專利名稱：多肽和含有重組病毒載體的核酸搬運體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因治療中使用的，含有重組病毒載體的核酸搬運體。
背景技術(shù)：
在基因治療的臨床應(yīng)用中，為了有效、安全的將藥物基因?qū)氚屑?xì)胞中，開發(fā)研制最適宜的基因形態(tài)和方法已成為重大技術(shù)課題之一。
1980年初期，試應(yīng)用了微型注入器等物理方法，還不能為疾病治療，安全有效地導(dǎo)入新需要的藥物基因，更沒有臨床應(yīng)用。后來，為有效地將藥物基因?qū)爰?xì)胞，開發(fā)了形成載體的重組病毒載體，一開始就能將基因治療應(yīng)用于臨床。在美國，直到1998年4月由NIH重組DNA委員會(RAC)承認(rèn)了212基因治療協(xié)議書，將先天性免疫不全癥、家族性高膽固醇血癥、囊胞性纖維癥等遺傳性疾病和各種癌癥作為對象，已對2000名以上患者進(jìn)行了臨床試驗(Hum.Gene Therapy，92143-2161，1998)。
使用現(xiàn)在臨床中使用的重組病毒載體，不可能將藥物基因?qū)胨械陌屑?xì)胞中。為此，例如進(jìn)行了如下治療法(US5399346)(exvivo基因?qū)敕?，即在將血液細(xì)胞作為對象的治療法中，從生物體中一次分離出靶血液細(xì)胞，在試管內(nèi)進(jìn)行基因?qū)牒螅俜祷氐缴矬w內(nèi)。然而，使用這種方法，仍存在基因?qū)胄实?Dunbar，C.E.，等人，Blood 85，3048-3057，1995)，需要數(shù)次基因?qū)胱鳂I(yè)，必然產(chǎn)生基因?qū)胄驶膯栴}。
另一方面，作為提高這種重組病毒載體的基因?qū)胄实姆椒ǎM(jìn)行如下嘗試，即，將可與病毒載體形成復(fù)合體的物質(zhì)與病毒相互作用，可有效將基因?qū)肽康募?xì)胞內(nèi)。作為實例，有將1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(Morgan，J.R.，等人，Biotechnol Prog.，10，441-446，1994)、聚乙烯亞胺(Meunier-Durmort C.，等人，Gene Therapy，4，808-814，1997)、陽離子性核蛋白體(Hodgson C.P.，和Solaiman F.，Nature Biotechnol.，14，339-342，1996)、合成多氨基酸(Curiel D.T.，等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，88，8850-8854，1991)等與病毒載體形成復(fù)合體，用作載體的方法。
然而，由于1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物、聚乙烯亞胺是生物體中不存在的物質(zhì)，難以向生物體內(nèi)給藥。關(guān)于陽離子性核蛋白體，據(jù)報導(dǎo)由調(diào)制核蛋白體時的組成形成很高的毒性(YagiK.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.196，1042-1048，1993)，所以必須注意。再有合成聚氨基酸，特別是聚賴氨酸，當(dāng)增加濃度時很容易產(chǎn)生沉淀，實際上對疾病治療難以使用。當(dāng)將含有產(chǎn)生沉淀粒子的藥液注入到靜脈內(nèi)時，很容易引起血管的栓塞和血栓等問題，即使局部注射，也存在注射針堵塞的問題，為對靶細(xì)胞進(jìn)行治療不能導(dǎo)入所需量基因等問題。
發(fā)明公開本發(fā)明的目的是為有效且安全地將藥物基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)而提供一種核酸搬運體。
本發(fā)明者為解決上述課題，經(jīng)過深入研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用含有由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許的鹽形成的多肽，和重組病毒載體的核酸搬運體，可有效、安全地將藥物基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，并至此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供了含有由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許的鹽形成的多肽，和重組病毒載體的核酸搬運體。
本發(fā)明提供的上述核酸搬運體，其特征是含有嵌段共聚物，而該嵌段共聚物由多肽和聚乙二醇形成，而所說的多肽是由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許的鹽所形成。
進(jìn)而，本發(fā)明提供的上述核酸搬運體，其特征是上述多肽是由殘基數(shù)為20～280的二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許的鹽所形成。
本發(fā)明提供的上述任何核酸搬運體，其特征是上述重組病毒載體含有藥物基因。
本發(fā)明提供的上述任何核酸搬運體，其特征是上述重組病毒載體是HIV載體。
再有，本發(fā)明提供的上述核酸搬運體，其特征是上述HIV載體是與VSV-G的假型HIV載體。
進(jìn)而根據(jù)本發(fā)明提供一種重組病毒載體的基因?qū)胄矢倪M(jìn)劑，以二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽作為有效成分。


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圖1是本發(fā)明的二氨基丁酸和其藥學(xué)上允許鹽的合成過程的一例示意圖。
圖2是構(gòu)成本發(fā)明重組病毒載體的輔助質(zhì)粒pCMV-R8.2構(gòu)造的模式圖。
圖3是構(gòu)成本發(fā)明重組病毒載體的供給VSV-G用質(zhì)粒pMD.G構(gòu)造的模式圖。
圖4是構(gòu)成本發(fā)明重組病毒載體的載體質(zhì)粒pHXCAGEGEP構(gòu)造的模式圖。
圖5是本發(fā)明的核酸搬運體的利用GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體導(dǎo)入EGFP基因的結(jié)果示意圖。
圖6是本發(fā)明的核酸搬運體的GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體的穩(wěn)定性試驗結(jié)果示意圖。
實施發(fā)明的最佳形態(tài)以下對本發(fā)明構(gòu)成和最好實施形態(tài)進(jìn)行詳細(xì)說明。
(由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽)本發(fā)明的由二氨基丁酸形成的多肽是具有以式(1)表示的(其中n為自然數(shù))構(gòu)造。但也可含有其他任意的單體單元。 本發(fā)明的由藥學(xué)上允許的二氨基丁酸鹽形成的多肽是具有以式(2)表示的(其中n為自然數(shù))構(gòu)造，但也可以含有其他任意的單體單元。 本說明書中使用的所謂「由二氨基和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽」也可以是具有以任意比率含上述2種構(gòu)造的構(gòu)造。即，也包括以任意比率，以聚二氨基丁酸、或其藥學(xué)上允許鹽形成存在的。
在上述二氨基丁酸中可存在光學(xué)異性體的D體和L體，但本發(fā)明的由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽，是含有D體、或L體、或二種任意混合的多肽、即，含有聚-L-二氨基丁酸、聚-D＝二氨基丁酸、和聚-DL-二氨基丁酸中任何一種的多肽。本說明書中使用的所謂「由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形的多肽的殘基」是指形成該多肽的單體的二氨基丁酸(或其藥學(xué)上允許的鹽)基，其殘基數(shù)是指這些分子的數(shù)(即，上述式中的n表示的)。本發(fā)明的由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽的最佳殘基數(shù)，至少在10個以上，更好在20個以上，最好在25個以上。本發(fā)明的由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽的最佳殘基數(shù)，更好在280個以下，最好在250個以下。殘基數(shù)太多時，難以合成，處理也不方便。而太少時，作為核酸搬運體，其性能不充分。最佳的殘基數(shù)，可根據(jù)所用重組病毒載體，從同時使用所得成分的性質(zhì)等進(jìn)行適當(dāng)選擇。
藥學(xué)上允許的二氨基丁酸鹽，在將本發(fā)明的核酸搬運體給藥對象時，不能呈現(xiàn)毒性，或者呈現(xiàn)允許程度毒性的鹽類，對此沒有特殊限定。好的有鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機(jī)酸鹽、醋酸、丙酸、檸檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、丙二酸、富馬酸、蘋果酸等有機(jī)酸鹽，這些中特別好的是醋酸鹽。
若將由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽形成二氨基丁酸·醋酸鹽，由于二氨基丁酸·醋酸鹽的分子量為160，所以上述的殘基數(shù)也可以用分子量表示。
本發(fā)明的由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽(以下也稱作「本發(fā)明的多肽」)另一實例，包括使上述說明的由二氨基丁酸形成的多肽進(jìn)一步與聚乙二醇結(jié)合的具有嵌段共聚物構(gòu)造的，并以式(3)表示(其中、m、n分別為自然數(shù))。 上述多肽由于具有1個羧酸基，對于具有上述塊述共聚物構(gòu)造的，也可以是以式(4)表示的(其中，m、n、n′分別為自然數(shù))。 此處關(guān)于乙二醇的分子量(或數(shù)m)沒有特殊限制，但從下述理由，通常最好是200～25000。
作為本發(fā)明的一種實施形態(tài)，也可以將組織特異的配位體與本發(fā)明的多肽結(jié)合。含有這種多肽的本發(fā)明核酸搬運體，對于組織特異的核配位體能很有效地進(jìn)入特異特定組織內(nèi)。例如，將肝臟作為靶時，將糖類(半乳糖、乳糖、酸異式糖蛋白、貧半乳糖、透明質(zhì)酸等)與本發(fā)明的多肽結(jié)合時，可提高對肝臟的親和性，可更有效地將本發(fā)明的核酸搬運體送達(dá)到肝臟。
將減輕細(xì)胞毒性、血中滯留、提高向溶劑的溶解性作為目的，作為本發(fā)明的多肽采用以式(3)或式(4)表示的、二氨基丁酸和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物最好。這種情況，使用PEG的分子量在200以上為理想的，更好使用1000以上的。PEG的分子量在2500以下是理想的，但更好在10000以下，最好在5000以下。PEG的分子量在25000以上時，由于和細(xì)胞表面的親和性降低，而引起導(dǎo)入核酸(基因)效率的降低，在200以下時，作為目的，由PEG產(chǎn)生的效果很小，不理想。
(本發(fā)明的多肽合成方法)將具有上述說明的構(gòu)造作為特征，關(guān)于本發(fā)明的多肽合成方法，沒有特殊限制。最好使用包括通常公知的各種多肽合成方法(新實驗化學(xué)講座19高分子化學(xué)I1980年發(fā)行、丸善株式會社)在內(nèi)的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)。
更具體講，本發(fā)明中，最好是通過適當(dāng)反應(yīng)將單體成分進(jìn)行聚合獲得。這時，作為使用的單體，最好使用二氨基丁酸、在γ氨基上導(dǎo)入保護(hù)基的二氨基丁酸、或者，為形成肽基而具有活性化氨基和/或羧酸基的二氨基丁酸。本發(fā)明中，為了保護(hù)γ氨基、而且易于結(jié)合形成肽，最好將二氨基丁酸形成酸酐化(新實驗化學(xué)講座19高分子化學(xué)I1980年發(fā)行、丸善株式會社)。
在聚合這種單體時，可使用各種類型的適量引發(fā)劑。具體講可使用各種胺化合物、醇化合物。對于上述胺化合物，有烷基胺類、最好是丁胺。作為醇類，使用聚乙二醇類時、可得到附加有聚乙二醇基的本發(fā)明多肽(即，由二氨基丁酸和聚乙二醇的嵌段共聚物形成)。
圖1中示出了在本發(fā)明多肽的合成中，最好的合成過程。即，使用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)γ氨基，而且用光氣將將部分氨基酸形成酸酐，最好用作縮聚單體(圖1的(10))。使用這種單體，，縮合反應(yīng)可使用適當(dāng)?shù)囊l(fā)劑，可導(dǎo)入最佳數(shù)的單體數(shù)。對于引發(fā)劑沒有特殊限制，較好使用各種胺化合物，更好使用丁胺。通過將適當(dāng)?shù)囊叶碱愑糜谝l(fā)劑，同樣是具有最佳數(shù)單體的多肽，而且能獲得具有乙二醇基的嵌段共聚物。
具體講，按照Helv.Chlm.Acta，43，270-279(1960)或「新實驗化學(xué)講座19高分子化學(xué)I1980年發(fā)行、丸善株式會社」中記載的方法，或者作為基準(zhǔn)進(jìn)行。
(本發(fā)明的多肽檢測)本發(fā)明的多肽構(gòu)造是具有上述說明的特征的。因此，根據(jù)這種構(gòu)造上的特征，可以檢測本發(fā)明的由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽。本發(fā)明的多肽本身，或使用它的核酸搬運體，或基因治療用組合物，以各種使用形態(tài)使用時，通過實施適當(dāng)?shù)那疤幚恚瑯涌蓹z測本發(fā)明的多肽。本領(lǐng)域人員很容易選擇必要的前處理。
關(guān)于檢測方法沒有特殊限制，可使用公知的各種多肽分析方法(Young H.C.，等人J.Controlled Release，54，39-48，1998)。具體講，可以使用肽的氨基酸分析方法對二氨基丁酸的定性和定量分析、使用各種液相色譜測定分子量以確定殘基數(shù)，檢測聚乙二醇基存在的光譜分析(紅外線吸收光譜、核磁共振吸收光譜)、質(zhì)量分析、或化學(xué)的定性分析方法。
(重組病毒載體)本發(fā)明的重組病毒載體，可以DNA或RNA病毒為基礎(chǔ)制作，并不限于來自這些的病毒種，也可以是MoMLV載體、皰疹病毒載體、腺病毒載體、AAV載體、HIV載體、仙臺病毒載體等任何病毒載體。如果具有病毒治療效果，具有人類以外的宿主域病毒也可以用作病毒載體。
作為本發(fā)明的重組病毒載體，最好使用HIV載體，將導(dǎo)入了HIV載體的核酸植入染色體內(nèi)，可在長時間內(nèi)發(fā)現(xiàn)該核酸的藥物基因。HIV載體可以是向細(xì)胞表面分子的CD4陽性T細(xì)胞有選擇地導(dǎo)入基因。HIV載體在沒有細(xì)胞分裂的靜止期內(nèi)，也能植入染色體內(nèi)，所以若使用下述的假型HIV病毒載體，可在骨髓干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等靜止期內(nèi)，向任何一種細(xì)胞可有效地導(dǎo)入藥物基因。
將病毒載體的構(gòu)成蛋白質(zhì)群中的一個置換成異種病毒的構(gòu)成蛋白質(zhì)的或者，將構(gòu)成基因信息的核酸配列中的一部分置換成異種病毒的核酸配列的，假型病毒載體也可用作本發(fā)明的重組病毒載體。例如，有將HIV外皮蛋白質(zhì)的EnV蛋白質(zhì)置換成小水痘性口內(nèi)炎病毒(Vesicular stomatitisvirusVSV)的外皮蛋白質(zhì)的VSV-G蛋白質(zhì)的假型病毒載體(NaldiniL.，等人.，Science272，263-267，1996)。
以下關(guān)于本發(fā)明中使用的重組HIV載體及其制造方法作詳細(xì)說明。
即，調(diào)制含有HIV的gag、pol、env基因的，缺少包裝信號的基因組，通過公知的基因操作方法，將細(xì)胞肥大病毒(CMV)的啟動子配置在其上游的基因構(gòu)筑物，插入到含有與耐氨必西林性基因一起復(fù)制的SV40開始點的表達(dá)載體中，構(gòu)筑成輔助質(zhì)粒(pCMV-R9)。進(jìn)而，利用公知基因操作方法，使pCMV-39的env基因缺損一部分，構(gòu)筑成未表達(dá)EnV蛋白質(zhì)的pCMV-R8.2。上述基因組含有HIV-1、HIV-2、和猿猴免疫不全病毒(SIV)、貓免疫不會病毒(FIV)等，也可以哺乳類的免疫不全病毒基因組配列為基礎(chǔ)構(gòu)筑。輔助質(zhì)粒和表達(dá)VSV-G蛋白質(zhì)的質(zhì)粒pMD.G、進(jìn)而和以下所示載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染成細(xì)胞，可調(diào)制成將VSV-G作為外皮蛋白質(zhì)的假型重組HIV病毒載體。
通過從輔助質(zhì)粒除去包裝信號，可減少確保RCR(Replication competentretrovirus)的出現(xiàn)，通過將Env蛋白質(zhì)置換成VSV-G蛋白質(zhì)，也可以向沒有表達(dá)CD4的細(xì)胞中導(dǎo)入基因(NaldiniL.，等人.，Science 272，263-267，1996)。
進(jìn)而，為了構(gòu)成HIV，除了必須的gag、pol、env基因之外，也可以任意缺損1個或1個以上的vif、vpr、vpu、tat、rev、nef基因，或者與它們相當(dāng)?shù)妮o助基因，以提高安全性。為了發(fā)現(xiàn)HIV基因，所用的啟動子并不僅限于CMV，例如，也可使用CAG、RSV、TK、SV40、SR-α、β-actin、EF1-α等啟動子。
例如，利用皰疹病毒、B型肝炎病毒等病毒性增強(qiáng)蛋白質(zhì)，或NFK-B、SP-1等細(xì)胞性轉(zhuǎn)印活性化蛋白質(zhì)，也可給藥增強(qiáng)啟動子的增強(qiáng)配列，將這些蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染也可制成重組HIV載體。調(diào)制重組HIV載體的細(xì)胞，若是能產(chǎn)生HIV蛋白質(zhì)的細(xì)胞，可使用任何體系的細(xì)胞。較好是哺乳類動物細(xì)胞系，例如，有將CV-1、Hela、Raji、RD、SW480、CHO、COS、293細(xì)胞、SV40large T抗原進(jìn)行變性的293T細(xì)胞等。特別好是COS、293T細(xì)胞，最好是293T細(xì)胞。
包裝在HIV病毒粒子中，隨后，用靶細(xì)胞逆轉(zhuǎn)印，植入染色體，為了發(fā)現(xiàn)藥物基因，所需要的斷片，按如下順序從5′末端到3′末端方向HIV-LTR(Long-Terminal-RepeatsU3、R、U5領(lǐng)域形成)、包裝信號、表達(dá)藥物基因的任意啟動子、藥物基因和HIV-LTR。利用公知的基因操作方法，將配置這些的基因構(gòu)筑物，例如，插入含有與耐氨必西林性基因復(fù)制的SV40開始點的表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)筑成載體質(zhì)粒。因此，上述載體質(zhì)粒以含有HIV-1、HIV-2、和猿猴免疫不全病毒(SIV)、貓免疫不全病毒(FIV)等的哺乳類的免疫不全病毒的基因組排列為基礎(chǔ)構(gòu)筑。
根據(jù)需要，可向藥物基因給藥聚腺苷化信號。對于表達(dá)藥物基因的任意啟動子沒有特殊限定，例如，可以使用CAG、CMV、RSV、TK、SV40、SR-α、MBP、β-actin、EF1-α等啟動子。藥物基因和表達(dá)它的啟動子5′末端的LTR，可以使用將LTR的U3區(qū)域。例如置換成CAG、CMV、RSV、TK、SV40、SR-α、MBP、β-actin、EF1-α等啟動子的嵌合體型LTR。
利用磷酸鈣法、使用各種陽離子性脂質(zhì)的脂轉(zhuǎn)染法、或電穿孔法等公知的方法，將這種構(gòu)筑的質(zhì)粒，例如轉(zhuǎn)染成COS細(xì)胞。
為了有效地制作重組HIV載體，在適宜所用宿主細(xì)胞的溫度下，將感染細(xì)胞培養(yǎng)24～72小時，至少培養(yǎng)48小時以上更好。
排出培養(yǎng)上清液的重組HIV載體，以2000rpm將培養(yǎng)上清液離心10分鐘，或者，使用孔徑為0.45μm的過濾器，除去來自宿主細(xì)胞的夾雜物，調(diào)制成重組HIV載體溶液。進(jìn)而，利用密度梯度離心法，PEG(Polyethylene glycol)沉淀法，或硫酸纖維素柱、親和性柱等柱法，也可除去夾雜物。
(藥物基因)插入本發(fā)明重組病毒載體中的藥物基因、和其他的基因，由各種核酸和/或病毒核心的衍生物形成，它們的種類、分子量、形狀、配列等沒有特殊限制。
例如，核酸的形狀，可以使用單鏈基因、雙鏈基因、3鏈基因、DNA、RNA、DNA/RNA嵌合型基因、偶磷硫酸型基因、直鏈狀基因、環(huán)狀基因等，沒有限制。在上述重組病毒載體內(nèi)編碼的基因排列，除了藥物基因外，還有為轉(zhuǎn)印藥物基因的啟動子和增強(qiáng)體、聚A信號、為標(biāo)識和/或選擇導(dǎo)入基因的細(xì)胞的標(biāo)識基因、為在細(xì)胞的基因組DNA排列內(nèi)很好插入基因的來自病毒的基因排列，為使以藥物起作用的物質(zhì)向細(xì)胞外分泌和/或滯留在細(xì)胞內(nèi)局部處的信號排列等，可使用任何排列。
藥物基因可使用與病患相對應(yīng)的基因、即對病患起抗拒作用的基因和補(bǔ)足病患中欠缺的基因。例如有細(xì)胞分裂素類、成長因子、抗體或抗體斷片、與細(xì)胞分裂素或成長因子相對的受體、具有防增殖作用或抑制細(xì)胞增殖作用的蛋白質(zhì)、酵素、脈關(guān)系制劑、血檢誘發(fā)物質(zhì)、和凝集抑制劑、具有溶解血纖維作用的蛋白質(zhì)、病素包涂蛋白質(zhì)、細(xì)菌性抗原和寄生動物性抗原、腫瘤抗原、在血液循環(huán)中有效果的蛋白質(zhì)、肽激素、和像核酶和反意義RNA一類的核糖核酸，對從以上中選出的藥理活性化合物進(jìn)行編碼的基因。
作為對特定病患有代表性的基因，對于炎病性病患，有SOD、抗炎癥性的細(xì)胞分裂素類、對細(xì)胞接合因子起抗拒作用的肽進(jìn)行編碼的基因；對于酵素缺損癥有將正常酵素進(jìn)行編碼的基因；對于受容體缺損癥，有將正常受容體進(jìn)行編碼的基因；對于病毒感染癥，有將為殺傷病毒感染細(xì)胞的胸苷激酶、白喉毒素等毒進(jìn)行編碼的基因和阻礙病毒復(fù)制等的反意義、三股螺旋、核酶、假、反式顯性突變種等進(jìn)行編碼的基因；對于癌癥，有為殺癌細(xì)胞的胸苷激酶、白喉毒素等毒素進(jìn)行編碼的基因和為使癌基因惰性化的反意義、核酶、三股螺旋等進(jìn)行編碼的基因、為使癌細(xì)胞正?；腜53等癌抑制基因、將關(guān)于對抗癌劑的多劑耐性的基因形成惰性化的反義、三股螺旋、核酶等進(jìn)行編碼的基因；對于家族性高膽固醇血癥，有將LDL受體進(jìn)行編碼的基因等。
進(jìn)而，藥物基因中使用的表達(dá)盒，若是在靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)基因的，對此沒有特殊限制，可使用任何一種。本技術(shù)人員可限容易選擇這種發(fā)現(xiàn)盒。好的是在來自動物細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)基因的表達(dá)盒、更好是在來自哺乳類細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)基因的表達(dá)盒，尤其好是在來自人類細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)基因的表達(dá)盒。表達(dá)盒中可使用的基因啟動子，包括來自腺病毒、細(xì)胞肥大病毒、人類免疫不全(HIV)病毒、猿病毒40、勞氏肉瘤病毒、單純皰疹病毒、小鼠白血病病毒、大腦神經(jīng)病毒、新培斯病毒A型肝炎病素、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、乳頭瘤病毒、人類T細(xì)胞白血病病毒、流感性病毒、日本腦炎病毒、JC病毒、小核糖核酸病毒B19、脊髓灰質(zhì)炎病毒等病毒的啟動子、來自蛋白質(zhì)和熱休克蛋白等哺乳類的啟動子、CAG啟動子等嵌合體型啟動子等。
(核酸搬運體)本發(fā)明的核酸搬運體，其特征是包括由上述二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽、和上述重病毒載體。按規(guī)定比將多肽和重組病毒載體組合在一起時很容易形成復(fù)合體，形成本發(fā)明的核酸搬運體。根據(jù)本發(fā)明的最佳實施形態(tài)，本明的一種重組病毒載體，含有上述所示的適宜藥物基因。是將該重組病毒載體和本發(fā)明的多肽組合在一起時可用于基因治療的核酸搬運體，而且得到的是基因治療用組合物。因此，通過將含有上述藥物基因的重組病毒載體，和上述由二氨基丁酸和/或基藥學(xué)上允許鹽形成的多肽進(jìn)行混合，調(diào)制成基因治療用的細(xì)合物。這樣得到的基因治療用組合物也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
更具體講，將二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽和含有藥物基因的重組病毒載體分別溶解在水、生理食鹽水、等進(jìn)行強(qiáng)化的緩沖液等適當(dāng)溶劑中后，再進(jìn)行混合調(diào)制成基因治療用組合物。
這時，所使用的含上述藥物基因的重組病毒載體和本發(fā)明的多肽混合比，沒有特殊限制。實用中，對于1×102～1×1013IU/ml、好的為1×103～1×1012IU/ml，更好為1×104～1×1011IU/ml的1ml重組病毒載體溶液，使用本發(fā)明的多肽濃度為5μg/ml～20μg/ml，最好5μg/ml～10μg/ml。
此處所說的IU(infectious units)，是指表示重組病毒載體的基因?qū)胄?titer)、在上述1ml的病毒載體溶液中可導(dǎo)入基因的細(xì)胞數(shù)?；?qū)胄?，例如在含耐新霉素藥劑性基因的重組病毒載體中對任意細(xì)胞進(jìn)行導(dǎo)入基因處理后，在含藥劑的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過統(tǒng)計獲得可增殖的耐藥劑性細(xì)胞數(shù)量。
本發(fā)明的核酸搬運體，在將多肽和重組病毒載體混合后，1分鐘后就形成復(fù)合體，這種復(fù)合體即使在形成后經(jīng)過1小時，仍穩(wěn)定地存在于混合溶液中。
本發(fā)明的核酸搬運體在混合形成復(fù)合體后也不會引起沉淀。因此，將本發(fā)明的核酸搬運體直接注入血管中。也不存在引起血栓的危險性，能有效安全地給藥藥物基因。
本發(fā)明的核酸搬運體，根據(jù)需要還可含有添加劑。例如，為了促進(jìn)對細(xì)胞吸附、使重組病毒載體穩(wěn)定化、促進(jìn)藥物基因向細(xì)胞胞內(nèi)或核內(nèi)導(dǎo)入，或者控制重組病毒載體的放出，根據(jù)需要可向本發(fā)明的肽中添加添加劑。
作為這樣的添加劑，只要能達(dá)到上述目的就可以，沒有特殊限定，例如有蔗糖、氨基醋酸、谷氨酸鈉、硫酸軟骨素、明膠、蛋白質(zhì)、細(xì)胞分裂素、HMG-1、HMG-2混合物、氯喹啉、VSV-G(小水痘性口內(nèi)炎病毒外皮蛋白質(zhì))、戊糖苷(腺苷病毒構(gòu)造蛋白質(zhì))等。
而且，還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的核酸搬運體，比單獨用重組病毒載體導(dǎo)入藥物基因，可向靶細(xì)胞有效導(dǎo)入約3倍以上的藥物基因。
(本發(fā)明核酸搬運體的使用方法)本發(fā)明的核酸搬運體，首先，從患者身體向體外取出靶細(xì)胞，導(dǎo)入藥物基因后，在將該細(xì)胞返還回患者體內(nèi)的由在自家移植的基因治療中可使用(ex vivo基因治療)。也可使用在直接將藥物基因給藥患者的基因治療中(in vivo基因治療)。
作為基因治療的方法，大致有原樣使用異常(原因)基因，付加新的(正常)基因方法(Augumentation Gene Therapy)，利用正?；蛑脫Q異?；虻姆椒?Replacement Gene Therapy)。本發(fā)明的核酸搬運體可使用任何一種方法。
關(guān)于將本發(fā)明核酸搬運體給藥生物體的方法，沒有特殊限制。例如非經(jīng)口給藥，最好實施注射給藥。
本發(fā)明核酸搬運體的用量，隨使用方法、使用目的而異，本領(lǐng)域人員可依據(jù)治療對象確定最適宜用量。例如，使用注射給藥時，1天的給藥量好的為0.1μg/kg～1000mg/kg，更好為1μg/kg～100mg/kg。
(實施例)以下列舉制造例、實施例、試驗例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些例所限制。
以下制造例和實施例中使用的由二氨基丁酸和/或基藥學(xué)上允許鹽形成多肽的合成，可按照VogelerK。等人的方法進(jìn)行(VogelerK、和LanzP.，Helv.Chim.Acta，43，270-279(1960)，其合成過程如圖1所示。
本說明書中，聚二氨基丁酸(Poly(2，4-diaminobutyric acid)，包括其醋酸鹽，簡寫成PDBA。PDBA中也包括可全部是旋光異構(gòu)體的。同樣將與聚乙二醇的嵌段共聚物簡寫成PDBApeg(或PDBA-PEG)。
(制造例1)由二氨基丁酸和/或基藥學(xué)上允許鹽形成肽的合成(1)作為單體的，Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(4N-Carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyric acld N-carboxy-anhydride)(10)的合成
(I-1)Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸(4N-carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyric acid)(8)的合成將15gDL-2，4-二氨基丁酸2鹽酸鹽(DL-2，4-diamino-n-butyric aciddihydro chloride)(1)(sigma社制)溶解在75ml水中，再向其中加入11.7g堿性碳酸銅(2)，放置后，煮沸回流、過濾。向濾液中加16.6g碳酸氫鈉、17.8ml芐氧羰基氯化物(4)(和光純藥社制)，攪拌，得到沉淀生成物。將得到的生成物過濾，用丙酮、和二乙基醚洗滌后，干燥，得到15gNγ-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸銅絡(luò)合物(4N-carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyric acid coppercomplex；以下寫作Dba(Z)-Cu)(5)。
將11g上述得到的絡(luò)合物(5)加入到9.3ml35％HCl、22ml水、11ml甲醇的混合液中。在硫化氫(H2S)氣的存在下攪拌。室溫下靜置，除去過剩的硫化氫后，過濾除去不溶物。將濾液減壓，加入水和甲醇，冷卻。再加入甲醇后，加入二乙胺(7)(diethylamine)將溶液PH調(diào)整到7。過濾分離出析出的結(jié)晶，在漏斗上用二乙醚洗滌，干燥、以白色結(jié)晶得到4g生成物。再將上述濾液濃縮、冷卻，過濾分離析出的結(jié)晶，在漏斗上用二乙醚洗涂、并干燥，以白色結(jié)晶得到1.5g生成物，將它們合并得到合計5.5g(由原料氨基酸計算收率31％的Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基基丁酸(8)。
(I-2)Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA)4N-carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyric acid N-carboxy-anhydride(10)的合成。
將5g上述得到的(8)溶解在四氫呋喃(THF)200ml中，向其中加入40mlTHF中溶解4.5g三光氣(9)溶液(triphosgene，bis(tricholoromethyl)carbonate，Aldrich社制)，在40℃攪拌60分鐘。減壓除去溶劑后，在得到的粗生成物中加入已烷溶解。冷卻，再減壓除去大部分已烷后，再向得到的粗生成物中加入醋酸乙酯溶解、過濾除去不溶物。向所得液中加入已烷，冷卻，生成物以白色結(jié)晶沉淀出。過濾分離析出的結(jié)晶，減壓下干燥。上過濾液也減壓濃縮后，同樣處理得到結(jié)晶生成物。將得到的結(jié)晶用二乙醚重結(jié)晶，獲得2.7g(收率50％)精制生成物(10)。
(II)聚合反應(yīng)由各種殘基數(shù)的二氨基丁酸形成的多肽，通過將上述得到的Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(10)，用各種比率的引發(fā)劑進(jìn)行縮聚，隨后脫去氨基的保護(hù)基。
所謖本發(fā)明的殘基數(shù)是指按下式(Arieh Yaron等、Biochim.Biophys.Acta，69，397-399(1963)計算出的(最后乘以0.9的理由是在去除保護(hù)基的反應(yīng)條件下，分子量約降低10％)。進(jìn)而，本發(fā)明的分子量意指以下式表示的。
殘基數(shù)＝聚合度(n)＝[Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(10)的量(摩爾數(shù))/引發(fā)劑的量(摩爾數(shù))]×收率(％)/100×0.9分子量＝n(聚合度)×殘基量(作為醋酸鹽，DBA醋酸鹽的殘基量＝160)以下詳述表1、表2中合成例3(殘基數(shù)49)中所示聚-DL-二氨基丁酸(poly-DL-2，4-diaminobutyric acid)和其醋酸鹽的合成。使用表1所示其他條件，同樣得到合成例1(殘基數(shù)12)、2(殘基數(shù)26)、4(殘基數(shù)62)、5(殘基數(shù)170)、6(殘基數(shù)278)、7(殘基數(shù)348)的PDBA。合成例3中在聚二氨基丁酸及其醋酸鹽的末端結(jié)合了聚乙二醇(14)(PEG、分子量1000)的聚二氨基丁酸-PEG(15)及其醋酸鹽的合成條件，作為合成例8也示于表1和表2。
(II-1)聚-Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸(poly(4-N-carbobenzoxy-DL-2，4-diaminobutyoric acid)(11)的合成將1g(3.6摩爾)Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基酷酸NCA(10)溶解在19ml乙腈(acetonitrile)中。
作為引發(fā)劑，加入4.38mg(0.06mmol)丁胺(butylamine)、在30℃靜置307小時。將得到的聚合物過濾、用乙腈洗滌。用索式萃取器，以二乙醚萃取后，減壓下干燥、得到0.77g(聚合率91％)聚-Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸(11)。
(II-2)聚-DL-二氨基丁酸(poly DL-2，4-diaminobutyric acid)(13)醋酸鹽的合成將0.5g聚Nγ-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸(11)溶解在2ml三氟醋酸中(trifluoroacetic acid)，向其中加入25％溴化氫醋酸溶液(12)，振蕩混合。靜置后，加入二乙醚，傾斜除去上澄醚相，再用二異丙醚進(jìn)行相同操作，傾斜去除上清醚相。將得到的沉淀物減壓充分干燥。在所得固體中加入醋酸鈉和水，使用除去分子量1000以下的滲析管，以流動水對所得混合液進(jìn)行滲析后，以20000G進(jìn)行一小時離心分離，除去沉淀物。將得到的溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到0.34g(收率91％)聚-DL-二氨基丁酸(13)。
表1利用4-N-芐氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸NCA的縮聚得到聚(4-N-芐氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸)的合成條件

a)BA；丁胺PEG1000；聚乙二醇MW1000b)引發(fā)劑/N-羧酸酐(NCA)摩爾比(引發(fā)劑和NCA的摩爾比)c)ACN；乙腈表2利用聚4-N-芐氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸的脫保護(hù)得到聚(DL-2，4-二氨基丁酸)醋酸鹽的合成條件

a)聚(Dba(Z))；聚(4-N-芐氧羰基-DL-二氨基丁酸)聚(Dba(Z))-PEG；聚(4-N-芐氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸)-PEG1000
(制造例2)GFP/HIV載體的調(diào)制將在含有HIV的gag、pol基因、缺少env基因和包裝信號的基因組上游，配置了細(xì)胞肥大病毒啟動子的基因構(gòu)筑物，插入含有與耐氨必西林性基因復(fù)制的SV40開始點的發(fā)現(xiàn)載體中的質(zhì)粒pCMV-R8.2(Naldini L，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，11382-11388，1996圖2)、和將在對小水痘性口內(nèi)炎病毒(Vesicular stomatitisvirusVSV)的外皮蛋白質(zhì)VSV-G進(jìn)行編碼基因上游配置了細(xì)胞肥大病毒啟動子的基因構(gòu)筑物，植入到表達(dá)載體PXF3中的質(zhì)粒pMD.G(Naldini L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，11382-11388圖3)，以及將從5′末端到3′末端方向依次配置HIV-LTR、CAG啟動子、綠色熒光蛋白質(zhì)(EGFP)基因和HIV-LTR的基因構(gòu)筑物，插入含有耐氨必西林基因復(fù)制的SV40開始點的表達(dá)載體中的表達(dá)質(zhì)粒pHXCAGEGFP(圖4)，一起利用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染在COS細(xì)胞上。培養(yǎng)2天后，將得到的培養(yǎng)上清液以2000rpm離心10分鐘，除去沉淀物，得到GFP/HIV載體溶液。
(實施例1)GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體的調(diào)制服用之前，每次以等量將制造例2中調(diào)制的GFP/HIV載體和以2倍要求濃度調(diào)制的PDBA溶液等量混合，調(diào)制成本發(fā)明的核酸搬運體GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體溶液。將PDBA的最終濃度分別調(diào)制成0、0.3、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg/ml。溶劑使用DMEM培養(yǎng)基(Sigma社制)。PDBA使用以表2中合成例3得到的PDBA，分子量為7800。此處，PDBA的最終濃度為25μg/ml形成的復(fù)合體在溶液中不會產(chǎn)生沉淀。
(試驗例1)和用GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體向Hela細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因試驗前一天，在12穴的多孔板(社制)上的每個孔中播種1×105個Hela細(xì)胞。在10％牛胎仔血清(三光純藥社制)存在下，給藥GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體溶液，在37℃進(jìn)行孵化4小時。更換新鮮培養(yǎng)液后，再孵化48小時。
(試驗例2)使用流式細(xì)胞儀測定導(dǎo)入基因的效率對試驗例1中導(dǎo)入基因的Hela細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理，從板中回收。將回收的細(xì)胞懸濁液用1％多聚甲醛進(jìn)行固定，用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur；ベクトンデイツキンソン社制)進(jìn)行測定。在10000個細(xì)胞中導(dǎo)入標(biāo)識基因(EGFP)的細(xì)胞比率示于圖5。在只以重排HIV載體用作對照樣(PDBA為0μg/ml)中，確認(rèn)約30％的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了基因。在PDBA和GFP/HIV載體的復(fù)合體組中，依賴于PDBA的濃度提高了導(dǎo)入基因的效率，以最終濃度10.0μg/ml以上，與對照樣比較，確認(rèn)導(dǎo)入基因約高3倍。圖5的縱軸單元為％，曲線以％表示將對照樣取為100％時各濃度的基因?qū)搿?br> (試驗例3)GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體的穩(wěn)定體評價GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體的調(diào)制分別在試驗前60、30、15、10、3、1分鐘，每次以等量將制造例2中調(diào)制的GFP/HIV載體和以20.0μg/ml調(diào)制的PDBA溶液混合，調(diào)制成GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體溶液(PDBA的終濃度為10.0μg/ml)。
溶劑使用DMEM培養(yǎng)基(Sigma社制)。PDBA使用由表2中合成例3得到的分子量為7800的。將各GFP/HIV載體/PDBA復(fù)合體溶液，在室溫下靜置后，給藥Hela細(xì)胞。48小時后，固定細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀CFACS Calibur；ベクトンデイツキンソン社制)測定導(dǎo)入基因效率。在10000個細(xì)胞中導(dǎo)入EGFP基因的細(xì)胞比率示于圖6。從圖6可以確認(rèn)，將PDBA和重組病毒載體混合后立刻形成穩(wěn)定的復(fù)合體，即使在室溫下放置1小時，導(dǎo)入基因效率也不發(fā)生變化。和圖5一樣，圖6的縱軸單元為％，曲線以％表示將對照樣取為100％時各濃度的基因?qū)肼省?br> 工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的核酸搬運體是由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽，與重組病毒載體形成復(fù)合體，可將藥物基因有效安全地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，由于保證能在該細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)很高的基因，所以可用于基因治療中。
權(quán)利要求
1.一種核酸搬運體，其特征是含有由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽，和重組病毒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸搬運體，其特征是上述多肽含有由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽，與聚乙二醇的嵌段聚合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1記載的核酸搬運體，其特征是多肽是由殘基數(shù)20～280的二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2記載的核酸搬運體，其特征是多肽是由殘基數(shù)20～280的二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項記載的核酸搬運體，其特征是上述重組病毒載體含有藥物基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項記載的核酸搬運體，其特征是重組病毒載體是HIV載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5記載的核酸搬運體，其特征是重組病毒載體是HIV載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6記載的核酸搬運體，其特征是上述HIV載體是與VSV-G的假型HIV載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7記載的核酸搬運體，，其特征是上述HIV載體是與VSV-G的假型HIV載體。
全文摘要
將含有由二氨基丁酸和/或其藥學(xué)上允許鹽形成的多肽、和重組病毒載體(最好也含藥物基因)的核酸搬運體、和藥物基因有效安全地導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),可在該細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)很高的藥物基因,實施基因治療。
文檔編號C12N15/86GK1379821SQ00814532
公開日2002年11月13日 申請日期2000年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月20日
發(fā)明者後藤武, 飯島修, 島田隆 申請人:久光制藥株式會社