專利名稱：高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與其它分子實(shí)體、尤其是除核酸本身以外的實(shí)體結(jié)合的核酸型分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明尤其涉及通過(guò)與特定分子靶結(jié)合并由此影響疾病狀態(tài)的具有藥學(xué)活性的核酸型分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明也涉及具有診斷效用的核酸型分子結(jié)構(gòu)。
非常需要提供能夠特異性改變特定蛋白質(zhì)的活性或調(diào)節(jié)特定基因產(chǎn)物表達(dá)的物質(zhì)的組合物。特別希望有能夠與其它分子形成特異性結(jié)合相互作用的分子，尤其是在體內(nèi)環(huán)境中能夠表現(xiàn)出特異性結(jié)合的這類分子。
針對(duì)這些需求，已經(jīng)開發(fā)出多種方法，使得能夠制備從中選出這樣的物質(zhì)組合物的各類分子文庫(kù)。一個(gè)有關(guān)的實(shí)例是見于抗體分子的非常靈敏的結(jié)合特異性，并且目前已有數(shù)種有效技術(shù)用于開發(fā)單克隆抗體及其重組衍生物。已提供了大量治療藥物和許多診斷及研究工具。所有這樣的制品都是蛋白質(zhì)分子，因此僅可以利用生物系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生。另一方面，已經(jīng)生產(chǎn)出全合成結(jié)合分子。這些結(jié)合分子是選自相同化學(xué)類別的相似或變異分子的不同文庫(kù)的分子，并且一般采用篩選系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行選擇，獲得所需治療靶的替代物或其某些方面活性的替代物。龐大的小分子化學(xué)文庫(kù)的篩選一直是開發(fā)常規(guī)小分子藥物的經(jīng)典途徑，而目前合成肽文庫(kù)和合成核酸分子文庫(kù)也用來(lái)篩選潛在有效的藥物。
對(duì)于核酸文庫(kù)，一般技術(shù)手段是利用已知單位長(zhǎng)度的單鏈RNA或DNA分子。與靶分子結(jié)合的基礎(chǔ)不在構(gòu)型前，而是可能依賴于促進(jìn)與其它分子實(shí)體結(jié)合的DNA(或RNA)分子本身內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成(Bock L.C.等1992 Nature355564-566；Kubrik，M.F.等1994 NucleicAcids Res.222619-2626)。以前沒(méi)有嘗試過(guò)制備治療和診斷效用、含二級(jí)(或高級(jí))結(jié)構(gòu)構(gòu)型前序列段的核酸分子，這就是本發(fā)明的目的。
本發(fā)明涉及新型高級(jí)核酸結(jié)構(gòu)以及這種結(jié)構(gòu)的新用途。
幾種類型的高級(jí)核酸結(jié)構(gòu)是現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域已知的。一種這樣的核酸稱為適合(aptamer)，而就其大小、制備和拓?fù)鋸?fù)雜度而論與本發(fā)明的分子不同。涉及從龐大的隨機(jī)文庫(kù)中體外進(jìn)化或者選擇的方法適用于開發(fā)RNA適體和DNA適體兩者。能夠促進(jìn)酶過(guò)程例如多核苷酸激酶活性的RNA分子已經(jīng)通過(guò)重復(fù)性選擇循環(huán)進(jìn)化(Lorsch J.R.和Szostak J.W.1994 Nature37131-36)，并且已經(jīng)篩選出能夠高度特異性抑制人磷脂酶A2的短單鏈DNA分子(Bennett C.F等1994 NucleicAcids Res.223202-3209)。其它研究者已經(jīng)獨(dú)立開發(fā)出能夠結(jié)合并抑制人凝血酶的某些功能的RNA型適體或DNA型適體(Bock L.C.等1992 Nature355564-566；Kubrik，M.F.等1994 Nucleic Acids Res.222619-2626)。
其它類型的高級(jí)核酸結(jié)構(gòu)包括“分支DNA”(Horn，T.和Urdea，M.S.1989，Nucleic-Acids-Res.176959-6967)，由此與互補(bǔ)核酸分子雜交的DNA分子的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域(“探針”)本身可以與其它DNA分子雜交，以便擴(kuò)增與所述DNA探針結(jié)合的DNA的量。然而，Horn和Urdea(出處同上)描述的復(fù)合物是線性延伸的，從而設(shè)計(jì)的新雜交核酸分子不與先前退火的分子雜交，而與輸入的其它新分子雜交形成分支DNA結(jié)構(gòu)。實(shí)際上，就是設(shè)計(jì)這樣的復(fù)合物而形成盡可能多的分支，以便提供更多信號(hào)核酸探針的退火點(diǎn)。
材料科學(xué)和納米技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)采用核酸堿基配對(duì)特性所提供的其它幾何結(jié)構(gòu)(Aliviatos，A.P.等1996 Nature 382609-611；Mao C.等2000 Nature407493-496；Yurke，B.等2000 Nature406605-608)。已有關(guān)于生產(chǎn)和分析高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)(包括多重連接成網(wǎng)格的四邊形、立方八面體和三角形基序)的精巧技術(shù)方法的介紹(Chen J.等1989，J.Am.Chem.Soc.1116402-6407；Zhang等1994，J.Am.Chem.Soc.1161661-1669；美國(guó)專利第5,278051號(hào)；美國(guó)專利第5,468,851號(hào)；美國(guó)專利第5,386,020號(hào)和美國(guó)專利第6,072,044號(hào))。所述幾何體是采用涉及限制性酶和DNA連接的迭代方法裝配的閉合結(jié)構(gòu)?？梢酝ㄟ^(guò)產(chǎn)生剛性結(jié)構(gòu)的鏈間交叉連接或者通過(guò)交叉退火明顯不同的支鏈獲得更柔性的分支固定所述結(jié)構(gòu)中的節(jié)點(diǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)不包括未閉合(即末端連接)的幾何結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有技術(shù)不包括包含修飾核酸區(qū)的幾何結(jié)構(gòu)，并且不包括與其它分子實(shí)體結(jié)合的幾何核酸結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有技術(shù)不包括應(yīng)用隨機(jī)或半隨機(jī)核酸結(jié)構(gòu)文庫(kù)。
關(guān)于高級(jí)核酸結(jié)構(gòu)的新用途，已知采用“低級(jí)”核酸本身作為治療和診斷分子是本領(lǐng)域已知的。具體地說(shuō)，有許多具有潛在治療活性和或?qū)嶋H治療活性的核酸分子的實(shí)例。這些分子作為反義分子、三鏈體試劑或作為具有內(nèi)切核糖核酸酶活性的RNA分子(“核酶”)起作用。在所有這些分子的外觀中，治療核酸的模式屬于通過(guò)減弱或阻斷蛋白質(zhì)翻譯的作用機(jī)制的蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)節(jié)劑。在所有這些情況下，靶結(jié)合特異性是核酸與核酸的結(jié)合特異性。這些特征(翻譯調(diào)節(jié)、核酸與核酸結(jié)合)與本發(fā)明模式不同。本發(fā)明的一個(gè)特殊發(fā)明特征是應(yīng)用與靶分子具有結(jié)合活性的高級(jí)核酸結(jié)構(gòu)。
已經(jīng)測(cè)試獲得用作治療和診斷分子的其它“低級(jí)”核酸結(jié)構(gòu)、尤其是適體。已鑒定出某些其它核酸分子、尤其是核酶因?yàn)榫哂忻富钚?，而具有潛在藥學(xué)價(jià)值。對(duì)于閉合的幾何結(jié)構(gòu)，雖然美國(guó)專利第5,278,051號(hào)推測(cè)了其作為用于小分子治療藥物的增溶劑或控釋載體的可能效用，但是沒(méi)有考慮其藥學(xué)效用。
本發(fā)明的第一方面涉及新型高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)、特別是開放型幾何結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明還涉及這類結(jié)構(gòu)用作藥物和/或診斷劑的用途。本發(fā)明也涉及包括修飾核苷酸的高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)。本發(fā)明也涉及包括隨機(jī)化或半隨機(jī)化核苷酸區(qū)的高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)。本發(fā)明也涉及與其它分子實(shí)體(例如蛋白質(zhì))綴合的高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)在雙鏈結(jié)構(gòu)的工程區(qū)利用Watson-Crick堿基配對(duì)法則。單鏈核酸分子借助堿基間的互補(bǔ)性可與其它單鏈分子退火(雜交)。盡管兩種單鏈分子的這樣的堿基退火通常產(chǎn)生線型雙鏈分子，但是還可以產(chǎn)生其它結(jié)構(gòu)，例如在一個(gè)分子具有內(nèi)部堿基對(duì)互補(bǔ)性的情況下，可產(chǎn)生發(fā)夾環(huán)；而在每個(gè)單鏈分子的兩個(gè)末端具有相互互補(bǔ)性的情況下，則可以產(chǎn)生環(huán)狀結(jié)構(gòu)。利用單鏈核酸序列策略設(shè)計(jì)，可以設(shè)計(jì)可與兩個(gè)或兩個(gè)以上其它分子同時(shí)退火的單個(gè)分子，如果這些其它分子進(jìn)而還可以與包括已經(jīng)參與退火的分子在內(nèi)的其它分子退火，則可以形成核酸復(fù)合物。
雙鏈DNA分子的整體空間結(jié)構(gòu)和拓?fù)鋵W(xué)是眾所周知的。雙鏈DNA分子是相當(dāng)柔性的，DNA分子雙螺旋能夠采取沿螺旋相鄰堿基對(duì)之間旋轉(zhuǎn)角不同的許多構(gòu)象。天然存在的單鏈核酸分子例如RNA在溶液中采用最適構(gòu)象。所述構(gòu)象取決于同一分子內(nèi)部堿基對(duì)相互作用，由此產(chǎn)生由雙鏈莖和單鏈環(huán)組成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。所述分子將采用最低能量的構(gòu)象，并且已知RNA序列的這種最低能量結(jié)構(gòu)可計(jì)算方法來(lái)預(yù)測(cè)(Jaeger J.A.等1989 Proc.Natl.Acad.Sci USA867706-7710)。已經(jīng)嘗試生產(chǎn)預(yù)測(cè)DNA折疊的軟件，并且已經(jīng)獲得一定成功(Nielsen D.A.等1995 Nucleic Acids Res.232287-2291)。核酸分子和蛋白質(zhì)分子之間的空間結(jié)構(gòu)比較說(shuō)明，這兩類分子間的結(jié)構(gòu)排列差異非常顯著，而且支持本發(fā)明的基本構(gòu)思。典型球狀蛋白例如分子量為17kDa的肌紅蛋白，其最長(zhǎng)維度為3nm。較大的球狀蛋白例如分子量為68kDa的牛血清白蛋白，其最長(zhǎng)維度為5nm(Cohen C.，載于Wolstenholme G.E.W.和O’Connor M.(編著)，Ciba FoundationSymposium，London，J&A Churchill，1966)。雙鏈螺旋的直徑本身為2nm，堿基對(duì)數(shù)少(例如100個(gè))DNA鏈的伸直長(zhǎng)度約為30nm。因此，雖然DNA或任何其它核酸分子的密度比典型蛋白質(zhì)低得多，但是DNA分子的拓?fù)鋵W(xué)、甚至其最常見天然結(jié)構(gòu)形式雙螺旋時(shí)，DNA分子可以容易地覆蓋幾乎任何蛋白質(zhì)分子暴露表面的大部分。尤其是如果常見單絲DNA的拓?fù)鋵W(xué)也如此改變時(shí)，所述DNA可以以更類似于密度高得多的蛋白質(zhì)分子的方式占據(jù)大部分空間區(qū)域。已知裝配由多條互相連接鏈(每條鏈為非常短(＜50)的核苷酸序列段)組成的核酸結(jié)構(gòu)，可以容易地獲得總體維度10-500nm的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的一個(gè)特別目的是提供這樣的核酸分子制劑。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是制備由于兩個(gè)或兩個(gè)以上核酸分子相互作用或者由于各個(gè)核酸分子內(nèi)不同限定區(qū)段相互作用形成的DNA或RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分子。在本發(fā)明中，DNA或RNA的信息內(nèi)容不是用作表達(dá)治療蛋白的編碼實(shí)體，也不是用作核酸代謝和基因表達(dá)的阻斷實(shí)體(反義)，而是用以指導(dǎo)裝配特定三維形狀分子結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明包括通過(guò)其組內(nèi)分子中特定堿基配對(duì)形成三維(非平面)分子結(jié)構(gòu)的核酸分子、尤其是合成的DNA分子。準(zhǔn)確地說(shuō)，設(shè)計(jì)DNA分子，使其含有1個(gè)或多個(gè)可以與其組內(nèi)的其它分子退火、最終形成復(fù)合三維核酸結(jié)構(gòu)的序列區(qū)(“結(jié)構(gòu)域”)。在該方案中，近似立方形結(jié)構(gòu)可以通過(guò)6個(gè)合成DNA分子自我退火而形成，每個(gè)合成DNA分子含有4個(gè)互補(bǔ)(complimentarity)結(jié)構(gòu)域，從而每個(gè)分子與4個(gè)其它分子相互作用，并且每個(gè)分子有效發(fā)揮作用，如同六面立方體的各個(gè)側(cè)面。所述結(jié)構(gòu)是開放的(未共價(jià)閉合)、柔性的，特別還體現(xiàn)在適合通過(guò)添加其它官能團(tuán)或結(jié)構(gòu)基團(tuán)來(lái)進(jìn)行修飾。
在本發(fā)明的一種高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)中，提供了每個(gè)核酸分子包含2個(gè)或2個(gè)以上的自我互補(bǔ)序列結(jié)構(gòu)域的多個(gè)核酸分子，使得所述核酸分子可以自我折疊以及通過(guò)特定堿基配對(duì)過(guò)程相互作用形成特殊的三維分子結(jié)構(gòu)。對(duì)于某些應(yīng)用，已知未修飾DNA分子的化學(xué)不穩(wěn)定性對(duì)于用作諸如治療藥物的用途已是一個(gè)相當(dāng)大的問(wèn)題。目前已有數(shù)種方法用以保護(hù)DNA分子免受酶攻擊降解。這些方法一般包括應(yīng)用修飾磷酸二酯主鏈(磷酸甲酯、硫代磷酸酯、肽核酸)、或采用亞磷酰胺、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鍵合在5’端或3’端加帽。本發(fā)明的一個(gè)特別目的是在所述高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)中采用修飾核酸或非天然核酸。此外，一個(gè)特別需要的特征是在結(jié)合特異性方面通過(guò)應(yīng)用混合化學(xué)和替代非天然核酸主鏈達(dá)到增加柔性。
本發(fā)明高級(jí)核酸結(jié)構(gòu)的核酸亞單位可以是天然同型或異源核酸亞單位，例如含有RNA序列段的DNA。已知DNA螺旋內(nèi)的RNA序列段改變?cè)谌芤褐械穆菪纬?Wang，A.等，1982 Nature299601-04)。限定核酸序列段存在構(gòu)象多樣性在改變與靶蛋白的結(jié)合特異性方面可能具有重要意義，這種現(xiàn)象是本領(lǐng)域已知的，凝血酶適體結(jié)合特異性依賴于高級(jí)三級(jí)結(jié)構(gòu)的短段(Griffin，L.等1993 Gene13725-31)。另外，非天然磷酸主鏈類似物可用來(lái)增強(qiáng)穩(wěn)定性，并且還可改變與所需靶蛋白的結(jié)合特異性。Latham等(Latham，J.A.等1994Nucleic-Acids-Res.222817-22)提供了一個(gè)實(shí)例，藉此在隨機(jī)寡核苷酸庫(kù)中用修飾核苷酸5-(1-戊炔基)-2’-脫氧尿苷代替胸苷。本發(fā)明包括由單鏈核酸序列段以及間插在所述單鏈核酸序列段中的雙鏈結(jié)構(gòu)序列段組成的分子，以及合成含有不同化學(xué)亞結(jié)構(gòu)但采用常規(guī)堿基配對(duì)法則連接的其它嵌合分子。這類結(jié)構(gòu)也可以組合含有DNA分子和RNA分子。
本發(fā)明的更高級(jí)分子結(jié)構(gòu)可按照本領(lǐng)域的任何方案由單個(gè)或多個(gè)核酸分子裝配而成，并且可以包括來(lái)自非常大的分子例如重組質(zhì)粒的各種合成核酸或片段。在單一線型DNA分子的自折疊(自動(dòng)裝配)或易化折疊后可以構(gòu)建所述結(jié)構(gòu)。易化折疊可以通過(guò)蛋白質(zhì)實(shí)體(酶類，例如連接酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、內(nèi)切核酸酶、聚合酶)或通過(guò)與非蛋白物理化學(xué)條件(pH、溫度、離子條件)相互作用來(lái)介導(dǎo)。另一方面，或者綜合以上所述方法，可以通過(guò)與結(jié)合在固體基質(zhì)上的分子相互作用裝配所述分子，或者在整個(gè)或部分裝配過(guò)程中折疊成更高級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA在空間上被限定或錨定。
本發(fā)明的第二方面是提供含有各式各樣的半隨機(jī)分子的核酸分子文庫(kù)，其中某些分子可能具有能夠以特定方式與靶分子相互作用的所需拓?fù)鋵W(xué)。在本發(fā)明的這一方面包括核酸分子文庫(kù)，所術(shù)核酸分了的特征為促進(jìn)裝配共同結(jié)構(gòu)亞單位的引導(dǎo)骨架。在每個(gè)亞單位內(nèi)摻入隨機(jī)序列段，使得就選擇性結(jié)合測(cè)定中的活性而論，文庫(kù)多樣性和潛在功能效用最大化。在本發(fā)明的第二方面中，采用n個(gè)合成DNA分子(亞單位)獨(dú)立群體(組)混合形成的文庫(kù)的實(shí)施方案。在該方面，合成核酸亞單位的群體數(shù)大，而群體數(shù)取決于所述亞單位可變區(qū)段內(nèi)存在的隨機(jī)化程度。在其它實(shí)施方案中通過(guò)改變所述可變結(jié)構(gòu)域的位置、改變可變結(jié)構(gòu)域數(shù)量(間插固定序列段)和改變?nèi)魏谓o定可變結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度進(jìn)一步構(gòu)建亞單位多樣性。最好在一個(gè)退火循環(huán)中混合n個(gè)獨(dú)立的亞單位群體，以產(chǎn)生具有多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)和各個(gè)序列多樣性的文庫(kù)。顯然其它實(shí)施方案可以包括多個(gè)退火循環(huán)和整數(shù)n的倍數(shù)值。在該方案中，所述文庫(kù)的一個(gè)特別特征是通過(guò)合理設(shè)計(jì)和布置互補(bǔ)序列段或引導(dǎo)序列段能夠調(diào)節(jié)亞單位間相互作用復(fù)雜程度。
本發(fā)明的第三方面是高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)的新用途，尤其是藥學(xué)和診斷用途。在該方面，這些結(jié)構(gòu)能夠與特定靶分子結(jié)合，通常是與蛋白或蛋白質(zhì)性靶分子結(jié)合。在優(yōu)選的實(shí)施方案包括單一蛋白靶的情況下，設(shè)想了進(jìn)一步的實(shí)施方案，其中所述靶是由多個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物(例如細(xì)胞表面受體)，而該蛋白復(fù)合物作為一個(gè)整體被本發(fā)明第一方面的分子結(jié)合。第三方面的其它實(shí)施方案包括結(jié)合通過(guò)結(jié)合本發(fā)明第一方面分子的能力鑒定的細(xì)胞靶或各種細(xì)胞。進(jìn)一步的實(shí)施方案包括與細(xì)胞、尤其是細(xì)胞表面的靶或靶復(fù)合物(包括非蛋白組分例如糖類或脂質(zhì)組分)的結(jié)合。蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì)實(shí)體和或其復(fù)合物可以是疾病特異性實(shí)體或組織或細(xì)胞正常成分。所述靶或靶復(fù)合物包括病毒顆?；虿《狙苌M分(例如衣殼蛋白)或病毒殼體中的宿主性組分。所述靶或靶復(fù)合物在其組成中可以包括金屬離子或其它無(wú)機(jī)化學(xué)物質(zhì)或化學(xué)基團(tuán)，并且可以是天然存在的或通過(guò)用外源因子處理而引入的。靶受體可以包括例如IL-2受體或其它細(xì)胞因子受體例如IL-3受體、M-CSF受體、GM-CSF受體和許多其它受體。同樣，諸如通過(guò)阻斷IgE結(jié)合IgE受體，而同時(shí)阻斷交聯(lián)活化過(guò)程的IgE表面分子應(yīng)是非常需要的表面分子。包括簇分化(CD抗原)系列成員在內(nèi)的其它表面分子是所需要的調(diào)節(jié)疾病、尤其是自身免疫成分性疾病的靶。
本發(fā)明的設(shè)計(jì)使得在治療分子領(lǐng)域具有特別廣泛的應(yīng)用。希望本發(fā)明的分子結(jié)構(gòu)激動(dòng)或拮抗特定受體或酶過(guò)程以產(chǎn)生治療效應(yīng)，同時(shí)沒(méi)有常規(guī)蛋白質(zhì)藥物的缺點(diǎn)例如免疫原性。因此，本發(fā)明延伸涉及用于治療或預(yù)防疾病或病癥的方法，所述方法包括給予受治療者有效量的所述分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還延伸涉及這類結(jié)構(gòu)在體內(nèi)和體外診斷方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的第四方面包含在所述結(jié)構(gòu)內(nèi)含修飾核苷酸的高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)。特別需要通過(guò)所述文庫(kù)亞單位的衍生化和或通過(guò)在其合成過(guò)程包括修飾堿基(硫羥化堿基、生物素?；瘔A基、ε-氨基衍生化堿基等)而賦予多樣性，這可獨(dú)立于上述第二方面賦予的多樣性或與所述多樣性同時(shí)存在。因此，獲得序列組成水平和序列長(zhǎng)度水平上都具有多樣性的高度多樣性文庫(kù)。這類參數(shù)可以因?yàn)椴煌膸?kù)和用于不同靶而固定于限定范圍。高級(jí)核酸結(jié)構(gòu)除了提供上述穩(wěn)定性或結(jié)合調(diào)節(jié)作用的特征外，還可含有能夠賦予所述結(jié)構(gòu)特定需要特性的修飾核苷酸。這種額外所需修飾可以在本發(fā)明的第一或第二方面中實(shí)施，包括應(yīng)用疏水序列段、包含補(bǔ)骨脂素或吖啶基團(tuán)、連接半抗原基團(tuán)例如生物素或與不同的帶電側(cè)鏈例如氨基或羧基連接的基團(tuán)，以促進(jìn)與特定靶分子的結(jié)合。在一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方案中，這類基團(tuán)可以用作其它分子的連接點(diǎn)，所述其它分子例如其它核酸分子或諸如抗體或酶的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明分子的一個(gè)所需特征是在體外和體內(nèi)都具有高度穩(wěn)定性。所述核酸結(jié)構(gòu)的化學(xué)組成不僅是高度有影響力的，而且所述分子的物理大小需要控制到在溶液中的剪切損害最小化，而在體內(nèi)功能效用最大化。為此，本發(fā)明優(yōu)選為普通的小(＜80mer)亞單位構(gòu)建成的多鏈核酸結(jié)構(gòu)。另一方面，可能需要采用由較大亞單位(＞80mer)組成的結(jié)構(gòu)，而同樣屬于本發(fā)明范疇。
本發(fā)明的第五方面包括與其它分子實(shí)體連接的高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)。具體地說(shuō)，這個(gè)方面包括在一個(gè)或多個(gè)特定位點(diǎn)與另一分子實(shí)體上的一個(gè)或多個(gè)特定位點(diǎn)連接的核酸，而本發(fā)明第四方面的修飾核苷酸促進(jìn)與所述核酸的特異性連接。這個(gè)方面特別包括與藥學(xué)上或診斷學(xué)上相關(guān)分子實(shí)體連接的高級(jí)核酸型結(jié)構(gòu)，從而所述核酸與疾病相關(guān)性特定分子靶結(jié)合，然后所述連接分子實(shí)體用來(lái)抵抗或檢測(cè)所述疾病。
藥學(xué)上相關(guān)的實(shí)體包括細(xì)胞因子、抗體的Fc部分、其它抗體相關(guān)實(shí)體、毒素、酶、藥物和前體藥物、受體激動(dòng)劑或拮抗劑、受體分子本身(尤其是配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、放射性同位素、藥學(xué)活性核酸、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體例如脂質(zhì)體、活微生物或減毒微生物、光活性部分以及其它誘導(dǎo)疫苗效應(yīng)的分子實(shí)體。診斷學(xué)上的相關(guān)實(shí)體特別包括放射性同位素、光活性部分例如產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)的部分、熒光染料、酶以及信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)載體例如微珠。
概括地講，本發(fā)明包括下列目的·一種三維多核酸結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)由核酸分子或其區(qū)段通過(guò)兩個(gè)或兩個(gè)以上分子的特定堿基配對(duì)相互作用的多個(gè)相互連接鏈組成，其特征在于所述結(jié)構(gòu)不是共價(jià)閉合的。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其特征在于所述結(jié)構(gòu)由兩條或兩條以上核酸分子鏈形成。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其特征在于所述結(jié)構(gòu)由三條或三條以上核酸分子鏈形成。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其特征在于所述結(jié)構(gòu)是立方體形式或基本上為立方體形式。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述立方形結(jié)構(gòu)由6條核酸分子鏈形成，其中每條分子鏈的作用如同六面立方體的各個(gè)側(cè)面。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)核酸序列包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的可以與其組內(nèi)的其它分子退火的結(jié)構(gòu)域。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)核酸序列包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)包括由單鏈核酸序列段以及間插在所述單鏈核酸序列段中的雙鏈結(jié)構(gòu)序列段組成的核酸分子。
·一種相應(yīng)的按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中每條核酸鏈小于80個(gè)核苷酸、最好是小于50個(gè)核苷酸。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)具有


圖1所示的裝配(A1+B1+C1)+(A2+B2+C2)。
·一種如上定義的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)含有由可變隨機(jī)化序列段組成的亞單位，以便得到能夠與靶分子相互作用的半隨機(jī)分子或其區(qū)段。
·一種三維多核酸結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)含有核酸分子或其區(qū)段通過(guò)兩個(gè)或兩個(gè)以上分子的特定堿基配對(duì)相互作用的多個(gè)相互連接鏈組成的亞單位，其中所述結(jié)構(gòu)是共價(jià)閉合的，并且含有由可變隨機(jī)化序列段組成的亞單位，以便得到能夠與靶分子相互作用的半隨機(jī)分子或其區(qū)段。
·一種如上定義的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述序列組成和序列長(zhǎng)度是可變的。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述可變序列組成通過(guò)所述序列內(nèi)核苷酸的一個(gè)或多個(gè)修飾來(lái)獲得。
·一種如上定義的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)含有多個(gè)可以與其它分子或固體基質(zhì)結(jié)合或連接的核酸位點(diǎn)或基團(tuán)。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述其它分子是蛋白質(zhì)、酶、脂蛋白、糖基化蛋白、免疫球蛋白或其片段。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述其它分子是核酸。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述分子是藥學(xué)上有效的分子。
·一種藥用組合物，所述組合物包含一種如上定義的、本權(quán)利要求書中的多核酸結(jié)構(gòu)以及任選合適的載體、賦形劑和稀釋劑和/或其它藥學(xué)上有效的化合物。
·一種相應(yīng)的多核酸結(jié)構(gòu)用作診斷劑的用途。
·一種如上定義的多核酸結(jié)構(gòu)的用途，用來(lái)提供影響特定隨機(jī)化拓?fù)鋵W(xué)多樣性的文庫(kù)，以便獲得不同的功能和/或活性。
合成兩個(gè)合成DNA分子文庫(kù)，每個(gè)文庫(kù)包含一個(gè)隨機(jī)化序列區(qū)。
文庫(kù)A包含以下結(jié)構(gòu)分子5’AGTCCCAAGCTGGCT(N)13CTCCATCGTGAAGTCAGCCAGCTTTGGACT文庫(kù)B包含以下結(jié)構(gòu)分子5’GACTTCACGATGGAGGTCAGAATGTGAATA(N)10TATTCACATTCTGAC這些序列設(shè)計(jì)用以促進(jìn)交叉退火，并且代表通過(guò)將按照本發(fā)明方案的不同的亞單位混合和交叉退火而形成的結(jié)構(gòu)文庫(kù)的亞單位。
合成具有硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸(亞單位)文庫(kù)，以在存在血清因子時(shí)達(dá)到最大穩(wěn)定性，并通過(guò)HPLC進(jìn)行純化。純化寡核苷酸得自GenoSys Biotechnologies(Cambridge，英國(guó))。采用單一循環(huán)的交叉退火裝配DNA結(jié)構(gòu)文庫(kù)。將亞單位文庫(kù)A和B進(jìn)行變性、混合以及在50mM Tris pH7.4、100mM NaCl、5mM EDTA的溶液中于溫度為37℃時(shí)退火。以等摩爾濃度(1□M)進(jìn)行亞單位文庫(kù)A和B的混合。在其它實(shí)驗(yàn)中，采用不同的摩爾比進(jìn)行混合。通過(guò)凝膠電泳確證所述亞單位的裝配。
篩選DNA結(jié)構(gòu)文庫(kù)中能夠與IL-2受體(IL2R)胞外域結(jié)合的結(jié)構(gòu)。這種篩選采用按照已公布的方法(Meidel，M.C.等1988 Biochem.Biophys.Res.Commun..154372-379；Meidel，M.C.等1989，J.Biol.Chem.26421097-21105)制備的可溶性重組IL2R進(jìn)行。采用供應(yīng)商(Bangs Labs，F(xiàn)ishers，IN，USA)建議的方案，使重組IL2R與表面活化磁珠共價(jià)結(jié)合，IL2R-磁珠用作親和性表面，以從所述DNA結(jié)構(gòu)文庫(kù)選擇結(jié)合結(jié)構(gòu)。將IL2R-磁珠在包括存在離液鹽的各種實(shí)驗(yàn)條件下在控制反應(yīng)中與所述文庫(kù)進(jìn)行反應(yīng)。所述文庫(kù)(DNA)濃度在如上所述的退火溶液中約為100nmol。用75mM Tris.HCl、200mM NaCl、0.5％正辛基葡糖苷pH8.0的溶液進(jìn)行徹底洗滌循環(huán)后，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)直接從所述磁珠回收結(jié)合分子。采用標(biāo)準(zhǔn)試劑系統(tǒng)和條件，使用引物PRA1(5’-AGTCCCAAGCTGGCT)進(jìn)行所述PCR以回收文庫(kù)A組分。在獨(dú)立反應(yīng)中，引物PRB1(5’GACTTCACGATGGAG)和PRB2(5’GTCAGAATGTGAATA)用來(lái)回收文庫(kù)B組分。采用標(biāo)準(zhǔn)試劑系統(tǒng)和方法，對(duì)所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序。
回收了許多序列，并鑒定為源自亞單位文庫(kù)A和亞單位文庫(kù)B。采用如前所述的硫代磷酸酯化學(xué)合成其中一對(duì)序列。如先前所述純化并裝配寡核苷酸IL2-R1和IL2-R2(圖2所示序列)，然后將其用于IL-2拮抗作用的細(xì)胞測(cè)定。
TALL-104(ATCC#CRL-11386)是一種人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系。所述細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)需要IL-2。無(wú)IL-2時(shí)所述細(xì)胞可以生長(zhǎng)一段時(shí)間，但其生長(zhǎng)明顯減慢。讓細(xì)胞在含有50-100u/ml重組人IL-2(Life Technologies，Paisley，英國(guó))并補(bǔ)充10％(v/v)加熱滅活的胎牛血清的Iscoves改良Dulbeccos培養(yǎng)基(Life Technologies，Paisley，英國(guó))中生長(zhǎng)。在8-10％CO2的環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。以含IL-2的培養(yǎng)基制備退火IL2-R1/IL2-R2 DNA制備物和含有相同外形長(zhǎng)度的隨機(jī)序列的對(duì)照DNA樣品的稀釋液。運(yùn)用沒(méi)有IL-2的培養(yǎng)基制備平行稀釋系列。稀釋系列濃度范圍為50□M DNA至390nM DNA。在96孔微量滴定板中，采用前一天平板接種的不完全融合TALL-104細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)離心收集細(xì)胞，用預(yù)溫?zé)?37℃)磷酸緩沖鹽水洗滌，然后加入含DNA的培養(yǎng)基處理48小時(shí)。處理以四個(gè)復(fù)份進(jìn)行。在48小時(shí)結(jié)束時(shí)，以比色測(cè)定，采用可商業(yè)性獲得的四氮唑化合物并按照供應(yīng)商(Promega，Southampton，英國(guó))提供的說(shuō)明書評(píng)價(jià)增殖。微量滴定板在540nm處讀數(shù)。
結(jié)果表明，在各個(gè)合成寡核苷酸IL2-R1和IL2-R2無(wú)活性的條件下，所述退火DNA制劑抑制TALL-104細(xì)胞系的生長(zhǎng)。
用實(shí)施例1中描述的文庫(kù)選擇能夠與人凝血酶結(jié)合的DNA結(jié)構(gòu)。按照實(shí)施例1，使用與表面活化的磁珠結(jié)合的人凝血酶制劑(Sigma，Poole，英國(guó))篩選所述文庫(kù)。按照實(shí)施例1使凝血酶-磁珠與所述DNA結(jié)構(gòu)文庫(kù)反應(yīng)，只是結(jié)合后的洗滌在20mM Tris乙酸、pH7.4、140mMNaCl、5mM KCl、1mM MgCl2的溶液中進(jìn)行。采用如實(shí)施例1所用的反應(yīng)和引物組，通過(guò)PCR，直接從所述磁珠中回收結(jié)合分子。采用標(biāo)準(zhǔn)試劑系統(tǒng)和方法，對(duì)所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序。
回收了許多序列，并鑒定為源自亞單位文庫(kù)A和亞單位文庫(kù)B。采用如前所述的硫代磷酸酯化學(xué)合成其中一對(duì)序列。純化并裝配寡核苷酸TB-R1和TB-R2(圖3所示序列)。將TB-R1/TB-R2復(fù)合物用于凝血酶抑制測(cè)定。采用纖維計(jì)(fibrometer)于37℃以及從健康供體新鮮制備的成人血漿測(cè)定凝固時(shí)間。采用凝固時(shí)間對(duì)凝血酶濃度作圖繪制的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定凝血酶抑制程度。在所述測(cè)定中，對(duì)三個(gè)對(duì)數(shù)的DNA結(jié)構(gòu)測(cè)定凝固時(shí)間。
結(jié)果表明，在存在所述TB-R1/TB-R2 DNA復(fù)合物時(shí)，凝血活性受抑制。
用實(shí)施例1中描述的文庫(kù)選擇能夠與重組可溶性CD4(rsCD4)制劑結(jié)合的DNA結(jié)構(gòu)。如先前所述，采用固定在活化磁珠上的CD4制劑(BioDesign，Saco，ME，美國(guó))篩選所述DNA結(jié)構(gòu)文庫(kù)。文庫(kù)篩選、洗滌和PCR選擇均如實(shí)施例2所述。合成并裝配源自A亞單位文庫(kù)和B亞單位文庫(kù)的單一寡核苷酸對(duì)。在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)中，用所述結(jié)構(gòu)抑制抗CD4單克隆RPAT4(Serotech，Abingdon，英國(guó))的結(jié)合。
在包被緩沖液(0.05M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液pH9.0)中，用0.2mg/ml rsCD4溶液將96孔ELISA板于4℃包被過(guò)夜。用TBS-T(tris緩沖鹽水pH8.0.05％(v/v)Tween 20)徹底洗滌各板，將待測(cè)DNA結(jié)構(gòu)和對(duì)照DNA結(jié)構(gòu)在TBS中從起始濃度為100□M在所述板中進(jìn)行稀釋(1∶2)。將各板于37℃保溫40分鐘后，用TBS洗滌。將抗體RPAT4在PBS中的100ng/ml制劑加入所述板中，于37℃保溫40分鐘。洗滌板后，采用堿性磷酸酶標(biāo)記的綿羊抗小鼠制劑(Sigma，Poole，英國(guó))和顯色底物Sigma Fast OPD(Sigma，Poole，英國(guó))，檢測(cè)結(jié)合的RPAT4。在有些測(cè)定中，將所述DNA與RPAT4單克隆抗體共孵育。運(yùn)用板讀出器讀出顯色強(qiáng)度，并比較待測(cè)孔和對(duì)照孔的信號(hào)。結(jié)果表明，在存在所述DNA結(jié)構(gòu)時(shí)，顯著抑制RPAT4與rsCD4的結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種三維多核酸結(jié)構(gòu)，該核酸結(jié)構(gòu)由核酸分子或其區(qū)段通過(guò)兩個(gè)或兩個(gè)以上分子的特定堿基配對(duì)相互作用而相互連接的多個(gè)核酸分子鏈組成，其特征在于所述結(jié)構(gòu)不是共價(jià)閉合的。
2.權(quán)利要求1的多核酸結(jié)構(gòu)，其特征在于所述結(jié)構(gòu)由兩條或兩條以上核酸分子鏈形成。
3.權(quán)利要求2的多核酸結(jié)構(gòu)，其特征在于所述結(jié)構(gòu)由三條或三條以上核酸分子鏈形成。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其特征在于所述結(jié)構(gòu)是立方體或基本上為立方體形式。
5.權(quán)利要求3的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述立方形結(jié)構(gòu)由六條核酸分子鏈形成，其中每條分子鏈的作用如同六面立方體的各個(gè)側(cè)面。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)核酸序列包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的可以與其組內(nèi)的其它分子退火的結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求6的多核酸結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)核酸序列包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)包含由單鏈核酸序列段以及間插在所述單鏈核酸序列段中的雙鏈結(jié)構(gòu)序列段組成的核酸分子。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中每條核酸鏈小于80個(gè)核苷酸。
10.權(quán)利要求9的多核酸結(jié)構(gòu)，其中每條核酸鏈小于50個(gè)核苷酸。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)的裝配為
圖1所示的(A1+B1+C1)+(A2+B2+C2)。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)含有由可變隨機(jī)序列段組成的亞單位，以便得到能夠與靶分子相互作用的半隨機(jī)分子或其區(qū)段。
13.一種三維多核酸結(jié)構(gòu)，該核酸結(jié)構(gòu)由核酸分子或其區(qū)段通過(guò)兩個(gè)或兩個(gè)以上分子的特定堿基配對(duì)相互作用而相互連接的多個(gè)核酸分子鏈組成，其中所述結(jié)構(gòu)是共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)，并且含有由可變隨機(jī)序列段組成的亞單位，以便得到能夠與靶分子相互作用的半隨機(jī)分子或其區(qū)段。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述序列組成和序列長(zhǎng)度是可變的。
15.權(quán)利要求14的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述可變序列組成是通過(guò)對(duì)所述序列內(nèi)核苷酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)含有多個(gè)可以與其它分子或固體基質(zhì)結(jié)合或連接的核酸位點(diǎn)或基團(tuán)。
17.權(quán)利要求16的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述其它分子是蛋白質(zhì)、酶、脂蛋白、糖基化蛋白、免疫球蛋白或其片段。
18.權(quán)利要求16的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述其它分子是核酸。
19.權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)，其中所述分子是藥學(xué)有效分子。
20.一種藥用組合物，該組合物包含權(quán)利要求19的多核酸結(jié)構(gòu)以及任選合適的載體、賦形劑、稀釋劑和/或其它藥學(xué)有效化合物。
21.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的多核酸結(jié)構(gòu)的用途，該用途為所述多核酸結(jié)構(gòu)用作診斷劑。
22.權(quán)利要求12或13的多核酸結(jié)構(gòu)的用途，該用途為所述多核酸結(jié)構(gòu)用來(lái)提供影響特異性隨機(jī)化拓?fù)鋵W(xué)多樣性的文庫(kù)，以便獲得不同的功能性和/或活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及與其它分子實(shí)體、尤其是除核酸本身以外的實(shí)體結(jié)合的核酸型分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明尤其涉及通過(guò)與特定分子靶結(jié)合并由此影響疾病狀態(tài)的具有藥學(xué)活性的核酸型分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明也涉及具有診斷效用的核酸型分子結(jié)構(gòu)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1390253SQ00815433
公開日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2000年11月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月13日
發(fā)明者F·J·卡爾, G·卡特 申請(qǐng)人:默克專利股份公司