專利名稱：能夠預(yù)防腹瀉的雙歧桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將非病原性微生物雙歧桿菌類用于制備一種載體和加入食品或藥物來治療或預(yù)防輪狀病毒引起的腹瀉，以及涉及含有此微生物的食品或藥物組合物。
很早以來人們就知道產(chǎn)生主要代謝組合物乳酸的生物體。在牛奶或牛奶處理工廠中，活著或腐爛的植物中，也可在人和動物的腸子中發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌。這些被概括為術(shù)語“乳酸細(xì)菌”的微生物，代表了一組相當(dāng)不同類的細(xì)菌包括例如乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)，鏈球菌(Streptococcus)、雙歧菌屬(Bifidobacterium)、片球菌屬(Pediococcus)。
乳酸細(xì)菌作為低pH值條件下保存食物的發(fā)酵劑使用，發(fā)酵產(chǎn)物的作用抑制有害細(xì)菌的生長。另外，乳酸細(xì)菌也用于制作不同的乳制品例如奶酪、酸奶酪和其他發(fā)酵的奶制品。
近期，乳酸細(xì)菌的一些菌株顯示出對人和動物的吸收頗有價值的特性，引起了人們的密切關(guān)注。特別是，特殊的乳酸菌或雙歧菌的菌株被發(fā)現(xiàn)能夠在腸內(nèi)膜上定居并且有助于維持人和動物的健康。
在這方面，歐洲專利EP0768375公開了雙歧菌的特異性菌株，這種菌株能夠灌輸進(jìn)入腸內(nèi)并且粘附在腸細(xì)胞上。報道說這些雙歧細(xì)菌有助于免疫功能，能夠競爭性抑制病原性細(xì)菌對腸內(nèi)細(xì)胞的粘附，有助于維持生物個體的健康。
最近幾年的科研集中在乳酸細(xì)菌作為益生菌試劑的潛在應(yīng)用。益生菌被認(rèn)為是能通過保持腸內(nèi)自然微生物區(qū)系促進(jìn)生物個體健康的可生長的微生物制劑。微生物制劑通常被認(rèn)為是益生菌也就是這種有效的微生物并且人們已經(jīng)知道了它們作用的模式。益生菌貼附在腸粘膜上，在腸道內(nèi)建群并且防止有害微生物在其上粘附。對于它們在腸內(nèi)發(fā)揮作用的至關(guān)重要的先決條件是它們必須以一種適當(dāng)?shù)哪艽婊畹姆绞秸掣降絻?nèi)臟的粘膜上而且在胃腸上部不被消滅，特別是不受胃內(nèi)低pH區(qū)域的影響。
在這方面，作為這樣的一種益生菌，WO97/00078公開了一種特異性菌株，稱為乳酸菌GG(ATCC53103)。在防止或治療食物誘發(fā)的過敏反應(yīng)的方法中特定的使用這種微生物，也就是將其和已經(jīng)經(jīng)過用胃蛋白酶和/或胰島素以及進(jìn)行水解處理的食品給藥于受體。所選擇的乳酸菌菌株顯示了粘附和生長性能及蛋白酶體系，以至于含在將被給藥的食物的蛋白質(zhì)通過被這種特殊的乳酸菌分泌的蛋白酶進(jìn)一步水解。這份文件所討論的方法最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)被內(nèi)臟消化，沒有顯示出存在任何引起過敏的物質(zhì)。
更進(jìn)一步，在EP 0 577 903參考資料中采用了這種乳酸菌，它具有取代幽門螺桿菌的能力，幽門螺桿菌公認(rèn)是引起潰瘍的原因，上述制備可以治療和預(yù)防幽門螺桿菌引起的潰瘍。
乳酸菌特殊菌株顯示出有價值的特性，現(xiàn)有技術(shù)目的在于希望發(fā)現(xiàn)細(xì)菌菌株能夠有益于人類和/或動物的健康的其它的特性。
因此，本發(fā)明要解決的問題是提供另外的乳酸菌，它對生物體的攝食機(jī)能產(chǎn)生有益的作用。
在導(dǎo)致本發(fā)明的研究過程中，雙歧桿菌類微生物沒有被確定的性質(zhì)現(xiàn)在被令人驚奇的發(fā)現(xiàn)了。本發(fā)明提供了屬于雙歧菌且能夠基本上防止輪狀病毒感染腸內(nèi)細(xì)胞的微生物在用于腹瀉的治療或護(hù)理的載體中的應(yīng)用。
所用的雙歧桿菌優(yōu)選從青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)的或長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)中選擇組成，優(yōu)選青春雙歧桿菌，更優(yōu)選雙歧桿菌CNCM I-2168。
微生物可以用于一種可吸收的載體制備，例如牛奶、酸奶酪、凝乳、發(fā)酵奶、奶基發(fā)酵產(chǎn)品、發(fā)酵谷類產(chǎn)品、奶粉(milk based powders)、嬰兒食品或?qū)櫸锸称?，且以大約105cfu/g到1011cfu/g的量包含在載體中。本發(fā)明采用的縮寫cfu的意思是“菌落形成單位”，定義為瓊脂板上的微生物計數(shù)所表示的細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)目。
本發(fā)明也提供一種食品或藥物組合物，含有至少一種雙歧桿菌菌株，能夠基本上防止腸細(xì)胞被輪狀病毒感染。
本發(fā)明制備的食物組合物至少使用一種雙歧桿菌菌株并以大約105cfu/g到1011cfu/g的含量，和合適的載體混合在一起，優(yōu)選含量為大約106cfu/g到1010cfu/g，更優(yōu)選大約為107cfu/g到109cfu/g.。
藥品可以以片劑、液體細(xì)菌懸浮液、口服補充劑(oral supplement)、濕口服補充劑、干管飼或濕管飼等形式制備，所用的雙歧桿菌菌株的含量高達(dá)1012cfu/g，優(yōu)選大約107cfu/g到1011cfu/g，更優(yōu)選107cfu/g到1010cfu/g。
微生物可以進(jìn)一步被配制于載體內(nèi)，以獲得所希望的釋放模式如膠囊劑等等。依據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的目的，可以選擇適當(dāng)?shù)馁x形劑和/或添加劑。
微生物在生物體腸內(nèi)的活性當(dāng)然取決于劑量。也就是分別通過上述食品或藥物組合物攝入的微生物越多，保護(hù)和/或治療的作用越高。由于所用的微生物對于人類或動物無害，實際上是從自然環(huán)境中分離出來的，也就是從嬰兒的糞中分離出來的，加入的量高，生物體腸內(nèi)微生物建群的比例也就高。
在這些圖中


圖1顯示用于評價細(xì)菌菌株對輪狀病毒的保護(hù)特性的細(xì)胞培養(yǎng)物的圖例說明。
在本發(fā)明的廣泛研究時，發(fā)明人調(diào)查了從嬰兒糞便中分離的不同細(xì)菌菌株或從美國組織及細(xì)胞保藏中心獲得不同的細(xì)菌菌株(ATCC15704)。檢驗這些不同的菌株防止腸細(xì)胞被輪狀病毒引起腹瀉的能力。
由于具有抑制輪狀病毒的性能，幾種細(xì)菌包括雙歧桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬類被篩選。用三種輪狀病毒的血清型進(jìn)行抑制性能試驗，這三種輪狀病毒血清類型代表了人類病毒腹瀉的主要病原因子(血清型G1、G3和G4)。
各種乳酸細(xì)菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長，例如在它們適合的培養(yǎng)基MRS、Hugo-Jago或M17培養(yǎng)基中，最佳的生長溫度30到40℃。在這些細(xì)菌穩(wěn)定生長后采用離心分離和在生理食鹽溶液中重新懸浮收集這些細(xì)菌。這些不同試驗之間中的細(xì)菌細(xì)胞被冷凍儲存(-20℃)。
通過融合細(xì)胞單層的感染制備各種輪狀病毒原種。在感染之前培養(yǎng)這些輪狀病毒。這些細(xì)胞用20個組織培養(yǎng)感染劑量感染。
為了評估抗輪狀病毒的特性采用了兩種不同的方案。一個方案直接檢驗和輪狀病毒直接作用的這些不同細(xì)菌菌株，而同時另一個方案使這些菌株和細(xì)胞輪狀病毒的受體交互作用并篩選這些細(xì)菌。
第一個方案涉及采用不同的輪狀病毒菌株與各自的細(xì)菌懸浮液相接觸并在在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后將這種病毒-細(xì)菌混合物施加在人類未分化的結(jié)腸腺瘤細(xì)胞HT-29的單層細(xì)胞上(腸內(nèi)上皮細(xì)胞系)并連續(xù)培養(yǎng)。然后檢驗病毒復(fù)制。
第二個方案涉及首先將各自的細(xì)菌懸浮液和人類未分化的結(jié)腸腺瘤細(xì)胞HT-29一起培養(yǎng)然后再加入這種病毒。在連續(xù)培養(yǎng)后檢驗病毒復(fù)制。
輪狀病毒的復(fù)制很容易采用感染細(xì)胞中的輪狀病毒蛋白質(zhì)的組織免疫著色法來檢測。
當(dāng)和輪狀病毒加上指定的細(xì)菌一起培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中的感染細(xì)胞與僅與輪狀病毒一起培養(yǎng)的細(xì)胞相比時感染細(xì)胞的數(shù)目減少到90％時，顯然輪狀細(xì)胞的抑制作用被施加于給定的細(xì)菌。
總數(shù)超出260種的不同的細(xì)菌菌株中只有4種具有抑制輪狀病毒復(fù)制的作用。這些不同細(xì)菌屬于雙歧桿菌屬的亞種青春雙歧桿菌或長雙歧桿菌。屬于青春雙歧桿菌的已命名為Bad4，根據(jù)布達(dá)佩斯條約被保存并獲得保存號CNCM I-2168。這種菌株證明能夠極其有效的防止人類細(xì)胞被輪狀病毒感染。本發(fā)明將采用舉例的方法描述。
培養(yǎng)基和溶液MRS(Difco)，Hugo-Jago(蛋白胨Difco 30g/l，酵母提取物Difco 10g/l，乳糖Difco 5g/l，KH2PO45g/l，牛肉汁Difco 2g/l，瓊脂Difco 2g/l)M17(Difco)M199(Seromed)Ringer溶液(Oxoid)PBS(NaCl 8g/l，KCl 0.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KH2PO40.2g/l))蛋白胨磷酸鹽肉湯(流體)胰酶-乙二胺四乙酸溶液(黏液)從美國費城兒童醫(yī)院P.A.Offit獲得人類輪狀病毒W(wǎng)a(G1血清型)和猿的輪狀病毒SA-11(G3血清型)。從美國國立衛(wèi)生研究所Bethesda，A.Kapikian獲得DS-1xRRV重排列體(reassortant)病毒。從德國慕尼黑大學(xué)P.Bachmann獲得血清型人類輪狀病毒Hochi。
實施例1從嬰兒糞便中分離乳酸菌從15到27天大的健康嬰兒的尿布收集新鮮的糞便。1克新鮮糞便在無氧的條件下送到實驗室在Ringer溶液系列稀釋樣品之后，在2小時內(nèi)進(jìn)行微生物分析，并涂在選擇性培養(yǎng)基上。在37℃溫度下在加入抗菌素的MRS瓊脂(磷霉素80μg/ml，磺胺甲基異噁唑新明磺93pg/ml，甲氧芐胺嘧啶5ug/ml)培養(yǎng)48小時，用于分離乳酸細(xì)菌。隨機(jī)提取并提純菌體。進(jìn)行分離株的生理學(xué)和遺傳學(xué)特征的分析。在這項試驗中也使用了獲自ATCC(ATCC15704)的另一種菌株，對應(yīng)于本發(fā)明優(yōu)選的菌株Bad4。
實施例2細(xì)胞中抗輪狀病毒活性的菌株試驗由雙歧桿菌屬、乳球菌屬和鏈球菌屬組成的幾種屬的細(xì)菌被選出并檢測其中顯示出在細(xì)胞培養(yǎng)基抑制試驗中具有抗輪狀病毒活性的成員(見下述1st和2st方案)。乳球菌屬采用一個種(乳酸乳球菌)由兩個亞種組成(乳酸乳球菌乳亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種)(Lc.lactis supsp.lactis and cremoris)。試驗了總共30個菌株。鏈球菌屬采用一個種(嗜熱鏈球菌(S.thermophilus))的45個菌株。明串珠菌屬(Leuconostoc)和丙酸菌屬(Propionibacterium)由一個種(6個菌株)代表，而腸球菌和葡萄球菌屬(Staphylococcus)每一種采用兩個種類代表，總共17個菌株。
總共260個細(xì)菌菌株用于試驗輪狀病毒的活性。
1st方案30ul的各自細(xì)菌懸浮液(含平均3×106細(xì)菌)和70u.l M199培養(yǎng)基補充了10％的蛋白胨磷酸鹽肉湯(流體)和5％胰酶-EDTA溶液(黏液)混合，再加入100μl補充M199培養(yǎng)基中的病毒。這種病毒-細(xì)菌混合物在4℃培養(yǎng)1小時，37℃培養(yǎng)1小時。作為融合單層細(xì)胞在96-well微量滴定板中(在M99培養(yǎng)基中用10％蛋白胨磷酸鹽肉湯(流體)和5％胰島素-EDTA溶液(黏液)用PBS沖稀1∶4補充)生長的人類未分化結(jié)腸瘤細(xì)胞HT-29用磷酸鹽緩沖劑鹽水(PBS，Ph7.2)洗三次。上述工藝混合的病毒和細(xì)菌混合物被轉(zhuǎn)到這些細(xì)胞中并在微量滴定板中在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18個小時。病毒的復(fù)制按照如下描述進(jìn)行檢驗。
2nd方案30ul細(xì)菌懸浮液和加有10％的蛋白胨磷酸鹽肉湯(流體)、5％胰酶-EDTA溶液(黏液)的70ul M199培養(yǎng)基混合，直接加到生長的HT-29細(xì)胞上并按照1st方案描述的方法在微量滴定板中進(jìn)行預(yù)處理。在37℃下培養(yǎng)1小時后，將M199培養(yǎng)基中的100μl的病毒加入到微量滴定板中的細(xì)胞上。在CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)中連續(xù)培養(yǎng)18個小時。復(fù)制病毒按照如下所述進(jìn)行檢驗。
復(fù)制輪狀病毒采用在后面將描述的感染細(xì)胞的輪狀病毒蛋白質(zhì)組織免疫著色進(jìn)行檢驗。
在感染一天后，從微量滴定板去除細(xì)胞培養(yǎng)基并用無水乙醇固定細(xì)胞10分鐘。去除乙醇并用PBS緩沖劑洗這些板三次。(主要直接抗VP6蛋白質(zhì))兔產(chǎn)生的50ul抗輪狀病毒血清(從洛桑大學(xué)ISREC獲得)在PBS中稀釋1∶2000倍加入每個孔并用蓋子蓋上防止干燥，在37℃培養(yǎng)1小時。然后清除抗體血清并用PBS清洗三次。然后抗兔免疫球蛋白G(IgG)的山羊抗血清和過氧物酶(GAR-IgG-PO；Nordic)稀釋1∶500倍的PBS加入到每個孔中，這些滴定板在37℃培養(yǎng)1小時。血清清除，滴定板再用PBS清洗三次。然后100pLI的下述混合物加入每一個孔中0.05M的Tris鹽酸(pH7.8)，1ml H2O2(30％suprapur，用水沖稀1∶600倍，Merck)和200μl 3-氨基-9-乙基咔唑(0.1g/10ml的乙醇在-80℃儲存在200μl aliquots；A-5754；Sigma)。這些滴定板在室溫至少培養(yǎng)30分鐘。去除培養(yǎng)基然后注入200ul的H2O來停止反應(yīng)。用倒置顯微鏡(Diavert；Leitz)計數(shù)感染細(xì)胞灶。
只有非常少的細(xì)菌菌株和輪狀病毒發(fā)生作用。260個細(xì)菌細(xì)胞的4種至少在第一個方案中抑制輪狀病毒復(fù)制。青春雙歧桿菌CNCM I-2168(Bad4)有極強的抗血清型1輪狀病毒、血清型3輪狀病毒SA-11和血清型4輪狀病毒Hochi的活性。
根據(jù)在＂Genera of lactic acid bacteria＂，Ed.B.J.B.Wood and W.H.Holzapfel，Blackie A & P.公開的方法，Bad4是革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性菌，在發(fā)酵時不產(chǎn)生CO2并產(chǎn)生L(+)乳酸。
134表
關(guān)于微生物保藏的說明(細(xì)則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
權(quán)利要求
1.屬于雙歧桿菌屬的能夠防止輪狀病毒感染腸細(xì)胞的乳酸細(xì)菌在制備一種可以治療和預(yù)防腹瀉的載體中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中雙歧桿菌選自由長雙歧桿菌或青春雙歧桿菌組成的組。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中雙歧桿菌是雙歧桿菌CNCM I-2168。
4.上述任一權(quán)利要求的應(yīng)用，其中雙歧桿菌含在可吸收的載體中。
5.權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中雙歧桿菌含在載體中的量從大約105到大約1012cfi/g載體。
6.按照權(quán)利要求4或5的應(yīng)用，其中載體是選自奶、干酪、凝乳、酸奶酪、奶基發(fā)酵產(chǎn)品、冰激凌、發(fā)酵谷類產(chǎn)品、奶粉、嬰兒食品或?qū)櫸锸称返氖澄锝M合物。
7.食品或藥物組合物，至少含有一種能夠防止輪狀病毒感染腸細(xì)胞的雙歧桿菌菌株。
8.按照權(quán)利要求7的組合物，選自奶、干酪、凝乳、酸奶酪、奶基發(fā)酵產(chǎn)品、冰激凌、發(fā)酵谷類產(chǎn)品、奶粉、嬰兒食品或?qū)櫸锸称?、片劑、液體細(xì)菌懸浮液、干口服補充劑、濕口服補充劑、干管飼或濕管飼。
9.按照權(quán)利要求7組合物為片劑、液體細(xì)菌懸浮液、干口服補充劑、濕口服補充劑，干管飼或濕管飼的形式。
全文摘要
本發(fā)明涉及屬于雙歧桿菌的微生物的應(yīng)用于制備一種載體，這種載體可用于治療或預(yù)防腹瀉。本發(fā)明也涉及含有這樣的微生物的食物或藥品的組合物。
文檔編號A23L1/03GK1420781SQ00811244
公開日2003年5月28日 申請日期2000年7月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月5日
發(fā)明者H·布呂索, R·雷尼洛, J·斯多蒂 申請人:雀巢制品公司