專利名稱：用于無蛋白無血清培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于無蛋白無血清培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
細(xì)胞、尤其是真核細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)一直需要應(yīng)用特殊的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基使得所述細(xì)胞可獲得有效生長(zhǎng)和生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)物質(zhì)。通常，在該方面，血清或源自血清(例如牛血清)的化合物用作所述培養(yǎng)基的組分。
然而，在細(xì)胞培養(yǎng)中使用源自人或動(dòng)物來源的血清或蛋白質(zhì)添加劑的清況下，存在許多問題，尤其是在用于制備給予人的藥物的原材料是通過細(xì)胞培養(yǎng)而獲得時(shí)。
因此，就這類血清制劑而論，所述組合物和質(zhì)量已經(jīng)是每批都不同，這正是因?yàn)橛糜谶@類制劑的供體生物的相異性所致。這是一個(gè)相當(dāng)大的問題，尤其是對(duì)于細(xì)胞生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化以及在建立這類細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件時(shí)。然而，在所有情況下都要求對(duì)所用血清材料進(jìn)行廣泛而恒定的質(zhì)量控制。然而，這是相當(dāng)耗時(shí)及昂貴的，尤其是在象血清這樣復(fù)雜的成分的情況下。
此外，這類復(fù)雜制劑含有多種可以以破壞方式起作用的蛋白質(zhì)，尤其是在用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收的重組蛋白的純化過程的情況下。這尤其適用于與待回收的蛋白質(zhì)同源或相似的那些蛋白質(zhì)。不用說，這些問題尤其急待解決，因?yàn)樵诩兓^程中僅可以通過十分專一的差別純化(例如用僅特異性抗重組蛋白而不抗牛蛋白的抗體)可靠地去除培養(yǎng)基中所用的生物附屬物(例如牛蛋白)(Bjrck，L.，J.Immunol.，1988，第140卷，第1194-1197頁；Nilson等，J.Immunol.Meth，1993，164，第33-40頁)。
然而，在培養(yǎng)基中應(yīng)用血清或源自血清的化合物時(shí)一個(gè)明顯的問題也是有支原體、病毒或BSE因子污染的危險(xiǎn)。關(guān)于來源于人血的制劑，在該方面必須特別強(qiáng)調(diào)被病毒(例如肝炎病毒或HIV)污染的危險(xiǎn)。就血清或源自牛材料的血清組分而論，尤其存在BSE污染的危險(xiǎn)。除此之外，所有血清來源的材料又可能被尚未知的致病因子污染。
為了保證細(xì)胞適當(dāng)?shù)乇砻嬲掣揭约氨ＷC從細(xì)胞適當(dāng)生產(chǎn)所需的物質(zhì)，除了少數(shù)例外外，加入血清組分先前一直被認(rèn)為對(duì)于在固體表面培養(yǎng)細(xì)胞確實(shí)是必需的。因此，例如用描述于WO 91/09935的方法，已有可能通過無血清無蛋白培養(yǎng)表面依賴型永久細(xì)胞、最好是vero細(xì)胞(參見WO 96/15231)來獲得無血清無蛋白培養(yǎng)FSME病毒/病毒抗原的方法。然而，這些細(xì)胞不是重組細(xì)胞，而是用來在裂解過程中生產(chǎn)病毒抗原的宿主細(xì)胞。
與此相反，主要用于重組制劑的細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)能夠只在有限程度上貼壁。因此，一直通過常規(guī)方法培育的CHO細(xì)胞只在含血清的條件下與光滑微載體和多孔微載體結(jié)合(參見US 4,973,616；Cytotechnology 9(1992)，247-253)。然而，如果在無血清的條件下培育這類細(xì)胞，它們則喪失這一特性并且不粘附于光滑載體，或者如果在培養(yǎng)基中沒有提供其它粘著促進(jìn)添加劑，例如纖連蛋白、胰島素或運(yùn)鐵蛋白，則它們變得容易地從載體中脫落下來。然而，這些粘著促進(jìn)添加劑也是源自血清的蛋白。
要不然，可以采用懸浮培養(yǎng)技術(shù)以及例如采用分批法或采用連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞。進(jìn)行培養(yǎng)最好采用恒化方法(Ozturk S.S.等，1996，Abstr.Pap.Am.Chem.Soc.，BIOT 164，Payne G.F.等，載于“Large ScaleCell Culture Technology，”1987，Lydersen B.K.編著，Hauser publishers；第206-212頁)。Kattinger H.等(Advances Mol.Cell.Biology，1996，15A，193-207)描述了在無蛋白培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞，但這些細(xì)胞必需在載體上進(jìn)行培養(yǎng)，并且沒有例如連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)的可供選擇的方法。據(jù)說這些細(xì)胞當(dāng)貼壁于載體表面時(shí)僅顯示長(zhǎng)期穩(wěn)定性，因?yàn)樯L(zhǎng)減少所致，并且因此對(duì)生長(zhǎng)因子的需求減少。
另外，為了使細(xì)胞適應(yīng)始于含血清條件的無蛋白培養(yǎng)基，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)屢次進(jìn)行了嘗試。然而，關(guān)于這種適應(yīng)，已經(jīng)重復(fù)地發(fā)現(xiàn)，與含血清的條件相比，在適應(yīng)后，在無蛋白培養(yǎng)基中已表達(dá)蛋白的得率和重組細(xì)胞的生產(chǎn)率顯著降低(Appl.Microbiol.Biotechnol.40(1994)，691-658)。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在高細(xì)胞密度的情況下，重組蛋白的生產(chǎn)有時(shí)受到相當(dāng)大的限制。在試圖使細(xì)胞適應(yīng)無蛋白或無血清培養(yǎng)基期間，也重復(fù)發(fā)現(xiàn)所用細(xì)胞的不穩(wěn)定性，伴隨生長(zhǎng)減少，使得產(chǎn)生表達(dá)減少的細(xì)胞，或甚至產(chǎn)生非生產(chǎn)性細(xì)胞，從而這些細(xì)胞在無蛋白無血清培養(yǎng)基中具有相對(duì)于生產(chǎn)細(xì)胞的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，這導(dǎo)致這樣一個(gè)事實(shí)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)超過生產(chǎn)細(xì)胞，然后，最終，全部培養(yǎng)物于是產(chǎn)生非常低的產(chǎn)物得率。
另外，本發(fā)明的再一個(gè)目的是有效提高重組細(xì)胞的產(chǎn)量。
最后，按照本發(fā)明，需要改進(jìn)重組細(xì)胞對(duì)無血清無蛋白培養(yǎng)基的適應(yīng)并且使其配置更有效。
按照本發(fā)明，借助無蛋白無血清培養(yǎng)細(xì)胞、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基完成了這些工作，所述培養(yǎng)基的特征在于所述培養(yǎng)基含有一定比例的大豆水解產(chǎn)物。
令人驚奇的是，已有可能表明，通過在含有大豆水解產(chǎn)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞可以達(dá)到上述目的，而不必忍受現(xiàn)有技術(shù)描述的無血清培養(yǎng)的缺點(diǎn)。與現(xiàn)有技術(shù)已知的其它水解產(chǎn)物(例如小麥水解產(chǎn)物、水稻水解產(chǎn)物或酵母水解產(chǎn)物)相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)僅大豆水解產(chǎn)物介導(dǎo)按照本發(fā)明的特性，并且導(dǎo)致例如顯著提高重組靶蛋白的得率。當(dāng)論及這些術(shù)語時(shí)，可以使用或者術(shù)語大豆水解產(chǎn)物或者術(shù)語大豆蛋白胨，而沒有不同的含義。
按照本發(fā)明的培養(yǎng)基最好含有基于所述培養(yǎng)基總干重的10％(重量)以上的大豆水解產(chǎn)物。通常，以4-40％的量提供培養(yǎng)基中的大豆水解產(chǎn)物。
按照本發(fā)明，特定大豆水解產(chǎn)物的選擇并不重要。按照本發(fā)明可以使用市場(chǎng)上將找到的許多大豆制品，例如，來自大豆粉經(jīng)酶消化(例如用木瓜蛋白酶)的蛋白胨，其pH值為6.5-7.5，總含氮量為9％-9.7％，灰分含量為8-15％。這些是本領(lǐng)域?qū)＜乙话阌糜诩?xì)胞培養(yǎng)的形式的來自大豆的蛋白胨。
按照一個(gè)優(yōu)選形式的實(shí)施方案，在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中使用大豆水解產(chǎn)物或其粗制級(jí)分的純化制劑。在這種純化過程中最好消除可能干擾有效培養(yǎng)的雜質(zhì)，或提高所述水解產(chǎn)物的精確度，例如就分子量而論。
按照本發(fā)明，實(shí)際上已經(jīng)證明在該純化過程中提供超濾步驟尤其重要；為此，在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中尤其優(yōu)選使用經(jīng)超濾的大豆水解產(chǎn)物。
超濾可以按照現(xiàn)有技術(shù)中全面描述的方法來進(jìn)行，例如，使用具有已知截留限的薄膜濾器。
借助“凝膠層析，例如，借助Sephadex層析，例如，用SephadexG25或Sephadex G10或等同材料，借助離子交換層析、親和層析、大小排阻層析或“反相”層析，可以進(jìn)行經(jīng)超濾的大豆蛋白胨的純化。這些是得自現(xiàn)有技術(shù)的方法，并且是本領(lǐng)域?qū)＜沂煜さ?。采用該方法，可以選擇含有已知分子量的大豆水解產(chǎn)物的那些級(jí)分，所述分子量例如≤1000道爾頓、優(yōu)選≤500道爾頓、更優(yōu)選≤350道爾頓。
因此，本發(fā)明也包括用于生產(chǎn)無血清無蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法包括獲得一種大豆水解產(chǎn)物，采用超濾法超濾所述大豆水解產(chǎn)物，采用大小排阻層析純化所述大豆水解產(chǎn)物的級(jí)分并且選擇由分子量≤1000道爾頓、優(yōu)選≤500道爾頓、更優(yōu)選≤350道爾頓的大豆水解產(chǎn)物組成的大豆水解產(chǎn)物級(jí)分。
尤其有利的大豆水解產(chǎn)物的特征在于，其游離氨基酸含量為10.3-15.6％、或優(yōu)選12-13.5％，總含氮量為7.6-11.4％、或優(yōu)選8.7-9.5％，內(nèi)毒素含量為＜500U/g；并且由此大豆水解產(chǎn)物中至少40％、或優(yōu)選至少50％、或尤其優(yōu)選至少55％的分子量為200-500道爾頓，大豆水解產(chǎn)物中至少10％、或優(yōu)選至少15％的分子量為500-1000道爾頓。最優(yōu)選的是，大豆水解產(chǎn)物中至少90％的分子量為≤500道爾頓。
這種大豆水解產(chǎn)物非常好地適合于工業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白，這是由于其特殊的特性所致，可以特別容易地對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并且它可用于常規(guī)方法中。
除大豆水解產(chǎn)物外，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基也可以以某種方式含有本身已知的合成培養(yǎng)基，例如DMEM/HAM’s F12、Medium 199或RPMI，從文獻(xiàn)中對(duì)這些已有相當(dāng)?shù)牧私狻?br> 此外，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基也最好含有氨基酸，所述氨基酸最好選自L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺或其混合物。
在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中最好也加入以下氨基酸L-天冬酰胺(其量為每升培養(yǎng)基0.001-1g，優(yōu)選0.1-0.05g/L、尤其優(yōu)選0.015-0.03g/L)、L-半胱氨酸(0.001-1g/L、優(yōu)選0.005-0.05g/L、尤其優(yōu)選0.01-0.03g/L)、L-胱氨酸(0.001-1g/L、優(yōu)選0.01-0.05g/L、尤其優(yōu)選0.015-0.03g/L)、L-脯氨酸(0.001-1.5g/L、優(yōu)選0.01-0.07g/L、尤其優(yōu)選0.02-0.05g/L)、L-色氨酸(0.001-1g/L、優(yōu)選0.01-0.05g/L、尤其優(yōu)選0.015-0.03g/L)和L-谷氨酰胺(0.05-1g/L、優(yōu)選0.1-1g/L)。
在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中可以單獨(dú)或聯(lián)合加入上述氨基酸。尤其優(yōu)選聯(lián)合加入含有所有上述氨基酸的氨基酸混合物。
在一個(gè)特定形式的實(shí)施方案中使用無血清無蛋白培養(yǎng)基，從而該培養(yǎng)基另外含有上述氨基酸混合物與經(jīng)純化的超濾大豆蛋白胨的組合。
意想不到的是，例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)為了滅活病毒或其它病原體，所述培養(yǎng)基可以于70-95℃、或優(yōu)選85-95℃加熱約5-20分鐘、或優(yōu)選15分鐘，而沒有負(fù)面效應(yīng)。
按照本發(fā)明，每種已知的合成培養(yǎng)基都可以與所述大豆水解產(chǎn)物聯(lián)合使用。常規(guī)的合成培養(yǎng)基可以含有無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳源和水。例如，可以使用DMEM/HAM’s F12培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中大豆汁的濃度可能最好為0.1-100g/L、尤其優(yōu)選1-5g/L。按照一個(gè)尤其優(yōu)選形式的實(shí)施方案，可以使用大豆蛋白胨，所述大豆蛋白胨就其分子量而論已經(jīng)被標(biāo)準(zhǔn)化。該大豆蛋白胨的分子量最好小于50 kD、尤其優(yōu)選小于10kD、最優(yōu)選小于1kD。
已經(jīng)證明超濾大豆蛋白胨的加入對(duì)于重組細(xì)胞系的生產(chǎn)率尤其有利，從而所述大豆蛋白胨的平均分子量為350道爾頓(QuestCompany)。這是一種這樣的大豆分離物，其總含氮量為約9.5％，游離氨基酸含量為約13％。
尤其優(yōu)選使用分子量為≤1,000道爾頓、優(yōu)選≤500道爾頓、尤其優(yōu)選≤350道爾頓的純化超濾大豆蛋白胨。
按照本發(fā)明的培養(yǎng)基也最好含有輔助物質(zhì)，例如，緩沖物質(zhì)、氧化穩(wěn)定劑、對(duì)抗機(jī)械應(yīng)力的穩(wěn)定劑或蛋白酶抑制劑。
尤其使用具有以下組成的培養(yǎng)基合成的基本培養(yǎng)基(1-25g/L)、大豆蛋白胨(0.5-50g/L)、L-谷氨酰胺(0.05-1g/L)、NaHCO3(0.1-10g/L)、抗壞血酸(0.0005-0.05g/L)、乙醇胺(0.0005-0.05g/L)和亞硒酸鈉(1-15μg/L)。
如有需要，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中可以加入作為消泡劑的非離子型表面活性劑，例如，聚丙二醇(PLURONIC F-61、PLURONIC F-68、SYNPERONIC F-68、PLURONIC F-71或PLURONIC F-108)。
由于在沒有加入表面活性劑的情況下，上升和爆裂的氣泡可能導(dǎo)致位于這些氣泡(“發(fā)泡”)表面的那些細(xì)胞損傷，因此為了保護(hù)細(xì)胞免受通氣的負(fù)面效應(yīng)，通常使用該試劑(Murhammer和Goochee，1990，Biotechnol.Prog.6142-148)。
雖然非離子型表面活性劑的量可以因此為0.05-10g/L，但是尤其優(yōu)選可能的最低量為0.1-5g/L。
另外，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基也可以含有環(huán)糊精或其衍生物。
所述無血清無蛋白培養(yǎng)基最好含有蛋白酶抑制劑，例如，絲氨酸蛋白酶抑制劑，它們適用于組織培養(yǎng)并且可以來源于合成或植物。
已經(jīng)適應(yīng)的細(xì)胞最好用作在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，即已經(jīng)適應(yīng)在無蛋白無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用按照本發(fā)明的培養(yǎng)基，用這類預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞不僅可以達(dá)到得率增加，而且也明顯提高它們對(duì)于無血清無蛋白培養(yǎng)的穩(wěn)定性。
然而，按照本發(fā)明，已經(jīng)證明重組細(xì)胞克隆尤其具有價(jià)值，從而這些重組細(xì)胞克隆在無血清無蛋白培養(yǎng)基中從開頭穩(wěn)定至少40個(gè)世代、優(yōu)選至少50個(gè)世代，并且表達(dá)重組產(chǎn)物。
這樣的細(xì)胞克隆可得自重組的原始細(xì)胞克隆在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且使所述細(xì)胞再適應(yīng)無血清無蛋白培養(yǎng)基后獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物。
術(shù)語“原始細(xì)胞克隆”可以理解為是指在用重組核苷酸序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后以穩(wěn)定的方式在實(shí)驗(yàn)室條件下表達(dá)重組產(chǎn)物的重組細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)染子。在含血清的培養(yǎng)基中培育原始克隆，以便使其生長(zhǎng)最佳。為了提高原始克隆的生產(chǎn)率，任選地在選擇劑的存在下，用選擇標(biāo)記和/或擴(kuò)增標(biāo)記進(jìn)行選擇，來培育所述原始克隆。對(duì)于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，在含血清的培養(yǎng)條件下，使所述原始細(xì)胞克隆增殖至高細(xì)胞密度，然后使其恰好在生產(chǎn)期之前再適應(yīng)無血清或無蛋白培養(yǎng)基。在這種情況下，培養(yǎng)最好在無選擇壓力時(shí)進(jìn)行。
可以從一開始就在無血清無蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行重組原始細(xì)胞克隆的培養(yǎng)；結(jié)果是，再適應(yīng)不再是必需的。在這種情況下，如有需要，也可以使用選擇劑，并且可以用選擇標(biāo)記和/或擴(kuò)增標(biāo)記來進(jìn)行選擇。所述方法描述于例如EP 0 711 835。
對(duì)再適應(yīng)無血清無蛋白培養(yǎng)基后獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物，測(cè)試細(xì)胞群體中以穩(wěn)定的方式在無血清無蛋白條件、任選地在不存在選擇壓力下產(chǎn)生產(chǎn)物的那些細(xì)胞克隆。這可以例如借助用經(jīng)標(biāo)記的抗所述重組多肽或蛋白的特異性抗體的免疫熒光來進(jìn)行。從所述細(xì)胞培養(yǎng)物分離出被鑒定為產(chǎn)物生產(chǎn)者的細(xì)胞，并且將其在最好與生產(chǎn)條件等同的無血清無蛋白條件下進(jìn)行再培育。所述細(xì)胞的分離可以由此通過分離所述細(xì)胞并對(duì)其測(cè)試產(chǎn)物生產(chǎn)者來進(jìn)行。
可以再測(cè)試含有所述穩(wěn)定細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的穩(wěn)定重組克隆，從所述細(xì)胞培養(yǎng)物分離這些克隆并將其亞克隆。然后可以再在無血清無蛋白條件下培育在無血清無蛋白條件下獲得的穩(wěn)定的重組細(xì)胞克隆。
以這種方法在按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中制備的重組細(xì)胞克隆或細(xì)胞群體，尤其由于其特征為它們穩(wěn)定至少40個(gè)世代、優(yōu)選穩(wěn)定至少50個(gè)世代、尤其穩(wěn)定超過60個(gè)世代，并且表達(dá)重組產(chǎn)物，因此勝過其它重組細(xì)胞克隆或細(xì)胞群體。
這種重組穩(wěn)定的細(xì)胞克隆或細(xì)胞群體的一個(gè)實(shí)例已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約提交了保藏，ECACC(UK)保藏號(hào)為98012206。
將按照本發(fā)明進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物最好來源于重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞。因此，重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以是所有的含有編碼重組多肽或蛋白的序列的那些細(xì)胞。在這一方面包括所有或者貼壁或者不貼壁生長(zhǎng)的連續(xù)生長(zhǎng)中的細(xì)胞。尤其優(yōu)選重組CHO細(xì)胞或BHK細(xì)胞。重組多肽或蛋白可以是血液因子、生長(zhǎng)因子或其它生物醫(yī)學(xué)相關(guān)制品。
按照本發(fā)明，優(yōu)選含有重組血液因子(例如因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI)、S蛋白、C蛋白、這些因子之一的活化形式或vWF的編碼序列并且能夠在數(shù)個(gè)世代內(nèi)以穩(wěn)定的方式表達(dá)這些蛋白的細(xì)胞克隆。在該方面尤其優(yōu)選表達(dá)vWF或具有vWF活性的多肽、因子VIII或具有VIII活性的多肽、vWF和因子VIII、因子IX或因子II的重組CHO細(xì)胞。
需要30個(gè)世代以建立主細(xì)胞庫。至少需要約40個(gè)世代以進(jìn)行1000-L規(guī)模的普通分批式培養(yǎng)。從單個(gè)細(xì)胞克隆開始，有可能用按照本發(fā)明的培養(yǎng)基制備“主細(xì)胞庫”(MCB)和具有約8-10個(gè)世代的“工作細(xì)胞庫”(WCB)，并且因此在生產(chǎn)規(guī)模(產(chǎn)量-生物量)下在無蛋白無血清條件下制備具有至多20-25個(gè)世代的細(xì)胞培養(yǎng)物，而與此相反，在用先前的細(xì)胞克隆和培養(yǎng)基在無血清或無蛋白培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后有些世代變得不穩(wěn)定，結(jié)果是a)具有產(chǎn)物生產(chǎn)者的均一細(xì)胞培養(yǎng)物是不可能得到的和b)在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定的產(chǎn)物生產(chǎn)率是不可能達(dá)到的。
然而，對(duì)比起來，甚至與已經(jīng)在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原始細(xì)胞克隆相比，按照本發(fā)明甚至也有可能發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物生產(chǎn)率提高。
按照再一方面，本發(fā)明也涉及用于培養(yǎng)細(xì)胞、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，其特征在于這些細(xì)胞已經(jīng)被接種到按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中，然后將其在該培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
因此，本發(fā)明也涉及應(yīng)用按照本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)重組細(xì)胞、優(yōu)選真核細(xì)胞、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
因此本發(fā)明的主題也是細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包括按照本發(fā)明的培養(yǎng)基和細(xì)胞、優(yōu)選真核細(xì)胞、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
通過以下實(shí)施例以及附圖將更詳細(xì)地闡述本發(fā)明，但不是用來限制本發(fā)明。


圖1顯示rFVIII-CHO細(xì)胞克隆在10-L灌注式生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)結(jié)果。
a)42天內(nèi)因子VIII的活性(毫單位/mL)及灌流速度(1-5/天)。
b)灌注式生物反應(yīng)器中的容積生產(chǎn)率(volumetric productivity)(因子VIII的單位/L/天)。
圖2顯示在采用分批法在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)重組因子(rFactor)VIII的CHO細(xì)胞的情況下，因子VIII的生產(chǎn)率(mU/mL)的比較。Mix 1由不含大豆水解產(chǎn)物但含有表4所列氨基酸混合物的無血清無蛋白培養(yǎng)基組成；Mix 2由含有大豆水解產(chǎn)物的無血清無蛋白培養(yǎng)基組成；Mix 3由含有大豆水解產(chǎn)物以及表4所列氨基酸混合物的無血清無蛋白培養(yǎng)基組成；Mix 4由含有2.5g/l純化超濾大豆水解產(chǎn)物以及表4所列氨基酸混合物的無血清無蛋白培養(yǎng)基組成。對(duì)于所述超濾大豆水解產(chǎn)物的純化，使用Sephadex柱。
圖3顯示在開始加入純化超濾大豆蛋白胨(即在培養(yǎng)的第6天)后表達(dá)重組因子VIII的CHO細(xì)胞在無血清無蛋白培養(yǎng)基中連續(xù)生長(zhǎng)的情況下，因子VIII的生產(chǎn)率(U/L)；和圖4顯示已經(jīng)在含有大豆水解產(chǎn)物的無蛋白無血清培養(yǎng)基中培育的表達(dá)重組因子II的BHK細(xì)胞。
表1
*)于1998年1月22日提交保藏(ECACC(歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，英國(guó))；保藏號(hào)98012206)實(shí)施例4合成的無血清無蛋白培養(yǎng)基的組成表2
實(shí)施例5在無蛋白無血清基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)rFVIII-CHO細(xì)胞在具有灌流的10-L攪拌釜中培養(yǎng)含有rFVIII-CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。在這種情況下使用按照實(shí)施例4的培養(yǎng)基。由此將細(xì)胞在多孔微載體(Cytopore，Pharmacia)上固定化，然后培養(yǎng)至少6周。灌流速度為4倍體積換液/天；pH為6.9-7.2；O2濃度為約20-50％；溫度為37℃。
圖1顯示rFVIII-CHO細(xì)胞克隆在10L灌注式生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)結(jié)果。
a)42天內(nèi)因子VIII的活性(毫單位/mL)及灌流速度(1-5/天)。
b)灌注式生物反應(yīng)器中的容積生產(chǎn)率(因子VIII的單位/L/天)。
表3
表3顯示表達(dá)rFVIII的細(xì)胞的穩(wěn)定性和比產(chǎn)出率。為了獲得這些結(jié)果，于15天、21天、28天、35天和42天后取樣，然后以300g將其離心，重懸于新鮮無血清無蛋白培養(yǎng)液中。再培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中因子VIII的濃度和細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)計(jì)算出FVIII的比產(chǎn)出率。
獲得888毫單位/106細(xì)胞/天的穩(wěn)定的平均生產(chǎn)率。在無血清無蛋白培養(yǎng)液中15天、21天、28天、35天和42天后，用抗FVIII抗體標(biāo)記，通過免疫熒光也證實(shí)這種穩(wěn)定的生產(chǎn)率。實(shí)施例6比較重組FVIII-CHO細(xì)胞在含有其它培養(yǎng)基成分的無蛋白無血清培養(yǎng)液中的生產(chǎn)率分批培養(yǎng)含有rFVIII-CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。在這種情況下，使用已經(jīng)添加以下氨基酸的按照實(shí)施例4的培養(yǎng)基表4
于37℃和pH 6.9-7.2培育細(xì)胞。采用分批法在24-72小時(shí)內(nèi)培育細(xì)胞。
測(cè)定重組FVIII-CHO細(xì)胞在下列培養(yǎng)基組合物中的生產(chǎn)率Mix 1包含不含大豆蛋白胨但另外含有按照上述表的氨基酸混合物的無血清無蛋白培養(yǎng)基。
Mix 2包含含有大豆蛋白胨的無血清無蛋白培養(yǎng)基。
Mix 3包含含有大豆蛋白胨并且另外還含有按照上述表的氨基酸混合物的無血清無蛋白培養(yǎng)基。
Mix 4包含無血清無蛋白培養(yǎng)基，并且另外還含有按照上述表的氨基酸混合物以及2.5g/L純化超濾大豆蛋白胨。所述超濾大豆蛋白胨的純化在Sephadex柱上用層析法進(jìn)行。實(shí)施例7采用恒化培養(yǎng)法在無蛋白無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)重組FVIII-CHO細(xì)胞在10-L攪拌式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)含有rFVIII-CHO細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。在這種情況下，使用按照實(shí)施例4的不含大豆蛋白胨但含有按照實(shí)施例6的氨基酸混合物的培養(yǎng)基。于37℃和pH 6.9-7.2時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞；氧濃度為20-50％空氣飽和度。為了測(cè)定培養(yǎng)物上清液中因子VIII的效價(jià)和細(xì)胞濃度，每24小時(shí)進(jìn)行取樣。從第2天至第14天總細(xì)胞濃度是恒定的。從第6天開始在培養(yǎng)液中添加超濾大豆蛋白胨。因子VIII的生產(chǎn)率示于3中；借助CHROMOGENIX CoA FVIIIC/4系統(tǒng)進(jìn)行所述測(cè)定。用標(biāo)記的抗FVIII抗體進(jìn)行免疫熒光。從所述數(shù)據(jù)可以觀察到由于添加大豆蛋白胨，因子VIII的生產(chǎn)率明顯增加，并且因此生物反應(yīng)器系統(tǒng)的容積生產(chǎn)率增加，因而這并不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的明顯增加。幾天后，連續(xù)培養(yǎng)物中不存在大豆蛋白胨導(dǎo)致因子VIII的生產(chǎn)率的明顯下降，而添加大豆蛋白胨的結(jié)果是生產(chǎn)率幾乎增加10倍。然而，由于所述添加并不增加細(xì)胞計(jì)數(shù)，由此清楚地表明，超濾大豆蛋白胨的結(jié)果是導(dǎo)致不依賴于細(xì)胞生長(zhǎng)的生產(chǎn)率的明顯增加。實(shí)施例8比較重組FVIII-CHO細(xì)胞在含有不同水解產(chǎn)物的無蛋白無血清培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)速率和生產(chǎn)率分批培養(yǎng)rFVIII-CHO細(xì)胞培養(yǎng)物。在這種情況下，使用已經(jīng)添加不同水解產(chǎn)物(來自大豆、酵母、水稻和小麥)的如實(shí)施例4所述的無血清無蛋白培養(yǎng)基。將沒有加入水解產(chǎn)物的無血清無蛋白培養(yǎng)基用作對(duì)照。
初始細(xì)胞密度分別為0.6×105和0.4×106。采用分批法于37℃在pH 6.9-7.2下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
表5顯示在已經(jīng)添加大豆水解產(chǎn)物(超濾的)和酵母水解產(chǎn)物的無血清無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)rFVIII-CHO細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。初始細(xì)胞密度為0.6×105細(xì)胞。將沒有加入水解產(chǎn)物的無血清無蛋白培養(yǎng)基用作對(duì)照。
表5
表6顯示在已經(jīng)添加大豆水解產(chǎn)物(超濾的)、水稻水解產(chǎn)物和小麥水解產(chǎn)物的無血清無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)rFVIII-CHO細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。初始細(xì)胞密度為0.6×105細(xì)胞。將沒有加入水解產(chǎn)物的無血清無蛋白培養(yǎng)基用作對(duì)照。
表6
表7顯示在已經(jīng)添加大豆水解產(chǎn)物(超濾的)和小麥水解產(chǎn)物的無血清無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)rFVIII-CHO細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。初始細(xì)胞密度相當(dāng)于0.4×106細(xì)胞。
表7
實(shí)施例9在含大豆水解產(chǎn)物的無蛋白無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)BHK細(xì)胞通過CaPO4方法將BHK-21(ATCC CCL 10)細(xì)胞用以下質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染三次25μg質(zhì)粒pSV-FII(Fischer，B.等，J.Biol.Chem.，1996，第271卷，第23737-23742頁)，該質(zhì)粒含有在SV40啟動(dòng)子(SV40早期基因啟動(dòng)子)控制下的人因子II(凝血酶原)-cDNA；4μg氨甲蝶呤抗性的質(zhì)粒pSV-DHFR和1μg介導(dǎo)G418/新霉素抗性的質(zhì)粒pUCSV-neo(Schlokat，U.等，Biotech.Appl.Biochem.，1996，第24卷，第257-267頁)。通過逐步增加氨甲蝶呤濃度直到3μM的濃度，借助在含有500μg/mL G418的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)來選擇穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。
對(duì)以這種方法獲得的克隆進(jìn)行亞克隆，并使其適應(yīng)無蛋白無血清培養(yǎng)基。采用懸浮培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。
結(jié)果可以參閱表6；在含大豆水解產(chǎn)物的無蛋白無血清培養(yǎng)基中培育的BHK細(xì)胞，表現(xiàn)出重組因子II的高的穩(wěn)定的產(chǎn)率。
權(quán)利要求
1.一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的無蛋白無血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含大豆水解產(chǎn)物，其中至少40％的所述大豆水解產(chǎn)物的分子量≤500道爾頓。
2.一種權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基含有基于所述培養(yǎng)基總干重的超過10％重量的大豆水解產(chǎn)物。
3.一種權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基含有經(jīng)超濾的大豆水解產(chǎn)物。
4.一種權(quán)利要求3的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基含有經(jīng)純化的大豆水解產(chǎn)物。
5.一種權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述大豆水解產(chǎn)物的內(nèi)毒素含量＜500U/g。
6.一種權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中至少50％的所述大豆水解產(chǎn)物的分子量≤500道爾頓。
7.一種權(quán)利要求6的培養(yǎng)基，其中至少55％的所述大豆水解產(chǎn)物的分子量≤500道爾頓。
8.一種權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基也含有氨基酸。
9.一種權(quán)利要求7的培養(yǎng)基，其中所述氨基酸選自L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-脯氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酰胺或其混合物。
10.一種權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基也含有輔助物質(zhì)，所述輔助物質(zhì)選自緩沖物質(zhì)、氧化穩(wěn)定劑、對(duì)抗機(jī)械應(yīng)力的穩(wěn)定劑和蛋白酶抑制劑。
11.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基的用途，用于培養(yǎng)選自CHO細(xì)胞和BHK細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
13.一種培養(yǎng)細(xì)胞的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞接種到權(quán)利要求1的培養(yǎng)基中和讓所述細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
14.一種從細(xì)胞培養(yǎng)物制備蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括將細(xì)胞接種到權(quán)利要求1的培養(yǎng)基中，其中所述細(xì)胞表達(dá)所需的蛋白質(zhì)；讓所述細(xì)胞在所述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并且表達(dá)所述蛋白質(zhì)，由此在所述培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述細(xì)胞和所述蛋白質(zhì)的混合物；從所述混合物中純化所述蛋白質(zhì)。
15.一種細(xì)胞培養(yǎng)組合物，所述組合物包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞和權(quán)利要求1的培養(yǎng)基。
16.一種權(quán)利要求1的細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，所述方法包括獲得大豆水解產(chǎn)物，采用超濾法超濾所述大豆水解產(chǎn)物采用大小排阻層析純化所述大豆水解產(chǎn)物級(jí)分，選擇由分子量≤500道爾頓的大豆水解產(chǎn)物組成的大豆水解產(chǎn)物級(jí)分。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基用于無蛋白無血清培養(yǎng)細(xì)胞、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因而所述培養(yǎng)基含有一定比例的大豆水解產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1391604SQ00816020
公開日2003年1月15日 申請(qǐng)日期2000年9月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月28日
發(fā)明者M·雷特, W·蒙德特, F·多納, L·格里爾伯格, A·米特雷爾 申請(qǐng)人:巴克斯特股份公司