專利名稱：葡萄穗霉屬的酚氧化酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)背景本發(fā)明涉及新型酚氧化酶，特別是，來(lái)源于葡萄穗霉屬的菌株的新型酚氧化酶以及產(chǎn)生這些酶的葡萄穗霉屬的新型菌株。本發(fā)明提供了用于表達(dá)葡萄穗霉屬酚氧化酶的方法和宿主細(xì)胞以及用于制備表達(dá)系統(tǒng)的方法。
背景技術(shù)：
酚氧化酶的作用是催化氧化還原反應(yīng)，即，將電子從電子供體(通常是一種酚化合物)轉(zhuǎn)移到分子氧(起著電子受體的作用)，從而將所述分子氧還原成H2O。雖然能夠采用多種不同的酚氧化物作為電子供體，但是酚氧化酶對(duì)于作為電子受體的分子氧則是非常特異的。
酚氧化酶可被用于多種用途，包括洗滌劑工業(yè)、造紙和紙漿工業(yè)、紡織業(yè)和食品業(yè)。在洗滌劑工業(yè)中，在用洗滌劑進(jìn)行洗滌的過(guò)程中，酚氧化酶已被用來(lái)防止溶液中的染料從一種織物轉(zhuǎn)移到另一種織物上，該應(yīng)用通常被稱作染料轉(zhuǎn)移的抑制。
大多數(shù)的酚氧化酶的最適pH是在酸性pH范圍內(nèi)，而在中性或堿性pH下則失去活性。
已知酚氧化酶由多種真菌產(chǎn)生，包括曲霉屬、鏈孢霉屬、Podospora、葡萄孢屬、灰側(cè)耳菌屬、層孔菌屬、射脈菌屬、栓菌屬、多孔菌屬、絲核菌屬和香菇屬。然而，仍需要鑒別和分離出用于洗滌劑洗滌方法和組合物中其最適pH值在堿性范圍內(nèi)的酚氧化酶和能夠自然產(chǎn)生這種酚氧化酶的微生物。
本發(fā)明概述本發(fā)明涉及新型酚氧化酶。在一個(gè)優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明涉及從葡萄穗霉屬中獲得的酚氧化酶。特別是，本發(fā)明的酶能夠減輕與染料以及具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的染色化合物有關(guān)的顏色，尤其是在中性或堿性pH下。正是基于它們的這種脫色的能力，本發(fā)明的酚氧化酶可以被用于，例如，紙漿和紙張的漂白，用于漂白脫去織物上的污跡顏色以及用于洗滌劑和紡織品應(yīng)用當(dāng)中。一方面，本發(fā)明的酚氧化酶能夠在沒(méi)有增強(qiáng)劑的條件下減輕染料或染色化合物的顏色。另一方面，本發(fā)明的酚氧化酶能夠在有增強(qiáng)劑存在的條件下進(jìn)行脫色。
本發(fā)明基于一種編碼酚氧化酶的基因組序列(SEQ ID NO3)的鑒別和定性，所述酚氧化酶從葡萄穗菌屬中獲得并且具有如SEQ ID NO2所示的推測(cè)氨基酸序列。
因此，本發(fā)明提供了與具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的酚氧化酶具有至少68％至100％的相同性，至少68％的相同性，至少70％的相同性，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性的酚氧化酶，條件是所述酶能夠減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色。在一個(gè)技術(shù)方案中，所述酚氧化酶具有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列或具有含在保藏號(hào)為MUCL 38898的Stachybotryschartarum中的氨基酸序列。
在一個(gè)技術(shù)方案中，所述酚氧化酶獲自于包括Stachybotrysparvispora，Stachybotrys chartarum；S.kampalensis；S.theobromae；S.bisbyi，S.cylindrospora，S.dichroa，S.oenanthes和S.Nilagerica在內(nèi)的葡萄穗霉的菌種。在另一個(gè)技術(shù)方案中，所述葡萄穗霉菌種包括Stachybotrys chartarum MUCL 38898和S.chartarum MUCL30782。
在另一個(gè)技術(shù)方案中，本發(fā)明提供了一種編碼一種酚氧化酶的分離多核苷酸，其中該多核苷酸含有與SEQ ID NO1具有至少65％至100％的相同性，也就是說(shuō)，至少65％的相同性，至少70％的相同性，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性的一種核酸序列，條件是所述多核苷酸編碼能夠減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色的酚氧化酶。本發(fā)明包括在高嚴(yán)緊度條件下與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示多核苷酸雜交的多核苷酸序列，條件是該序列能夠減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色。本發(fā)明還包括編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多核苷酸。在一個(gè)技術(shù)方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核酸序列或者含在Stachybotrys chartarum MUCL 38898中的核酸序列。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明酚氧化酶的方法。因此，本發(fā)明提供了一種包括下列步驟的制備酚氧化酶的方法在產(chǎn)生所述酚氧化酶的條件下培養(yǎng)含有一種編碼酚氧化酶的分離多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述酚氧化酶的序列與SEQ ID NO2所示的酚氧化酶氨基酸序列具有至少68％至100％的相同性，也就是說(shuō)，至少68％的相同性，至少70％的相同性，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性；并且任選地回收所制備的酚氧化酶。在一個(gè)技術(shù)方案中，所述多核苷酸含有如SEQ ID NO1所示的序列。在另一個(gè)技術(shù)方案中，所述多核苷酸含有如SEQ ID NO3所示的序列。在一個(gè)附加的技術(shù)方案中，所述多核苷酸在高嚴(yán)緊度條件下與具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示序列的多核苷酸雜交或者與含在Stachybotryschartarum MUCL 38898中的序列雜交。在另一個(gè)技術(shù)方案中，所述多核苷酸與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3具有65％至100％的相同性，也就是說(shuō)，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性。
本發(fā)明還提供了一種制備含有編碼酚氧化酶的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞的方法，該方法包括的步驟是獲得一種編碼所述酚氧化酶的分離多核苷酸，該多核苷酸與SEQ ID NO3具有65％至100％的相同性，也就是說(shuō)，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性；將所述多核苷酸引進(jìn)所述宿主細(xì)胞；并且在適于產(chǎn)生所述酚氧化酶的條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞。在一個(gè)技術(shù)方案中，所述多核苷酸被整合到宿主基因組中，并且在另一個(gè)技術(shù)方案中，所述多核苷酸存在于一種復(fù)制質(zhì)粒上。本發(fā)明還包括在高嚴(yán)緊度條件下與SEQ ID NO1或SEQ IDNO3所示多核苷酸雜交的多核苷酸。本發(fā)明還提供了編碼SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多核苷酸。在一個(gè)技術(shù)方案中，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核酸序列或含在Stachybotrys chartarum MUCL 38898中的核酸序列。
在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，所述含有編碼酚氧化酶多核苷酸的宿主細(xì)胞包括絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌。在另一個(gè)技術(shù)方案中，所述宿主細(xì)胞是包括曲霉菌種、木霉菌種和白霉菌種在內(nèi)的絲狀真菌。在另一個(gè)技術(shù)方案中，所述絲狀真菌宿主細(xì)胞包括黑色曲霉變種.泡盛曲霉和Trichoderma reseei.
在本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案中，所述宿主細(xì)胞是一種包括糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、漢遜氏酵母屬、裂殖糖酵母屬、克魯維氏酵母屬和Yarrowia的菌種在內(nèi)的酵母菌。在另外一個(gè)技術(shù)方案中，所屬糖酵母菌種是啤酒糖酵母。在另一個(gè)技術(shù)方案，所述宿主細(xì)胞是一種包括革蘭氏陽(yáng)性菌如桿菌屬，和革蘭氏陰性菌如埃希氏菌屬在內(nèi)細(xì)菌。
本發(fā)明還提供了含有與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的酚氧化酶具有68％至100％的相同性，也就是說(shuō)，至少68％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性的氨基酸的酶組合物。在一個(gè)技術(shù)方案中，所述氨基酸具有如SEQ ID NO2所式的氨基酸序列。這種酶組合物可被用于，例如生產(chǎn)洗滌劑和其它清潔組合物，紙張和紙漿漂白組合物和織物組合物。
本發(fā)明還包括減輕樣本上污跡中與染料或染色化合物有關(guān)的顏色的方法，該方法包括步驟將樣本與含有一種氨基酸的一種組合物接觸，所述氨基酸與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的酚氧化酶具有68％至100％的相同性，也就是說(shuō)，至少68％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性，條件是所述酶能夠減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色。在一個(gè)優(yōu)選的方法技術(shù)方案中，所述氨基酸如SEQ ID NO2所示。
所述方法中，pH最適值在5.0至11.0之間，優(yōu)選地，pH最適值在7至10.5之間，以及更優(yōu)選地，pH最適值在8.0至10之間。另外所述的方法中，最適溫度在20至60℃之間，優(yōu)選地，在20至40℃之間。
附圖的主要描述


圖1提供了利用實(shí)施例5中記載的PCR制備來(lái)源于Stachybotryschartarum的酚氧化酶的核酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2提供了在本文中被命名為Stachybotrys氧化酶B基因的氨基酸的氨基酸序列。
圖3表示來(lái)源于Stachybotrys chartarum的酚氧化酶的基因組序列(SEQ ID NO3)。該核酸序列在本文中被定義為Stachybotrys氧化酶B基因。
圖4是一種葡萄穗霉屬酚氧化酶B酶SEQ ID NO2(底下一行)和膽紅素氧化酶(SEQ ID NO4)的氨基酸排列順序。
圖5提供了一種載體pGAPT2-spoB的構(gòu)建圖譜，該載體被用于在曲霉菌中進(jìn)行表達(dá)。堿基1至1134含有黑色曲霉葡萄糖淀粉酶基因啟動(dòng)子。堿基3098至3356以及4950至4971含有黑色曲霉葡萄糖淀粉酶終止子。作為一個(gè)真菌轉(zhuǎn)化標(biāo)記的溝巢曲霉pyrG基因被插入到3357至4949之間。所述質(zhì)粒的其余部分含有用于在大腸桿菌中進(jìn)行繁殖的pBR322序列。編碼SEQ ID NO1的葡萄穗霉屬酚氧化酶的核酸被克隆到Bgl II和Age I限制位點(diǎn)中。
圖6是一個(gè)葡萄穗霉屬氧化酶B蛋白在一種復(fù)制質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)的構(gòu)建圖譜。所述葡萄穗霉屬氧化酶的表達(dá)受控于曲霉菌的葡萄糖淀粉酶啟動(dòng)子和終止子。所述轉(zhuǎn)化標(biāo)記pyrG基因和AMA 1序列來(lái)源于溝巢曲霉。
圖7表示葡萄穗霉屬氧化酶B作用于底物2，6 DMP的pH曲線圖。
圖8表示如實(shí)施例1中所述的從離子交換柱上分部收集的Stachybotrys chartarum餾分的非變性(天然的)凝膠電泳(銀染)。
圖9表示如實(shí)施例1中所述的覆蓋ABTS的餾分的非變性凝膠電泳。
圖10表示從圖9所示凝膠的ABTS覆蓋層鑒定和分離的SDS-PAGE凝膠電泳帶。Stachybotrys chartarum氧化酶B被顯示在具有覆蓋層2標(biāo)記的泳道中。泳道覆蓋層2表示在所述條件下觀察到的Stachybotryschartarum氧化酶B的模式帶。
詳細(xì)描述定義本文所使用的術(shù)語(yǔ)酚氧化酶是指那些能夠催化氧化還原反應(yīng)的酶，在該氧化還原反應(yīng)中電子供體是一種酚化合物并且對(duì)作為電子受體的分子氧或過(guò)氧化氫是特異的。本發(fā)明獲自于Stachybotrys chartarum的舉例性酚氧化酶如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明包括與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的酚氧化酶具有65％至100％的相同性，也就是說(shuō)，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少 85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性的酚氧化酶。本文所使用的相同性是通過(guò)GCG軟件的GAP程序來(lái)測(cè)定的(UniversityResearch Park，Madison Wis.)，該程序具有下列參數(shù)間距權(quán)重＝12；長(zhǎng)度權(quán)重＝4；間距創(chuàng)建罰值＝8；和間距延伸罰值＝2。
本文所使用的葡萄穗霉屬是指任何產(chǎn)生能夠減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色的酚氧化酶的葡萄穗霉屬的菌種。本發(fā)明包括葡萄穗霉屬的天然分離物的衍生物，包括子代和突變體，條件是所述衍生物能夠產(chǎn)生一種能夠減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色的酚氧化酶。
本文中在涉及酚氧化酶時(shí)，術(shù)語(yǔ)“獲自于”是指來(lái)源于或由所述特定微生物菌株天然產(chǎn)生的酚氧化酶。舉個(gè)例子，獲自于葡萄穗霉屬的酚氧化酶是指那些由葡萄穗霉菌天然產(chǎn)生的酚氧化酶。本發(fā)明包括那些與由葡萄穗霉菌產(chǎn)生的酚氧化酶相同然而是利用基因工程技術(shù)由微生物如被編碼所述酚氧化酶的基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、真菌或酵母菌產(chǎn)生的或是由與那些來(lái)源于葡萄穗霉屬的微生物相同的微生物產(chǎn)生的，或者是由那些來(lái)源于葡萄穗霉屬的微生物的等同物如子代或突變體產(chǎn)生的酚氧化酶。
本發(fā)明包括由一種能夠在高嚴(yán)緊度條件下與具有SEQ ID NO1或SEQID NO3所示序列的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的酚氧化酶。本發(fā)明包括編碼酚氧化酶的多核苷酸，該多核苷酸與含有SEQ ID NO1所示序列的多核苷酸具有至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性。核酸水平的相同性是通過(guò)GCG軟件的GAP程序測(cè)定的(University Research Park，Madison Wis.)，該程序具有下列參數(shù)間距權(quán)重＝50；長(zhǎng)度權(quán)重＝4；間距創(chuàng)建罰值＝50；和間距延伸罰值＝3。本發(fā)明還包括含有部分本發(fā)明的酚氧化酶的突變體、變異體和衍生物，條件是所述突變體、變異體或衍生物酚氧化酶能夠保留天然存在的酚氧化酶的至少一種特性。
本文所使用的術(shù)語(yǔ)“染色化合物”是指一種使紡織品著色的物質(zhì)或者是指產(chǎn)生具有污跡視覺(jué)表觀的物質(zhì)。如在《纖維和紡織品技術(shù)詞典》(Hoechst Celanese Corporation(1990)PO Box 32414，Charlotte N.C.28232)中定義的，一種染料是一種通過(guò)化學(xué)反應(yīng)、吸收或分散作用插入到纖維中的染色化合物。染料的實(shí)例包括直接染色的藍(lán)染料、酸性藍(lán)染料、直接染色的紅染料、反應(yīng)性藍(lán)或反應(yīng)性黑染料。通用紡織品染料的目錄見(jiàn)顏色索引，第3版，1-8期。產(chǎn)生污跡視覺(jué)表觀的物質(zhì)是多元酚、類胡蘿卜素、花色素苷、單寧、美拉反應(yīng)產(chǎn)物等。
本文使用的短語(yǔ)“減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色”或“染色化合物的修飾”是指所述染料或化合物通過(guò)氧化反應(yīng)，直接地或間接地被改變了，使得顏色看起來(lái)被減輕了，也就是說(shuō)，視覺(jué)上所述顏色被減弱了、減輕了、脫色了、漂白了或被除去了，或者所述顏色不受影響但所述化合物被修飾了結(jié)果使得染料的再沉積受到抑制。本發(fā)明包括通過(guò)任何方法減輕顏色，所述方法包括，例如通過(guò)任何方法徹底去除織物上的污跡中的染色化合物以及減小顏色的強(qiáng)度或改變所述化合物的顏色。
當(dāng)本文使用的術(shù)語(yǔ)“突變體”和“變異體”指的是酚氧化酶時(shí)，是指通過(guò)改變天然存在的氨基酸序列和/或其結(jié)構(gòu)如通過(guò)改變結(jié)構(gòu)基因的DNA核苷酸序列和/或通過(guò)直接置換和/或改變氨基酸序列和/或酚氧化酶的結(jié)構(gòu)而獲得的酚氧化酶。本文使用的術(shù)語(yǔ)酚氧化酶“衍生物”是指天然存在的全長(zhǎng)序列的一部分或一個(gè)片段或仍保留天然存在的酚氧化酶的至少一種活性的變異酚氧化酶氨基酸序列。當(dāng)本文所使用的術(shù)語(yǔ)“突變體”或“變異體”指的是微生物菌株時(shí)，是指由某種形式的自然分離物變化而來(lái)的細(xì)胞，例如，該細(xì)胞具有例如改變的編碼酚氧化酶結(jié)構(gòu)基因的DNA核苷酸序列；對(duì)自然分離物進(jìn)行改變是為了提高酚氧化酶的產(chǎn)率；或其它影響酚氧化酶表達(dá)的改變。
術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)劑”或“調(diào)節(jié)劑”是指能夠減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色的任何化合物，所述染料或染色化合物與酚氧化酶或一種增強(qiáng)酚氧化酶氧化活性的化合物相結(jié)合。所述的增強(qiáng)劑通常是指一種有機(jī)化合物。酚氧化酶本發(fā)明的酚氧化酶的功能是催化氧化還原反應(yīng)，即，將電子從電子供體(通常是一種酚氧化物)轉(zhuǎn)移給分子氧或過(guò)氧化氫(起電子受體的作用)，從而將過(guò)氧化氫還原成水。這種酶的實(shí)例是漆酶(EC 1.10.3.2)、膽紅素酶(EC 1.3.3.5)、酚氧化酶(EC 1.14.18.1)、兒茶酚酶(EC1.10.3.1)。編碼酚氧化酶的核酸本發(fā)明包括編碼獲自于葡萄穗霉屬菌種的酚氧化酶的多核苷酸，其中所述多核苷酸與SEQ ID NO3所示的多核苷酸序列具有65％至100％的相同性，也就是說(shuō)，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性，條件是由所述多核苷酸編碼的酶能夠減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色。在一個(gè)技術(shù)方案中，所述酚氧化酶具有如SEQ ID NO3或SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或者具有含在Stachybotryschartarum MUCL 38898中的多核苷酸序列。正如本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所能理解的，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，多種多核苷酸能夠編碼如SEQ ID NO2所示的酚氧化酶。本發(fā)明包括所有這些多核苷酸。
所述編碼酚氧化酶的核酸可以通過(guò)本技術(shù)領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，通過(guò)化學(xué)合成、通過(guò)cDNA克隆、通過(guò)PCR、或通過(guò)從一種需要的細(xì)胞如葡萄穗霉屬菌種中純化的基因組DNA或其片段的克隆來(lái)從克隆的DNA(例如，一種DNA“文庫(kù)”)中獲得(參見(jiàn)，例如，Sambrook等.，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約；Glover，D.M.(編輯)，1985，DNA克隆實(shí)用方法，MRL出版社，Ltd.，牛津大學(xué)，聯(lián)合王國(guó)，I，II期)。來(lái)源于基因組DNA的核酸序列除了含有編碼區(qū)外還可含有調(diào)節(jié)區(qū)。無(wú)論是哪種來(lái)源，分離到的編碼本發(fā)明酚氧化酶的核酸應(yīng)當(dāng)被分子克隆到用于基因擴(kuò)增的合適載體中。
在分子克隆來(lái)源于基因組DNA的基因過(guò)程中，產(chǎn)生了DNA片段，其中的某些DNA片段將編碼目的基因。采用不同的限制酶可以在特異性位點(diǎn)對(duì)所述DNA進(jìn)行裂解?；蛘?，可以在有錳存在的條件下采用脫氧核糖核酸酶將DNA裂解成片段，或所述DNA被物理剪切，例如通過(guò)超聲處理。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)按照大小分離得到的線性DNA片段，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱層析。
一旦產(chǎn)生了核酸片段，就可以通過(guò)多種方法完成對(duì)編碼酚氧化酶具有特異性的DNA片段的鑒定。例如，本發(fā)明的一種編碼酚氧化酶的基因或其特異性RNA，或其片段如一種探針或引物進(jìn)行分離和標(biāo)記后被用于檢測(cè)一種生成基因的雜交分析(Benton，W.和Davis，R.，1977，科學(xué)196180；Grunstein，M.和Hogness，D.，1975，美國(guó)國(guó)立科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)723961)中。含有類似于所述探針基本序列的那些DNA片段在高嚴(yán)緊度條件下將進(jìn)行雜交。
本發(fā)明包括獲自于葡萄穗霉屬菌種的酚氧化酶，其中該酚氧化酶通過(guò)核酸雜交技術(shù)來(lái)鑒定，該核酸雜交技術(shù)以SEQ ID NO1或SEQ ID NO3作為探針或引物并且篩選基因組或cDNA來(lái)源的核酸。編碼獲自于葡萄穗霉屬菌種的酚氧化酶并且與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3具有至少65％的相同性的核酸可以通過(guò)DNA-DNA或DNA-RNA雜交或利用探針、SEQ IDNO1或SEQ ID NO3的部分或片段進(jìn)行的擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)。因此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)編碼酚氧化酶的核酸的方法，該核酸包含在本發(fā)明中且含有與葡萄穗霉屬菌種的基因組或cDNA來(lái)源的核酸雜交的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的部分或全部核酸序列。
因此，本發(fā)明的范圍包括能夠在高嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO3所示核酸序列雜交的多核苷酸序列。雜交條件是基于核酸結(jié)合復(fù)合物的熔解溫度(Tm)，如本文中引進(jìn)作為參考的Berger和Kimmel(1987，分子克隆技術(shù)指南，酶學(xué)方法(Guide to Molecular Cloning Techniques，Methodsin Enzymology)，152期，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，San DiegoCalif.)中所教導(dǎo)的，并且賦予了一個(gè)如下所釋的確定術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊度”。
“最大嚴(yán)緊度”通常大約在Tm-5℃(比探針Tm低5℃)；“高嚴(yán)緊度”比Tm低大約5℃-10℃；“中等嚴(yán)緊度”比Tm低大約10℃-20℃；以及“低嚴(yán)緊度”比Tm低大約20℃-25℃。例如，在本發(fā)明中下列條件是高嚴(yán)緊度的條件在37℃下于含有50％甲酰胺，5×SSPE，0.5％SDS和50ug/ml的被剪切的鯡DNA的緩沖液中進(jìn)行雜交。在65℃下于1×SSC和0.1％SDS存在的條件下沖洗30分鐘一次，在65℃下于0.5×SSC和0.1％SDS存在的條件下沖洗30分鐘一次以及在65℃下于0.1×SSC和0.1％SDS存在的條件下沖洗30分鐘一次；下列條件是中等嚴(yán)緊度的條件在37℃下于含有25％甲酰胺，5×SSPE，0.5％SDS和50ug/ml的被剪切的鯡DNA的緩沖液中進(jìn)行雜交。在50℃下于1×SSC和0.1％SDS存在的條件下沖洗30分鐘一次，在50℃下于0.5×SSC和0.1％SDS存在的條件下沖洗30分鐘一次；下列條件是低嚴(yán)緊度的條件在37℃下于含有25％甲酰胺，5×SSPE，0.5％SDS和50ug/ml的被剪切的鯡DNA的緩沖液中進(jìn)行雜交。在37℃下于1×SSC和0.1％SDS存在的條件下沖洗30分鐘一次，在37℃下于0.5×SSC和0.1％SDS存在的條件下沖洗30分鐘一次。能夠在高嚴(yán)緊度的條件下與一種核酸探針雜交的核酸與所述探針具有大約80％至100％的相同性；能夠在中等嚴(yán)緊度的條件下與一種核酸探針雜交的核酸與所述探針具有大約50％至80％的相同性。本文使用的術(shù)語(yǔ)“雜交”將包括“核酸的一條鏈通過(guò)堿基配對(duì)與一條互補(bǔ)鏈結(jié)合的方法”(Coombs J(1994)生物技術(shù)詞典(Dictionary of Biotechnology)，Stockton出版社，紐約N.Y.)。
在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)中使用的擴(kuò)增方法被記載在DieffenbachC W和G S Dveksler(1995，PCR引物實(shí)驗(yàn)指南，冷泉港出版社，PlainviewN.Y.)中。來(lái)源于SEQ ID NO3的至少大約10個(gè)核苷酸和至多大約60個(gè)核苷酸，優(yōu)選地大約12至30個(gè)核苷酸，和更優(yōu)選地大約25個(gè)核苷酸的核酸序列可以被用作一種PCR引物。
從cDNA或基因組文庫(kù)中分離本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建物的優(yōu)選方法是采用利用簡(jiǎn)并的寡核苷酸探針的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，所述寡核苷酸探針是在具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的基礎(chǔ)上制備的。例如，所述PCR可以利用美國(guó)專利US4,683,202中記載的技術(shù)來(lái)進(jìn)行。表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明提供了用于在宿主微生物如真菌、酵母菌和細(xì)菌中產(chǎn)生酚氧化酶的宿主細(xì)胞、表達(dá)方法和系統(tǒng)。一旦獲得了本發(fā)明的編碼酚氧化酶的核苷酸，就可以利用本技術(shù)領(lǐng)域中已知技術(shù)來(lái)構(gòu)建含有所述核酸的重組宿主細(xì)胞。分子生物學(xué)技術(shù)被記載在Sambrook等的分子生物學(xué)克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版(1989)冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，(1989)中。獲得了編碼酚氧化酶的核酸并利用合適的載體將其轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，所述編碼酚氧化酶的核酸與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示核酸具有至少65％至100％的相同性，也就是說(shuō)，至少65％的相同性，至少70％，至少75％的相同性，至少80％的相同性的，至少85％的相同性，至少90％的相同性和至少95％的相同性，所述相同性是通過(guò)利用GCG軟件的GAP程序(University Research Park，Madison，Wis.)并按照下列參數(shù)間距權(quán)重＝50；長(zhǎng)度權(quán)重＝4；間距創(chuàng)建罰值＝50；和間距延伸罰值＝3進(jìn)行測(cè)定的。多種適用于在真菌、酵母菌和細(xì)菌中進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化和表達(dá)的載體以及轉(zhuǎn)化和表達(dá)盒對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。
通常，所述載體或盒含有指導(dǎo)所述核酸轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、一種選擇標(biāo)記和允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的載體包括一個(gè)調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的基因5’區(qū)域以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3’區(qū)域。這些調(diào)控區(qū)域可以來(lái)源于與所述宿主同源或異源的基因，條件是選擇的所述調(diào)控區(qū)域能夠在宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用。
能夠用來(lái)在一種宿主細(xì)胞中啟動(dòng)所述酚氧化酶表達(dá)的起始調(diào)控區(qū)域或啟動(dòng)子對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知的。實(shí)際上，任何能夠啟動(dòng)所述酚氧化酶表達(dá)的啟動(dòng)子都適用于本發(fā)明。編碼所述酚氧化酶的核酸通過(guò)起始密碼子被可操作性連接在用于有效表達(dá)所述氧化或還原酶的選擇表達(dá)調(diào)控區(qū)域上。一旦構(gòu)建出適當(dāng)?shù)暮?，就將其用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法被記載在最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編(第1卷，由Ausubel等編輯，John Wiley & Sons，Inc.1987，第9章)中并且包括磷酸鈣方法、利用PEG的轉(zhuǎn)化和電穿孔。PEG和鈣介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Finkelstein，D B 1992轉(zhuǎn)化.絲狀真菌的生物中工程，技術(shù)和產(chǎn)品(由Finkelstein & Bill編輯)113-156)可以被用于曲霉屬和木霉曲屬的轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體的電穿孔被記載在Finkelstein，D B1992轉(zhuǎn)化.絲狀真菌的生物技術(shù).技術(shù)和產(chǎn)品(由Finkelstein & Bill編輯)113-156中。對(duì)分生孢子的顯微投影轟擊被記載在Fungaro等.(1995)的“通過(guò)對(duì)完整分生孢子的顯微投影轟擊轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉”，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊125293-298頁(yè)中。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化被記載在Groot等.(1998)根癌土壤桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌的轉(zhuǎn)化.自然生物工程16 839-842頁(yè)中。對(duì)于酵母屬的轉(zhuǎn)化，本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知有醋酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化以及PEG和鈣介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及電穿孔技術(shù)。
含有本發(fā)明酚氧化酶的編碼序列并表達(dá)所述蛋白的宿主細(xì)胞可以通過(guò)多種本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法來(lái)鑒定。這些方法包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA雜交以及蛋白的生物分析或免疫分析技術(shù)，該技術(shù)包括用于鑒定和/或定量分析所述核酸或蛋白的基于膜、基于溶液或基于碎片的技術(shù)。
如本文所述，將編碼獲自于Stachybotrys chartarum(MUCL 38898)的酚氧化酶的基因組序列(SEQ ID NO3)分離出來(lái)并且在黑色曲霉變種.泡盛曲霉和Trichoderma reesei中進(jìn)行表達(dá)。酚氧化酶活性本發(fā)明的酚氧化酶能夠利用多種不同的酚化合物作為電子供體，同時(shí)對(duì)作為電子的受體的分子氧或過(guò)氧化氫的特異性非常強(qiáng)。
根據(jù)特異底物和反應(yīng)條件，例如，溫度、有無(wú)增強(qiáng)劑等的存在，每一酚氧化酶的氧化反應(yīng)將具有各自的最佳pH。酚氧化酶的應(yīng)用如下文所述，本發(fā)明的葡萄穗霉屬酚氧化酶能夠氧化多種具有不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的染料或染色化合物，所述氧化過(guò)程成中以氧或過(guò)氧化氫作為電子受體。因此本發(fā)明的酚氧化酶被用于需要減輕與染料或染色化合物有關(guān)的顏色的應(yīng)用中，如在清潔過(guò)程中的應(yīng)用，用于除去織物上的食物污跡；和用于紡織品；和用于造紙和紙漿。需要一種介質(zhì)或增強(qiáng)劑來(lái)獲得需要的效果。染色化合物在本發(fā)明中，多種染色化合物可被用作本發(fā)明酚氧化酶的氧化對(duì)象。例如，在洗滌劑的應(yīng)用中，織物上的污跡中的染色物質(zhì)可以是一種對(duì)象。幾種類型或種類的染色物質(zhì)可能產(chǎn)生污跡，如卟啉的衍生結(jié)構(gòu)如血跡中的血紅素或植物中的葉綠素；茶污跡、酒污跡、香蕉污跡、桃污跡中的單寧和多元酚(參見(jiàn)P.Ribereau-Gayon，植物酚醛塑料，Ed.Oliver &Boyd，Edinburgh，1972，pp.169-198)；番茄(番茄紅素，紅色)、芒果(胡蘿卜素，桔黃色)中的染色物質(zhì)類胡蘿卜素(G.E.Bartley等.，植物細(xì)胞(1995)，第7期，1027-1038頁(yè))；許多水果和花中的高度染色分子，花色素苷(P.Ribereau-Gayon，植物酚醛塑料，編輯Oliver & Boyd，Edinburgh，1972，135-169頁(yè))；和美拉反應(yīng)產(chǎn)物，通過(guò)在有蛋白/肽成分存在的條件下加熱碳水化合物分子的混合物產(chǎn)生的黃/褐色染色物質(zhì)，諸如在烹飪油中發(fā)現(xiàn)的黃/褐色染色物質(zhì)。增強(qiáng)劑根據(jù)染料或染色化合物的性質(zhì)，本發(fā)明的酚氧化物能夠在有或無(wú)增強(qiáng)子存在的條件下減輕與所述染料或染色化合物有關(guān)的顏色。如果一種化合物能被作為所述酚氧化酶的直接底物，所述酚氧化酶能在無(wú)增強(qiáng)子存在的條件下減輕與所述染料或染色化合物有關(guān)的顏色，盡管對(duì)于酚氧化酶最佳活性來(lái)說(shuō)一種增強(qiáng)子仍然是優(yōu)選的。對(duì)于其它不能作為所述酚氧化酶的直接底物或不能直接被所述酚氧化酶利用的化合物來(lái)說(shuō)，需要一種使酚氧化酶活性最佳化并減輕所述顏色的增強(qiáng)子。
增強(qiáng)子被記載在例如1995年1月12日公開的WO 95/01426；1996年3月7日公開的WO 96/06930；和1997年3月27日公開的WO 97/11217中。增強(qiáng)子包括但不限于吩噻嗪-10-丙酸(PTP)、10-甲基吩噻嗪(MPT)、吩嗪-10-丙酸(PPO)、10-甲基吩嗪(MPO)、10-乙基吩噻嗪-4-羧酸(EPC)、乙酰丁香酮、丁香醛、甲基丁香酯、2，2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸鹽(ABTS)。培養(yǎng)物本發(fā)明包括能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酚氧化酶的葡萄穗霉屬菌株和天然分離物以及這種菌株和分離物的衍生菌株，諸如Stachybotrys parvispora菌種的菌株，特別包括Stachybotrys parvispora變種hughes MUCL38996；Stachybotrys chartarum菌種的菌株，特別包括Stachybotryschartarum MUCL 38898；S.parvispora MUCL 9485；S.chartarum MUCL30782；S.kampalensis MUCL 39090；S.theobromae MUCL 39293；和S.Bisbyi、柱孢葡萄穗霉、S.Dichroa、S.Oenanthes、S.Nilagerica菌種的菌株。
本發(fā)明提供了基本生物純的葡萄穗霉屬的新型菌株培養(yǎng)物，特別是從中能夠純化出酚氧化酶的菌株Stachybotrys parvispora MUCL 38996和Stachybotrys chartarum MUCL 38898的基本生物純的培養(yǎng)物。純化本發(fā)明的酚氧化酶可以通過(guò)在有氧的條件下在含有可同化碳源和氮源與其它必需營(yíng)養(yǎng)成分的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生酚氧化酶的葡萄穗霉菌株(如S.parvispora MUCL 38996，S.chartarum MUCL 38898)來(lái)制備。所述培養(yǎng)基可以按照本技術(shù)領(lǐng)域已知的原則來(lái)配制。
在培養(yǎng)過(guò)程中，所述產(chǎn)生酚氧化酶的菌株將酚氧化酶分泌到胞外。這樣可以通過(guò)例如從培養(yǎng)液中分離細(xì)胞物質(zhì)(例如通過(guò)過(guò)濾或離心)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)所述酚氧化酶的分離和純化(回收)。得到的不含細(xì)胞的培養(yǎng)液可以就這樣使用，或者如果需要，可以先進(jìn)行濃縮(例如，通過(guò)蒸發(fā)或超濾)。如果需要，所述酚氧化酶可以從所述不含細(xì)胞的培養(yǎng)液中分離出來(lái)并通過(guò)常規(guī)方法，例如通過(guò)柱層析被純化到所需的純度。
通過(guò)濃縮所述宿主培養(yǎng)物的上清液以及隨后通過(guò)硫酸銨分離和凝膠滲透色譜可以從培養(yǎng)液中分離和純化出本發(fā)明的酚氧化酶，其中酚氧化酶被胞外分泌到所述培養(yǎng)液中。
本發(fā)明的酚氧化酶可以根據(jù)所要進(jìn)行的應(yīng)用來(lái)配制和使用。在這方面，如果被用于洗滌劑組合物，利用美國(guó)專利U.S.4,689,297中記載的方法可以從發(fā)酵液中直接配制所述酚氧化酶的涂層固體。而且，如果需要，所述酚氧化酶可以通過(guò)適當(dāng)?shù)妮d體被配制成液體形式。如果需要，所述酚氧化酶也可以被固定化。
本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的葡萄穗霉酚氧化酶的表達(dá)載體和重組細(xì)胞以及所述重組宿主細(xì)胞中的酚氧化酶的隨后純化。酶組合物本發(fā)明的酚氧化酶可以被用來(lái)制備例如用于洗滌或清潔組合物；用于在處理、加工、整理、拋光過(guò)程中的紡織品或纖維生產(chǎn)；用于紙和紙漿的生產(chǎn)；和用于淀粉加工應(yīng)用中的酶組合物。酶組合物也可以含有其它組分，該組分例如被用于配制或作為效能增強(qiáng)子。
例如，洗滌組合物除了所述酚氧化酶還可以含有常規(guī)的洗滌劑成分如表面活性劑、助洗劑和其它酶如蛋白酶、淀粉酶、脂酶、角質(zhì)素酶、纖維素酶或過(guò)氧化物酶。其它成分包括增強(qiáng)子、穩(wěn)定劑、殺菌劑、光學(xué)增白劑和香料。所述酶組合物可以是任何適當(dāng)?shù)奈锢硇问?，諸如一種粉末、含水或不含水的液體、一種糊狀物或凝膠。
本發(fā)明的酚氧化酶就描述至此，提供下列的實(shí)施例只是說(shuō)明性質(zhì)的，而不是也不應(yīng)該被理解為是限制性質(zhì)的。除非另有說(shuō)明，本文中以百分比形式表示的稀釋度、數(shù)量等的百分?jǐn)?shù)是每單位體積的重量百分?jǐn)?shù)(w/v)。如本文所使用的以％(v/v)形式表示的稀釋度、數(shù)量等是指每單位的體積百分?jǐn)?shù)。本文中的溫度是攝氏溫度(C)。實(shí)施本發(fā)明的方式和方法通過(guò)參考下列實(shí)施例可以被本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員更加充分理解，所述實(shí)施例并不意味著以任何方式限制本發(fā)明或附在其后的權(quán)利要求的范圍。本文所參照的所有參考文獻(xiàn)和專利出版物被引進(jìn)本文作為參考。實(shí)施例1純化該實(shí)施例闡明了具有圖2所示氨基酸序列的Stachybotryschartarum酚氧化酶的純化。
在PAD平板(Difco)上將Stachybotrys chartarum培養(yǎng)大約5-10天。一部分平板培養(yǎng)物(大約3/4×3/4英寸)被用來(lái)接種裝在500ml搖瓶中的100ml的PDB(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液)。該搖瓶在26-28℃和150rpm的條件下溫育3-5天一直到達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
然后將所述液體培養(yǎng)物接種到裝在2.8L搖瓶中的1L的PDB中。該搖瓶在26-28℃和150rpm的條件下溫育2-4天一直達(dá)到良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
準(zhǔn)備一個(gè)含有生產(chǎn)培養(yǎng)基(含有g(shù)/L的下列組分葡萄糖15；卵磷脂1.51；叔-烏頭酸1.73；KH2PO43；MgSO4.7H2O 0.8；CaCl2.2H2O 0.1；酒石酸銨1.2；大豆蛋白胨5；Staley 7359；芐醇1；吐溫20 1；氨三乙酸0.15；MnSO4.7H2O 0.05；NaCl 0.1；FeSO4.7H2O 0.01；CoSO40.01；CaCl2.2H2O 0.01；ZnSO4.7H2O O.01；CuSO40.001；ALK(SO4)2.12H2O0.001；H3BO30.001；NaMoO4.2H2O 0.001)的10L發(fā)酵罐。然后用1L液體培養(yǎng)物接種所述發(fā)酵罐，在28℃下，以5.0L/分鐘的恒定速率通入空氣并以120RPM的恒定的轉(zhuǎn)速攪拌來(lái)進(jìn)行60個(gè)小時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)。pH維持在6.0。
通過(guò)離心從發(fā)酵培養(yǎng)液中除去1L液體中細(xì)胞并且通過(guò)DE過(guò)濾器進(jìn)一步澄清上清液。通過(guò)利用Amicon YM10膜和4個(gè)體積的含20mM MOPS的緩沖液進(jìn)行膜滲濾以便除去低分子量的鹽。
采用裝有25ml的Poros HQ-20樹脂的離子交換柱純化所述酶。該柱首先用5個(gè)柱體積(125ml)的20 mM MOPS pH 7.0來(lái)進(jìn)行平衡。將5ml含有5-10mg的總蛋白的樣品加載到所述柱上。然后用3個(gè)柱體積的MOPS緩沖液沖洗，再用一個(gè)體積的250ml中的0-0.5M的梯度硫酸銨進(jìn)行洗脫。所述流速是10ml/分鐘。以5ml的體積收集餾分。采用ABTS方法分析每一餾分中的酚氧化酶活性。對(duì)具有ABTS活性的所述餾分在SDS PAGE凝膠上跑電泳。切下凝膠上對(duì)應(yīng)ABTS活性的帶并測(cè)定其氨基酸序列。
下面的數(shù)據(jù)來(lái)自另一輪的純化并且表明在SDS PAGE凝膠上存在葡萄穗霉屬氧化酶B。在該純化過(guò)程中，發(fā)酵的粗產(chǎn)物采用利用HQ20的離子交換柱進(jìn)行純化。在4-20％的Tris-甘氨酸凝膠上對(duì)餾分進(jìn)行初步的非變形(天然)凝膠電泳。采用跟蹤染料稀釋樣品并且采用Laemmli緩沖液作為跑膠緩沖液。對(duì)所有感興趣的洗脫峰的餾分采用所述觀察純度的初步凝膠進(jìn)行電泳并對(duì)得到的凝膠進(jìn)行銀染。對(duì)每一相同洗脫峰的其它餾分采用證實(shí)活性蛋白的第二步凝膠進(jìn)行電泳并在pH7和pH10采用ABTS進(jìn)行覆蓋。為了進(jìn)行ABTS覆蓋，在pH7和pH10制備4.5mM ABTS(pH7采用50mM醋酸鈉和pH10采用50mM硼酸鈉)。所述凝膠被分成兩部分來(lái)進(jìn)行覆蓋泳道1-5被pH7覆蓋以及泳道6-10被pH10覆蓋。切下ABTS陽(yáng)性的帶并且用Laemmli緩沖液和含有BME的跟蹤染料進(jìn)行勻質(zhì)化。然后將樣品置于100℃下維持5分鐘后加載到4-20％的Tris-甘氨酸梯度凝膠上。跑膠緩沖液采用具有20％SDS的Laemmli。然后將所述凝膠進(jìn)行銀染。
初步變性凝膠、ABTS覆蓋凝膠和SDS-PAGE凝膠的結(jié)果分別如圖8、9和10所示。實(shí)施例2Stachybotrys chartarum酚氧化酶的氨基酸序列分析將實(shí)施例1中所制備的Stachybotrys chartarum酚氧化酶進(jìn)行SDS聚丙酰胺凝膠電泳并進(jìn)行分離。采用尿素和碘乙酰胺處理分離的成分并用endoLysC酶進(jìn)行消化。通過(guò)endoLysC消化產(chǎn)生的片段采用HPLC(反相單孔(monobore)C18柱，CH3CN梯度)進(jìn)行分離并利用微滴板來(lái)進(jìn)行收集。通過(guò)用于質(zhì)量鑒定的MALDI對(duì)所述餾分進(jìn)行分析并且通過(guò)Edman降解進(jìn)行序列分析。測(cè)定了下列的氨基酸序列并以氨基端到羧基端的方向來(lái)表示N’FVNSGENTSPNSVHLHGSFSR C’(SEQ ID NO5)N’GVEPYEAAGLKDVVWLAR C’ (SEQ ID NO6)實(shí)施例3克隆基因組核酸在實(shí)施例2提供的肽序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)兩個(gè)簡(jiǎn)并引物。引物1具有以下序列GTCAACAGTGGNGARAAYAC以及引物2具有以下序列GCGGCCTCATANGGCTCNAC，其中N代表所有四種核苷酸(A，T，C和G)的混合物，R代表A和G的混合物以及Y代表T和C的混合物。
為了分離編碼酚氧化酶的基因DNA，將從Stachybotrys chartarum(MUCL #38898)中分離到的DNA作為PCR的模板。用Tris-EDTA緩沖液將所述DNA稀釋100倍從而使終濃度達(dá)到88 ng/ul。將10微升的稀釋DNA加到一個(gè)eppendorf管中的總體積為100微升的反應(yīng)混合物中，該反應(yīng)混合物含有0.2mM的各種核苷酸(A，G.C和T)、1×反應(yīng)緩沖液，0.542微克的引物1和0.62微克的引物2。在100℃下將所述混合物加熱5分鐘后，將2.5單位的Taq DNA聚合酶加到所述反應(yīng)混合物中。PCR反應(yīng)在95℃下進(jìn)行1分鐘，所述引物在50℃下退火1分鐘連接到所述模板上并且在72℃下延伸1分鐘。這樣的循環(huán)反應(yīng)重復(fù)30次后再在68℃下進(jìn)行一次7分鐘的延伸反應(yīng)。通過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)到的PCR片段含有一個(gè)大約1.3千對(duì)堿基的片段，然后將該1.3千對(duì)堿基的片段克隆到質(zhì)粒載體pCR-II(Invitrogen)中。然后對(duì)所述1.3kb的插入片段進(jìn)行核酸測(cè)序。由于推導(dǎo)出的肽序列與實(shí)施例2中記載的通過(guò)Edman降解測(cè)序的肽序列相匹配，所以測(cè)得的序列數(shù)據(jù)表明所述片段是編碼Stachybotryschartarum酚氧化酶B的基因。然后采用反向PCR方法分離含有5’基因和3’基因的PCR片段，所述反向PCR方法采用了在1.3 kb PCR片段的序列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上推導(dǎo)出的4個(gè)引物。圖3提供了含有啟動(dòng)子和終止子的葡萄穗霉屬酚氧化酶B基因(spoB)的全長(zhǎng)基因組序列(SEQ ID NO3)。實(shí)施例4Stachybotrys chartarum酚氧化酶B與其它氧化酶的比較翻譯的蛋白序列(如2所示)(SEQ ID NO2)被用作查詢檢索DNA和蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫(kù)。結(jié)果表明葡萄穗霉屬氧化酶B的蛋白序列與膽紅素氧化酶的蛋白序列具有67％的相同性。圖4表示通過(guò)GCG軟件的GAP程序(University Research Park，Madison Wis.)測(cè)定的兩種蛋白質(zhì)的序列排列，該程序具有下列參數(shù)間距權(quán)重＝12；長(zhǎng)度權(quán)重＝4；間距創(chuàng)建罰值＝8；和間距延伸罰值＝2。實(shí)施例5葡萄穗霉氧化酶B在黑色曲霉變種.泡盛曲霉中的表達(dá)通過(guò)PCR分離在側(cè)翼上具有兩個(gè)新引進(jìn)的限制酶切位點(diǎn)(BamHI和AgeI)且含有編碼葡萄穗霉屬酚氧化酶B的核酸的DNA片段。該P(yáng)CR片段首先被克隆到質(zhì)粒載體pCR-II上并且通過(guò)核酸測(cè)序來(lái)證實(shí)所述的基因序列(
圖1)。然后將該DNA片段克隆到載體(pGAPT2)的Bgl II至Age I位點(diǎn)之間以便構(gòu)建一個(gè)質(zhì)粒pGAPT2-spoB，參見(jiàn)圖5。所述表達(dá)質(zhì)粒被命名為pGAPT2-spoB(圖5)，該質(zhì)粒能被整合到所述的宿主基因組中。除了插入溝巢曲酶基因組DNA片段AMA1序列(分子微生物學(xué)199619565-574)的5259 bp HindIII片段外，將側(cè)翼上具有兩個(gè)新引進(jìn)的限制酶切位點(diǎn)(BamHI和AgeI)且含有編碼葡萄穗霉屬酚氧化酶的核酸的DNA片段也克隆到與質(zhì)粒pGAPT2相同的質(zhì)粒pRAX1中。該表達(dá)質(zhì)粒被命名為pRAX1-spoB(圖6)，該表達(dá)質(zhì)粒能被維持作為一個(gè)復(fù)制質(zhì)粒，然后利用標(biāo)準(zhǔn)的PEG方法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到曲霉菌株GCAP4(基因1990，86153-162)中。在不含尿苷的平板上選擇轉(zhuǎn)化體。將三個(gè)轉(zhuǎn)化體在尿苷平板上培養(yǎng)3天。采用0.01％tween80將由所述轉(zhuǎn)化體長(zhǎng)出的孢子重新懸浮在水中。將所述孢子(100,1000或10,000)加到含有160 ul的PROC培養(yǎng)基的96孔微滴板中。在30℃下培養(yǎng)5天后，結(jié)果表明這些樣品具有ABTS活性。將1000個(gè)所述孢子加到250ml搖瓶中的50ml PROC培養(yǎng)基中，然后在30℃下培養(yǎng)3天，ABTS活性是0.33單位/ml。在30℃下培養(yǎng)4天后，ABTS活性是4.8單位/ml。大約1.2×106個(gè)孢子也被加到2.8升搖瓶中的1升PROC培養(yǎng)基中。葡萄穗霉屬酚氧化酶B蛋白的產(chǎn)生在第3天達(dá)到1單位/ml和在第4天達(dá)到4單位/ml并且所述活性是利用ABTS分析方法測(cè)得的。實(shí)施例6酚氧化酶在Trichoderma reesei中的表達(dá)在轉(zhuǎn)化Trichoderma reesei中使用的表達(dá)質(zhì)粒是按照下述方法構(gòu)建的。圖5所示的含有編碼葡萄穗霉屬酚氧化酶B基因的BamHI至AgeI片段的末端被T4 DNA聚合酶鈍化后被插到木霉表達(dá)載體pTREX的Pmel限制位點(diǎn)，該載體是PCT出版物WO 96/23928(該文獻(xiàn)并入本文參考)中記載的pTEX的修飾變型，該載體含有用于基因表達(dá)的CBH1啟動(dòng)子和終止子和一個(gè)作為轉(zhuǎn)化選擇標(biāo)記的木霉pyr4基因。從凝膠中分離僅含CBH1啟動(dòng)子、酚氧化酶基因(spoB)、CBH1終止子和選擇標(biāo)記pyr4的線性DNA片段并將該片段用來(lái)轉(zhuǎn)化尿苷營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株Trichoderma reesei(參見(jiàn)美國(guó)專利US 5,472,864)，該菌株缺失了4個(gè)主要的纖維素酶基因。在不合尿苷的木霉最小平板上分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。所述轉(zhuǎn)化體在搖瓶中的50ml Proflo培養(yǎng)基中于28℃至30℃下培養(yǎng)4天并且通過(guò)實(shí)施例8中記載的ABTS分析所述酚氧化酶B的表達(dá)。Proflo培養(yǎng)基由下列成分(g/l)組成Proflo 22.5；乳糖30.0；(NH4)2SO46.5；KH2PO42.0；MgSO47H2O0.3；CaCl20.2；CaCO30.72；痕量金屬原液1.0 ml/l和10％Tween80 2.0ml/l。所使用的痕量金屬原液含有(g/l)FeSO4.7H2O 5.0；MnSO4.H2O 1.6；ZnSO4.7H2O 1.4；CoCl2.6H2O 2.8。實(shí)施例7葡萄穗霉酚氧化酶B的純化從搖瓶中取出按照實(shí)施例5中記載的方法獲得的葡萄穗霉屬酚氧化酶B培養(yǎng)液，冷卻到4℃并在Sorval離心機(jī)中利用GSA轉(zhuǎn)頭以10500rpm離心15分鐘。然后將得到的上清液從沉淀中取出并利用從MilliporeCorporation得到的TFF固定器和柱體UF(6 ft^2 PTGC 10K聚醚砜Cat.#CDUF006TG)將所述上清液超濾濃縮6-10倍。通過(guò)膜滲透用4個(gè)體積的蒸餾(Di)水沖洗所述濃縮物，得到的回收率在40-80％之間。將所述物質(zhì)再次離心除去固體并通過(guò)0.45μ的濾器進(jìn)行過(guò)濾。然后采用陰離子交換柱層析進(jìn)一步純化含有濾出液的酶。在此過(guò)程中，用pH6.9、50mM的磷酸鉀緩沖液平衡Q-Sepharose陰離子交換柱。用pH6.9、20mM的磷酸鉀緩沖液將濃縮物(上述酶混合物)稀釋成1至4份(總共5份)并以120ml/分鐘加載到柱上。用含有300mM NaCl的pH6.9的20mM磷酸鉀緩沖液洗脫主要的雜質(zhì)。接著用含有500mM NaCl的緩沖液以120 ml/分鐘的流速洗脫所述柱子。然后分別收集各個(gè)餾分。將酚氧化酶活性最高的各個(gè)餾分合并在一起，利用帶有YM10膜的Amicon濃縮器進(jìn)行濃縮并滲透到milli-Q中。
然后按照實(shí)施例8中記載的內(nèi)容，利用基于ABTS氧化的標(biāo)準(zhǔn)分析方法測(cè)定酚氧化酶活性。如此測(cè)得的酶活性在pH5下是61.4U/ml和在pH9下是6.1U/mL。實(shí)施例8ABTS分析下列實(shí)施例描述了用于酚氧化活性測(cè)定的ABTS分析。所述ABTS分析是一種分光光度活性分析，該分析使用了下列試劑分析緩沖液＝50mM醋酸鈉，pH5.0；50mM磷酸鈉，pH7.0；50mM碳酸鈉，pH9.0。所述ABTS(2，2’-連氮基雙3乙苯噻唑啉-6-磺酸)是一種4.5mM的蒸餾水溶液。將0.75ml分析緩沖液和0.1ml ABTS底物溶液混合后加到比色杯中。將一個(gè)含有緩沖液-ABTS溶液用作空白對(duì)照。加入0.05ml酶樣品快速混合并加到含有緩沖液-ABTS溶液的比色杯中。30℃下15分鐘(對(duì)于活性比＜0.1的樣品視再長(zhǎng)些)內(nèi)測(cè)得的420nm下的吸光度變化率為ΔOD 420/分鐘。用分析緩沖液將具有高活性比的酶樣品稀釋到0.1至1的濃度。實(shí)施例9番茄污跡的漂白該實(shí)施例說(shuō)明具有圖2所示序列的葡萄穗霉屬酚氧化酶在減輕番茄污跡顏色中的用途。
在250ml容器中進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)，將15ml的沖洗液加到該容器(如表中所示)中。沖洗液的pH被調(diào)到pH9。將來(lái)源于葡萄穗霉屬菌種的純酚氧化酶以6mg/l加到?jīng)_洗液中。吩噻嗪-10-丙酸鹽(PTP)被用作增強(qiáng)子，濃度為250mM。下列組成被用作沖洗液(2g/L)洗滌劑組合物L(fēng)AS 24％STP 14.5％蘇打 灰分17.5％硅酸鹽 8.0％SCMC 0.37％藍(lán)色顏料 0.02％含水量/鹽 34.6％在30℃下將所述樣品沖洗30分鐘。沖洗后，采用滾筒式干燥機(jī)將所述樣品干燥并利用Minolta分光計(jì)測(cè)定反射光譜。沖洗前和沖洗后樣品間的顏色差異數(shù)據(jù)被表示為CIELAB L*a*b*顏色間隔。在該顏色間隔中，L*表示亮度，a*和b*表示色度坐標(biāo)。樣品間的顏色差異被表示為ΔE，ΔE通過(guò)下面的公式計(jì)算ΔE=ΔL2+Δa2+Δb2]]>作為ΔE值的結(jié)果如下面的表1所示
由ΔE值可以看出，在有所述酶/增強(qiáng)子體系存在的條件下番茄污跡的漂白得到了改善。
權(quán)利要求
1.一種酚氧化酶，其與具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的酚氧化酶具有至少68％的相同性。
2.如權(quán)利要求1所述的酚氧化酶，其中所述酶獲自于一種包括S.Parvispora，S.Chartarum，S.Kampalensis，S.Theobromae，S.Bisbyi，S.Cylindrospora，S.Dichroa，S.Oenanthes和S.nilagerica在內(nèi)的葡萄穗霉屬的菌種。
3.如權(quán)利要求1所述的酚氧化酶，其具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
4.一種分離的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO2所示序列的氨基酸。
5.如權(quán)利要求4所述的分離的多核苷酸，其與SEQ ID NO1或SEQ IDNO3所示核酸序列具有至少65％的相同性。
6.如權(quán)利要求5所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1所示的核酸序列。
7.如權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸，其具有SEQ ID NO3所示的核酸序列。
8.一種分離的多核苷酸，其能夠與具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示序列的多核苷酸在高嚴(yán)緊度條件下進(jìn)行雜交。
9.一種含有權(quán)利要求4所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
10.一種含有權(quán)利要求5所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
11.一種含有權(quán)利要求8所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
12.一種含有權(quán)利要求9、10或11所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求12所述的宿主細(xì)胞，其為一種絲狀真菌。
14.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中所述絲狀真菌包括曲霉屬的菌種、木霉屬的菌種和白霉屬的菌種。
15.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其為一種酵母菌。
16.如權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其中所述酵母菌包括糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、裂殖糖酵母屬、漢遜氏酵母屬、克魯維氏酵母屬和Yarrowia的菌種。
17.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其為一種細(xì)菌。
18.如權(quán)利要求17所述的宿主細(xì)胞，其中所述的細(xì)菌包括桿菌屬和埃希氏菌屬的菌種。
19.一種在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)酚氧化酶的方法，其包括步驟(a)在適于產(chǎn)生所述酚氧化酶的條件下培養(yǎng)含有一種編碼所述酚氧化酶的多核苷酸的宿主細(xì)胞，其中所述酶與SEQ ID NO2所示的氨基酸序列具有至少68％的相同性；和(b)任選地回收所生產(chǎn)的酚氧化酶。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述酚氧化酶獲自于一種包括S.Parvispora，S.Chartarum，S.Kampalensis，S.Theobromae，S.Bisbyi，S.Cylindrospora，S.Dichroa，S.Oenanthes和S.nilagerica在內(nèi)的葡萄穗霉屬的菌種。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述酚氧化酶獲自于S.Chartarum并且具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的序列。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中宿主細(xì)胞包括絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述酵母菌包括糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、裂殖糖酵母屬、漢遜氏酵母屬、克魯維氏酵母屬和Yarrowia的菌種。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述絲狀真菌包括曲霉屬的菌種、木霉屬的菌種和白霉屬的菌種。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述絲狀真菌是曲霉屬的菌種。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述絲狀真菌是黑色曲霉變種泡盛曲霉。
28.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述絲狀真菌是一種木霉屬的菌種。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述木霉屬菌種是Trichodermareseei。
30.一種制備含有編碼酚氧化酶的多核苷酸的宿主細(xì)胞的方法，該方法包括步驟(a)獲得一種編碼所述酚氧化酶的多核苷酸，該酚氧化酶與SEQ IDNO2所示氨基酸序列具有至少68％的相同性；(b)將所述多核苷酸引進(jìn)所述宿主細(xì)胞；和(c)在適于產(chǎn)生所述酚氧化酶的條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的宿主細(xì)胞包括絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述絲狀真菌包括曲霉屬的菌種、木霉屬的菌種和白霉屬的菌種。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述絲狀真菌是黑色曲霉變種.泡盛曲霉。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述木霉屬菌種是Trichodermareseei。
35.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述酵母菌是糖酵母屬的菌種。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述糖酵母屬的菌種是啤酒糖酵母。
37.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸與SEQ ID NO1或SEQ ID NO3所示的核酸具有至少65％的相同性。
38.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸具有SEQ IDNO1或SEQ ID NO3所示的核酸序列。
39.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸被引到一個(gè)復(fù)制質(zhì)粒上。
40.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述多核苷酸被整合到宿主細(xì)胞的基因組中。
41.一種含有權(quán)利要求1所述的酚氧化酶的酶組合物。
42.如權(quán)利要求41所述的酶組合物，其含有具有SEQ ID NO2所示序列的酚氧化酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了由葡萄穗霉屬菌種的菌株天然產(chǎn)生的新型酚氧化酶，該酶具有堿性范圍內(nèi)的pH最適值并且被用于減輕與染料和染色化合物有關(guān)的顏色，以及被用于防止染料轉(zhuǎn)移的應(yīng)用中。本發(fā)明還公開了葡萄穗霉屬的菌株的生物純培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物在本發(fā)明中指的是能夠天然產(chǎn)生新型酚氧化酶的Stachybotrys parvispora MUCL 38996和Stachybotrys chartarum MUCL 38898。本發(fā)明公開了葡萄穗霉屬酚氧化酶B的氨基酸和核酸序列以及含有該核酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明公開了制備所述酚氧化酶的方法以及構(gòu)建表達(dá)宿主的方法。
文檔編號(hào)C12R1/685GK1391611SQ00814209
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2000年9月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月22日
發(fā)明者王華明 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司