專利名稱：在無rna酶和有機溶劑的條件下應(yīng)用切向流過濾來純化質(zhì)粒dna的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種純化質(zhì)粒DNA的方法。更明確的說，本發(fā)明提供一種簡單的、可放大的(scalable)方法，其利用了切向流過濾，從而比傳統(tǒng)的基于堿裂解的方法獲得更多的高純度質(zhì)粒。
相關(guān)領(lǐng)域的描述從細胞培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒DNA是許多研究和藥學(xué)應(yīng)用的必要先決條件。一般而言，質(zhì)粒純化方法分為兩個階段，初步細胞破碎/質(zhì)粒分離步驟和隨后的一個或多個連續(xù)的純化步驟。初始的分離步驟的最常用方法是兩種方法的改進法一種方法是采用煮沸使質(zhì)粒釋放(Holmes和Quigley，Anal.Biochem.，114193-197(1981))，第二種方法是采用堿性pH和清潔劑引起細菌膜的溶解(Birnboim和Doly，Nucleic Acids Res.，71513-1523(1979))。這兩種方法都使質(zhì)粒DNA從其細胞溶質(zhì)的位置釋放。
除了常用氯化銫梯度超離心(Clewell和Helinski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，621150-1152(1969))外，下游純化步驟常涉及從雜質(zhì)中選擇性沉淀質(zhì)粒(Lis和Schleif，Nucleic Acids Res.，2383-389(1975)；Ishaq等.，Biotechniaues，919-24(1990)；Kondo等.，Anal.Biochem.，19830-35(1991)；Chakrabarti等.，Biotech.APPl.Biochem.，16211-215(1992))，和/或采用柱層析(Horn等.，Human Gene Ther.，6565-573(1995)；美國專利5,707,812；Chandra等.，Anal.Biochem.，203169-172(1992)；Marquet等，BioPharm26-37(1995)；Johnson和Ilan，Anal.Biochem.，13220-25(1983)；Vincent和Goldstein，Anal.Biochem.，110123-127(1981))。柱層析方案基于反相(Edwardson等.，Anal.Biochem.，152215-220(1986)；Johnson等.，Biotechniaues，464-70(1986)；van Helden和Hoal，New Nucleic AcidTechniques，Walker編(Humana PressClifton，NJ，1988)，pp.61-74))，普通相(Marko等.，Anal.Biochem.，121382-387(1982))，離子交換(Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning(WileyNew York，1984)，pp.165-175；Colman等.，Eur.J.Biochem.，91303-310(1978)；Garon和Petersen，Gene Anal.Tech.，45-8(1987)；Kim和Rha，Biotech.Bioeng.，331205-1209(1989)；Ohmiya等.，Anal.Biochem.，189126-130(1990))，大小排阻層析(Van Helden和Hoai，同上；Perbal，同上；Cornelis等.，Plasmid，5221-223(1981)，Micard等.，Anal.Biochem.，148121-126(1985)；Moreau等.，Anal.Biochem.，166188-193(1987)；Raymond等.，Anal.Biochem.，173125-133(1988)；Hansen和Rickett，Anal.Biochem.，179167-170(1989))，和混合式(Flanagan et，Anal.Biochem.，153299-304(1986))方法。
代替這些方法的方法包括在質(zhì)粒純化時在96-孔板模式的堿裂解時采用0.2微米膜代替離心分離(Ruppert等.，Anal.Biochem.，230130-134(1995))，使用雙水相分離(Cole，Biotechnigues，1118-24(1991))，和使用離子交換膜(vanHuynh等.，Anal.Biochem.，21161-65(1993))。通常，這些方法需要其它的純化步驟，涉及基于有機溶劑的提取(例如，苯酚/氯仿)或沉淀(例如異丙醇，乙醇)步驟，以及外源酶的添加(例如RNase，蛋白酶K)以便產(chǎn)生足夠純度的質(zhì)粒。
質(zhì)粒DNA純化的其它技術(shù)還包括基于聚乙二醇的DNA純化方法(Lis和Schleif，同上；美國專利5,707,812，其中將短鏈聚合醇加入裂解物中，使裂解物結(jié)合到用于純化的柱或膜上)；質(zhì)粒DNA的酸-酚純化(Zasloff等.，Nucleic Acids Res.，51139-1153(1978))；和各種用于科研的較小規(guī)模質(zhì)粒DNA純化方法(Sambrook等.，Molecular CloningA Laboratorv Manual，2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory PressNew York，1989)；Ausubel等編CurrentProtocols in Molecular Biology，(John Wiley & SonsNew York，1989)).Ausubel等編Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & SonsNewYork，1989))DNA-RNA分離技術(shù)見Roman和Brown，J.Chromatogr.，592；3-12(1992).
切向流過濾(TFF)，或錯流過濾是一種流體以沖刷方式直接流過膜表面的分離技術(shù)(Gabler，ASM News，50299(1984))。這種沖刷運動有助于使被膜阻擋的物質(zhì)不在濾膜表面形成一層，這個情況就是眾所周知的濃差極化。TFF可用于使被該膜攔截的溶液(回流液)濃縮和/或脫鹽，或收集已流過膜的物質(zhì)(濾過液)。小于孔徑(或標(biāo)稱分子量截留值(NMWC))的物質(zhì)能夠通過膜并且能去熱原質(zhì)、澄清或者與較高分子量或更大的物質(zhì)分離。大于孔徑或NMWC的物質(zhì)被膜阻隔并且被濃縮，沖洗或與低分子量物質(zhì)分離。用于TFF的原理、理論和裝置在Michaels等，“切向流過濾”，分離技術(shù)，藥學(xué)和生物技術(shù)應(yīng)用(W.P..Olson編，Interpharm Press，Inc.，Buffalo Grove，IL，1995)。也可參見美國專利5,256,294和5,490,937，其描述高效切向流過濾(HP-TFF)，它是TFF的改進技術(shù)，和WO 87/04169，其描述了切向流親和超濾技術(shù)，它涉及使待純化的溶液與一種能選擇性結(jié)合該待純化物質(zhì)的親和凝膠混合，然后對該溶液進行TFF，使得除結(jié)合物以外的所有成分都透過濾膜。
使用物理分離技術(shù)例如TFF或其他的錯流過濾技術(shù)純化病毒、核酸、噬菌體和其他生物物質(zhì)的其它方法已有很多出版物提及(Richards和Goldmintz，J.Virol.Methods，4147-153(1982)；Fernandez等.，Acta Biotechnol.，1249-56(1992)；Matsushita等.，Kagaku Koaaku Ronbunshu，20725-728(1994)；Rembhotkar和Khatri，Anal.Biochem.，176373-374(1989)；WO 98/05673，1998年2月12日公開；EP 307,373；Sekhar等.，Hum.Gene Ther.，733-38(1996)).。
隨著質(zhì)粒DNA作為生物藥物在基因治療方面的日益增加的應(yīng)用，對能用于從轉(zhuǎn)化的原核生物中分離出中等量和大量的這種分子的簡單、高效和可放大式純化工藝的需求不斷增加。當(dāng)前可用于大量產(chǎn)生科研材料或供應(yīng)臨床實驗的質(zhì)粒純化方法的使用受到多種原因的限制。這些純化方法涉及使用大量的可燃性有機溶劑(例如乙醇和異丙醇)，有毒化學(xué)試劑(例如溴乙錠、酚、和氯仿)。超速離心和“旋轉(zhuǎn)柱(spin-column)”適合于少量科研物質(zhì)的制備，不適合大量生產(chǎn)生物制藥所需的材料。
另外，許多當(dāng)前的質(zhì)粒純化方法涉及RNA酶，特別是牛源RNA酶的加入?；趯ε：＞d狀腦病(BSE)的考慮，來源于牛的物質(zhì)在制藥方面日益不受歡迎(Hill等.，Nature，389448-450(1997))?？傊Ｍ苊庠谫|(zhì)粒制劑中加酶，因為隨后這些分子必須通過純化除去。
涉及凝膠過濾層析的純化，由于操作中固有的低上樣能力而受阻，一份報告報道，上樣量限制在柱體積的近2％(McClung和Gonzales，Anal.Biochem.，177378-382(1989)).。
發(fā)明的概述本發(fā)明提供一種從原核細胞中純化質(zhì)粒DNA的方法，其包括下述步驟(a)消化細胞；(b)培養(yǎng)細胞大約4到24個小時以使其裂解并溶解，但不進行RNA的酶促消化；(c)除去來自細胞的裂解雜質(zhì)，以提供一種質(zhì)粒DNA溶液；(d)采用切向流過濾裝置過濾這種溶液，得到含有該質(zhì)粒DNA的回流液；(e)收集回流液。
這種細胞優(yōu)選是細菌細胞。步驟(c)優(yōu)選通過離心使細胞裂解物中的質(zhì)粒DNA與裂解物雜質(zhì)分離，從而提供一種含有質(zhì)粒DNA的上清溶液。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了含有按照上述方法制備的質(zhì)粒DNA的組合物。
本文提供了一種簡單、可放大、基于過濾的純化質(zhì)粒DNA的方法，它可以非常高的產(chǎn)率產(chǎn)生高純度質(zhì)粒。這種方法通過將溶解步驟從不足30分鐘延長到約4-24小時，改進了經(jīng)典的基于堿性裂解質(zhì)粒提取法。提取后新增TFF步驟以純化殘余的雜質(zhì)。本發(fā)明的方法不涉及任何有機溶劑、RNA酶、蛋白酶K的應(yīng)用、高速離心或柱層析步驟。有機溶劑的使用可引起安全和法令方面的關(guān)注，因為可能在最終產(chǎn)物中留下痕量的有機溶劑，而且這些溶劑是有毒的和可燃的，在大規(guī)模純化中大量使用時將引起嚴(yán)重的危險和排放/環(huán)境問題。該方法通常每升細菌培養(yǎng)物產(chǎn)生15到20mg的質(zhì)粒DNA并在改進的堿裂解法步驟后除去殘留的99％以上的RNA和95％以上的蛋白。采用這種方法分離的質(zhì)粒與采用經(jīng)典氯化銫梯度法分離的質(zhì)粒相比有相似的轉(zhuǎn)染能力。
由于本發(fā)明的質(zhì)粒DNA已純化到很高的純度，它能夠有效的用于基因治療和其他基因傳遞技術(shù)例如涉及脂類載體的技術(shù)，可獲得重復(fù)性高的高效轉(zhuǎn)染。本方法正如所需求能夠比較容易按比例擴大投產(chǎn)。
附圖簡述


圖1A和
圖1B是經(jīng)大小排阻層析評估質(zhì)粒DNA從RNA中的純化。
圖1A是在TFF純化之前對醋酸鉀上清液的分析。
圖1B描述對TFF最終匯集物的分析結(jié)果。數(shù)值表示在260納米的總吸光率的百分?jǐn)?shù)。
優(yōu)選實施方案詳述定義這里所述“濾過液”定義為透過了濾膜的樣品部分。
這里所述“回流液”定義為沒有透過濾膜的樣品部分。
“切向流過濾”或“TFF”或“錯流過濾”是指一種過濾方法其中使樣品混合物循環(huán)通過膜的上部，同時應(yīng)用壓力使溶質(zhì)和小分子透過膜。一般，溶液平行于濾膜而流動，使得流體連續(xù)不斷的清潔濾膜的表面，排除不可濾過的溶質(zhì)的阻塞。膜兩邊的壓力差引起流體和可以濾過的溶質(zhì)流過濾膜。這可通過一種連續(xù)流動過程實現(xiàn)，因為溶液在濾膜以上反復(fù)流過，而同時，能透過該濾膜的液體被持續(xù)抽離至另一個回路中。
這里所述“裂解物雜質(zhì)”定義為含有所需質(zhì)粒DNA的混合物中所有不必要的組分，包括染色體DNA、宿主蛋白、細胞碎片包括細胞膜碎片、碳水化合物、小的降解的核苷酸、宿主RNA、脂多糖等等。
短語“不進行RNA的酶促消化”意思是不存在諸如RNA酶等能消化RNA(包括細胞RNA或宿主RNA)的酶。
本文中“分子量截留值”是指被膜截留90％的球狀溶質(zhì)的分子量。參見Filtron目錄，1995/96，p.5。能透過膜或被膜截留的顆粒的實際分子量取決于給定分子的大小、構(gòu)象和電荷，膜孔或基質(zhì)的性質(zhì)，以及溶液的電導(dǎo)率和pH值。
本文中“純化的”質(zhì)粒是與雜質(zhì)諸如內(nèi)毒素、蛋白和RNA分離的，優(yōu)選至少由大約95％的質(zhì)粒和大約5％的RNA組成，更優(yōu)選至少由98％質(zhì)粒和大約2％RNA組成的質(zhì)粒，如大小排阻層析在260納米處測量的那樣。優(yōu)選在這類純化的質(zhì)粒制劑中內(nèi)毒素水平低于300,000EU/ml，更優(yōu)選低于30,000EU/ml。
本發(fā)明的實施方式已發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA能利用TFF在無RNA酶的情況下從含有該質(zhì)粒DNA的原核細胞以大產(chǎn)率高度純化。優(yōu)選本文中質(zhì)粒DNA的大小范圍為大約2Kb到50Kb，更優(yōu)選大約2Kb到15Kb，TFF使用的選擇性截留分子量大于約500kD，優(yōu)選約500kD到1000kD。
本文所述質(zhì)粒DNA從原核細胞培養(yǎng)物優(yōu)選細菌發(fā)酵物，更優(yōu)選大腸桿菌的組分分離、或提取。從原核細胞分離的質(zhì)粒DNA包括自然產(chǎn)生的質(zhì)粒也包括重組質(zhì)粒，這種質(zhì)粒含有目的基因，包括例如標(biāo)記基因或治療基因。發(fā)酵可以在任何適合所用細胞生長的液體培養(yǎng)基中進行。
本文中要純化的DNA質(zhì)?？梢允蔷哂腥魏翁卣鞯娜魏稳旧w外DNA分子，只要它的大小范圍符合上述規(guī)定。質(zhì)?？梢允歉呖截愋汀⒌涂截愋突蛱右葙|(zhì)粒，并且可以是單鏈或雙鏈DNA、超螺旋質(zhì)粒DNA、或DNA片段。它們可以含有多個遺傳元件包括選擇性基因、多接頭、復(fù)制起點、啟動子、增強子、前導(dǎo)序列、聚腺苷酰化位點、和終止序列。質(zhì)?？珊谢旧鲜侨魏蝸碓吹牟溉閯游锏幕颉?yōu)選治療基因、更優(yōu)選編碼人類目的多肽的基因。這些治療基因包括能夠在合適宿主中表達以補償宿主細胞中的缺陷型基因或抑表達型基因的功能基因或基因片斷，以及表達后抑制宿主細胞基因的功能的那些基因或基因片斷，包括例如反義序列，核酶、轉(zhuǎn)顯性(transdominant)抑制劑和其類似物。
在消化和裂解細胞以提取質(zhì)粒DNA之前，一般首先從發(fā)酵培養(yǎng)基中收獲細胞。從液體培養(yǎng)基中收獲細胞的常規(guī)方法都是合適的，包括離心、過濾和沉降。
本文所述方法的第一步涉及消化細胞。消化可采用常規(guī)程序(例如，Birnboim和Doly的技術(shù)，出處同上)，但是優(yōu)選加入諸如溶菌酶之類的消化酶，混合，然后在低于室溫的溫度下，優(yōu)選在冰上保溫這些混合物。
本文所述方法的第二步涉及細胞的裂解和溶解，這導(dǎo)致RNA的化學(xué)消化。這一步進行約4到24小時，優(yōu)選約6到24小時，更優(yōu)選約10到24小時，還更優(yōu)選約15到24小時，最優(yōu)選約20到24小時。通常，在收獲細胞后，將細胞重懸在緩沖液中，然后用具有裂解和溶解細胞功能的一種或更多的試劑處理指定的時間。這些試劑的例子包括堿(例如稀堿例如氫氧化鈉)和/或清潔劑。優(yōu)選堿和清潔劑一起使用。另一優(yōu)選實施方案中，為了最大限度的去除內(nèi)毒素，清潔劑是例如十二烷基硫酸鈉(SDS)、膽酸、去氧膽酸、或TRITON X-114TM、最優(yōu)選SDS或去氧膽酸。為了獲得質(zhì)粒的最大釋放和雜質(zhì)基因組DNA的清除，優(yōu)選清潔劑是陰離子型，更優(yōu)選SDS，膽酸，或去氧膽酸，最優(yōu)選SDS或去氧膽酸。
細胞裂解/溶解步驟在沒有消化RNA的酶例如RNA酶存在的情況下進行。優(yōu)選此方法也在沒有可能損害細胞壁的酶處理的情況下進行，這種損害可能是因為任何可能的動物病毒的污染。優(yōu)選采用不剪切染色體DNA的方法，從而易于將其清除而且避免污染最終的質(zhì)粒DNA產(chǎn)物。細菌細胞的優(yōu)選裂解方法涉及Birnboim和Doly，出處同上，描述的堿裂解法或本文實施例1中所報道的其改進法。
在裂解和溶解后，處理細胞以去除裂解物雜質(zhì)包括細胞碎片如蛋白、細胞壁、或膜，染色體DNA、和宿主蛋白。此去除步驟一般包括沉淀、離心、過濾、和/或沉降，這些步驟取決于采用的細胞類型和裂解方法。如果采用堿裂解，優(yōu)選將所得裂解物酸化以沉淀染色體DNA和宿主蛋白。然后，細胞碎片和其他雜質(zhì)優(yōu)選采用標(biāo)準(zhǔn)方法例如離心、過濾或沉降，優(yōu)選離心而清除。然后任選采用硅藻土過濾上清溶液使其澄清并且減少上清中宿主RNA的濃度。在適當(dāng)?shù)臈l件下，采用沉淀劑從澄清的濾液中沉淀質(zhì)粒DNA，收集并且重懸于緩沖液。隨后，優(yōu)選在適當(dāng)?shù)臈l件下用一種沉淀劑從緩沖液中沉淀宿主RNA、蛋白和脂多糖而非質(zhì)粒DNA。最后，優(yōu)選收集濾液，然后在適當(dāng)?shù)臈l件下，使用沉淀劑重新沉淀質(zhì)粒DNA，并且將沉淀的質(zhì)粒DNA重新懸浮以備后續(xù)TFF過濾步驟中使用。
本方法的下一個步驟涉及通過一個TFF裝置過濾該溶液。在過濾之前，采用短鏈聚合醇處理質(zhì)粒DNA，使其不會結(jié)合TFF膜。TFF方法示意圖如WO 98/05673的
圖1所示。實施HP-TFF所用采樣裝置如美國專利5,256,294的圖2、3和4所示。過濾膜根據(jù)例如要純化的質(zhì)粒DNA的大小和構(gòu)象來選擇，其截留分子量大于約500kD，優(yōu)選大約500到1000kD。一般而言，用于本文TFF的過濾膜正如Gabler，出處同上，所述。它們一般是微孔(MF)或超濾型(UF)的合成膜；反向滲透(RO)型的膜一般不適用于這種用途，因為它們的孔徑范圍太小。
一般MF型的孔徑為0.1到10微米，它能夠阻擋所有大小大于此級別的粒子。超濾膜(UF)有更小的孔，以被截留的球狀蛋白來表征。它們可用于從1,000到1,000,000標(biāo)稱分子量(道爾頓)的范圍，這對應(yīng)于約0.001到0.05微米。UF膜一般是不對稱的，在上游表面有一薄膜或薄層是其分離能力的真正所在。這種UF膜通常最適合本發(fā)明的應(yīng)用。
本發(fā)明的方法很適合于商業(yè)或半商業(yè)規(guī)模的應(yīng)用。它能夠半連續(xù)運轉(zhuǎn)，也就是含有所需質(zhì)粒DNA的溶液連續(xù)流動通過一個切向流過濾器，直到大批量溶液全部被過濾，接著從所需質(zhì)粒DNA中連續(xù)流動分離雜質(zhì)。洗滌步驟也能在過濾步驟之間插入。然后能夠處理新的批次的溶液。按照這種方法，能夠連續(xù)循環(huán)進行操作，從而在相對較短時間內(nèi)大量產(chǎn)生具有可接受的純度的所需產(chǎn)物。
在這樣的條件下，質(zhì)粒DNA被保留在回流液中，而雜質(zhì)包括許多蛋白、細胞膜碎片，碳水化合物、小的降解的核苷酸等等，透過膜進入濾出液。商業(yè)過濾裝置包括Pall-Filtron(Northborough，MA)，Millipore(Bedford，MA)，和Amicon(Danvers，MA)。任何可用于進行TFF的過濾裝置都在此合適，包括例如平板裝置、螺旋卷筒、中空纖維、管式或單片裝置、開放通道裝置等等。
過濾膜的表面積取決于需要純化的質(zhì)粒DNA的量。膜應(yīng)是低結(jié)合力材質(zhì)，以便將吸附損失降低到最少，優(yōu)選耐久的，可清洗的并且與所用緩沖液在化學(xué)上相容的膜。商業(yè)上有許多合適的過濾膜，例如醋酸纖維素類、聚砜類、聚醚砜類和聚偏二氟乙烯類。優(yōu)選膜的材料是聚砜或聚醚砜。
樣品緩沖液通過膜表面時采用切向流循環(huán)進行過濾。在TFF期間，在膜的兩邊加上壓力差，其使小的分子通過膜而回流液重新循環(huán)。通常調(diào)節(jié)流速以保持壓差恒定。一般而言，壓力越大流速越大則過濾越快，但是高流速易于導(dǎo)致核酸在通過膜時發(fā)生剪切或損失。另外，各種TFF裝置也有一定的操作壓力限制。因此，壓力應(yīng)按照制造商的說明書進行調(diào)節(jié)。平板式裝置，優(yōu)選壓力是5到30psi，最優(yōu)選10到15psi。應(yīng)選擇循環(huán)泵以確保對核酸的最少剪切。通常，循環(huán)泵是在進料管路上的蠕動泵或隔膜泵，壓力通過調(diào)節(jié)回流閥來控制。
過濾通常按照滲濾模式進行。可選地，樣品溶液先不加入緩沖液而進行過濾直至濃縮到所需體積。一旦濃縮完成后，就要加入滲濾緩沖液，將過濾持續(xù)到洗去小分子雜質(zhì)的回流液，并清除不必要的溶劑和鹽類。滲濾可以連續(xù)也可以不連續(xù)。優(yōu)選連續(xù)滲濾而且進行到5到500倍體積的等價物被交換。通常根據(jù)所需純度，核酸結(jié)合的雜質(zhì)越多滲濾的次數(shù)越多。
為了進一步提高TFF之后純化質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率，任選將回流液再循環(huán)通過過濾器，此時滲透閥關(guān)閉幾分鐘以清除殘留的質(zhì)粒DNA?；厥栈亓饕翰⑶以偌尤刖彌_液沖洗膜過濾器。再收集回流液并與含有純化的質(zhì)粒DNA的初始回流液混合。然后將進料液濃縮并對緩沖液例如TRISTM透析獲得純化的質(zhì)粒DNA。
采用本文TFF方法純化的質(zhì)粒DNA可以直接使用或根據(jù)初始樣品中雜質(zhì)的水平和類型和所需用途進一步純化。這樣純化的質(zhì)粒DNA可以用于許多應(yīng)用，例如分子生物學(xué)應(yīng)用諸如克隆或基因表達、或用PCR、RT-PEC、樹形體的形成(dendromer formation)等等進行的診斷應(yīng)用。在治療性應(yīng)用方面，例如，可用于基因治療或作為疫苗使用或用于基因免疫，優(yōu)選進一步純化TFF步驟得到的質(zhì)粒DNA。離子交換層析可以用于進一步純化質(zhì)粒DNA。
將質(zhì)粒DNA樣品上柱，所用上柱緩沖液的鹽濃度低于質(zhì)粒DNA從層析柱洗脫的濃度。通常，鹽濃度為10到50mS，取決于采用的樹脂。弱的陰離子交換樹脂使用較低電導(dǎo)性的溶液，而強的陰離子交換樹脂使用較高電導(dǎo)性溶液。采用幾個柱體積的緩沖液洗柱以清除與樹脂結(jié)合較弱的物質(zhì)。按照常規(guī)方法采用緩慢連續(xù)的鹽梯度，例如最高至1.5M NaCl的Tris-HCl緩沖液從層析柱上洗脫級分。然后從層析柱上收集樣品級分。在中等規(guī)模的制備(例如從約100mg到3g質(zhì)粒DNA)中，預(yù)計出現(xiàn)質(zhì)粒DNA峰時，級分一般為至少50ml到2L，然后增加體積。分別測定每一級分的質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率和純度。另外，對每一級分進行鱟試劑(LAL)分析，以測定每一份級分中殘留的內(nèi)毒素水平。將含有高水平質(zhì)粒DNA和低水平內(nèi)毒素的級分集中。
根據(jù)上面的方案純化的質(zhì)粒DNA應(yīng)與脂類載體結(jié)合以用于基因治療，需要將質(zhì)粒DNA交換進入低電導(dǎo)的緩沖液，優(yōu)選通過滲濾完成。低電導(dǎo)的緩沖液指電導(dǎo)小于約10mS，優(yōu)選小于約1mS的任何緩沖液。
在上述方案的各步驟中，對質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率和純度進行分析測量較有利。這類分析通常在每一步純化步驟之前和之后進行，并對每一來自，例如制備型離子交換層析的含核酸的級分進行。優(yōu)選的分析方法包括用高效液相層析(HPLC)或大小排阻層析(SEC)分析純度，用分光光度法評估產(chǎn)率，用銀染色和SDS-PAGE分析蛋白，用瓊脂凝膠電泳和Southern印跡分析DNA。
借助于下面的實施例將更充分的理解本發(fā)明。但是，這些例子并不限制本發(fā)明的范圍。所有引用的文獻和專利都引入作為參考。
實施例1材料和方法VIII因子細胞糊的產(chǎn)生為了純化VIII因子質(zhì)粒，將已用VIII因子基因轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(美國專利5,618,788和5,633,150)在10升的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，用放線菌酮處理以獲得最大的質(zhì)粒DNA產(chǎn)率。
大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和過夜發(fā)酵為了純化質(zhì)粒而不是VIII因子，將轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(DH5a)細胞(Gibco-BRL)按照制造商的說明轉(zhuǎn)化以擴增氨芐青霉素抗性(AmpR)質(zhì)粒。菌落的過夜培養(yǎng)物在補充羧芐青霉素(50mg/mL)的LB培養(yǎng)基中生長。
大腸桿菌的堿裂解根據(jù)Bimboim和Doly，出處同上，方法的改良后對大腸桿菌進行堿裂解，如下所示。每克(濕重)大腸桿菌細胞懸浮在8mL的50mM葡萄糖/25mMTris-HCl/10mM EDTA(GTE)，pH8中。然后加入總量為0.8mL的溶菌酶溶液(GTE中2mg/mL)(Canadian Lysozyme Company，Abbotsford，BritishColumbia)，在混合后，使細胞在冰上培養(yǎng)30分鐘。向混合液中每克細胞加入總量為16mL的溶液，該溶液含有0.2mM NaOH和1％SDS(或如所指明的其他洗滌劑)，并在室溫下慢慢連續(xù)攪拌培養(yǎng)過夜(或指定的時間)。每克細胞加入總量為12mL的5M的醋酸鉀，pH4.8，在混合后，將混合物冰浴。在培養(yǎng)10分鐘后，將混合物以13,000g離心30分鐘。收集上清然后使其通過幾層MIRACLOTHTM(Calbiochem-Novabiochem Corporation，San Diego，CA)材料過濾澄清。
采用TFF純化質(zhì)粒如上所述從大腸桿菌分離的質(zhì)粒DNA在TFF裝置(TFF膜包和膜包夾持器來自Pall Filtron Corporation，Northborough，MA)中純化，處理10到15克(通常在過夜振動培養(yǎng)后觀察的量)的細胞采用0.5平方英尺的聚醚砜膜。膜的標(biāo)稱截留分子量為500或1000kDa。TFF裝置的進料速度設(shè)為0.5升/分鐘/平方英尺膜。試驗表明為了使初始超濾濾出液中的產(chǎn)率損失降低到最小的程度，超濾前，需要使超濾膜在正常操作條件下用澄清的上清液平衡15到20分鐘。所有的試驗都在維持恒定的跨膜壓力(TMP)的情況下進行。經(jīng)數(shù)次試驗測定優(yōu)選的TMP約10到15psi.。在這些條件下濾液流速接近每平方英尺膜每小時1.5升。為了純化質(zhì)粒，將進料溶液濃縮兩倍，然后用8-10倍體積的20mM Tris-HCl，pH7.6進行透析。
氯化銫密度梯度離心采用氯化銫梯度分離質(zhì)粒的操作如Clewell和Helinski，出處同上，和Miller，Meth.Enzvmol.，152145-170(Berger和Kimmel，eds)(Academic PressSan Diego，CA，1987)的描述。
大小排阻分析將100uL樣品注射至已用20mM Tris-HCl，pH7.5平衡的TSK-G5000PWTM柱(7.5×300mm)(Tosohaas，Montgomeryville，PA)進行分析。柱以1ml/min的流速運行。通過260nm處的吸光率監(jiān)測層析柱的流出液。將質(zhì)粒的洗脫體積與經(jīng)氯化銫方法標(biāo)準(zhǔn)分離的進行比較。
293細胞的轉(zhuǎn)染和VIII因子活性的分析將本文的純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入293人胚腎細胞，該細胞原本維持在含有10％熱滅活的胎牛血清的PS19培養(yǎng)基中。用lipofectin試劑(BRL，Gaithersburg，MD)按照制造商的說明書形成脂質(zhì)/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物，每復(fù)合物含1μg質(zhì)粒DNA。然后將該混合物加入35-mm孔(6孔板)中的細胞中，再加入培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染后24小時，收集培養(yǎng)基，采用ELISA分析VIII因子并用COATEST VIIIC/4TM試劑盒(Chromogenix AB，Moelndal，Sweden)按照制造商的說明書分析VIII因子的活性。
測定蛋白用Bradford方法(Bradford，Anal.Biochem.，72248-254(1976))以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品測定蛋白的濃度。
結(jié)果影響質(zhì)粒分離和純化的因素分析了幾種不同類型的陰離子、陽離子和非離子型洗滌劑在溶菌酶消化后產(chǎn)生可溶性質(zhì)粒的能力。陰離子洗滌劑，作為一類，對于質(zhì)粒的釋放是最有效的。另外，用EcoR1(New England Biolabs，Beverly，MA)限制酶消化從陰離子洗滌劑制備的質(zhì)粒制品，未顯示基因DNA雜質(zhì)的存在。最后發(fā)現(xiàn)，陰離子洗滌劑類產(chǎn)生的可溶性質(zhì)粒的內(nèi)毒素含量低得多(表1)。
表1使用不同的洗滌劑溶解VIII因子質(zhì)粒對于所得內(nèi)毒素含量的影響
調(diào)查了在兩種不同的洗滌劑存在時暴露于氫氧化鈉的時間延長的影響。增加培養(yǎng)時間雜質(zhì)RNA的總體大小的量均以時間依賴性方式顯著降低。培養(yǎng)24小時后，在SDS溶解和螯合溶解的產(chǎn)物中幾乎沒有探測到RNA。不限于任何理論，認(rèn)為在暴露于堿性條件的時間延長后，雜質(zhì)RNA可能充分降解，從而允許質(zhì)粒DNA通過TFF從RNA和其他低分子量雜質(zhì)(例如蛋白、內(nèi)毒素)中純化。為了最大量的純化，選擇能夠截留質(zhì)粒的最大的膜孔徑。500,000和1,000,000Da標(biāo)稱截留分子量的膜可以滿足這種需要。采用暴露于氫氧化鈉和SDS長達4和24小時的質(zhì)粒進行初期試驗表明優(yōu)選暴露24小時以便用TFF清除RNA。
純化的VIII因子質(zhì)粒的鑒定與氫氧化鈉/SDS培養(yǎng)4或24小時然后采用UF/DF純化的上述分離的質(zhì)粒，與用標(biāo)準(zhǔn)氯化銫梯度技術(shù)制備的質(zhì)粒，在用瓊脂凝膠上表現(xiàn)相似。采用大小排除層析法評估在質(zhì)粒制品中共純化的RNA量。如
圖1所示，99％以上的雜質(zhì)RNA通過過濾步驟清除。所得TFF匯集液中的蛋白濃度為10到30μg/ml，這些蛋白構(gòu)成了醋酸鉀上清中的總蛋白減少95％以上。在5步分離制備后，VIII因子質(zhì)粒的產(chǎn)率為每克細胞(濕重)2.2±0.8mg質(zhì)粒。內(nèi)毒素含量為2400±1700EU/ml(n＝3)。
TFF方法純化的質(zhì)粒的活性采用TFF方法分離含有VIII因子基因的質(zhì)粒DNA并與采用常規(guī)CsCl方法(Miller，出處同上)分離的相同的質(zhì)粒比較轉(zhuǎn)染293-HEK細胞的能力。如表2所示，采用本文中改良的堿裂解法和TFF方法分離的質(zhì)粒DNA的活性與采用CsCl梯度分離的質(zhì)粒相似。
表2TFF和CsCl-純化的VIII因子質(zhì)粒的表達水平對比
所述方法在多種質(zhì)粒上的應(yīng)用采用六種不同大小的不同質(zhì)粒評估TFF方法的可信度，所述質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌并在搖瓶中振蕩培養(yǎng)過夜。如表3所示，不管回收的質(zhì)粒大小如何，每一種制品得到最小為每克細胞(濕重)2mg的純化質(zhì)粒DNA。
表3用不同質(zhì)粒進行的基于TFF的質(zhì)粒分離
結(jié)論這里描述了一種簡單、可放大用于純化大量轉(zhuǎn)染感受態(tài)的質(zhì)粒的方法，這種方法基于延長裂解/溶解時間(約4至24小時)，然后采用TFF純化。采用這種方法每升過夜培養(yǎng)物產(chǎn)生7到20mg質(zhì)粒，比先前報道(Ishaq等.，出處同上；Kondo等.，出處同上；Chakrabarti等.，出處同上；Chandra等.，出處同上Miller，出處同上)的數(shù)值高幾倍。而且采用這種方法分離的質(zhì)粒具有的細胞轉(zhuǎn)染活性與采用經(jīng)典方法分離的質(zhì)粒的水平相當(dāng)。
采用TFF方法觀測到的內(nèi)毒素比采用其他純化方法(Miller，出處同上)的含量高。但是，與先前的觀察(Cotten等.，Gene Ther.，1239-246(1994)；Weber等.，Biotechniaues，19930-940(1995))相反，這樣的內(nèi)毒素含量不會對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞和表達蛋白的能力產(chǎn)生不利影響。況且，如果必要，這些內(nèi)毒素含量能夠通過進一步的純化例如離子交換層析法基本去除。
這里描述的基于TFF的純化方法可采用標(biāo)準(zhǔn)的TFF放大原理容易地進行放大。最后，通過對幾種不同的分子量的質(zhì)粒的有效使用，這種方法表明了它的廣泛應(yīng)用性。
權(quán)利要求
1.一種從含有質(zhì)粒DNA的原核細胞中純化該質(zhì)粒DNA的方法，其包括下述步驟(a)消化所述細胞；(b)在不對RNA進行酶促消化的前提下，將這些細胞培養(yǎng)約4到24小時，以便實施裂解和溶解；(c)除去細胞裂解物的雜質(zhì)，以獲得一種質(zhì)粒DNA溶液；(d)使所述溶液流經(jīng)切向流過濾裝置而過濾，獲得含有質(zhì)粒DNA的回流液；(e)收集這種回流液。
2.權(quán)利要求1所述方法，其中所述細胞是細菌細胞。
3.權(quán)利要求1所述方法，其中所述細胞是大腸桿菌的細胞。
4.權(quán)利要求1所述方法，其中所述質(zhì)粒DNA的大小為大約2到50kb。
5.權(quán)利要求1所述方法，其中步驟(a)采用溶菌酶進行。
6.權(quán)利要求1所述方法，其中步驟(b)進行約10到24小時。
7.權(quán)利要求1所述方法，其中步驟(b)進行約20到24小時。
8.權(quán)利要求1所述方法，其中所述培養(yǎng)步驟在堿性條件下進行。
9.權(quán)利要求1所述方法，其中所述培養(yǎng)步驟在洗滌劑存在的條件下進行。
10.權(quán)利要求8所述方法，其中所述培養(yǎng)步驟在洗滌劑存在的條件下進行。
11.權(quán)利要求9所述方法，其中所述洗滌劑是離子型的。
12.權(quán)利要求11所述方法，其中所述洗滌劑是陰離子型的。
13.權(quán)利要求12所述方法，其中所述洗滌劑是十二烷基磺酸鈉、膽酸、去氧膽酸。
14.權(quán)利要求1所述方法，其中步驟(c)通過離心使裂解物的雜質(zhì)與質(zhì)粒DNA分離，得到作為上清液的質(zhì)粒DNA溶液。
15.權(quán)利要求1所述方法，其中所述過濾裝置帶有截留分子量大于約500kD的膜。
16.權(quán)利要求1所述方法，其還包括從回流液中回收質(zhì)粒DNA。
17.權(quán)利要求1所述方法，還包括用一種緩沖液對所述回流液進行透析。
18.權(quán)利要求1所述方法，還包括對所述回流液進行離子交換層析。
19.一種組合物，其含有按照權(quán)利要求1的方法制備的質(zhì)粒DNA。
全文摘要
本發(fā)明描述了從含有質(zhì)粒DNA的原核細胞中純化該質(zhì)粒DNA的方法。該方法包括如下步驟:(a)消化所述細胞;(b)將細胞培養(yǎng)約4到24小時以進行裂解并溶解,但不對RNA進行酶促消化;(c)除去來自細胞的裂解物雜質(zhì)以提供一種質(zhì)粒DNA溶液;(d)使該溶液流經(jīng)切向流過濾裝置而過濾,以獲得含有該質(zhì)粒DNA的回流液;(e)回收該回流液。
文檔編號C12N15/09GK1378592SQ00813109
公開日2002年11月6日 申請日期2000年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月23日
發(fā)明者米歇爾·D·巴特勒, 達里恩·L·科恩, 戴維·卡恩, 馬喬里·E·溫克勒 申請人:杰南技術(shù)公司