專利名稱：免疫強化組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫強化組合物以及促進產(chǎn)生干擾素γ的組合物。
當消化道黏膜生物保護系統(tǒng)的免疫功能低下時，外源微生物就會移居到消化道中并繁殖，從而引起消化道感染和細菌性痢疾等，還導(dǎo)致一些如發(fā)燒、嘔吐、腹瀉和腹痛癥狀。例如，免疫功能低下也可由過度勞累或壓力造成的厭食引起。
年幼孩子、老年人和體弱多病的人特別容易受到外病原體的攻擊，這是因為他們的免疫力差。因此，充當加速產(chǎn)生IgA并維持在高水平的物質(zhì)將對這些個體和前面提及的消化道感染患者有益，尤其是當服用形式為飲料或其他食品時候。
然而，當今還沒有有效的預(yù)防或治療藥物在內(nèi)臟免疫功能低下和消化道感染的情況下能起到促進產(chǎn)生IgA的作用。細菌性痢疾疾病的治療如今限制于針對脫水的流體輸液和施用抗生素。
發(fā)明公開因此，本發(fā)明的目的是提供一種新型消化道免疫強化組合物，用于預(yù)防和/或治療這些消化道感染等，特別是這種組合物以飲料或其他食品形式存在。
為達到該目的，本發(fā)明人經(jīng)過廣泛研究，發(fā)現(xiàn)低聚乳果糖在人體中展示了理想的免疫強化作用，而且施用低聚乳果糖能治療和預(yù)防消化道感染等，并在此新發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上完成了該發(fā)明。
本發(fā)明提供了一種免疫強化組合物，包括低聚乳果糖和載體。
本發(fā)明人還新發(fā)現(xiàn)施用這種組合物促進產(chǎn)生干擾素-γ(IFN-γ)。
因此，本發(fā)明提供了促進產(chǎn)生IFN-γ的組合物，包括低聚乳果糖和載體。
本發(fā)明的組合物必須含有低聚乳果糖(下文稱為“LS”)作為活性成分。如本發(fā)明所用，術(shù)語“低聚乳果糖”表示眾所周知的下列化學式的物質(zhì)，具有化學名稱O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1←2)-β-D-呋喃果糖苷。 LS能由多種方法生產(chǎn)。這些方法包括例如如日本審查專利公開S57-58905中所描述的方法，將衍生自氣桿菌的果聚糖蔗糖酶應(yīng)用到含有蔗糖和乳糖的溶液中；如日本未審查專利公開S64-85090中所描述的方法，將擲孢酵母屬的真菌例如獨特擲孢酵母(Sporobolomycessingularis)或其抽提物應(yīng)用到含有蔗糖和乳糖的溶液中；或如日本未審查專利公開H2-35095所描述的方法，將拉恩桿菌屬的真菌如Rahnella aquatilis，或其抽提物應(yīng)用到含有蔗糖和乳糖的溶液中。
反應(yīng)混合物主要包含由前述方法獲得的LS或由此法制備的純化的LS，可用在本發(fā)明的組合物中。
LS也已知是個至關(guān)重要的營養(yǎng)素(糖原)，其對腸中雙歧桿菌的選擇性生長是必須的。
本發(fā)明組合物中的LS比例正常選自從約0.5到約70g/100g或優(yōu)選從約5到約30g/100g的范圍。
只要組合物能通過口腔施用或被攝取，對免疫強化組合物或促進產(chǎn)生IFN-γ的組合物的形式，本發(fā)明沒有特別的限制。組合物能以多種形式提供，包括塊、液體、糖漿或粉末。能采用的更具體的形式例子包括食品如液體或粉末甜味劑，飲料如軟飲料、牛奶飲料和碳酸飲料，和點心如面包、餅干和糖果以及健康食品、藥劑如散裝(bulk)粉末、粉末、液體、懸浮液、片劑和發(fā)泡制品等。
這些形式中，飲料和發(fā)泡制品尤其合乎要求。
上述本發(fā)明組合物的形式能通過制定活性組份LS和適用于多種形式的食品載體或可藥用載體的配方而產(chǎn)生。食品載體包括例如可食用性添加劑，如填充劑、甜味劑、其他碳水化合物、維生素、香料和色素。
更具體地，如果例如本發(fā)明的組合物是以食品形式，考慮到LS每日給與量(有效量)為約1到約30g，組合物從LS和合適的食品載體中制備以使得有效量能被容易地攝取。食品形式的一個典型例是飲料，其能制備成水溶液形式，含有0.5-70g/100ml或優(yōu)選5-30g/100ml的活性成分。此種飲料的pH使用pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液等能調(diào)節(jié)至約4.0到約6.5或優(yōu)選地至約4.5到約6.0。
此種pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液的典型例子包括弱酸如檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、碳酸和其鹽如檸檬酸鈉、檸檬酸銨、酒石酸鈉、蘋果酸鈉、乳酸鈉、乳酸鈣、碳酸鈉和碳酸氫鈉。碳酸氫鈉也能用作pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液。這些酸或其鹽能單個使用或以兩個或多個結(jié)合使用。其制訂的配方量選自有益于上述產(chǎn)品飲料pH范圍的范圍，但一般不可以大于組合物重量的約2％或優(yōu)選約0.05到約0.3％。
當組合物以此種飲料或其他食品形式存在時，各種碳水化合物、甜味劑和其他添加劑也能加入到本發(fā)明的組合物中，就象是將他們加入到普通飲料等中一樣。碳水化合物的例子包括葡萄糖、果糖和其他單糖；麥芽糖、蔗糖和其他雙糖；糊精、環(huán)糊精和其他多糖(LS除外)；木糖醇、赤蘚糖醇、山梨糖醇和其他糖醇；和糖酯等。甜味劑的例子包括天然甜味劑(新蛇菊苷A和其他蛇菊抽提物，sormatin和甘草皂苷等)和合成甜味劑(糖精和阿氏巴甜等)。這些碳水化合物和甜味劑制定的配方量一般不超過所得飲料重量的約15％或優(yōu)選約13％。
當配制作為食品的本發(fā)明組合物時，一種、二種或多種例如下列添加劑，如必要，也可加入。該添加劑包括例如葡萄柚、蘋果、橘子、檸檬、菠蘿、香蕉、梨和其他水果果汁(濃縮果汁或果汁粉末等)；維生素和維生素原(視黃醇棕櫚酸酯、雙苯酰硫胺、核黃素、鹽酸吡哆醇、氰鈷胺素、抗壞血酸鈉、尼克酰胺、泛酸鈣、葉酸、生物素、膽鈣化甾醇、二酒石酸鈣、生育酚、β-胡蘿卜素以及水溶性和脂溶性維生素)；香料(檸檬香料、橘子香料、葡萄柚香料和香草香精等)；氨基酸、核酸和其鹽(谷氨酸、谷氨酸鈉、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺鈉和肌苷酸等)；食用性纖維(聚葡萄糖、果膠、黃原膠、阿拉伯膠和藻酸等)；以及礦物質(zhì)和微量元素(氯化鈉、醋酸鈉、硫酸鎂、氯化鉀、氯化鎂、碳酸鎂、氯化鈣、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、甘油磷酸鈣、檸檬酸鐵鈉、檸檬酸鐵銨、檸檬酸鐵、硫酸鎂、硫酸銅、碘化鈉、山梨酸鉀、鋅、鎂、銅、碘和鈷等)。
本發(fā)明組合物的制備采用混合前述成分的方法。對制備方法沒有特別限制，如需要可將所有成分一步混合，或當同時使用油性和水性成分時，首先將油性成分溶解在適當?shù)挠托悦浇樯希缓笤谌榛瘎椭掠盟猿煞值乃芤喝榛?。此乳化方法可采用常?guī)方法使用普通乳化分散設(shè)備進行，如在直接通道(pass-through)系統(tǒng)或循環(huán)系統(tǒng)中采用均質(zhì)混合機或高壓勻漿器等。各成分通常在室溫下混合或乳化，但也可使用加熱方法。然后將所得的本發(fā)明組份包裝在一個適當?shù)娜萜髦?，并采用常?guī)方法滅菌如巴氏殺菌和無菌過濾等，從而生產(chǎn)出產(chǎn)品。
本發(fā)明的組合物還能加工成能溶解或分散在水中的發(fā)泡產(chǎn)品，如片劑、顆粒、粉末或膠囊等。這種發(fā)泡產(chǎn)品的制備以碳酸氫鈉和/或碳酸鈉作為發(fā)泡劑并使用中和劑?？赡艿闹泻蛣┌ɡ鐧幟仕?、酒石酸、富馬酸、抗壞血酸、乳酸和蘋果酸等。發(fā)泡劑和中和劑在總成分中的比例優(yōu)選選自發(fā)泡劑重量為8-60％和中和劑重量為10-70％。這些發(fā)泡產(chǎn)品的制備能根據(jù)常規(guī)方法如直接粉末壓縮或干燥或潮濕顆粒壓縮，可任選地加入合適量的碳酸鉀。
對消化的或施用的本發(fā)明組合物劑量沒有特別限制，劑量明智的確定是依據(jù)目的用途或使用者年齡、性別、體重或疾病的嚴重性以及其他因素。當本發(fā)明組合物為固體形狀時，一般一次每劑量約1到約30g的活性成分被攝取，優(yōu)選地經(jīng)過30-200ml水中溶解。當本發(fā)明的組合物為飲料或其他液體形式時，每次服用約30到約200ml。本發(fā)明組合物每天攝取或施用量優(yōu)選的為這樣，其中包含約0.5到約70g或優(yōu)選的約1到約30g或更優(yōu)選的約3到約20g的活性成分被攝取或被施用。攝取或施用量通過一天多次吸取前述的固體或飲料形式能夠獲得。發(fā)明效果在從口施用或攝取后，本發(fā)明的組合物能產(chǎn)生免疫強化或IFN-γ產(chǎn)生促進作用，增強消化道的生物防衛(wèi)機構(gòu)(免疫功能)，因而有效預(yù)防和治療了消化道感染等。
附圖2表示測試例3中由給予了本發(fā)明組合物的實驗大鼠淋巴集結(jié)淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ(pg/ml)的結(jié)果。
表1

實施例7將下列成分(總5g)混合并直接壓縮成片劑，或?qū)⒊煞忠苑勰┓Q重、混合和分開，或?qū)⒊煞忠灶w粒稱重、混合、顆?；?、干燥和分開，以將本發(fā)明的組合物制成制劑形式。
LS55P 34％(相當于LS 18.7％)L-抗壞血酸21％L-酒石酸 20％甜味劑適量碳酸氫鈉 21％氯化鈉適量碳酸鉀0.5％香料、色素微量總100％上述“LS55P”是含有55％LS的粉末。實施例8-10本發(fā)明組合物的片劑、粉末或顆粒狀制劑含有下列成分，如上述
(相當于LS 22％)L-酒石酸 29％甜味劑 適量碳酸氫鈉 24％檸檬酸鐵銨 3.6％氰鈷胺素 微量碳酸鉀 0.5％香料、色素 微量總 100％(總4g)
表2

實施例19-25將下列表3中所顯示的各成分(mg)混合并直接壓縮以提供可咀嚼的片劑。
表3

上述“LS75P”是含有75％LS的粉末。
表4

丙二醇脂肪酸酯用作乳化劑，紅花油用作表面活性劑。
表中氣體體積值表示二氧化碳含量，用1代表溶解的二氧化碳體積等于溶液體積，值越高則二氧化碳含量越高。
表5

測試實施例1如下操作，本實驗采用安慰劑飲料作空白對照，依據(jù)雙盲對比方法，測試了腸內(nèi)菌群的作用和以飲料形式攝取本發(fā)明組合物的免疫功能。
1.被試者28名成人男性2.測試設(shè)計采用安慰劑飲料作空白對照，雙盲對比測試3.組構(gòu)成發(fā)明組攝取本發(fā)明飲料組(n＝14)對照組攝取安慰劑飲料組(n＝14)4.測試物質(zhì)本發(fā)明飲料溶液制備是將5g的低聚乳果糖(LS)溶解在50ml水(1)中。
安慰劑飲料用蔗糖代替本發(fā)明飲料中的LS以相同方式制備。
5.劑量每天一次(共50ml)，臨睡前服用，連續(xù)服用6周。
6.測定腸內(nèi)菌群和糞便中IgA濃度。
7.糞便采集方法攝取測試物質(zhì)前和攝取6周后采集新鮮糞便。采集當日，將覺醒后排泄的糞便采集到可密封的聚乙烯袋中，并將口袋極其小心地密封使得口袋內(nèi)無空氣保留，最后存放在聚丙烯糞便收集器內(nèi)的冰上。將采集的糞便稱重并混合均勻，測定腸內(nèi)菌群和IgA量。
8.腸內(nèi)菌群的測定腸內(nèi)菌群的研究依據(jù)光岡等的方法進行(光岡知足、腸內(nèi)常在菌叢、臨床検查、23(4)320-334(1979))，作為制備培養(yǎng)基使用3種非選擇性的培養(yǎng)基(BL瓊脂、EG瓊脂和胰胨(tryprycase)大豆血瓊脂)和11種選擇性的培養(yǎng)基(BS瓊脂、NBGT瓊脂、ES瓊脂、修飾VS瓊脂、新霉素納格勒氏瓊脂、修飾LBS瓊脂、DHL瓊脂、TATAC瓊脂、PEES瓊脂、土豆葡萄糖瓊脂和GE瓊脂)。這些培養(yǎng)基的組成記載在“腸內(nèi)常在細菌叢、光岡知足、臨床検查、23(4)320-334(1979)”。
首先將1.0g左右的新鮮糞便精確稱重并懸浮在9ml的厭氧稀釋劑中(制備方法如前述參考中所描述)，然后在二氧化碳氣體下用稀釋劑連續(xù)10倍稀釋制備101-108的稀釋液。將這樣制得的106、107和108稀釋液涂抹在BL和EG瓊脂培養(yǎng)基上，將105、106和107的稀釋液涂抹在胰胨大豆血瓊脂培養(yǎng)基上，以及將101、103、105和107稀釋液涂抹在其他選擇性的培養(yǎng)基中，每個涂抹量為0.05ml。繼而將BL、EG、BS、NBGT、ES、修飾VS、新霉素納格勒氏和修飾LBS瓊脂在替換二氧化碳氣體后，使用鋼絲絨方法放于厭氧瓶中，37℃厭氧培養(yǎng)48小時。胰胨大豆血瓊脂和DHL瓊脂以相似方式37℃培養(yǎng)24小時，而TATAC、PEES、土豆葡萄糖和GE瓊脂則培養(yǎng)48小時。
培養(yǎng)后，每個培養(yǎng)基上的菌落計數(shù)，并依據(jù)菌落性質(zhì)、革蘭氏染色、孢子產(chǎn)生、需氧生長和顯微鏡下的形態(tài)學觀察來鑒定菌落的水平。結(jié)果相對地表達為每1g糞便中細菌數(shù)的對數(shù)(log10CFU/g濕重糞便)。
9.糞便IgA濃度的測定(1)制備糞便IgA測定樣品將儲存在-80℃的糞便樣品冷干，并將2.0ml 0.1M的碳酸緩沖液(pH9.6)加入到0.2g的干燥糞便中震蕩，然后1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，并將上清液調(diào)至pH7.5用作IgA測定樣品。
(2)糞便IgA測定樣品中IgA濃度的測定IgA濃度依據(jù)Tsuyuki等的方法采用ELISA測定(露木重雄、山崎省二、上村裕、木村昌伸、川島拓司、上田雄幹、マウス膽汁および小腸內(nèi)容物中のIgA抗體および総IgAの酵素抗體法(ELISA)による測定、ビフイズス、29-13(1988))。
IgA抗體按下列方法測定。即所用抗原是未標記的小鼠衍生的抗人IgA(25μg/ml，200μl)，其被注入到孔中4℃過夜。用相同量的緩沖液代替抗原注入的孔作為對照。
次日，從孔中吸出溶液，將1％BSA溶液(0.1M碳酸緩沖液，200μl)作為隔離物加入，并于37℃反應(yīng)60分鐘。接著，將糞便IgA測定樣品(40μl)加到抗原處理的孔和對照孔中，并于37℃反應(yīng)45分鐘。本反應(yīng)后，加入過氧化物酶標記的小鼠衍生的抗人IgA(稀釋1000倍，40μl)，37℃反應(yīng)45分鐘。然后加入Sigma Fast ODP(Sigma Co.，200μl)生色反應(yīng)15分鐘，用3M HCl(50ml)終止反應(yīng)，測定吸光度(490nm)。
樣品中的IgA濃度以如下方式獲得從sIgA樣品中(純化的人分泌型IgA 5mg；Capple Co.)制作工作曲線，再將依據(jù)工作曲線所計算的樣品IgA濃度轉(zhuǎn)換成每1g干糞便的濃度。
10.統(tǒng)計學分析每組的平均值和標準偏差從攝取測試物質(zhì)前和攝取6周后的值中計算得出。由重復(fù)的離散分析進行組間比較，有5％或更少的顯著性水平。測試結(jié)果如在下列表6中顯示。
表6

從表6中所顯示的結(jié)果中可明顯得出下列結(jié)論1.在本發(fā)明飲料攝取組中，攝取本發(fā)明飲料導(dǎo)致了雙歧桿菌數(shù)的增加(9.5±0.7→10.1±0.7log10CFU/g濕糞便，配對的T-檢驗；p＝0.013)。相反，在安慰劑飲料攝取組中沒有變化(9.8±0.6→9.8±0.6log10CFU/g濕糞便)。因此，組別間雙歧桿菌數(shù)的變化存在顯著的差異。
2.在本發(fā)明飲料攝取組中，攝取本發(fā)明飲料導(dǎo)致了雙歧桿菌占有率的提高(19.6±15.2→32.1±15.2％，配對的T-檢驗；p＝0.001)。相反，在安慰劑飲料攝取組中有降低的趨勢(23.5±12.6→18.8±9.2％，配對的T-檢驗；p＝0.110)，因此，組別間依據(jù)雙歧桿菌占有率的變化也存在顯著的差異。
3.在本發(fā)明飲料攝取組中，糞便IgA濃度顯著升高(3.9±3.2→6.9±5.4mg/g干重，配對的T-檢驗；p＝0.014)。相反，在安慰劑飲料攝取組中沒有變化(5.6±7.0→4.4±3.1mg/g干重)，因此，組別間糞便IgA濃度的變化也存在顯著的差異。
這表明糞便IgA濃度升高是攝取本發(fā)明測試飲料的結(jié)果。因此本發(fā)明飲料顯然促進了消化道中IgA的產(chǎn)生。
本發(fā)明還證實盲腸IgA濃度在以相似方式攝取了LS的豚鼠中也顯著地升高了。測試實施例2本實驗如下操作，測試了當本發(fā)明組合物(活性成分LS)被健康個體攝取后其對免疫指示物的作用。1.被試者被試者是20只健康成人，在前個月內(nèi)未服用任何抗生素。2.測試物質(zhì)和攝取條件被試者連續(xù)4周一天兩次(上午1000和下午300)攝取本發(fā)明飲料(5gLS溶解在50ml水中的溶液)。3.測試方法被試者飲用測試物質(zhì)，并在攝取第一天(第0周)和攝取后4周(第4周)采血。被試者在采血和收集糞便前一天下午9點后禁食。在測試期間，被試者要求避免過量飲食和攝取發(fā)酵食品。他們還要求在測試期間禁止服藥。4.評價項目和方法(1)血清轉(zhuǎn)鐵蛋白比濁法分析(2)粒細胞部分的吞噬作用將20μl的熒光珠(2μm熒光標記珠，Polyscience#18604，Lot No.425844)加入到1ml的葡萄糖培養(yǎng)基中(下列溶液A、下列溶液B和無菌水的混合物，體積比為1∶1∶8)，并采用11000rpm離心30分鐘洗滌。
葡萄糖培養(yǎng)基組成溶液A1.01M NaCl0.31M CH3COONa0.04M KCl0.04M CaCl20.02M MgCl2溶液B0.07M葡萄糖所得沉淀懸浮在1ml同樣的葡萄糖培養(yǎng)基中，超聲處理得到統(tǒng)一的珠液體。將100μl的這些熒光珠加入到100μl加入肝素的采自測試被試者的外周血中，37℃振蕩溫育0、5、10和30分鐘。反應(yīng)完成后，將2ml含溶血劑液體加入，完全溶解紅血球，并置于冰上冷卻后進行測定，所述溶血劑的液體由溶解在相等量緩沖液(Facs裂解緩沖液，Becton Dickinson Co.，Cat.No.349202)中的溶血劑組成。樣品采用流式細胞儀(Coulter Epics XL-MCL System II)測定。將門(gate)對至粒細胞部分并安放檢測熒光發(fā)射吞噬細胞作為最高峰，并分析此吞噬率。
(3)嗜酸性粒細胞顯微鏡檢5.統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差，隨機分組設(shè)計后，它們用Dunnett多重比較測試并評價顯著性。顯著性水平為5％或更小。6.結(jié)果(1)血清轉(zhuǎn)鐵蛋白所獲得的結(jié)果表示在表7中。
表7

平均值±標準偏差，n＝20(第0周)，n＝17(第4周)※P＜0.05，相對于第0周表7結(jié)果顯示血清轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度與第0周比較，攝取4周后明顯更高，其顯著性水平小于5％。(2)粒細胞部分的吞噬作用結(jié)果如


圖1顯示(縱軸＝粒細胞部分的吞噬率(％)，橫軸＝測試期(周))，這表明平均值±標準偏差(30分鐘反應(yīng)值)對于粒細胞部分的吞噬率第0周為50.8±10.8％以及第4周為63.6±14.1％，從第0周到第4周有顯著升高，其顯著性小于1％。(3)血液嗜酸性粒細胞結(jié)果在表8中顯示。
同時進行的一般性血液測試(白細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞)結(jié)果也在表8中顯示出來。
表8

平均值±標準偏差，n＝20(第0周)，n＝17(第4周)※P＜0.05，相對于第0周本表中的結(jié)果顯示血液嗜酸性粒細胞第4周明顯低于第0周，其顯著性小于5％。7.討論上述結(jié)果顯示攝取本發(fā)明組合物導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和粒細胞吞噬作用的增加，這些對預(yù)防感染至關(guān)重要，因此顯示了本發(fā)明組合物起到了增強了宿主對感染的預(yù)防功能。它們還暗示既然攝取本發(fā)明組合物導(dǎo)致血液嗜酸性粒細胞降低，因而本發(fā)明組合物具有抑制過敏反應(yīng)的潛力。測試實施例3本實驗使用可遺傳的糖尿病模型動物如下進行，以測試服用本發(fā)明組合物對腸道免疫的作用。1.測試動物使用4周大的LETO大鼠和OLETF大鼠(各10只)。OLETF胚胎于1994年8月24日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號ATCC No.72016。LETO大鼠可購置并保存在大塚制藥廠德島實驗動物管理室。2.動物飼養(yǎng)條件大鼠交付后，檢疫隔離一周。在此期間給它們喂食MF固體飼料(Oriental Yeast Co.)和自來水，可隨意食用。它們關(guān)在不銹鋼籠子里，一個籠子養(yǎng)一只大鼠，用明/暗循環(huán)，從700到1900有光線。
在測試期間，低纖維(3％)、高脂肪(5％玉米油+10％牛脂肪)飼料的制備方法依據(jù)AIN76組成(美國營養(yǎng)研究所(1977)美國營養(yǎng)研究所特別委員會對營養(yǎng)研究標準的報告，J.Nutri.，1071340-1348)作為對照飼料，并用LS代替對照飼料的蔗糖/玉米淀粉混合物部分以給予LS含量為5％的飼料作為本發(fā)明的飼料(飼料含有LS)。飼料組成如下列表9所顯示。
表9

3.測試組別測試組(動物類型、飼料和動物數(shù))如下組別 動物 飼料 動物數(shù)1 LETO大鼠 對照飼料 102 LETO大鼠 本發(fā)明飼料 103 OLETF大鼠對照飼料104 OLETF大鼠本發(fā)明飼料 104.測試進度動物檢疫隔離結(jié)束后，用對照飼料喂養(yǎng)2周。在隔離期結(jié)束時，LETO和OLETF大鼠分成前述組別，應(yīng)使所有組都有相同的平均體重。組別分配后，引入測試飼料(在7周齡時)，并自此將大鼠用測試飼料喂養(yǎng)22周。5.解剖22周完成后(29周齡)，在乙醚麻醉下切開大鼠腹部，從腹部下腔靜脈取血，因此大鼠由放血被處死。下腔靜脈血以3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，血清分離并在-80℃保存。處死后，每組中三只大鼠的小腸用于制備淋巴細胞。6.制備淋巴細胞小腸淋巴集結(jié)淋巴細胞采用桿菌衍生的蛋白酶酶法制備(Boehringer-Mannheim Corp.＂Dispase II＂)。淋巴集結(jié)細胞的分離依據(jù)Fragaski等方法(Fragaski等，Journal of Immunological Methods 48，33-44(1989))。處死后，從十二指腸的上部到回腸的末端部的區(qū)域消毒取出。在無菌鹽水仔細洗滌后，用注射器輸送無菌鹽水穿過腸子，洗去內(nèi)容物。淋巴集結(jié)被切掉放到冰上的無菌紗布中。切離的淋巴集結(jié)放置到不完全的RPMI1640培養(yǎng)基上(含有10μg/ml慶大霉素的RPMI1640)。所有獲得的淋巴集結(jié)37℃酶法處理40分鐘，同時在含有1.5mg/ml中性蛋白酶的液體(酶液體)培養(yǎng)基(Joklik-修飾的MEM)中用攪拌子攪拌。收集開始分開的細胞，再加入相同的酶液體。本法重復(fù)3-4次。完全分離的細胞4℃以下350g離心10分鐘，用PBS洗滌并懸浮在指定的培養(yǎng)基中，在紅血球計數(shù)器上測定細胞數(shù)。
將每組三只大鼠的淋巴集結(jié)集中，并制得淋巴細胞。7.培養(yǎng)淋巴細胞淋巴細胞被制備成在RPMI1640(含有2mM L-谷氨酰胺、50μM巰基乙醇、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10％FCS)中的細胞計數(shù)達到1×106個/ml。1ml/孔的淋巴細胞懸浮液在5.0μg/ml ConA(伴刀豆球蛋白A衍生自Canavalia ensiformis，Sigma Co.)作細胞分裂促進劑的刺激下培養(yǎng)，在24孔板中用作細胞培養(yǎng)(FALCON3047)。
抗體生產(chǎn)測試由在5％CO2中37℃培養(yǎng)7天進行，細胞因子測試則在同樣條件下培養(yǎng)3天。在脾淋巴細胞情況下每個樣品一個孔，而在淋巴集結(jié)淋巴細胞情況下，每個樣品三個孔。
培養(yǎng)完成后，板在1600轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清液。收集的上清液儲存冰凍在-20℃直到進行各種測定。8.細胞因子測定淋巴細胞培養(yǎng)上清液中的IFN-γ由ELISA法采用商品化測定試劑盒測定。9.統(tǒng)計學處理結(jié)果顯示為平均值±標準偏差。對細胞因子濃度，組別對比由一元配置離散分析進行，接著Fisher保護的LSD多重比較。由于每組樣品集中，在淋巴集結(jié)細胞的情況下不進行統(tǒng)計學處理。顯著性水平小于5％。10.結(jié)果從培養(yǎng)淋巴集結(jié)中產(chǎn)生IFN-γ的結(jié)果顯示在圖2中。
從這些結(jié)果中，與對照喂養(yǎng)組(組1和組3)比較，攝取帶有本發(fā)明組合物飼料的組(組2和組4)中的LETO和OLETF大鼠顯然表現(xiàn)出了更高的IFN-γ濃度。
權(quán)利要求
1.一種免疫強化組合物，包含低聚乳果糖和載體。
2.一種促進產(chǎn)生干擾素-γ的組合物，包含低聚乳果糖和載體。
3.權(quán)利要求1或2的組合物，其中每100g所述組合物中含有0.5-70g低聚乳果糖。
4.權(quán)利要求1或2的組合物，其中所述組合物以食品形式存在。
5.權(quán)利要求1或2的組合物，其中每天攝取1-30g低聚乳果糖。
6.一種用于預(yù)防和治療消化道感染的藥劑，包含低聚乳果糖和載體。
7.低聚乳果糖在制備免疫強化組合物中的應(yīng)用。
8.低聚乳果糖在制備組合物中的應(yīng)用，其中所述組合物促進產(chǎn)生干擾素-γ。
9.低聚乳果糖在制備藥物組合物中的應(yīng)用，其中所述藥物組合物用于預(yù)防或治療消化道感染。
10.患者免疫強化的方法，包括使患者服用或攝取有效量的低聚乳果糖。
11.權(quán)利要求10的方法，其中有效量的低聚乳果糖是1-30g/天。
12.促進患者產(chǎn)生干擾素-γ的方法，包括使患者服用或攝取有效量的低聚乳果糖。
13.權(quán)利要求12的方法，其中有效量的低聚乳果糖是1-30g/天。
14.在需要的患者中預(yù)防消化道感染的方法，包括使患者服用或攝取有效量的低聚乳果糖。
15.權(quán)利要求14的方法，其中有效量的低聚乳果糖是1-30g/天。
16.在需要的患者中治療消化道感染的方法，包括使患者服用或攝取有效量的低聚乳果糖。
17.權(quán)利要求16的方法，其中有效量的低聚乳果糖是1-30g/天。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種免疫強化組合物和促進產(chǎn)生干擾素－γ的組合物,兩者皆包含低聚乳果糖作為活性成分。尤其本發(fā)明以食品形式提供了該組合物?？诜驍z取所述組合物增強了消化道中的生物防御機構(gòu)(免疫學功能),從而對消化道感染和類似疾病達到顯著的治療和預(yù)防作用。
文檔編號A23L2/52GK1371385SQ00812124
公開日2002年9月25日 申請日期2000年8月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月27日
發(fā)明者久米村惠, 土居達也, 齋藤高雄, 野田恒行, 岡松洋 申請人:大塚制藥株式會社