡糖桿菌屬(Gluconobacter)的細(xì)菌；屬于根瘤菌科(Rhizobiaceae)的土壤桿菌屬(Agrobacterium)的細(xì)菌；屬于腸桿菌科(Enterobacteriacea)的歐文氏菌屬(Erwinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)的細(xì)菌；或者屬于巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的巴斯德氏菌屬(Pasteurella)或嗜血桿菌屬(Haemophilus)的細(xì)菌。
13.權(quán)利要求9所述的方法，其中所用能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物是黃單胞菌屬菌株(Xanthomonas sp.)AB10119(保藏號(hào)FERM BP-7168)或假單胞菌屬菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215(保藏號(hào)FERM BP-7170)和歐文氏菌屬菌株(Erwinia sp.)10135(保藏號(hào)FERM BP-7169)。
14.權(quán)利要求9所述的方法，包括在需氧條件下、在由含有一定量?jī)?nèi)消旋肌醇、碳源和氮源的液體培養(yǎng)基組成的含水基質(zhì)中，培養(yǎng)能夠?qū)?nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，以使內(nèi)消旋肌醇與所述微生物在所述含水反應(yīng)基質(zhì)中反應(yīng)，由此在所得培養(yǎng)肉湯中產(chǎn)生和積聚L-表-2-肌醇單酮，得到培養(yǎng)肉湯，即含有所述微生物的微生物細(xì)胞和L-表-2-肌醇單酮的所得反應(yīng)溶液；從所得到的反應(yīng)溶液、即培養(yǎng)肉湯中除去所述微生物的微生物細(xì)胞，得到培養(yǎng)肉湯上清液，即含有L-表-2-肌醇單酮的所述反應(yīng)溶液濾液；向所得培養(yǎng)肉湯上清液中直接加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與該還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)，由此在所述培養(yǎng)肉湯上清液、即所述反應(yīng)溶液濾液中產(chǎn)生表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；從所得還原反應(yīng)的反應(yīng)溶液、即含有所產(chǎn)生的表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的培養(yǎng)肉湯上清液中回收表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；將所回收的表肌醇與內(nèi)消旋肌醇彼此分離。
15.權(quán)利要求9所述的方法，包括在需氧條件下、在含有碳源和氮源的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)能夠?qū)⒒钚詢?nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的微生物，由此得到所述微生物的培養(yǎng)肉湯，然后從所得培養(yǎng)肉湯中分離所述微生物的微生物細(xì)胞；在由含水緩沖液或液體培養(yǎng)基組成的含水反應(yīng)基質(zhì)中，將所分離的所述微生物的微生物細(xì)胞與內(nèi)消旋肌醇反應(yīng)，在所述含水反應(yīng)基質(zhì)中產(chǎn)生L-表-2-肌醇單酮；從所得到的含有所述微生物的微生物細(xì)胞以及在其中生成的L-表-2-肌醇單酮的所得含水反應(yīng)溶液中除去所述微生物的微生物細(xì)胞，得到已經(jīng)除去微生物細(xì)胞、而L-表-2-肌醇單酮仍溶解于其中的所得反應(yīng)溶液濾液；向所述反應(yīng)溶液濾液中加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與所述還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)，由此在所述反應(yīng)溶液濾液中產(chǎn)生表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；從所得含有所產(chǎn)生的表肌醇和內(nèi)消旋肌醇的還原反應(yīng)的反應(yīng)溶液中回收表肌醇和內(nèi)消旋肌醇；將所回收的表肌醇與內(nèi)消旋肌醇彼此分離。
16.權(quán)利要求14或15所述的方法，其中在L-表-2-肌醇單酮與所加入的還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)之前，進(jìn)行這樣一個(gè)預(yù)備步驟，即，將由含有L-表-2-肌醇單酮的培養(yǎng)肉湯上清液或反應(yīng)溶液濾液組成的含水基質(zhì)的pH調(diào)至pH8-12的堿性pH范圍；然后進(jìn)行的步驟是，向含有L-表-2-肌醇單酮和pH8-12的該堿性含水介質(zhì)中加入堿金屬硼氫化物、堿金屬三烷氧基硼氫化物或堿金屬硼氰化物作為還原劑，使L-表-2-肌醇單酮與所述還原劑進(jìn)行還原反應(yīng)，由此產(chǎn)生了遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于副產(chǎn)物內(nèi)消旋肌醇產(chǎn)率的所需表肌醇。
17.權(quán)利要求9所述的方法，其中L-表-2-肌醇單酮還原反應(yīng)所用的還原劑選自硼氫化鈉、硼氫化鋰、硼氫化鉀、三甲氧基硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉。
18.權(quán)利要求9所述的方法，其中所用含水反應(yīng)基質(zhì)是水；所用還原劑是硼氫化鈉。
19.新微生物黃單胞菌菌株(Xanthomonas sp.)AB 10119，該微生物具有能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的特性，并且已經(jīng)保藏在日本的國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-7168。
20.新微生物假單胞菌菌株(Pseudomonas sp.)AB 10215，該微生物具有能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的特性，并且已經(jīng)保藏在日本國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-7170。
21.新微生物歐文氏菌菌株(Erwinia sp.)AB 10135，該微生物具有能夠使內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-表-2-肌醇單酮的特性，并且已經(jīng)保藏在日本國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，保藏號(hào)為FERM BP-7169。
全文摘要
本發(fā)明提供了L－表－2－肌醇單酮和表肌醇新的有效制備方法,表肌醇適于用作各種藥物或合成各種藥物的中間體。在該方法中,使用便宜的內(nèi)消旋肌醇作為原料。也就是說,本發(fā)明開發(fā)了一種新的方法,包括將內(nèi)消旋肌醇與能夠?qū)?nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)－表2－肌醇單酮的革蘭氏陰性菌反應(yīng),由此通過將內(nèi)消旋肌醇轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)－表－2－肌醇單酮產(chǎn)生L－表－2－肌醇單酮。另外,本發(fā)明提供了新的方法,該方法包括將所產(chǎn)生的L－表－2－肌醇單酮與由堿金屬硼氫化物或任何其他堿金屬氫化物組成的還原劑在含水反應(yīng)基質(zhì)中反應(yīng),產(chǎn)生表肌醇和內(nèi)消旋肌醇,然后從由表肌醇和內(nèi)消旋肌醇組成的所得反應(yīng)產(chǎn)物中分離表肌醇。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1365394SQ00811034
公開日2002年8月21日 申請(qǐng)日期2000年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月7日
發(fā)明者高橋篤, 神邊健司, 森哲也, 北雄一, 玉村健, 竹內(nèi)富雄 申請(qǐng)人:北興化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社, 財(cái)團(tuán)法人微生物化學(xué)研究會(huì)