專利名稱：氨基酸生產(chǎn)的代謝工程的制作方法
背景技術：
L-賴氨酸是通過工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的氨基酸的一個范例。這種必需氨基酸的商業(yè)生產(chǎn)主要利用革蘭氏陽性的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、和乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)進行(A.Kleemann等人，氨基酸(Amino Acids)，在《Ullmann氏工業(yè)化學百科全書》(Ullmann’s Encycolpedia of Industrial Chemistry)一書中，第A2卷，第57-97頁，WeinhamVCH-Verlagsgesellschaft，1985)，這3種生物體累計每年生產(chǎn)大約250,000噸L-賴氨酸。
考慮到通過發(fā)酵工藝進行的L-賴氨酸生產(chǎn)在經(jīng)濟上的重要性，提高生產(chǎn)的總量同時降低生產(chǎn)成本將是有益的。為達此目的，在棒桿菌中深入研究了L-賴氨酸合成的生化途徑(最近的評論見Sahm等人，紐約科學院年鑒(Ann.N.Y.Acad.Sci.)78225-39，1996)。賴氨酸途徑的入口開始于L-天冬氨酸(見


圖1)，而L-天冬氨酸是由草酰乙酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨基作用生成的。谷氨酸棒桿菌的一個特殊特性是它能夠通過兩種不同路徑將賴氨酸中間物哌啶-2，6-二羧酸轉(zhuǎn)變成二氨基庚二酸，即通過涉及琥珀酸化中間物的反應或者通過二氨基庚二酸脫氫酶的單一反應。總之，進入該途徑的碳流在兩個點上受到調(diào)控第一，L-蘇氨酸和L-賴氨酸二者水平對天冬氨酸激酶的反饋抑制；第二，對二氫吡啶二羧酸合酶水平的控制。因此，可去調(diào)控和提高這兩種酶的活性從而提高棒桿菌中的L-賴氨酸產(chǎn)量。
除了通向L-賴氨酸合成的生化途徑，新的證據(jù)表明賴氨酸離開細胞進入培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)運是開發(fā)過度生成賴氨酸的谷氨酸棒桿菌菌株時需要考慮的另一個條件。Krmer及其同事的研究指出被動轉(zhuǎn)運離開細胞，作為滲漏膜的結果，并不是賴氨酸外流的唯一解釋；他們的數(shù)據(jù)提出具有下列特性的特異載體(1)轉(zhuǎn)運蛋白對賴氨酸具有較高的Km值(20mM)；(2)轉(zhuǎn)運蛋白是OH-同向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(攝取系統(tǒng)是H+反向轉(zhuǎn)運系統(tǒng))；且(3)轉(zhuǎn)運蛋白帶正電荷，以及膜電位刺激分泌(S.Brer和R.Krmer，歐洲生化雜志(Eur.J.Biochem.)202137-143，1991)。
本領域已知利用對營養(yǎng)缺陷型或抗性特性而分離的多種菌株生產(chǎn)L-賴氨酸的幾種發(fā)酵工藝美國專利號2,979,439公開了需要高絲氨酸(或甲硫氨酸和蘇氨酸)的突變體；美國專利號3,700,557公開了對蘇氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、或半胱氨酸有營養(yǎng)要求的突變體；美國專利號3,707,441公開了對賴氨酸類似物有抗性的突變體；美國專利號3,687,810公開了能夠生成L-賴氨酸且對桿菌肽、青霉素G、或多粘菌素具有抗性的突變體；美國專利號3,708,395公開了對高絲氨酸、蘇氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、或上述混合物有營養(yǎng)要求且對賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、或其類似物有抗性的突變體；美國專利號3,825,472公開了對賴氨酸類似物有抗性的突變體；美國專利號4,169,763公開了能夠生成L-賴氨酸且對至少一種天冬氨酸類似物和磺胺類藥物有抗性的棒桿菌屬突變菌株；美國專利號5,846,790公開了能夠在不存在任何生物素作用遏制劑時生成L-谷氨酸和L-賴氨酸的突變株；以及美國專利號5,650,304公開了能夠生成L-賴氨酸且對4-N-(D-丙氨酰)-2，4-二氨基-2，4-二脫氧-L-阿拉伯糖、2，4-二脫氧-L-阿拉伯糖、或其衍生物有抗性的屬于棒桿菌屬或短桿菌屬(Brevibacterium)的菌株。
利用棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸領域的最新進展包括使用分子生物學技術來提高賴氨酸產(chǎn)量。提供下列范例作為例示性技術美國專利申請編號4,560,654和5,236,831公開了通過用重組DNA分子轉(zhuǎn)化對S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸敏感的宿主棒桿菌或短桿菌屬微生物獲得的L-賴氨酸生產(chǎn)突變株，其中載體DNA中插入了賦予對S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸的抗性和生成賴氨酸的能力的DNA片段；美國專利申請編號5,766,925公開了通過將源自對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制脫敏的棒狀細菌、編碼天冬氨酸激酶的基因整合到具有滲漏型高絲氨酸脫氫酶的棒狀細菌或高絲氨酸脫氫酶基因缺陷的棒狀細菌的染色體DNA中產(chǎn)生的突變株。
除了L-賴氨酸以外，棒桿菌及相關生物體可用于生產(chǎn)其它氨基酸，例如支鏈氨基酸L-亮氨酸、L-異亮氨酸、和L-纈氨酸。通向支鏈氨基酸生物合成的生化途徑也已透徹研究。進入天冬氨酸途徑的碳流可集中生成L-賴氨酸或L-蘇氨酸，而L-蘇氨酸可用于生成L-異亮氨酸(
圖1B)。L-異亮氨酸是由L-蘇氨酸經(jīng)5個反應生成的；催化這些反應的酶包括(1)蘇氨酸脫水酶；(2)乙酰羥酸合酶(acetohydroxy acidsynthase，AHAS)；(3)異構還原酶(isomeroreductase，IR)；(4)二羥酸脫水酶；和(5)轉(zhuǎn)氨酶B。蘇氨酸脫水酶是該途徑中異亮氨酸合成唯一獨有的酶；其它4種酶還用于生成其它支鏈氨基酸，纈氨酸和亮氨酸。由蘇氨酸流向異亮氨酸的碳流受到蘇氨酸脫水酶和乙酰羥酸合酶(AHAS)的控制。在克隆了棒桿菌中異亮氨酸途徑的各種酶的編碼基因(ilvA、ilvB、ilvC、ilvD、和ilvE)之后(C.Cordes等人，基因(Gene)112113-116，1992；B.Mckel等人，細菌學雜志(J.Bacteriology)1748065-8072，1992；和C.Keilhauer等人，細菌學雜志(J.Bacteriology)1755595-5603，1993)，可應用重組DNA技術產(chǎn)生新的菌株。
通過提高支鏈氨基酸生物合成途徑中酶的活性來提高氨基酸L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-纈氨酸產(chǎn)量已有描述。另外，通過提高由ilvBN操縱子編碼的乙酰羥酸合酶(AHAS)的活性來提高支鏈氨基酸產(chǎn)量已有描述(H.Sahm等人，紐約科學院年鑒(Ann.N.Y.Acad.Sci.)78225-39，1996)。
用于生產(chǎn)支鏈氨基酸的例示性工藝包括美國專利號5,188,948公開了利用對聚酮化合物(polyketide)有抗性的微生物生產(chǎn)L-纈氨酸的發(fā)酵工藝；美國專利號5,521,074公開了利用屬于棒桿菌屬或短桿菌屬的微生物生產(chǎn)L-纈氨酸的工藝，該微生物展示a)生成L-纈氨酸的能力，b)在含乙酸作為唯一碳源的培養(yǎng)基中對L-纈氨酸的抗性，和c)在含葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中對丙酮酸類似物的敏感性；美國專利號4,601,983公開了能夠用于生產(chǎn)具有高絲氨酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)、能夠在棒狀細菌中復制、且用于生成L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的遺傳序列；美國專利號4,442,208公開了利用通過重組DNA技術獲得的對α-氨基-β-羥基戊酸有抗性的短桿菌或棒桿菌菌株生產(chǎn)L-異亮氨酸的發(fā)酵工藝；美國專利號4,656,135公開了用于生產(chǎn)L-異亮氨酸的工藝，包括培養(yǎng)對甲基賴氨酸或α-酮丙二酸有抗性且能夠在液體培養(yǎng)基中生成L-異亮氨酸的屬于短桿菌屬或棒桿菌屬的微生物，并由所述培養(yǎng)基回收積累的L-異亮氨酸；美國專利號5,118,619公開了經(jīng)利用D-乳酸的突變體由D，L-α-羥基丁酸發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸的方法；美國專利號5,763,231公開了生產(chǎn)L-亮氨酸的工藝，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于棒桿菌屬、埃希氏菌屬、短桿菌屬、或微桿菌屬(Microbacterium)的菌株，并使產(chǎn)生的細胞與糖類和乙酸或其鹽類反應以形成L-亮氨酸并在反應液中積累；以及美國專利號3,970,519公開了抵抗亮氨酸或其類似物的反饋抑制且需要異亮氨酸、蘇氨酸、或甲硫氨酸中至少一種作為生長養(yǎng)分以生成L-亮氨酸的菌株。
通過降低纈氨酸產(chǎn)量來提高氨基酸產(chǎn)量尚未有描述。
通過降低AHAS活性來提高氨基酸產(chǎn)量尚未有描述。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供能夠以比親本菌株更高的效率將葡萄糖轉(zhuǎn)變成除L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-纈氨酸以外的其它氨基酸的微生物。轉(zhuǎn)變效率可通過下面的公式量化[(生成的氨基酸克數(shù)/消耗的右旋糖克數(shù))*100]＝％產(chǎn)量，并表述為由右旋糖生成的產(chǎn)量。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)誘變而成為一種或多種支鏈氨基酸的合成營養(yǎng)缺陷型且經(jīng)選擇以比親本菌株更高的百分比產(chǎn)量生成預期氨基酸的微生物。
在更具體的實施方案中，本發(fā)明提供了如下獲得的微生物，包括對親本菌株進行隨機化學誘變，分離支鏈氨基酸合成營養(yǎng)缺陷型的經(jīng)誘變變體，并選擇能夠以比親本菌株更高的效率將葡萄糖轉(zhuǎn)變成除L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-纈氨酸以外的其它氨基酸的變體。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了如下獲得的微生物，包括利用rDNA方法學在ilvBN操縱子的核酸序列中引入變化(即突變)，分離支鏈氨基酸合成營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型的經(jīng)誘變變體，并選擇能夠以比親本菌株更高的效率將葡萄糖轉(zhuǎn)變成除L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-纈氨酸以外的其它氨基酸的變體。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的微生物生成L-賴氨酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明致力于棒桿菌微生物或短桿菌微生物，特別優(yōu)選的微生物是生成L-賴氨酸的棒桿菌或短桿菌微生物。在最優(yōu)選的實施方案中，微生物具有NRRL No.B-30149(也稱為LC10)或NRRLNo.B-30150(也稱為BF100-1030)的鑒定特征，這兩種菌株于1999年6月29日保藏于農(nóng)業(yè)研究機構培養(yǎng)物收藏中心(AgriculturalResearch Service Culture Collection)，北方地區(qū)研究中心(Northern Regional Research Center)，北方大學街1815號(1815University Street)，Peoria，伊利諾斯州(Illinois)，61604，美國。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于提高氨基酸產(chǎn)量的方法，包括誘變親本菌株，選擇一種或多種支鏈氨基酸合成的營養(yǎng)缺陷型細胞，并選擇以比親本菌株更高的百分比產(chǎn)量由右旋糖生成預期氨基酸的支鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法致力于通過培養(yǎng)經(jīng)隨機化學誘變或重組DNA(rDNA)技術變成對支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸中一種或多種為營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型的棒桿菌來提高由右旋糖生成氨基酸L-賴氨酸的產(chǎn)量。
在一個具體的實施方案中，支鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型是由棒桿菌的化學誘變產(chǎn)生的。在另一個具體的實施方案中，支鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型是由ilvBN操縱子通過rDNA技術的誘變產(chǎn)生的。
本發(fā)明的另一個目的是提供由能夠以比親本菌株更高的效率將葡萄糖轉(zhuǎn)變成除L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-纈氨酸以外的其它氨基酸的微生物生產(chǎn)氨基酸的工藝。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)氨基酸的工藝，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如下獲得的微生物誘變親本菌株成為支鏈氨基酸合成營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型，并選擇能夠以比親本菌株更高的效率將葡萄糖轉(zhuǎn)變成除L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-纈氨酸以外的其它氨基酸的變體。
在本發(fā)明工藝的優(yōu)選實施方案中，發(fā)酵利用的微生物是如下獲得的，包括對親本菌株進行隨機化學誘變，分離支鏈氨基酸合成營養(yǎng)缺陷型的經(jīng)誘變變體，并選擇能夠以比親本菌株更高的效率將葡萄糖轉(zhuǎn)變成除L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-纈氨酸以外的其它氨基酸的變體。在本發(fā)明工藝的另一個優(yōu)選實施方案中，發(fā)酵利用的微生物是如下獲得的，包括利用rDNA方法學改變(即引入突變)ilvBN操縱子的核苷酸序列，分離支鏈氨基酸合成營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型的經(jīng)誘變變體，并選擇能夠以比親本菌株更高的效率將葡萄糖轉(zhuǎn)變成除L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-纈氨酸以外的其它氨基酸的變體。
應當領會，上文一般描述和下文詳細描述只是例示性和解釋性的，意欲提供對所申請發(fā)明的進一步解釋。
圖的簡述
圖1.(A)棒桿菌中L-賴氨酸生成的生化途徑的示意圖；(B)棒桿菌中L-異亮氨酸生成的生化途徑的示意圖。
圖2.(A-B)棒桿菌的ilvBN操縱子核苷酸序列的示意圖(SEQ ID NO1)；(C)棒桿菌的ilvBN操縱子氨基酸序列的示意圖(SEQ ID NO2)。
圖3.(A-B)質(zhì)粒pAL203Δ中的ilvBN缺失突變體核苷酸序列的示意圖(SEQ ID NO3)；(C)質(zhì)粒pAL203Δ中的ilvBN缺失突變體氨基酸序列的示意圖(SEQ ID NO4)。
圖4.(A-C)pRV1B5等位基因的核苷酸序列的示意圖(SEQ ID NO5)；(D)pRV1B5等位基因的氨基酸序列的示意圖(SEQ ID NO6)。
優(yōu)選實施方案的詳述1.定義為了清楚且一致的理解說明書和權利要求書，包括這些術語的范圍，本文提供了下列定義。
營養(yǎng)缺陷型當用于本文時，該術語指由于獲得性遺傳缺陷而不能合成特定代謝物，因而其生長需要該代謝物的外部來源的微生物菌株。
氨基酸補充當用于本文時，該術語指生長所需并添加到基本培養(yǎng)基中以支持營養(yǎng)缺陷型生長的氨基酸。
營養(yǎng)徐緩型當用于本文時，該術語指在不存在特定代謝物的外部來源時展示延緩生長的微生物菌株。營養(yǎng)徐緩型能夠合成代謝物，但是由于獲得性遺傳缺陷，合成速率低于親本菌株合成相同代謝物的速率。
支鏈氨基酸當用于本文時，該術語指其中R基團具有支鏈碳結構的氨基酸，諸如亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸。
碳流當用于本文時，該術語指碳在生物體兩用、分解、和/或合成生化途徑之間的運動。
染色體整合當用于本文時，該術語指外源DNA片段插入宿主生物體的染色體；更具體的說，該術語用于指外源DNA片段與宿主細胞染色體適當區(qū)域之間的同源重組。
高產(chǎn)量衍生物當用于本文時，該術語指與進行衍生的親本菌株相比，以更高產(chǎn)量由右旋糖生成特定氨基酸的微生物菌株。
突變當用于本文時，該術語指感興趣的核苷酸序列中單個堿基對的變化、插入、或缺失。
操縱子當用于本文時，該術語指細菌基因表達和調(diào)控的DNA單位，包括結構基因和調(diào)控元件。操縱子內(nèi)包含的調(diào)控元件的范例包括但不限于啟動子和操縱基因。
親本菌株當用于本文時，該術語指進行某些形式的誘變以產(chǎn)生本發(fā)明微生物的微生物菌株。
由右旋糖生成的百分比產(chǎn)量當用于本文時，該術語指由公式[(生成的氨基酸克數(shù)/消耗的右旋糖克數(shù))*100]＝％產(chǎn)量定義的由右旋糖生成氨基酸的產(chǎn)量。
表型當用于本文時，該術語指依賴微生物遺傳結構的看得見的物理特征。
相對生長當用于本文時，該術語指在已知成分培養(yǎng)基上培養(yǎng)確定的時間后，通過直接比較親本菌株與后代菌株的生長情況來提供生長評價的測量。
誘變當用于本文時，該術語指在DNA中產(chǎn)生突變的工藝。對于“隨機”誘變，突變的準確位置是不可預測的，即可發(fā)生于微生物基因組中的任何位置，而且突變是由諸如照射或化學處理等因素引起的物理損傷的結果。rDNA誘變針對的是感興趣的克隆DNA，可以是隨機的或定點的。2.基于降低流向支鏈氨基酸合成的碳流和提高生成非支鏈氨基酸的產(chǎn)量的本發(fā)明微生物一般而言，本發(fā)明提供了因支鏈氨基酸合成為營養(yǎng)缺陷型而將碳流指向非支鏈氨基酸合成的微生物。更具體的說，通過選擇需要一種或多種支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、或纈氨酸(如異亮氨酸和纈氨酸)的特定營養(yǎng)缺陷型表型，或設計ilvBN操縱子中的突變以降低流向異亮氨酸、亮氨酸、和纈氨酸合成的碳流，從而該系統(tǒng)的碳流可用于其它代謝途徑(如L-賴氨酸合成)。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了生成氨基酸X的微生物C，其中所述微生物C是由下列方法獲得的(a)選擇以百分比產(chǎn)量Y由右旋糖生成所述氨基酸的親本微生物A；(b)通過選自下組的方法誘變所述親本微生物A以產(chǎn)生微生物B(i)隨機化學誘變；和(ii)ilvBN操縱子的rDNA誘變；(c)由步驟(b)選擇一種或多種支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型的至少一種經(jīng)誘變微生物B；并(d)由步驟(c)選擇以百分比產(chǎn)量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一種微生物C，其中所述百分比產(chǎn)量Z比所述百分比產(chǎn)量Y更高。
由右旋糖生成的百分比產(chǎn)量優(yōu)選使用下面的公式計算[(生成的賴氨酸克數(shù)/L)/(消耗的右旋糖克數(shù)/L)]*100。
親本微生物可選自本領域已知能夠生成氨基酸X的任何微生物。特別優(yōu)選的親本微生物是棒桿菌和短桿菌。
可通過本領域熟練技術人員知道和可用的任何方法和技術來制備本發(fā)明的菌株。適用于構建本發(fā)明細菌菌株的方法的例示性范例包括但不限于使用合適試劑(諸如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝酸胍，即NTG)進行的誘變；由轉(zhuǎn)化線性DNA或同源重組介導的基因整合技術；以及由噬菌體介導的轉(zhuǎn)導。這些方法在本領域是眾所周知的，且描述于例如，J.H.Miller，《分子遺傳學實驗》(Experiments in MolecularGenetics)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1972；J.H.Miller，《細菌遺傳學短期課程》(A Short Course in Bacterial Genetics)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1992；M.Singer和P.Berg，《基因和基因組》(Gene & Genomes)，大學科學叢書，Mill Valley，加利福尼亞，1991；J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatis，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989；P.B.Kaufman等人，《生物學和醫(yī)學中的分子和細胞方法手冊》(Handbook of Molecularand Cellular Methods in Biology and Medicine)，CRC出版社，Boca Raton，佛羅里達，1995；《植物分子生物學和生物技術中的方法》(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)，B.R.Glick和J.E.Thompson編，CRC出版社，Boca Raton，佛羅里達，1993；和P.F.Smith-Keary，《大腸桿菌的分子遺傳學》(MolecularGenetics of Escherichia coli)，Guilford出版社，紐約，NY，1989。A.通過隨機誘變來構建支鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型在一個具體的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明假定修飾L-異亮氨酸、L-亮氨酸、和L-纈氨酸生物合成中共有的酶促步驟可提高由右旋糖生成L-賴氨酸的百分比產(chǎn)量。
在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明通過隨機誘變親本菌株隨后選擇特定表型而提供了支鏈氨基酸合成營養(yǎng)缺陷型的微生物。選擇用于誘變的親本菌株可以是已知生成感興趣氨基酸的任何菌株。優(yōu)選的生物體包括棒桿菌菌株和短桿菌菌株，最優(yōu)選的生物體包括生成L-賴氨酸的棒桿菌菌株和短桿菌菌株。
可使用本領域已知的任何隨機誘變技術來誘變親本菌株，包括但不限于照射和化學操作。特別優(yōu)選的是隨機化學誘變，最優(yōu)選的是由J.H.Miller描述的烷化劑法(J.H.Miller，《分子遺傳學實驗》(Experiments in Molecular Genetics)，冷泉港實驗室，1972)。
作為范例，如下進行化學誘變。在豐富培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)生成賴氨酸的棒桿菌菌株的培養(yǎng)物至光密度達到6.0。用基本培養(yǎng)基清洗細胞，并重懸于含100μg/mL NTG的基本培養(yǎng)基。將細胞于30℃暴露于誘變劑達30分鐘。用基本培養(yǎng)基清洗細胞，并涂布在豐富培養(yǎng)基平板上。將豐富培養(yǎng)基平板上的菌落復制到豐富培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基的平板上。在豐富培養(yǎng)基上生長但在基本培養(yǎng)基上不生長的菌落歸類為營養(yǎng)缺陷型。將營養(yǎng)缺陷型突變體復制到基本培養(yǎng)基和含10mM L-異亮氨酸和10mM L-纈氨酸的基本培養(yǎng)基的平板上。由異亮氨酸和纈氨酸挽救的菌落歸類為纈氨酸營養(yǎng)缺陷型。菌株B4B是通過化學誘變產(chǎn)生的纈氨酸營養(yǎng)缺陷型。B.通過經(jīng)rDNA方法學的誘變來構建支鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型在另一個具體的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明利用重組DNA技術對編碼支鏈氨基酸生物合成中重要蛋白質(zhì)的克隆DNA序列進行體外和體內(nèi)誘變。突變后的DNA可用于修飾親本菌株，以產(chǎn)生支鏈氨基酸合成營養(yǎng)缺陷型且以比親本菌株更高的產(chǎn)量由右旋糖生成非支鏈氨基酸的突變菌株。
在一個具體的優(yōu)選實施方案中，可通過重組DNA技術通過本領域已知的任何方法突變感興趣的克隆DNA。正如本領域熟練技術人員所知道的，克隆DNA中的突變可包括單個核苷酸的變化(點突變)、多個核苷酸的變化、核苷酸缺失或插入。重組DNA技術的一般方法對于本領域熟練技術人員是知道的，而且可在描述基本技術(諸如核酸純化、限制酶消化、連接、基因克隆、基因測序、基因序列的聚合酶鏈式反應即PCR、諸如此類)的許多常見實驗室手冊中找到。參閱如Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA LaboratoryManual)，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989；《分子生物學現(xiàn)行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等人編，John Wiley & Sons，紐約，1994；《PCR方案》(PCRProtocols)，Innis等人編，Academic出版公司，紐約，第407-415頁，1990)。
另外，具體傳授體外誘變克隆DNA的參考文獻對于本領域熟練技術人員是知道的。例如，諸如定點誘變、由寡核苷酸介導的誘變、接頭掃描誘變、體外隨機化學誘變、盒式誘變、PCR誘變、和其它策略詳細描述于《定向誘變實踐方法》(Directed MutagenesisA PracticalApproach)，M.J.McPherson編，牛津大學出版社，紐約，1991。
在另一個具體的優(yōu)選實施方案中，可在宿主細胞體內(nèi)突變感興趣的克隆DNA。這種“體內(nèi)誘變”包括通過在DNA修復途徑之一或多個中攜有突變的大腸桿菌菌株中增殖DNA，從而在感興趣的任何克隆DNA中產(chǎn)生隨機突變的工藝。這些“增變”菌株的隨機突變率高于野生型親本。DNA在這些菌株中的增殖將在DNA中產(chǎn)生隨機突變。設計用于實現(xiàn)該目的的系統(tǒng)對于本領域熟練技術人員是知道的，而且可通過商業(yè)途徑獲得。例如，Stratagene公司提供了利用大腸桿菌XLl Red菌株的系統(tǒng)，該菌株缺失了DNA修復基因(MutH、MutL、和MutS)，從而在短時間內(nèi)得以發(fā)生許多不同突變。在30小時的時間跨度里可發(fā)生多達10,000處突變，從而得以通過本領域已知流程由突變DNA制備完整的突變DNA文庫。
選擇用于突變的克隆DNA可以是本領域已知對于支鏈氨基酸合成重要的任何序列，包括但不限于，對于合成重要的一種或多種酶或者對于轉(zhuǎn)運和分泌重要的一種或多種蛋白質(zhì)產(chǎn)物的編碼序列。最優(yōu)選的是棒桿菌或短桿菌ilvBN操縱子的克隆序列。已經(jīng)克隆了涉及支鏈氨基酸合成的棒桿菌基因；例如可獲得異亮氨酸途徑的基因序列(ilvA、ilvB、ilvC、ilvD、和ilvE)(C.Cordes等人，基因(Gene)112113-116，1992；B.Mckel等人，細菌學雜志(J.Bacteriology)1748065-8072，1992；和C.Keilhauer等人，細菌學雜志(J.Bacteriology)1755595-5603，1993)。
L-異亮氨酸是由L-蘇氨酸經(jīng)5個反應生成的；催化這些反應的酶包括(1)蘇氨酸脫水酶(ilvA)；(2)乙酰羥酸合酶(ilvBN)；(3)異構還原酶(ilvC)；(4)二羥酸脫水酶(ilvD)；和(5)轉(zhuǎn)氨酶(ilvE)。蘇氨酸脫水酶是該途徑中異亮氨酸合成唯一獨有的酶；其它4種酶還用于生成其它支鏈氨基酸，纈氨酸和亮氨酸。圖2顯示了棒桿菌菌株中涉及異亮氨酸生物合成的酶促途徑。
乙酰羥酸合酶(AHAS)和異構還原酶(IR)催化代謝物流向異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、和泛酸的后續(xù)反應。正如在其它細菌中，棒桿菌菌株的AHAS是由兩個基因(ilvB和ilvN)編碼的?；蚱茐拇_認了這兩個基因在谷氨酸棒桿菌中編碼單一AHAS活性(C.Keilhauer等人，細菌學雜志(J.Bacteriology)1755595-5603，1973)。通過Northern印跡分析在體內(nèi)鑒定了3.9、2.3、和1.1kb的3種轉(zhuǎn)錄本，分別對應于ilvBNC、ilvNC、和ilvC信息。ilvC轉(zhuǎn)錄本(編碼IR)是來自谷氨酸棒桿菌ilv操縱子的最豐富的轉(zhuǎn)錄本。其它分析指出，在這個操縱子中有3個有活性的啟動子；ilvBNC和ilvNC信息的穩(wěn)態(tài)水平顯著有助于單一AHAS的總活性。
在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，可通過限制酶消化在克隆ilvBN操縱子DNA序列中產(chǎn)生缺失，從而產(chǎn)生突變。然后可通過同源重組用突變后的ilvBN序列替代野生型序列，并篩選支鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型。
本發(fā)明的另一個實施方案致力于具有下列特征的微生物棒桿菌一種或多種支鏈氨基酸異亮氨酸、亮氨酸、和纈氨酸營養(yǎng)缺陷型，而且以比親本菌株百分比產(chǎn)量更高的百分比產(chǎn)量由右旋糖生成感興趣氨基酸。在特別優(yōu)選的實施方案中，生成的氨基酸是L-賴氨酸。
本發(fā)明其它高度優(yōu)選的實施方案致力于基本上具有NRRL保藏物編號B-30149或NRRL保藏物編號N-30150的所有特征的微生物。3.用于提高氨基酸產(chǎn)量的方法本發(fā)明的另一個目的是提供用于提高氨基酸產(chǎn)量的方法。一般而言，本發(fā)明提供了用于提高氨基酸X產(chǎn)量的方法，包括
(a)選擇以百分比產(chǎn)量Y由右旋糖生成所述氨基酸的親本微生物A；(b)通過選自下組的方法誘變所述親本微生物A以產(chǎn)生微生物B(i)隨機化學誘變；和(ii)ilvBN操縱子的rDNA誘變；(c)由步驟(b)選擇一種或多種支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸營養(yǎng)缺陷型的至少一種經(jīng)誘變微生物B；并(d)由步驟(c)選擇以百分比產(chǎn)量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一種微生物C，其中所述百分比產(chǎn)量Z比所述百分比產(chǎn)量Y更高。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，可選擇本領域已知的任何菌株作為以確定百分比產(chǎn)量由右旋糖生成感興趣氨基酸的親本菌株?？墒褂孟旅娴墓饺菀椎挠嬎阌捎倚巧傻陌俜直犬a(chǎn)量[(生成的氨基酸克數(shù)/L)/(消耗的右旋糖克數(shù)/L)]*100。
在選擇微生物并測定由右旋糖生成氨基酸的百分比產(chǎn)量后，優(yōu)選通過針對該生物體完整基因組的隨機誘變技術或者通過針對感興趣克隆DNA的rDNA技術對微生物進行誘變。不管誘變采用哪種具體方法，均對突變后的生物體進行篩選并依據(jù)支鏈氨基酸合成營養(yǎng)缺陷型進行選擇。然后篩選所選擇的營養(yǎng)缺陷型，以確定哪些菌株由右旋糖生成所需氨基酸的百分比產(chǎn)量高于親本菌株。
在多個實施方案，本發(fā)明提供了用于提高生物體棒桿菌、短桿菌、和大腸桿菌的感興趣氨基酸產(chǎn)量的方法。另外，根據(jù)具體的實施方案，本發(fā)明提供了用于提高非支鏈氨基酸產(chǎn)量的方法，諸如甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、和組氨酸。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了通過產(chǎn)生支鏈氨基酸合成營養(yǎng)缺陷型并使亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸合成的碳流轉(zhuǎn)向來提高非支鏈氨基酸產(chǎn)量的方法。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了通過由誘變后的親本菌株選擇纈氨酸和異亮氨酸合成營養(yǎng)缺陷型菌株來提高氨基酸產(chǎn)量的方法。
在多種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明還提供了通過隨機誘變技術(即照射或化學誘變)或者通過ilvBN操縱子的rDNA誘變技術誘變親本菌株來提高氨基酸產(chǎn)量的方法。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，可通過隨機化學誘變來誘變親本菌株。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，通過針對克隆ilvBN操縱子核苷酸序列的rDNA技術來誘變親本菌株。4.用于生產(chǎn)氨基酸的工藝本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)氨基酸的工藝。一般而言，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)氨基酸X的工藝，包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物C，其中所述微生物C是由下列方法獲得的(i)選擇以百分比產(chǎn)量Y由右旋糖生成所述氨基酸的親本微生物A；(ii)通過選自下組的方法誘變所述親本微生物A以產(chǎn)生微生物B(1)隨機化學誘變；和(2)ilvBN操縱子的rDNA誘變；(iii)由步驟(ii)選擇一種或多種支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸營養(yǎng)缺陷型的至少一種經(jīng)誘變微生物B；并(iv)由步驟(iii)選擇以百分比產(chǎn)量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一種微生物C，其中所述百分比產(chǎn)量Z比所述百分比產(chǎn)量Y更高；并(b)回收由所述微生物C生成的所述氨基酸X。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案是其中培養(yǎng)的微生物選自棒桿菌、短桿菌、和大腸桿菌的方法。特別優(yōu)選的是涉及棒桿菌屬生物體的方法。為本發(fā)明工藝選擇的微生物是那些生成感興趣氨基酸(特別是非支鏈氨基酸)的微生物。更特別優(yōu)選的微生物是生成甘氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、和組氨酸的微生物?？赏ㄟ^下面計算由右旋糖生成的百分比產(chǎn)量的公式方便的測定選定氨基酸的產(chǎn)量水平[(生成的氨基酸克數(shù)/L)/(消耗的右旋糖克數(shù)/L)]*100。
用于本發(fā)明工藝的微生物優(yōu)選通過誘變選定的親本菌株而獲得。本發(fā)明優(yōu)選實施方案包括其中對選定親本菌株進行針對整個基因組的隨機誘變或者感興趣的克隆DNA的rDNA誘變的方法。
在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案中，對親本菌株進行的隨機誘變包括但不限于通過照射處理或化學處理的誘變。在更特別優(yōu)選的實施方案中，對親本菌株進行隨機化學誘變。
在本發(fā)明另一個特別優(yōu)選的實施方案中，對親本菌株進行rDNA誘變。在更特別優(yōu)選的實施方案中，進行ilvBN操縱子的體外或體內(nèi)rDNA誘變。然后通過本領域熟練技術人員眾所周知的同源重組技術，可用ilvBN操縱子或其片段的突變形式替代野生型ilvBN操縱子序列(見實施例6)。
無論誘變的是選擇的親本菌株還是克隆的DNA序列，均對產(chǎn)生的后代進行篩選，并選擇支鏈氨基酸合成(即亮氨酸、異亮氨酸、或纈氨酸)營養(yǎng)缺陷型。這種突變體的選擇完全屬于本領域從業(yè)人員的技術范圍之內(nèi)。一個特別優(yōu)選的實施方案是纈氨酸和異亮氨酸生物合成營養(yǎng)缺陷型菌株。
最后，根據(jù)選定氨基酸的產(chǎn)量選擇本發(fā)明工藝的微生物。利用公式[(氨基酸克數(shù)/L)/(消耗的右旋糖克數(shù)/L)]*100來測定由右旋糖生成的百分比產(chǎn)量，根據(jù)具有比親本菌株更高的百分比產(chǎn)量由右旋糖生成選定氨基酸來選擇所需微生物。
本發(fā)明的其它實施方案是在培養(yǎng)本發(fā)明微生物的具體方法方面有所不同的方法。因此，本領域已知的多種發(fā)酵技術可應用于本發(fā)明生產(chǎn)氨基酸的方法中。
合適碳源的例示性范例包括但不限于碳水化合物，諸如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉水解產(chǎn)物、纖維素水解產(chǎn)物、和糖蜜；有機酸，諸如乙酸、丙酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸、和延胡索酸；以及醇類，諸如甘油。
合適氮源的例示性范例包括但不限于氨，諸如氨氣和氨水；無機酸或有機酸的銨鹽，諸如氯化銨、磷酸銨、硫酸銨、和乙酸銨；以及其它含氮物質(zhì)，包括肉膏、蛋白胨、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物、豆餅水解產(chǎn)物、和酵母提取物。
一般而言，可根據(jù)本發(fā)明通過發(fā)酵工藝(諸如分批發(fā)酵或補料分批發(fā)酵)商業(yè)性生產(chǎn)氨基酸。在分批發(fā)酵中，在發(fā)酵開始時加入所有養(yǎng)分。在補料分批發(fā)酵或持續(xù)補料分批發(fā)酵中，由發(fā)酵開始時或在培養(yǎng)達到某一時間時，或者在培養(yǎng)液中補加的養(yǎng)分耗盡時，向培養(yǎng)物中持續(xù)供應一種或多種養(yǎng)分。持續(xù)分批發(fā)酵或補料分批發(fā)酵的變化形式是重復補料分批發(fā)酵或流入-流出發(fā)酵，其中在某些時刻由發(fā)酵罐取出部分內(nèi)含物，例如當發(fā)酵罐充滿時，而養(yǎng)分的補充持續(xù)進行。在這種方式中，發(fā)酵可持續(xù)較長時間。
另一類發(fā)酵，即連續(xù)發(fā)酵或恒化培養(yǎng)，連續(xù)補加完全培養(yǎng)基，同時連續(xù)或半連續(xù)取出培養(yǎng)物，使得發(fā)酵罐中培養(yǎng)液的體積保持大致恒定。連續(xù)發(fā)酵在原理上可持續(xù)無限時間。
在分批發(fā)酵中，生物體生長直至培養(yǎng)基中的一種必需養(yǎng)分耗盡，或者發(fā)酵條件變得不適宜(如pH降至抑制微生物生長的數(shù)值)。在補料分批發(fā)酵中，通常進行測量(如使用pH控制)以維持適宜的生長條件，并向培養(yǎng)物中添加一種或多種必需養(yǎng)分以預防這些養(yǎng)分的耗盡。微生物將以養(yǎng)分補料速率規(guī)定的生長速率繼續(xù)生長。通常，一種養(yǎng)分，非常常見的是碳源，將限制生長。相同原理也適用于連續(xù)發(fā)酵，通常培養(yǎng)基補料中的一種養(yǎng)分是限制性的，所有其它養(yǎng)分是過量的。限制性養(yǎng)分將以非常低的濃度存在于培養(yǎng)液中，常常低得測量不到?？刹捎貌煌愋偷酿B(yǎng)分限制。碳源限制是最常用的。其它范例是氮源限制、氧限制、特定養(yǎng)分限制諸如維生素或氨基酸(在這種化合物的營養(yǎng)缺陷型微生物的情況中)、硫限制、和磷限制。
可通過本領域已知的任何方法回收氨基酸。例示性流程提供于H.J.Van Walsem和M.C.Thompson，細菌學雜志(J.Bacteriology)59127-132，1997；和美國專利號3,565,951(收入本文作為參考)。
本文明確收入文中提及的所有專利和發(fā)表物作為參考。
實施例實施例1化學誘變和纈氨酸營養(yǎng)缺陷型的選擇如J.H.Miller所述(J.H.Miller，1972，《分子遺傳學實驗》(Experiments in Molecular Genetics)，冷泉港實驗室)，用烷化劑誘變生成賴氨酸的棒桿菌菌株BF100。將菌落復制到基本培養(yǎng)基(MM)平板上。在MM上不生長但在完全培養(yǎng)基(CM)上生長的菌落鑒定為營養(yǎng)缺陷型。選擇在補充L-纈氨酸和L-異亮氨酸的MM上能夠生長的營養(yǎng)缺陷型菌株用于賴氨酸產(chǎn)量分析。
MM每升含20g D-葡萄糖、10g硫酸銨、2.5g尿素、1g KH2PO4、0.4gMgSO47H2O、1g NaCl、0.01g MnSO4·H2O、0.01g FeSO47H2O、10mg泛酸、50mg生物素、200mg硫胺素、和50mg煙酰胺，pH7.2。當在MM中補充L-氨基酸時，每種用量是50mg/L。MMIV指添加異亮氨酸和纈氨酸的MM。
表1顯示了親本菌株及其通過化學誘變產(chǎn)生的高產(chǎn)量衍生物在補充3種氨基酸的基本培養(yǎng)基瓊脂平板上的生長模式。補充的是50mg/LL-氨基酸。以30℃培養(yǎng)3天后的相對菌落大小表示生長情況。實施例2使用rDNA技術產(chǎn)生支鏈營養(yǎng)缺陷型1.缺失型ilvB基因的制備通過PCR擴增乳發(fā)酵棒桿菌(ATCC 21799)的ilvBN操縱子，并克隆到pCR-Script中產(chǎn)生pAL203。ilvB基因包含由2個EcoNI限制性位點分隔的390bp區(qū)域。EcoNI不切割質(zhì)粒pCR-Script。通過用EcoNI切割質(zhì)粒pAL203隨后自身連接產(chǎn)生pAL203Δ，由此設計了ilvB缺失型等位基因。2.經(jīng)修飾ilvBN等位基因進入棒桿菌染色體的同源重組如Maloy等人所述(S.R.Maloy、V.J.Stewart、和R.K.Taylor，1996，《致病細菌的遺傳分析實驗室手冊》(Genetic Analysis ofPathogenic BacteriaA Laboratory Manual)，冷泉港出版社)，構建了用于通過雙交換進行等位基因交換的載體。ATCC 37766是在大腸桿菌中復制但在棒桿菌中不復制的質(zhì)粒pK184的來源。將sacB基因亞克隆到該質(zhì)粒的SspI位點中產(chǎn)生pJC3。pJC3不能在棒桿菌中復制。在任何卡那霉素抗性菌落中，載體已通過克隆基因內(nèi)位點處的同源重組整合到染色體中。整合載體上sacB基因的致死表達防止了在存在蔗糖時的生長。在存在蔗糖時的生長要求沿克隆的插入片段的同源區(qū)發(fā)生第二次交換。若第一次和第二次交換位于修飾(缺失、點突變)的兩側(cè)，則ilvBN的經(jīng)修飾等位基因?qū)Q下宿主菌株染色體上存在的等位基因。
將來自pAL203Δ的ilvBN操縱子的經(jīng)修飾等位基因亞克隆到整合載體pJC3中，并電穿孔轉(zhuǎn)化到棒桿菌的BF100菌株中，然后涂布在不含蔗糖但含卡那霉素的豐富培養(yǎng)基(DMK)平板上。挑取菌落，并在不含蔗糖和卡那霉素的豐富肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)物在不含卡那霉素但含蔗糖的豐富培養(yǎng)基平板上劃線。由蔗糖平板挑取單菌落，并復制到DMK、SM1、MM、和MMIV平板上。選擇不具有卡那霉素抗性、能在蔗糖上生長、不能在MM上生長、能在MMIV上生長的菌株用于搖瓶實驗。LC10是BF100衍生的營養(yǎng)缺陷型。
表2顯示了親本菌株及其使用重組DNA方法產(chǎn)生的高產(chǎn)量衍生物在補充3種氨基酸的一系列基本培養(yǎng)基瓊脂平板上的生長模式。補充的是50mg/L L-氨基酸。以30℃培養(yǎng)3天后的相對菌落大小表示生長情況。實施例3通過隨機化學誘變產(chǎn)生的纈氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株的L-賴氨酸產(chǎn)量的搖瓶測定由SM1平板挑取單菌落并轉(zhuǎn)移至SM1肉湯培養(yǎng)基，由此制備B4B種子培養(yǎng)物。SM1是由每升水混合50g蔗糖、3g K2HPO4、3g尿素、0.5gMgSO47H2O、20g聚蛋白胨、5g牛肉浸膏、0.9mg D-生物素、3mg硫胺素、125mg煙酰胺、0.5g L-甲硫氨酸、0.25g L-蘇氨酸、和0.5g L-丙氨酸并調(diào)pH7.3而制備的。平板含20g/L瓊脂。在SM1肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時后，加入等體積的30％甘油，并將培養(yǎng)物凍存于-80℃。
在裝有20mL SFM的帶擋板250mL種子搖瓶中接種0.1mL融化的種子培養(yǎng)物。種子培養(yǎng)基(SFM)每升水含60g D-葡萄糖、3g K2HPO4、3g尿素、0.5g MgSO47H2O、20g聚蛋白胨、5g牛肉浸膏、3mg D-生物素、125mg煙酰胺、0.5g L-甲硫氨酸、0.25g L-蘇氨酸、和0.5g L-丙氨酸，pH7.3。將培養(yǎng)物于30℃培養(yǎng)16小時，攪拌設為240pm，位移2英寸。取2mL種子培養(yǎng)物用于接種21mL發(fā)酵培養(yǎng)基(FM4)。FM4培養(yǎng)基是通過混合16mL主要培養(yǎng)基與5mL右旋糖原液產(chǎn)生的。右旋糖原液是180gD-葡萄糖加500mL水。主要培養(yǎng)基每升含0.083g MnSO4、0.4mg D-生物素、玉米漿、萃余液(raffinate)、和50g CaCO3。加入玉米漿使FM4終體積為4％干固體。加入萃余液使FM4終體積中有5％硫酸銨。將培養(yǎng)物在250mL帶擋板的搖瓶中于30℃培養(yǎng)48小時，通氣設為240rpm，位移2英寸。
表3顯示了通過選擇纈氨酸和異亮氨酸要求而得到改進的棒桿菌菌株在搖瓶中的L-賴氨酸產(chǎn)量的數(shù)據(jù)。實施例4通過rDNA方法學產(chǎn)生的纈氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株的L-賴氨酸產(chǎn)量的搖瓶測定表4顯示了通過由ilvBN操縱子染色體拷貝缺失390個堿基的DNA序列而得到改進的棒桿菌菌株在搖瓶中的L-賴氨酸產(chǎn)量的數(shù)據(jù)(見實施例2)。如實施例3所述培養(yǎng)并分析培養(yǎng)物。實施例5纈氨酸營養(yǎng)缺陷型的賴氨酸產(chǎn)量的微量發(fā)酵測定在裝有500mL SM1的2升帶擋板搖瓶中培養(yǎng)種子培養(yǎng)物18小時。將3.1L FM4培養(yǎng)基用于4L微量發(fā)酵罐。將溫度和pH分別維持于32℃和7.2。在20小時將攪拌由700rpm提高至950rpm。通氣為4.5LPM。將右旋糖維持于3g/L。發(fā)酵時間為48小時。
表5顯示了不能合成L-異亮氨酸和L-纈氨酸的棒桿菌菌株在4升發(fā)酵罐中的L-賴氨酸產(chǎn)量的數(shù)據(jù)。實施例6通過克隆的ilvBN的體內(nèi)誘變產(chǎn)生的營養(yǎng)徐緩型的L-賴氨酸生產(chǎn)1.產(chǎn)生功能性AHAS酶的缺陷型ilvBN操縱子的制備將pAL203上的i lvBN操縱子亞克隆到穿梭載體pM2中產(chǎn)生pVAL1。pM2在大腸桿菌和棒桿菌中都能復制。將pVAL1轉(zhuǎn)化到增變菌株XL1RED(Stratagene公司)中。參照XL1RED試劑盒的指示制備誘變質(zhì)粒，并電穿孔到纈氨酸營養(yǎng)缺陷型棒桿菌中。纈氨酸營養(yǎng)缺陷型在沒有功能性ilvBN操縱子的遺傳互補的情況下，在沒有補充異亮氨酸和纈氨酸的MM平板上不能生長。
由SM1平板選擇卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體，并復制到MM平板上。那些在MM平板上生長的菌落顯示存在ilvB缺失的功能互補。選擇比含親本質(zhì)粒(pVAL1)的纈氨酸營養(yǎng)缺陷型菌落小的菌落用于纈氨酸營養(yǎng)缺陷型活性測定分析。pRV1B5是由在大腸桿菌和棒桿菌中都能復制的pVAL1衍生的質(zhì)粒。纈氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株產(chǎn)生的AHAS活性比由pVAL1產(chǎn)生的AHAS比活性的1％還要低。ilvBN操縱子的這種構建物具有滲漏AHAS活性。2.同源重組進入棒桿菌染色體DNA將ilvBN操縱子的RV1B5滲漏型等位基因亞克隆到整合載體pJC3中，并用于通過同源重組用滲漏型等位基因換下纈氨酸營養(yǎng)缺陷型的缺失型等位基因，正如實施例2中進行的。BF100-1030是用RV1B5等位基因構建的纈氨酸營養(yǎng)徐緩型。表6的數(shù)據(jù)顯示BF100-1030在搖瓶中生成的纈氨酸比它的親本菌株少。表7顯示BF100-1030營養(yǎng)徐緩型的生長相對于表5中的營養(yǎng)缺陷型得到了改善。表7還顯示營養(yǎng)徐緩型在微量發(fā)酵罐中生成的纈氨酸比親本菌株少。
表在實施例部分中討論了下面這些表格顯示的數(shù)據(jù)。注意，術語“生長”指于660nm測量的光密度；術語“滴度”指氨基酸克數(shù)/升；術語“產(chǎn)量”由下列公式定義[(生成的賴氨酸克數(shù)/L)/(消耗的右旋糖克數(shù)/L)]*100；B4B＝通過化學誘變構建的纈氨酸營養(yǎng)缺陷型；LC10＝通過用pAL203Δ的i1vB缺失型等位基因取代染色體ilvB基因構建的纈氨酸營養(yǎng)缺陷型；BF100-1030＝通過用RV1B5滲漏型等位基因取代染色體ilvB基因構建的纈氨酸營養(yǎng)徐緩型。
序列表<110>Archer-Daniels-Midland公司Rayapati，P，JohnCrafton，Corey M.<120>氨基酸生產(chǎn)的代謝工程<130>1503.074PC01<140><141><150>US 60/146,379<151>1999-08-02<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1895<212>DNA<213>棒桿菌屬之種<400>1ggagccagaa agtcgtgaat gtggcagctt ctcaacagcc cactcccgcc acggttgcaa 60gccgtggtcg atccgccgcc cctgagcgga tgacaggtgc aaaggcaatt gttcgatcgc 120tcgaggagct taacgccgac atcgtgttcg gtattcctgg tggtgcggtg ctaccggtgt 180atgacccgct ctattcctcc acaaaggtgc gccacgtctt ggtgcgccac gagcagggcg 240caggccacgc agcaaccggc tacgcgcagg ttactggacg cgttggcgtc tgcattgcaa 300cctctggccc aggagcaacc aacttggtta ccccaatcgc tgatgcaaac ttggactccg 360ttcccatggt tgccatcacc ggccaggtcg gaagtggcct gctgggtacc gacgctttcc 420aggaagccga tatccgcggc atcaccatgc cagtgaccaa gcacaacttc atggtcacca 480accctaacga cattccacag gcattggctg aggcattcca cctcgcgatt actggtcgcc 540ctggccctgt tctggtggat attcctaagg atgtccagaa cgctgaattg gatttcgtct 600ggccaccaaa gatcgacctg ccaggctacc gcccagtttc aacaccacat gctcgccaga 660tcgagcaggc agtcaagctg atcggtgagg ccaagaagcc cgtcctttac gttggtggtg 720gcgtaatcaa ggctgacgca cacgaagagc ttcgtgcgtt cgctgagtac accggcatcc 780cagttgtcac caccttgatg gctttgggta ctttcccaga gtctcacgag ctgcacatgg 840gtatgccagg catgcatggc actgtgtccg ctgttggtgc actgcagcgc agcgacctgc 900tgattgctat cggctcccgc tttgatgacc gcgtcaccgg tgacgttgac accttcgcgc 960ctgacgccaa gatcattcac gccgacattg atcctgccga aatcggcaag atcaagcagg 1020ttgaggttcc aatcgtgggc gatgcccgcg aagttcttgc tcgtctgctg gaaaccacca 1080aggcaagcaa ggcagagacc gaggacatct ccgagtgggt tgactacctc aagggcctca 1140aggcacgttt cccgcgtggc tacgacgagc agccaggcga tctgctggca ccacagtttg 1200tcattgaaac cctgtccaag gaagttggcc ccgacgcaat ttactgcgcc ggcgttggcc 1260agcaccaaat gtgggcagct cagttcgttg actttgaaaa gccacgcacc tggctcaact 1320ccggtggact gggcaccatg ggctacgcag ttcctgcggc ccttggagca aaggctggcg 1380cacctgacaa ggaagtctgg gctatcgacg gcgacggctg tttccagatg accaaccagg 1440aactcaccac cgccgcagtt gaaggtttcc ccattaagat cgcactaatc aacaacggaa 1500acctgggcat ggttcgccaa tggcagaccc tattctatga aggacggtac tcaaatacta 1560aacttcgtaa ccagggcgag tacatgcccg actttgttac cctttctgag ggacttggct 1620gtgttgccat ccgcgtcacc aaagcggagg aagtactgcc agccatccaa aaggctcgag 1680agatcaacga ccgcccagta gtcatcgact tcatcgtcgg tgaagacgca caggtatggc 1740caatggtgtc tgctggatca tccaactccg atatccagta cgcactcgga ttgcgcccat 1800tctttgatgg tgatgaatct gcagcagaag atcctgccga cattcacgaa gccgtcagcg 1860acattgatgc cgccgttgaa tcgaccgagg cataa 1895<210>2<211>626<212>PRT<213>棒桿菌屬之種<400> 2Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser1 5 10 15Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys Ala Ile20 25 30Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro35 40 45Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys50 55 60Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala65 70 75 80Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr85 90 95Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn100 105 110Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly115 120 125Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr130 135 140Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile145 150 155 160Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro165 170 175Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu180 185 190Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val195 200 205Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly210 215 220Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala225 230 235 240Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly Ile Pro245 250 255Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu260 265 270Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly275 280 285Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp290 295 300Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile305 310 315 320Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val325 330 335Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu340 345 350Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu Asp Ile Ser Glu Trp355 360 365Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp370 375 380Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu385 390 395 400Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln405 410 415His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr420 425 430Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala435 440 445Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile450 455 460Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala465 470 475 480Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn485 490 495Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr500 505 510Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val515 520 525Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala530 535 540Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg545 550 555 560Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro565 570 575Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly580 585 590Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala595 600 605Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr610 615 620Glu Ala625<210>3<211>1505<212>DNA<213>棒桿菌屬之種<400>3ggagccagaa agtcgtgaat gtggcagctt ctcaacagcc cactcccgcc acggttgcaa 60gccgtggtcg atccgccgcc cctgagcgga tgacaggtgc aaaggcaatt gttcgatcgc 120tcgaggagct taacgccgac atcgtgttcg gtattcctgg tggtgcggtg ctaccggtgt 180atgacccgct ctattcctcc acaaaggtgc gccacgtctt ggtgcgccac gagcagggcg 240caggccacgc agcaaccggc tacgcgcagg ttactggacg cgttggcgtc tgcattgcaa 300cctctggccc aggagcaacc aacttggtta ccccaatcgc tgatgcaaac ttggactccg 360ttcccatggt tgccatcacc ggccaggtcg gaagtggcct gctgggtacc gacgctttcc 420aggaagccga tatccgcggc atcaccatgc cagtgaccaa gcacaacttc atggtcacca 480accctaacga cattccacag gcattggctg 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tccaactccg 1380atatccagta cgcactcgga ttgcgcccat tctttgatgg tgatgaatct gcagcagaag 1440atcctgccga cattcacgaa gccgtcagcg acattgatgc cgccgttgaa tcgaccgagg 1500cataa 1505<210>4<211>496<212>PRT<213>棒桿菌屬之種<400>4Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser1 5 10 15Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys Ala Ile20 25 30Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro35 40 45Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys50 55 60Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala65 70 75 80Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr85 90 95Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn100 105 110Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly115 120 125Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr130 135 140Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Ash Asp Ile145 150 155 160Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro165 170 175Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu180 185 190Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val195 200 205Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly210 215 220Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala225 230 235 240Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly Ile Pro245 250 255Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu260 265 270Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly275 280 285Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp290 295 300Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile305 310 315 320Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val325 330 335Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu340 345 350Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu Asp Ile Ser Glu Trp355 360 365Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp370 375 380Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu385 390 395 400Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala Glu Glu405 410 415Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg Pro Val420 425 430Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro Met Val435 440 445Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly Leu Arg450 455 460Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala Asp Ile465 470 475 480His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr Glu Ala485 490 495<210>5<211>2427<212>DNA<213>棒桿菌屬之種<400>5aggagccaga aagtcgtgaa tgtggcagct tctcaacagc ccactcccgc cacggttgca 60agccgtggtc gatccgccgc ccctgagcgg atgacaggtg cacaggcaat tgttcgatcg 120ctcgaggagc ttaacgccga catcgtgttc ggtattcctg gtggtgcggt gctaccggtg 180tatgacccgc tctattcctc cacaaaggtg cgccacgtcc tagtgcgcca cgagcagggc 240gcaggccacg cagcaaccgg ctacgcgcag gttactggac gcgttggcgt ctgcattgca 300acctctggcc caggcgcaac caacttggtt accccaatcg ctgatgcaaa cttggactcc 360gttcccatgg ttgccatcac cggccaggtc ggaagtagcc tgctgggtac cgatgctttc 420caggaagccg atatccgcgg catcaccatg ccagtgacca agcacaactt catggtcacc 480aaccccaacg acattccaca ggcattggct gaggcattcc acctcgcgat tactggtcgc 540cctggtcctg ttctagtgga tatccccaag gatgttcaga acgctgaatt ggatttcgtc 600tggccaccaa agatcgacct gccaggctac cgcccagttt caacaccgca tgctcgacag 660attgagcagg ctgtcaaact gatcggtgag tctaagaagc ctgtccttta cgttggcggc 720ggcgttatca aggctgatgc ccacgaagag cttcgtgcgt tcgctgagca caccggcatt 780ccagttgtca ccacattgat ggcgctggga accttcccag agtcccacga gctgcacatg 840ggtatgccag gcatgcatgg cactgtgtcc gctgttggtg cactgcagcg cagcgacctg 900ctgattgcta tcggctcccg ctttgatgac cgcgtcaccg gtgacgttga cactttcgca 960cctgatgcca agatcattca cgccgacatt gatcctgccg aaatcggcaa gatcaagcag 1020gttgaggttc caatcgtggg cgatgcccgc gaggttcttg ctcgtctgct cgaaaccacc 1080aaggcaagca aggcagagtc tgaggacatc tccgagtggg ttgactacct caagggcctc 1140aaggcacgtt tcccacgtgg ctacgacgag cagccaggcg atctgctggc accacagttt 1200gtcattgaaa ccctgtccaa ggaagttggc cccgacgcaa tttactgcgc cggcgttggc 1260cagcaccaga tgtgggcagc tcagttcgtt gacttcgaaa agccacgcac ctggctcaac 1320tccggtggac tgggcaccat gggctacgca gttcctgcgg ctcttggagc aaaggctggc 1380gcacctgaca aggaagtctg ggctatcgac ggcgacggct gtttccagat gaccaaccag 1440gaactcacca ccgccgcagt tgaaggtttc tccattaaga tcgcactaat caacaacgga 1500aacctgggta tggttcgcca atggcagacc ctattctatg aaggacggta ctcaaatact 1560aaacttcgta accagggcga gtacatgccc gactttgtta ccctttctga gggacttggc 1620tgtgttgcca tccgcgtcac caaagcggag gaagtactgc cagccatcca aaaggctcga 1680gagatcaacg accgcccagt agtcatcgac ttcatcgtcg gtgaagacgc acaggtatgg 1740ccaatggtgt ctgctggatc atccaactcc gatatccagt acgcactcgg attgcgccca 1800ttctttgatg gtgatgaatc tgcagcagaa gatctgccga cattcacgaa gccgtcagcg 1860acattgatgc cgccgttgaa tcgaccgagg cataaggaga gacccaagat ggctaattct 1920gacgtcaccc gccacatcct gtccgtactc gttcaggacg tagacggaat catttcccgc 1980gtatcaggta tgttcacccg acgcgcattc aacctcgtgt ccctcgtgtc tgcaaagacc 2040gaaacactcg gcatcaaccg catcacggtt gttgtcgacg ccgacgagct caacattgag 2100cagatcacca agcagctcaa caagctgatc cccgtgctca aagtcgtgcg acttgatgaa 2160gagaccacta tcgcccgcgc aatcatgctg gttaaggttt ctgcggacag caccaaccgt 2220ccgcagatcg tcgacgccgc gaacatcttc cgcgcccgag tcgtcgacgt ggctccagac 2280tctgtggtta ttgaatccac aggcacccca ggcaagctcc gcgcactgct tgacgtgatg 2340gaaccattcg gaatccgcga actgatccaa tccggacaga ttgcactcaa ccgcggtccg 2400aagaccatgg ctccggccaa gatctaa 2427<210>6<211>803<212>PRT<213>棒桿菌屬之種<400>6Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser1 5 10 15Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Gln Ala Ile20 25 30Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro35 40 45Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys50 55 60Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala65 70 75 80Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr85 90 95Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn100 105 110Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Ser115 120 125Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr130 135 140Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile145 150 155 160Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro165 170 175Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu180 185 190Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val195 200 205Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly210 215 220Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala225 230 235 240Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu His Thr Gly Ile Pro245 250 255Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu260 265 270Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly275 280 285Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp290 295 300Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile305 310 315 320Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val325 330 335Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu340 345 350Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Ser Glu Asp Ile Ser Glu Trp355 360 365Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp370 375 380Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu385 390 395 400Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln405 410 415His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr420 425 430Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala435 440 445Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile450 455 460Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala465 470 475 480Ala Val Glu Gly Phe Ser Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn485 490 495Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr500 505 510Ser Ash Thr Lys Leu Arg Ash Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val515 520 525Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala530 535 540Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg545 550 555 560Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro565 570 575Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly580 585 590Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Leu Pro595 600 605Thr Phe Thr Lys Pro Ser Ala Thr Leu Met Pro Pro Leu Asn Arg Pro610 615 620Arg His Lys Glu Arg Pro Lys Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His625 630 635 640Ile Leu Ser Val Leu Val Gln Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val645 650 655Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser660 665 670Ala Lys Thr Glu Thr Leu Gly Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp675 680 685Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu690 695 700Ile Pro Val Leu Lys Val Val Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala705 710 715 720Arg Ala Ile Met Leu Val Lys Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro725 730 735Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val740 745 750Ala Pro Asp Ser Val Val Ile Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu755 760 765Arg Ala Leu Leu Asp Val Met Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile770 775 780Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro785 790 795 800Ala Lys Ile
權利要求
1.生產(chǎn)氨基酸X的微生物C，其中所述微生物C是由下列方法獲得的(a)選擇以百分比產(chǎn)量Y由右旋糖生成所述氨基酸的親本微生物A；(b)通過選自下組的方法誘變所述親本微生物A以產(chǎn)生微生物B(i)隨機化學誘變；和(ii)ilvBN操縱子的rDNA誘變；(c)由步驟(b)選擇一種或多種支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型的至少一種經(jīng)誘變微生物B；并(d)由步驟(c)選擇以百分比產(chǎn)量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一種微生物C，其中所述百分比產(chǎn)量Z比所述百分比產(chǎn)量Y更高。
2.權利要求1的微生物C，其中氨基酸X選自下組(a)甘氨酸；(b)丙氨酸；(c)甲硫氨酸；(d)苯丙氨酸；(e)色氨酸；(f)脯氨酸；(g)絲氨酸；(h)蘇氨酸；(i)半胱氨酸；(j)酪氨酸；(k)天冬酰胺；(l)谷氨酰胺；(m)天冬氨酸；(n)谷氨酸；(o)賴氨酸；(p)精氨酸；和(q)組氨酸。
3.權利要求2的微生物C，其中微生物A選自下組(a)棒桿菌屬；(b)短桿菌屬；和(c)大腸桿菌。
4.權利要求3的微生物C，其中微生物B是纈氨酸和異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型。
5.權利要求3的微生物C，其中步驟(b)誘變是隨機化學誘變。
6.權利要求3的微生物C，其中步驟(b)誘變是ilvBN操縱子的定點誘變。
7.具有下列特征的微生物棒桿菌屬菌株(a)一種或多種支鏈氨基酸異亮氨酸、亮氨酸、和纈氨酸營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型；(b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時生成選自下組的氨基酸(i)甘氨酸；(ii)丙氨酸；(iii)甲硫氨酸；(iv)苯丙氨酸；(v)色氨酸；(vi)脯氨酸；(vii)絲氨酸；(viii)蘇氨酸；(ix)半胱氨酸；(x)酪氨酸；(xi)天冬酰胺；(xii)谷氨酰胺；(xiii)天冬氨酸；(xiv)谷氨酸；(xv)賴氨酸；(xvi)精氨酸；和(xvii)組氨酸；且(c)由右旋糖生成步驟(b)氨基酸的百分比產(chǎn)量為至少大約30％。
8.權利要求7的微生物，其特征還包括ilvBN操縱子中的突變。
9.權利要求8的微生物，其中ilvBN操縱子中的突變是缺失、插入、或點突變。
10.權利要求9的微生物，其中ilvBN操縱子中的突變特征為序列SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
11.具有NRRL保藏物編號B-30149的鑒定特征的微生物棒桿菌菌株。
12.具有NRRL保藏物編號B-30150的鑒定特征的微生物棒桿菌菌株。
13.提高氨基酸X產(chǎn)量的方法，包括(a)選擇以百分比產(chǎn)量Y由右旋糖生成所述氨基酸的親本微生物A；(b)通過選自下組的方法誘變所述親本微生物A以產(chǎn)生微生物B(i) 隨機化學誘變；和(ii)ilvBN操縱子的rDNA誘變；(c)由步驟(b)選擇一種或多種支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型的至少一種經(jīng)誘變微生物B；并(d)由步驟(c)選擇以百分比產(chǎn)量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的至少一種微生物C，其中所述百分比產(chǎn)量Z比所述百分比產(chǎn)量Y更高。
14.權利要求13的方法，其中氨基酸X選自下組(a)甘氨酸；(b)丙氨酸；(c)甲硫氨酸；(d)苯丙氨酸；(e)色氨酸；(f)脯氨酸；(g)絲氨酸；(h)蘇氨酸；(i)半胱氨酸；(j)酪氨酸；(k)天冬酰胺；(l)谷氨酰胺；(m)天冬氨酸；(n)谷氨酸；(o)賴氨酸；(p)精氨酸；和(q)組氨酸。
15.權利要求14的方法，其中微生物A選自下組(a)棒桿菌屬；(b)短桿菌屬；和(c)大腸桿菌。
16.權利要求15的方法，其中微生物B是纈氨酸和異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型。
17.權利要求15的方法，其中步驟(b)誘變是隨機化學誘變。
18.權利要求15的方法，其中步驟(b)誘變是ilvBN操縱子的定點誘變。
19.用于生產(chǎn)氨基酸X的工藝，包括(a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物C，其中所述微生物C是由下列方法獲得的(i)選擇以百分比產(chǎn)量Y由右旋糖生成所述氨基酸的親本微生物A；(ii)通過選自下組的方法誘變所述親本微生物A以產(chǎn)生微生物B(1)隨機化學誘變；和(2)ilvBN操縱子的rDNA誘變；(iii)由步驟(ii)選擇一種或多種支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸營養(yǎng)缺陷型的至少一種經(jīng)誘變微生物B；并(iv)由步驟(iii)選擇以百分比產(chǎn)量Z由右旋糖生成所述氨基酸X的營養(yǎng)缺陷型的至少一種微生物C，其中所述百分比產(chǎn)量Z比所述百分比產(chǎn)量Y更高；并(b)回收由所述微生物C生成的所述氨基酸X。
20.權利要求19的工藝，其中氨基酸X選自下組(a)甘氨酸；(b)丙氨酸；(c)甲硫氨酸；(d)苯丙氨酸；(e)色氨酸；(f)脯氨酸；(g)絲氨酸；(h)蘇氨酸；(i)半胱氨酸；(j)酪氨酸；(k)天冬酰胺；(l)谷氨酰胺；(m)天冬氨酸；(n)谷氨酸；(o)賴氨酸；(p)精氨酸；和(q)組氨酸。
21.權利要求20的工藝，其中所述微生物A選自下組(a)棒桿菌屬；(b)短桿菌屬；和(c)大腸桿菌。
22.權利要求21的工藝，其中所述微生物B是纈氨酸和異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型。
23.權利要求21的工藝，其中步驟(ii)誘變是隨機化學誘變。
24.權利要求21的工藝，其中步驟(ii)誘變是ilvBN操縱子的定點誘變。
全文摘要
本發(fā)明涉及氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn),并提供其中有用的微生物、方法和工藝。本發(fā)明的微生物能夠以比親本菌株更高的效率將葡萄糖轉(zhuǎn)變成除L－異亮氨酸、L－亮氨酸、和L－纈氨酸以外的其它氨基酸。本發(fā)明提供了經(jīng)誘變而成為一種或多種支鏈氨基酸的合成營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型且經(jīng)選擇以比親本菌株更高的百分比產(chǎn)量生成預期氨基酸的微生物。優(yōu)選的微生物是生成L－賴氨酸的棒桿菌、短桿菌、或大腸桿菌。誘變是通過經(jīng)典技術或rDNA方法學進行的。本發(fā)明的方法設計用于提高氨基酸產(chǎn)量,包括誘變親本菌株,選擇一種或多種支鏈氨基酸合成的營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型細胞,并選擇以比親本菌株更高的百分比產(chǎn)量由右旋糖生成預期氨基酸的支鏈氨基酸營養(yǎng)缺陷型或營養(yǎng)徐緩型。本發(fā)明的工藝設計用于生產(chǎn)氨基酸,包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)通過誘變親本菌株并選擇能夠以比親本菌株更高的效率將葡萄糖轉(zhuǎn)變成除L－異亮氨酸、L－亮氨酸、和L－纈氨酸以外的其它氨基酸的變體獲得的微生物。
文檔編號C12N15/01GK1367823SQ00811165
公開日2002年9月4日 申請日期2000年8月2日 優(yōu)先權日1999年8月2日
發(fā)明者P·J·拉雅帕蒂, C·M·卡拉夫頓 申請人:阿徹·丹尼爾斯－米德蘭公司