專利名稱：Dna測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于多核苷酸序列測(cè)定的。
背景技術(shù)：
測(cè)定多核苷酸序列的能力具有巨大的科學(xué)重要性。例如，人類基因組計(jì)劃是一個(gè)雄心勃勃的國(guó)際性努力，它致力于測(cè)定編碼在人類基因組中的30億堿基序列和繪制其圖譜。當(dāng)該計(jì)劃完成后，產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)庫對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究來說將是一個(gè)空前有力的工具。成功完成這項(xiàng)計(jì)劃的主要障礙來自于測(cè)序方法中所使用的技術(shù)。
在DNA大規(guī)模測(cè)序中，通常使用的主要方法是反應(yīng)鏈終止方法。這種方法最初由Sanger和Coulson發(fā)展起來(Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977；745463-5467)，它依賴于使用四種三磷酸核苷的雙脫氧衍生物，這些物質(zhì)在聚合酶反應(yīng)中將摻入新生成的多核苷酸鏈。一旦摻入，雙脫氧衍生物就會(huì)終止聚合酶反應(yīng)，用凝膠電泳將產(chǎn)物分離并加以分析，以揭示特定雙脫氧衍生物在鏈中摻入的位置。
盡管這種方法得到廣泛應(yīng)用，而且能產(chǎn)生可靠的結(jié)果，但還是被認(rèn)為速度慢，勞動(dòng)強(qiáng)度大以及花費(fèi)高。
在EP-A-0471732中提出了一種替代的序列測(cè)定方法，是用光譜學(xué)方法來檢測(cè)核苷酸摻入與目標(biāo)互補(bǔ)的新生多核苷酸鏈的情況。這種方法依賴于固定的模板和引物的復(fù)合體，該復(fù)合體暴露于只含有不同核苷酸中的一種的流體中。然后用光譜學(xué)技術(shù)測(cè)量依賴于時(shí)間的信號(hào)，該信號(hào)是由聚合酶催化的模板拷貝增加引起的。上述的光譜學(xué)技術(shù)是表面等離子體激元共振(surface plasmon resonance，SPR)光譜法和熒光測(cè)量技術(shù)，前者是在損耗波場(chǎng)內(nèi)測(cè)量分析物中的變化。但是，人們也認(rèn)識(shí)到了這種方法的局限性；對(duì)SPR技術(shù)來說，最嚴(yán)重的在于當(dāng)拷貝鏈大小增加時(shí)，由于鏈的移動(dòng)超出了損耗波場(chǎng)，也會(huì)引起信號(hào)絕對(duì)值的增加，從而導(dǎo)致檢測(cè)增量變得更加困難。熒光測(cè)量技術(shù)有一個(gè)缺點(diǎn)，即由摻入延長(zhǎng)中的新生多核苷酸鏈的熒光團(tuán)引起的背景干擾增加。隨著鏈的增長(zhǎng)，背景“噪音”也增加，檢測(cè)每個(gè)核苷酸摻入情況所需的時(shí)間也需要增加。這嚴(yán)重的限制了這種方法在大分子量多核苷酸測(cè)序中的應(yīng)用。
在WO-A-9924797和WO-A-9833939中描述了單片斷多核苷酸測(cè)序方法，兩者都利用熒光檢測(cè)標(biāo)記的單核苷酸分子。這些單核苷酸是在核酸外切酶分子的作用下，從被光阱(optical trap)束縛在液流中的模板多核苷酸上切割下來(Jett等人，J.Biomol.Struc.Dyn，1989；7301-309)。接著，這些切割下來的核苷酸在石英流室內(nèi)往下流，受到激光激活，然后由靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)來檢測(cè)。但是，人們認(rèn)識(shí)到了這種方法的局限性；這種核酸外切酶技術(shù)最嚴(yán)重的缺點(diǎn)是標(biāo)記的核苷酸嚴(yán)重影響了核酸外切酶的處理能力。這種方法的另外一些局限性包括核苷酸會(huì)“粘在”用來固定多核苷酸片斷的生物素小珠上，從而導(dǎo)致核苷酸流變成不同步的；初始酶標(biāo)記過程的低效率和長(zhǎng)度限制；以及這四種不同染料分子之間的交叉激活導(dǎo)致的錯(cuò)誤率急劇增加。
因此就有必要有一種改進(jìn)的方法—最好是在單個(gè)片斷水平上—來測(cè)定多核苷酸的序列，這種方法能極大地增加檢測(cè)多核苷酸的速率以及片斷大小，該方法優(yōu)選由自動(dòng)化的方法來執(zhí)行，從而減少現(xiàn)存方法的復(fù)雜性和成本。
發(fā)明概述本方法基于以下認(rèn)識(shí)目標(biāo)多核苷酸的序列可以通過測(cè)量結(jié)合并且沿著目標(biāo)多核苷酸推移的酶的構(gòu)象變化來測(cè)定。依目標(biāo)多核苷酸上與酶接觸的單個(gè)核苷酸的不同，所產(chǎn)生的構(gòu)象變化的程度也是不同的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，測(cè)定多核苷酸序列的方法包括以下步驟(i) 在足以誘導(dǎo)酶活性的條件下，讓目標(biāo)多核苷酸與能和目標(biāo)多核苷酸相互作用并沿著多核苷酸推移的酶反應(yīng)；和(ii) 當(dāng)酶沿著多核苷酸推移時(shí)，檢測(cè)該酶的構(gòu)象變化。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的酶是聚合酶，該酶在延伸互補(bǔ)鏈的過程中和目標(biāo)相互作用。該酶通常是固定在固體支持物上以使反應(yīng)定位在一個(gè)限定的區(qū)域內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明的第二種實(shí)施方案，酶含有第一結(jié)合可檢測(cè)標(biāo)記，該標(biāo)記的特征能隨酶構(gòu)象的改變而變化。該酶也可以含有第二結(jié)合可檢測(cè)標(biāo)記，該標(biāo)記能與第一標(biāo)記相互作用，其中，相互作用的程度依賴于酶的構(gòu)象變化。通常，第一標(biāo)記是能量受體，第二標(biāo)記是能量供體，通過測(cè)量這兩個(gè)標(biāo)記之間的能量傳輸來檢測(cè)構(gòu)象變化。
根據(jù)本發(fā)明的更進(jìn)一步的實(shí)施方案，利用熒光共振能量傳遞方法(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)來檢測(cè)同目標(biāo)聚合酶相互作用并沿著它推移的酶的構(gòu)象變化，從而測(cè)定多核苷酸的序列。熒光能量共振傳遞可以在兩個(gè)結(jié)合在酶上的FRET供體和受體標(biāo)記之間進(jìn)行?；蛘?，其中的一個(gè)標(biāo)記可以結(jié)合在酶上，而另一個(gè)標(biāo)記則結(jié)合在多核苷酸上。
進(jìn)一步的實(shí)施方案是能和目標(biāo)多核苷酸相互作用并沿著其推移的可檢測(cè)標(biāo)記的酶在測(cè)定多核苷酸的序列中的用途，其中隨著該酶沿多核苷酸的推移，它所帶的標(biāo)記能改變可檢測(cè)的特征。
根據(jù)另一個(gè)方面，固體支持物至少含有一種能和目標(biāo)多核苷酸相互作用并沿著其推移的固定化酶，該酶標(biāo)記有一種或更多可檢測(cè)的標(biāo)記。
根據(jù)另一個(gè)方面，用于測(cè)定多核苷酸序列的系統(tǒng)含有如上所述的固體支持物以及檢測(cè)標(biāo)記的設(shè)備。
本發(fā)明提供了幾個(gè)傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)所沒有的優(yōu)點(diǎn)。一旦聚合酶開始了它的多核苷酸延伸輪回，在從單鏈上脫離之前，它將聚合幾千個(gè)核苷酸。另外，某些特定的聚合酶體系能夠以環(huán)繞模板分子的“滑行夾子”(如聚合酶III)或者部分環(huán)繞模板的分子鉤(如T7硫氧還蛋白復(fù)合體)，來將自己錨定或拴在模板多核苷酸上。
本發(fā)明也可以以每秒幾百個(gè)堿基對(duì)的速度，一次性測(cè)定幾萬或更多的堿基。這是對(duì)DNA單個(gè)片斷測(cè)定的結(jié)果。對(duì)DNA單個(gè)片斷測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)序速度由所使用的酶體系決定，而不是由無方向的，累計(jì)性的反應(yīng)來決定，因此測(cè)定速度也相應(yīng)更快。測(cè)定大片斷DNA的能力同高速度一樣重要。這將會(huì)極大的減少亞克隆量，以及用來組裝兆堿基級(jí)片斷遺傳信息所需的重疊序列的數(shù)目。單片斷方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是消除了處理有毒廢物所帶來的問題，例如丙烯酰胺，它給當(dāng)前的測(cè)序努力帶來了困擾。
圖例說明


圖1是本發(fā)明中所用的共焦顯微鏡裝置的圖示；圖2描述了熒光共振能量傳遞后的曲線，每個(gè)峰代表檢測(cè)到特定核苷酸。
發(fā)明詳述測(cè)定多核苷酸序列的本方法，涉及了對(duì)酶和目標(biāo)多核苷酸之間構(gòu)象變化的分析。
這里所使用的“多核苷酸”一詞應(yīng)有廣泛的含義，包括DNA和RNA，既包括修飾過的DNA和RNA，也包括其它一些雜交核酸樣分子，例如肽核酸(PNA)。
酶可以是聚合酶，當(dāng)聚合酶將核苷酸摻入與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的新生鏈上時(shí)，會(huì)產(chǎn)生構(gòu)象變化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于不同的核苷酸A，T，G或C，構(gòu)象變化是不同的，因此通過測(cè)量這種變化就能確定摻入了哪種核苷酸。
或者，所用的酶也可以是任何涉及與多核苷酸相互作用的酶，例如解旋酶、引發(fā)酶和全酶。當(dāng)酶沿著多核苷酸推移時(shí)，依它所帶來與目標(biāo)接觸的核苷酸不同，它的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化。
檢測(cè)酶構(gòu)象變化的一種方法是測(cè)量合適的能量供體標(biāo)記和能量受體標(biāo)記之間的共振能量傳遞。在一種情況下，供體和受體各自結(jié)合在酶上，由酶與目標(biāo)多核苷酸相互作用引起的構(gòu)象變化改變了標(biāo)記之間的相對(duì)位置。位置的不同由所產(chǎn)生的能量傳遞反映出來，同時(shí)也是與酶接觸的特定核苷酸的特性?；蛘撸粋€(gè)標(biāo)記可以定位在酶上，而另一個(gè)則可以在目標(biāo)的核苷酸上或是摻入與目標(biāo)互補(bǔ)的鏈上的核苷酸上。
利用熒光共振能量傳遞方法(FRET)是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。這項(xiàng)技術(shù)能測(cè)量2-8納米的距離，并依賴于供體熒光團(tuán)和受體熒光團(tuán)之間和距離有關(guān)的能量傳遞。該技術(shù)不僅具有超強(qiáng)的靜態(tài)共定位能力，而且也可以提供分子內(nèi)和分子間FRET過程中兩個(gè)熒光團(tuán)之間的距離或方向的動(dòng)力學(xué)變化信息。自從首次測(cè)量單一供體和單一受體(單對(duì)FRET)之間的能量傳遞之后(Ha等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996；96893)，該技術(shù)已用來研究配基—受體的共定位(Schutz等人，Biophys.J.，1998；742223)，探察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性波動(dòng)的平衡和催化過程中酶—底物的相互作用(Ha等人，1999，出處同前)，以及確定溶液中各擴(kuò)散分子的構(gòu)象狀態(tài)和亞群。所有這些可變物都視為在本發(fā)明中可適用。
本發(fā)明也可以通過使用只需一種標(biāo)記的測(cè)量技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。任何能在單分子水平測(cè)量酶所處局部環(huán)境變化的系統(tǒng)，都是本發(fā)明可接受的實(shí)施方案。附著在沿多核苷酸推移的酶上和/或它的底物上的單個(gè)熒光探針的多種性質(zhì)都可以在本發(fā)明中用來提供變量的數(shù)據(jù)，這些變量屬于酶體系/分子環(huán)境或同它們緊密聯(lián)系，并且對(duì)核苷酸摻入事件是特異性的。這些變量包括，但并不僅限于，分子相互作用，酶活性，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，構(gòu)象動(dòng)力學(xué)，分子運(yùn)動(dòng)自由度，活性以及化學(xué)和靜電環(huán)境方面的變化。
例如，單個(gè)熒光團(tuán)的吸收和發(fā)射轉(zhuǎn)化偶極子可以通過使用偏振激發(fā)光，或者分析發(fā)射偏振，或者兩者的結(jié)合使用來測(cè)定。剛性附著的或旋轉(zhuǎn)式擴(kuò)散的纏繞的標(biāo)記，它的偶極子方向的時(shí)間性變化，可以通過大分子系統(tǒng)或其亞單位之一的角運(yùn)動(dòng)來報(bào)告(Warshaw等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998；958034)，因此可以在本發(fā)明中使用。
本發(fā)明中可以使用的標(biāo)記對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是十分明顯的。優(yōu)選的標(biāo)記是熒光標(biāo)記，例如Xue等人在Nature，1995；373681中所公開的那些?；蛘撸瑹晒饷溉缇G色熒光蛋白(Lu等人，Science，1998；2821877)也可以使用。
但是，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及小熒光分子的使用，這些熒光分子共價(jià)及位點(diǎn)特異性的結(jié)合在沿多核苷酸推移的酶上，例如四甲基羅丹明(TMR)。
如果在本發(fā)明中使用熒光標(biāo)記，由于重復(fù)將它們暴露于激發(fā)波長(zhǎng)下，它們的檢測(cè)可能會(huì)受光漂白的影響。避免這個(gè)問題的一個(gè)可能方法是進(jìn)行許多連續(xù)的反應(yīng)，但一次只對(duì)其中一些檢測(cè)熒光信號(hào)。利用這種重復(fù)的方法，可以確定信號(hào)的正確順序，以及測(cè)定多核苷酸的序列。例如，將大量酶固定在固體支持物上，使它們和目標(biāo)多核苷酸接觸，測(cè)序反應(yīng)應(yīng)該基本在同一時(shí)間開始。激發(fā)和檢測(cè)熒光可以只對(duì)總反應(yīng)中的一部分進(jìn)行一段時(shí)間，直到光漂白現(xiàn)象明顯。這時(shí)，激發(fā)和檢測(cè)可以轉(zhuǎn)移到反應(yīng)的其它部分來繼續(xù)測(cè)序。由于所有的反應(yīng)在時(shí)相上是相對(duì)的，因此正確的序列可通過最小片斷序列組裝得到。
標(biāo)記可以通過共價(jià)鍵或其它一些連鍵附著在酶上。有一些方法可以用來將標(biāo)記附著在酶上。這些方法包括使用定點(diǎn)誘變和非天然氨基酸誘變(Anthony-Cahil等人，Trends Biochem.Sci.，1989；14400)來為特異正交染料標(biāo)記蛋白質(zhì)引入半胱氨酸和酮柄(Cornish等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994；912910)。
另一種用來標(biāo)記沿多核苷酸推移的酶的可預(yù)見的實(shí)施方案是，用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的分子克隆技術(shù)將綠色熒光蛋白和移動(dòng)酶(如聚合酶)融合(Pierce，D.W.等人，Nature，1997；388338)。這種技術(shù)被證明在測(cè)量構(gòu)象變化(Miyawaki等人，Nature，1997；388882)和局部pH變化(Llopis等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998；956803)中是可適用的。
適合用來作為固定酶的支持物，對(duì)技術(shù)人員來說是很明顯的。硅，玻璃和陶瓷材料都可以適用。支持物通常是平面。酶的固定可以用共價(jià)結(jié)合或其它方法來實(shí)現(xiàn)。例如，共價(jià)連接分子可以用來附著在適合制備的酶上。附著方法為技術(shù)人員所熟知。
可以有一個(gè)或更多的酶固定在固相支持物上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，有許多酶附著。這樣能允許監(jiān)測(cè)許多單獨(dú)的反應(yīng)，也許對(duì)解決如上所述的光漂白問題有所幫助。
許多技術(shù)都可以用來測(cè)量酶的構(gòu)象變化。共振能量傳遞可以用表面等離子體激元共振(SPR)技術(shù)或熒光表面等離子體激元共振技術(shù)來測(cè)量。
但是，也可以考慮另外一些通過與“標(biāo)記”或能量傳導(dǎo)器相互作用來測(cè)量輻射變化的技術(shù)，例如內(nèi)部全反射熒光光譜法(totalinternal reflectance fluorescence，TIRF)，衰減全反射(attenuated total reflection，ATR)，受抑全反射(frustrated totalreflection，F(xiàn)TR)，布魯斯特角反射測(cè)定法(Brewster anglereflectometry)，scattered total internal reflection(STIR)，熒光壽命成像顯微和光譜技術(shù)(fluorescence lifetime imagingmicroscopy and spectroscopy)，熒光偏振異向術(shù)(fluorescencepolarisation anisotrophy，F(xiàn)PA)，熒光光譜法，損耗波橢圓測(cè)量術(shù)(evanescent wave ellipsometry).
現(xiàn)在，用下面的實(shí)例結(jié)合相應(yīng)圖式的參考來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)例本實(shí)例使用了共焦熒光裝置，如
圖1所示。
參考
圖1，該裝置由一個(gè)能在高分辨率下掃描X，Y，Z軸的掃描工作臺(tái)(1)和蓋玻片(2)組成，蓋玻片是顯微流體室系統(tǒng)(microfluidicflow cell system)的一部分，該顯微流體室系統(tǒng)有一個(gè)入口(8)和一個(gè)出口(7)，入口用來在緩沖液中固定(9)的聚合酶分子(3)上導(dǎo)入引物—模板多核苷酸復(fù)合體和核苷酸，出口用來導(dǎo)出廢物。從激光源(6)發(fā)出的用來提供供體激活作用的入射光通過油鏡(5)傳遞。
蛋白質(zhì)結(jié)合在本實(shí)驗(yàn)中，四甲基羅丹明(TMR，供體)和Cy5(受體)作為FRET對(duì)使用。這是由于它們具有分離較遠(yuǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)(＞100nm)和大的福斯特半徑(Fster radius)。
使用了從新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室取得的T7 DNA聚合酶(10000U/ml)。50微升T7在Vivaspin500中經(jīng)過4次緩沖液交換，每次用500微升200mM pH為4的醋酸鈉緩沖液，用來將T7 DNA聚合酶所在的儲(chǔ)存液中含有的DTT去除。接著將50微升經(jīng)緩沖液交換的T7 DNA聚合酶加入100微升pH為4的醋酸鈉緩沖液和50微升飽和的2-2-dipyridyl-disulphide水溶液。反應(yīng)進(jìn)行110分鐘，測(cè)量波長(zhǎng)343nm的吸收值。最后，樣品用如上所述的方法經(jīng)緩沖液交換到200mMpH為8的Tris溶液中(4次，每次500微升)。
染料附著通過變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳來確定。在相同的標(biāo)記條件下將Cy5丁二酰亞胺脂(Molecular Probes)綴合在TMR-T7 DNA聚合酶上，并用如上所述的方法純化和鑒定。
聚合酶固定蓋玻片用N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺三乙酸衍生。然后粘成流體室陣列(flow cell arrangement)，以允許緩沖液連續(xù)的流過衍生玻片表面。接著向緩沖液中加入標(biāo)記的聚合酶，允許它們流過蓋玻片，從而使蛋白質(zhì)固定在玻片表面上。
然后將蛋白質(zhì)以低密度固定在玻片—水界面上，以使任何時(shí)候都只有一個(gè)分子處于激發(fā)激光的光柱下。用掃描臺(tái)共焦顯微鏡的外照明裝置上的油鏡使激光(514nm的氬離子激光，15微瓦，環(huán)形偏振)聚焦在0.4微米大小的點(diǎn)上。發(fā)射熒光由同一物鏡收集，并由二色分光鏡(630nm寬帶通過)分成兩束，再由兩個(gè)崩光電二極管(AvalanchePhoto Diode，APD)計(jì)數(shù)裝置同時(shí)檢測(cè)。
將一個(gè)585nm帶通濾光片放在供體檢測(cè)器前；650nm寬帶濾光片放在受體檢測(cè)器前。由于熒光檢測(cè)過程中的光譜范圍離二色分光鏡的波長(zhǎng)臨界值足夠遠(yuǎn)，因此供體和受體信號(hào)檢測(cè)效率的光偏振依賴性可以忽略不計(jì)。已有人證明高近場(chǎng)光圈(near field aperture，NA)物鏡造成的偏振混合可以忽略(Ha等人，出處同前)。
為了得到供體和受體的發(fā)射時(shí)間，使用了如(Ha等人，Appl.Phys.Letter，1997；70；782)中所述的受體信號(hào)搜尋條件。這種方法有助于雙重標(biāo)記蛋白質(zhì)的篩選受體不直接激發(fā)，只有經(jīng)歷FRET的蛋白質(zhì)能顯示受體信號(hào)。一旦蛋白質(zhì)在激光點(diǎn)下得到篩選，查找位置并定位，就得到了供體和受體的時(shí)間曲線(5毫秒的積分時(shí)間)。獲得時(shí)間持續(xù)到所有目標(biāo)蛋白上的熒光標(biāo)記都被光漂白。
反應(yīng)起始用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)法合成兩段寡核苷酸。名為SEQ ID NO.1的寡核苷酸用作目標(biāo)多核苷酸，名為SEQ ID NO.2的寡核苷酸用作引物，這兩段寡核苷酸在雜交條件下反應(yīng)形成目標(biāo)—引物復(fù)合體。
CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAGSEQ ID NO.1CTCTCCCTTCTCTCGTC SEQ ID NO.2接著將引發(fā)DNA和所有四種濃度為0.4mM的核苷酸(dGTP，dCTP，dATP，dTTP)注入流體室以引發(fā)反應(yīng)。流體室通過一臺(tái)改進(jìn)的帕耳帖(peltier)設(shè)備來使溫度維持在25攝氏度。
使用了一種除氧體系(50μg/ml葡萄糖氧化酶，10μg/ml過氧化氫酶，18％(重量/重量)葡萄糖，1％(重量/體積)β-巰基乙醇)來延長(zhǎng)熒光壽命(Funatsu等人，Nature，1995；374555-559)。
FRET數(shù)據(jù)分析初始研究已經(jīng)確定了閃爍現(xiàn)象、光漂白及三重線態(tài)峰的起因(Ha等人，Chem.Phy，1999，247107-118)，這三種現(xiàn)象都會(huì)干擾由于構(gòu)象變化引起的熒光團(tuán)之間的距離變化所致的FRET效率的潛在改變。如Ha等人在1999(出處同前)上所公開的，將從供體和受體時(shí)間曲線上減去背景信號(hào)后，用具有五點(diǎn)平均值的中間濾片除去三重峰。接著，兩檢測(cè)器上顯示由供體閃爍現(xiàn)象引起的同時(shí)黑暗計(jì)數(shù)的點(diǎn)在時(shí)間曲線上不予考慮。
受體光漂白后供體信號(hào)回收量同該分子的量子產(chǎn)率和它們的總體檢測(cè)效率有關(guān)。
接著得到能量傳遞時(shí)間曲線。圖2所示為在目標(biāo)鏈SEQ ID NO.1的聚合過程中FRET的效率時(shí)間曲線。從圖2可以看出，該序列與SECID NO.1的互補(bǔ)序列一致(從右向左讀，去掉同引物序列雜交的那部分)。
序列表<110>Medical Biosystems Ltd.<120>DNA測(cè)序方法<130>REP06193WO<140>(not yet known)<141>2000-10-06<150>9923644.0<151>1999-10-06<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述模板多核苷酸<400>1caaggagagg acgctgtctg tcgaaggtaa ggaacggacg agagaaggga gag53<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物多核苷酸<400>2ctctcccttc tctcgtc1權(quán)利要求
1.測(cè)定多核苷酸序列的方法，其包括以下步驟i.在足以誘導(dǎo)酶活性的條件下，使目標(biāo)多核苷酸與能和多核苷酸相互作用并沿著多核苷酸推移的酶反應(yīng)；ii.測(cè)定當(dāng)酶沿著多核苷酸推移時(shí)酶的構(gòu)象變化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中酶是聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中酶是解旋酶或者引發(fā)酶。
4.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中酶被固定在固體支持物上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，包含有許多酶固定在固體支持物上。
6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中酶含有第一結(jié)合可檢測(cè)標(biāo)記，其特征隨著酶構(gòu)象的改變而改變。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中酶含有第二結(jié)合可檢測(cè)標(biāo)記，該標(biāo)記能與第一標(biāo)記相作用，其中相互作用的程度依賴于酶的構(gòu)象變化。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中第二可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合在與酶接觸的核苷酸上。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中第一標(biāo)記是能量受體，第二標(biāo)記是能量供體，或者相反，并且步驟(ii)通過測(cè)量這兩個(gè)標(biāo)記之間的能量傳遞來進(jìn)行。
10.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟(ii)通過使用共焦顯微術(shù)來進(jìn)行。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中步驟(ii)通過熒光成像來進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(ii)通過測(cè)量由第一標(biāo)記的特性改變引起的偏振效應(yīng)來進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中步驟(ii)通過使用熒光偏振異向術(shù)來進(jìn)行。
14.用熒光共振能量傳遞方法來檢測(cè)與目標(biāo)多核苷酸相互作用并沿其推移的酶的構(gòu)象變化，從而測(cè)定多核苷酸的序列的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中酶是聚合酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的用途，其中酶是固定在固體支持物上的。
17.用可檢測(cè)標(biāo)記的并且能和目標(biāo)多核苷酸相互作用并沿著其推移的酶，來測(cè)定多核苷酸的序列的用途，其中隨著酶沿多核苷酸推移，標(biāo)記會(huì)改變它的可檢測(cè)特性。
18.含有至少一種固定化的、能和目標(biāo)多核苷酸相互作用并沿其推移的酶的固體支持物，該酶標(biāo)記有一個(gè)或更多的可檢測(cè)標(biāo)記。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的固體支持物，其中酶是聚合酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的固體支持物，其中標(biāo)記是熒光團(tuán)。
21.一種測(cè)定多核苷酸序列的系統(tǒng)，其包括權(quán)利要求18到21中任一項(xiàng)所述的固體支持物，以及檢測(cè)標(biāo)記的設(shè)備。
全文摘要
測(cè)量多核苷酸序列的方法，該方法依賴于檢測(cè)與多核苷酸相互作用并沿其推移的酶的構(gòu)象變化。測(cè)量構(gòu)象變化可以通過測(cè)量結(jié)合在酶上的熒光團(tuán)的變化來實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1391615SQ0081378
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2000年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月6日
發(fā)明者D·H·丹斯哈姆 申請(qǐng)人:醫(yī)療生物系統(tǒng)有限公司