專利名稱：人乙酰肝素酶相關(guān)多肽和核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸和由該多核苷酸編碼的多肽、多肽的用途及該多核苷酸和多肽的產(chǎn)生。更具體地，本發(fā)明多肽為乙酰肝素酶(heparanase)相關(guān)的內(nèi)切葡糖醛酸酶(endoglucuronidase)。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及針對本發(fā)明所述多肽的抗體和含有該抗體、多肽或多核苷酸的藥物組合物和診斷試劑。本發(fā)明也涉及改變、修飾或其它方式調(diào)節(jié)該乙酰肝素酶相關(guān)的內(nèi)切葡糖醛酸酶在細(xì)胞或生物體中表達水平的方法。本發(fā)明另一方面為適于鑒定調(diào)節(jié)劑例如該多肽的激動劑或拮抗劑的分析系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)蛋白植埋于主要由硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)組成的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。HSPG是血管的主要化合物(內(nèi)皮下基底膜)，其支撐著血管壁內(nèi)皮細(xì)胞并使毛細(xì)管壁的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。乙酰肝素酶(一種內(nèi)切-β-D-葡糖醛酸酶)在血小板、胎盤滋養(yǎng)層和白細(xì)胞中的表達證實了乙酰肝素酶在胚胎形態(tài)發(fā)生、傷口愈合、組織修復(fù)和炎癥中的常規(guī)功能。與消化ECM的蛋白酶一樣，乙酰肝素酶可以使細(xì)胞穿過基底膜并釋放貯存于ECM中的結(jié)合肝素的生長因子(如bFGF，VEGF)(Finkel等，科學(xué)，1999，28533-34；Eccles，自然醫(yī)學(xué)，1999，5735-736)最近，乙酰肝素酶已被4個獨立的研究小組克隆成功(Vlodavsky等，自然醫(yī)學(xué)，1999，5793-802；Hulett等，自然醫(yī)學(xué)，1999，5803-809；Toyoshima和Nakajima，生物化學(xué)雜志，1999，27424153-24160；Kussie等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊，1999，261183-187)，其作為65kDa前體蛋白得以表達，該前體蛋白的N端被加工后成為50kDa的活性酶。該活性酶的重組表達已在CHO、NIH3T3和COS-7細(xì)胞中成功進行。雖然以前已經(jīng)對幾個活性明顯不同的乙酰肝素酶有所描述，但克隆了不同來源(正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)乙酰肝素酶cDNA的4個研究小組報導(dǎo)的cDNA序列卻一致。
幾種跡象都表明在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移形成中有降解ECM的葡糖醛酸酶參與(1)與相應(yīng)的正常組織相比，乙酰肝素酶優(yōu)先在人腫瘤組織的mRNA和蛋白水平上進行表達，如乳房侵入性導(dǎo)管癌、肝癌、卵巢腺癌、子宮頸鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌(Vlodavsky等，同前)。(2)在患有轉(zhuǎn)移性瘤動物的血清和尿里及癌癥患者上發(fā)現(xiàn)有乙酰肝素酶水平的增加。(3)乙酰肝素酶mRNA的表達和酶活性與人和大鼠乳房瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。(4)低轉(zhuǎn)移性瘤細(xì)胞需要在乙酰肝素酶cDNA的轉(zhuǎn)染方面具有高轉(zhuǎn)移表型，如鼠科T淋巴瘤L5178Y和小鼠B16-F1黑色素瘤(Vlodavsky等，同前)。(5)抑制乙酰肝素酶活性的硫酸寡糖PI-88(磷酸甘露戊糖(phosphomannopentaose)SO4)抑制初級腫瘤生長、轉(zhuǎn)移形成和腫瘤血管化(Parish等，癌癥，1999，593433-3441)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種新的、分離的核酸分子，其含有一段編碼具有內(nèi)切葡糖醛酸酶活性多肽或其片段的核酸序列或與該核酸序列互補。
本發(fā)明也涉及由該多核苷酸編碼的多肽、其功能片段或功能衍生物或功能類似物。
本發(fā)明另一方面涉及制備此多肽或此多核苷酸的方法。
本發(fā)明再一方面涉及含有此多核苷酸的重組載體(優(yōu)選與表達控制序列有效連接的)和用此重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
而且，本發(fā)明涉及改變、修飾或以其它方式調(diào)節(jié)此多肽或此多核苷酸在細(xì)胞或生物體中表達水平的方法。
本發(fā)明另一方面涉及利用此多核苷酸、或其片段或衍生物，或多肽、或其片段或衍生物進行診斷的方法。
而且，本發(fā)明涉及特異性識別并結(jié)合于此多肽的抗體和利用此抗體進行診斷的方法。
而且，本發(fā)明涉及含有此多核苷酸或此多肽或此抗體或其片段的藥物組合物及含有此多核苷酸或此多肽或此抗體或其片段給藥的治療方法。
本發(fā)明再一方面涉及鑒定能夠調(diào)節(jié)該多肽生物活性的物質(zhì)的方法及由此方法得到的物質(zhì)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其含有一段編碼具有內(nèi)切葡糖醛酸酶活性的多肽的核酸序列或其與該核酸序列互補。
在其中的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述的分離的核酸分子是這樣的核酸分子，其含有(a)至少SEQ ID NO1所列核苷酸序列的蛋白編碼部分，(b)在遺傳密碼的簡并范圍內(nèi)與(a)序列相應(yīng)的核苷酸序列，或(c)在嚴(yán)格條件下與(a)和/或(b)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明也提供了由本發(fā)明所述核酸分子編碼的多肽。該多肽優(yōu)選含有(a)SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列或(b)與(a)的氨基酸序列具有至少70％，優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少95％同源性的氨基酸序列。
除了SEQ ID NO1中所列核苷酸序列和在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)與其相應(yīng)的核苷酸序列以外，本發(fā)明也包括在嚴(yán)格條件下與上述序列之一雜交的核苷酸序列。本發(fā)明所述術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”是按Sambrook等(分子克隆，實驗手冊，冷泉港實驗室出版，1989，1∶1.101-1.104)定義的。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件下的雜交是指在用1xSSC和0.1％SDS在50℃(優(yōu)選55℃，更優(yōu)選62℃，最優(yōu)選68℃)洗滌1小時后，特別是在0.2xSSC和0.1％SDS中50℃(優(yōu)選55℃，更優(yōu)選62℃，最優(yōu)選68℃)洗滌1小時后可以觀察到陽性的雜交信號。在上述洗滌條件下與SEQ ID NO1中所列核苷酸序列或在遺傳密碼簡并范圍內(nèi)與其相應(yīng)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
本發(fā)明所述核苷酸序列優(yōu)選DNA，例如cDNA、基因組DNA或合成DNA，其可以是雙鏈也可以是單鏈，并且假如是單鏈的話可以是編碼鏈也可以是非編碼(反義)鏈。然而，它可以含有RNA，例如編碼或非編碼(反義)鏈的mRNA、前體mRNA和合成RNA或核酸類似物(如peptidic核酸)。本發(fā)明所述核苷酸序列特別優(yōu)選含有SEQ ID NO1中所示核苷酸序列的蛋白編碼部分或與SEQ ID NO1中所示核苷酸序列具有多于70％，優(yōu)選多于85％，更優(yōu)選多于95％同源性的序列或其具有長度為優(yōu)選至少20個核苷酸，更優(yōu)選至少30個核苷酸，最優(yōu)選至少50個核苷酸的部分。
在核苷酸或蛋白水平上的同源性測定如下I＝n∶L，其中I代表同源性百分比，n代表在受檢序列與分別選自核苷酸序列SEQ ID NO1、氨基酸序列SEQ ID NO2或其一部分的基本序列之間不同核苷酸或氨基酸的數(shù)目，L是與受檢序列進行比較的基本序列的長度。
本發(fā)明的多核苷酸可以從哺乳動物(例如人細(xì)胞)或從來源于哺乳動物(例如人細(xì)胞)的cDNA文庫或基因組文庫中獲得。具體地說，此處描述的多核苷酸可從購自Incyte公司的cDNA文庫(PENCNOT07，BLADNOT09，PROSTUT08，BRSTNOT27，MIXDNOP01，ESOGNOT04，PENCNOT03)中分離得到。SEQ ID NO1中所示的cDNA插入子長度為3943堿基對(bp)并含有編碼長度為492個氨基酸蛋白的開放閱讀框架。本發(fā)明多肽推斷出的氨基酸序列與人乙酰肝素酶有38％的氨基酸同源性(


圖1)。本發(fā)明cDNA的5’末端是不完整的；推斷的成熟蛋白從其與人乙酰肝素酶的同源性推測來看是完整的。電子表達(Northern)分析表明本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)先在神經(jīng)系統(tǒng)和雄性生殖器組織中表達(圖2)。
本發(fā)明也涉及此處描述的多核苷酸的變體，其編碼具有SEQ IDNO2推導(dǎo)的氨基酸序列多肽的片段、類似物和衍生物。本發(fā)明也涉及從SEQ ID NO1的多核苷酸序列或SEQ ID NO1的片段構(gòu)建的多核苷酸探針。此處描述的變體包括缺失變體、取代變體和添加或插入變體。
本發(fā)明也包括多核苷酸，其中該多肽的編碼序列或其片段可與某一可幫助多肽由宿主細(xì)胞中表達或分泌，或可以使本發(fā)明的多肽進行純化(即多聚組氨酸標(biāo)簽，血凝素標(biāo)簽，GST標(biāo)簽)的多核苷酸融合在相同的閱讀框架中。
制備本發(fā)明所述多核苷酸的方法代表了本發(fā)明的一個方面。此方法可以包含化學(xué)合成、重組DNA技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或這些方法的組合。該多核苷酸優(yōu)選由上述適合原料通過擴增反應(yīng)獲得，例如使用序列特異性寡核苷酸引物進行的PCR。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽。本發(fā)明的功能片段、衍生物或類似物可以是其一或多個氨基酸被其它氨基酸取代的，或其一或多個氨基酸殘基包括取代基團的，或該多肽與其它化合物(即聚乙二醇)融合在一起的，或附加氨基酸與該多肽融合在一起的(即前導(dǎo)序列、分泌序列、純化標(biāo)簽)。
本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明多核苷酸的重組載體。此載體優(yōu)選表達載體，即含有與合適表達控制序列有效連接的本發(fā)明多核苷酸的載體。該載體可以是原核載體也可以是真核載體。原核載體的實例有染色體載體(如細(xì)菌噬菌體)和非染色體載體(如質(zhì)粒)，其中特別優(yōu)選環(huán)型質(zhì)粒載體。適合的原核載體在如Sambrook等，同前，1-4章中有述。另一方面，該載體可以是真核載體，例如酵母載體或適合在更高等細(xì)胞(例如昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或脊椎動物細(xì)胞，具體地說為哺乳動物細(xì)胞)中表達的載體。真核載體的優(yōu)選實例有質(zhì)?；虿《据d體。適合的真核載體在Sambrook等，同前，16章中有述。
而且，本發(fā)明涉及含有至少一個上述多核苷酸或載體異源拷貝的細(xì)胞。該多核苷酸或載體可通過已知方法，例如通過轉(zhuǎn)化(此術(shù)語也包括轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、侵染等)，插入到細(xì)胞中。該細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞。用核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法是通常所知的，并不需要進行詳細(xì)解釋。優(yōu)選細(xì)胞的實例為真核細(xì)胞，具體地說為脊椎動物細(xì)胞，更具體地說為哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面涉及制備本發(fā)明多肽的重組方法，所說的方法包括在適于該多肽進行表達的條件下培養(yǎng)用上述多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，和從細(xì)胞或培養(yǎng)物上清中分離由此表達的多肽。宿主細(xì)胞可在經(jīng)恰當(dāng)修飾的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)以篩選轉(zhuǎn)化子、擴增此多核苷酸或此載體或純化該多肽。
如此表達的本發(fā)明多肽可從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中通過迄今所使用的方法，包括去污劑勻漿、肝磷脂-瓊脂糖層析、陽離子交換層析、Con A-Sepharose層析、凝膠過濾層析、螯合鎳層析、谷胱甘肽瓊脂糖(瓊脂糖)層析、疏水層析和抗體親和層析，進行回收和純化。
本發(fā)明的多肽可以是由高表達細(xì)胞系天然表達的純產(chǎn)物，或化學(xué)合成的產(chǎn)物，或通過重組技術(shù)從原核或真核宿主中產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)重組生產(chǎn)方法中所用宿主的不同，本發(fā)明多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。
本發(fā)明另一方面涉及寡核苷酸或其衍生物，其在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1所列核苷酸序列雜交。根據(jù)計劃用途的不同，此寡核苷酸的長度，例如從約5，優(yōu)選約15到約100或甚至幾百個核苷酸單位或其類似物。
本發(fā)明的寡核苷酸可用作為克隆引物，或作為PCR引物，或作為測序引物，或作為雜交探針來使用。另一個用途涉及在體內(nèi)通過有義或反義技術(shù)刺激或抑制本發(fā)明多肽的表達。這些技術(shù)可通過在雙鏈DNA上三股螺旋的形成或在RNA的反義機制來控制基因表達，這兩種方法都基于此寡核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。寡核苷酸，具體地說是RNA寡核苷酸，的另一個用途涉及使用核酶技術(shù)的表達控制。通過本領(lǐng)域的方法，該寡核苷酸可通過現(xiàn)有技術(shù)被直接遞送至細(xì)胞，或者此反義或核酶RNA或DNA可在胞內(nèi)表達以抑制本發(fā)明多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明多核苷酸的反義構(gòu)建體或核酶抑制本發(fā)明多肽的活性并可被用于治療某些紊亂情況，例如癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移。
此外，此類寡核苷酸可用于檢測本發(fā)明多核苷酸是否存在及多核苷酸的表達水平。而且，此類寡核苷酸可用于檢測編碼本發(fā)明多肽的基因中的突變?；蛑械耐蛔兛赡芘c疾病或疾病預(yù)后有關(guān)。因此，寡核苷酸可作為診斷標(biāo)記物對紊亂(如癌癥、癌癥和血管生成異常)進行診斷。
多肽、它們的功能片段、其衍生物或類似物、或表達它們的細(xì)胞、或此多核苷酸或其片段可被用作免疫原以產(chǎn)生抗體。因此，本發(fā)明涉及特異性識別并結(jié)合于本發(fā)明多肽的抗體。
此種抗體可以是，例如，多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明也包括嵌合的、單鏈的和人源化的抗體及Fab片段。本領(lǐng)域已知的各種方法均可用于此抗體和片段的生產(chǎn)。
多克隆抗體可由用選擇性偶聯(lián)于載體的適當(dāng)多肽或肽抗原免疫實驗動物并從該免疫動物中分離該抗體獲得。單克隆抗體可通過由Khler和Milstein發(fā)展的雜交瘤技術(shù)獲得。產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體的方法分別是通常所知的，并不需要詳細(xì)解釋(Harlow和Lane抗體實驗手冊，冷泉港實驗室，1988)。
該抗體可用于從表達此多肽的組織中分離該多肽。本發(fā)明多肽的特異性抗體通過與該多肽結(jié)合可進一步用來抑制該多肽的生物活性。該抗體可以此方式用于治療，例如治療癌癥。該癌癥治療可通過Weiner(Semin.Oncol.26(1999)，41-50)或其引用的參考文獻所描述的方法進行。
而且，該抗體可以檢測本發(fā)明的多肽是否存在及此多肽的濃度水平，因此用作紊亂(例如癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移和異常血管生成)診斷的診斷標(biāo)記物。
另一方面，本發(fā)明涉及鑒定具有調(diào)節(jié)本發(fā)明多肽的生物活性或表達能力的物質(zhì)的方法。因此，本發(fā)明涉及鑒定本發(fā)明多肽功能或活性或表達的拮抗劑和抑制劑，以及激動劑和刺激劑的方法。
例如，拮抗劑可與本發(fā)明多肽結(jié)合并抑制或消除其功能。例如，該拮抗劑可以是抗該多肽的抗體或高親和力的寡核苷酸或肽，其通過與該多肽結(jié)合消除該多肽的葡糖醛酸酶活性。抑制劑的實例為低分子量分子，其通過結(jié)合并占據(jù)催化位點使該多肽失活，從而使底物無法進入該催化位點進而抑制該多肽的生物活性。
拮抗劑和抑制劑可通過阻止該多肽從胞外基質(zhì)上剝落硫酸乙酰肝素蛋白多糖的這一功能來治療癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移和異常血管生成。
由上述方法鑒定的拮抗劑和抑制劑或其衍生物可與適合的藥物載體一起在組合物中使用。
具體地說，本發(fā)明涉及鑒定上述物質(zhì)(例如低分子量的抑制劑，其對本發(fā)明多肽是特異性的并可抑制其功能或抑制其表達)的分析方法。天然的或合成的碳水化合物底物將用于評估該多肽的內(nèi)切葡糖醛酸酶活性。
另一方面涉及本發(fā)明所述多核苷酸或多肽在醫(yī)藥方面的用途。具體地說，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述多肽或多核苷酸在制備藥物組合物中的用途，該藥物組合物用于治療由所說多肽的不足或缺乏導(dǎo)致的疾病。多肽的激動劑或多肽的表達誘導(dǎo)物/增強劑可代替和與本發(fā)明的多核苷酸和多肽一起用于醫(yī)學(xué)目的。例如，此類疾病有外傷、自身免疫疾病、皮膚病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。本發(fā)明多肽可用于基因治療。基因治療可按Beutler(生物血液骨髓移植，1999，5273-276)或Gomez-Navarro等人(歐洲癌癥雜志，1999，35867-885)或其中引用的文獻所描述的方法進行。
本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明所述的抗體或其片段在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途。具體地說，本發(fā)明涉及本發(fā)明所述抗體在制備藥物組合物中的用途，該藥物組合物用于治療由本發(fā)明多肽的過量活性或過表達所導(dǎo)致的疾病。除了本發(fā)明的抗體以外，此多肽的拮抗劑或抑制劑或表達抑制劑可用于醫(yī)學(xué)目的。此類疾病為，例如癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移、血管生成和炎癥(包括關(guān)節(jié)炎)。
此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，該藥物組合物適于對患有由于本發(fā)明多肽不足或缺乏或失活導(dǎo)致的疾病，或?qū)加杏捎诒景l(fā)明多肽的過量活性或過表達導(dǎo)致的疾病的恒溫動物(包括人)給藥。
既然本發(fā)明多核苷酸優(yōu)先在雄性生殖器組織中表達，其所編碼多肽的表達和/或活性的調(diào)節(jié)可在雄性生殖器功能(即雄性生育力控制，勃起功能障礙)方面用于醫(yī)學(xué)介入。
實施例1本發(fā)明多核苷酸的鑒定使用已經(jīng)公布的人乙酰肝素酶序列(AAD54941.1)，三個Incyte模板(即Incyte ESTs集合)被發(fā)現(xiàn)與此人乙酰肝素酶具有明顯的同源性。每個模板的這些ESTs中的一些購自Incyte公司。每個EST克隆的3’和5’末端核苷酸序列的確定顯示出了更新的序列信息，這些序列信息進一步從Incyte克隆中導(dǎo)出兩個集合。將此序列信息與由這些Incyte克隆本身的測序結(jié)果得到的序列信息結(jié)合在一起，使我們能夠裝配一個人乙酰肝素的新的貌似物(paralogue)，人乙酰肝素酶相關(guān)多肽。該新序列含有3943bp并且鑒定的編碼序列范圍為1bp-1479bp(包括終止密碼子)。編碼區(qū)分析(由ESTSCAN程序確定)和與人乙酰肝素酶的同源性提示5’末端仍是開放的。
實施例2電子表達分析基于所給定組織ESTs的數(shù)目，我們可以估計或推測一種在此特定組織中測定特定基因的體內(nèi)表達水平的方法。
“電子-northern”是一種生物信息方法，其首先確定在數(shù)據(jù)庫中所給組織的所有ESTs的總數(shù)(所謂的“庫大小“)，然后確定該組織中僅與此查詢序列相關(guān)的ESTs的數(shù)目。
使用所感興趣基因的cDNA作為查詢條件，以人EST數(shù)據(jù)庫(Incyte公司的LifeSeqGold)作為數(shù)據(jù)來源，通過BLAST(NCBIBLAST版本2.0.10；Altschul等，核酸研究，1997，253389-3402)進行搜索。搜索參數(shù)為E＝le-30。隨后在此數(shù)據(jù)庫中進行的SQL查詢檢出搜索到的每個EST的組織來源和每個組織的庫大小。
該數(shù)據(jù)被認(rèn)為與體內(nèi)表達水平有關(guān)。此處，統(tǒng)計分析(庫大小的標(biāo)準(zhǔn)化和置信區(qū)間的確定)幫助評估該數(shù)據(jù)的可信度并幫助比較不同組織之間表達水平的差異。此預(yù)測方法的可信度通常隨采樣數(shù)/組織和組織的庫大小的提高而增加。
實施例3多核苷酸的表達使用HepR1(5′-GAC AGG AGA CCC TTG CCT GTA GAC-3′)作為5’引物、HepR2(5′-ATA GTC GAG TTA TCG GTA GCG GCA GGCCAA AGC-3′)作為3’引物和使用分離自克隆#3207535H1和#3385824H1(Incyte公司1999年十月/十一月公布的LifeSeqGold數(shù)據(jù)庫)的DNA作為模板，擴增SEQ ID NO1中所給出的多核苷酸的編碼區(qū)。此1488bp DNA以T4多核苷酸激酶去磷酸化后，再用XhoI限制性消化。該片段按三聯(lián)體密碼框架連入pISP-myc載體(其有一個N-末端免疫球蛋白信號序列，其后接有myc標(biāo)簽表位)。將該片段以HIndIII和XhoI限制性消化，然后連入表達載體pCEP4(Invitrogen)的適當(dāng)位點，得到表達載體HepR-pCEP。HepR-pCEP被轉(zhuǎn)染到MCF7、MBA-231、和MBA-468乳腺癌細(xì)胞系和CHO細(xì)胞。重組蛋白以抗-myc-標(biāo)簽表位抗體進行鑒定。
為在昆蟲中進行表達，該PCR片段用EcoR1和Xbal從pISP-myc載體中釋放出來。然后此片段被克隆到pVL1392桿狀病毒穿梭載體，得到HepR-pVL載體并轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞。
實施例4抗體的產(chǎn)生使用實施例3中的表達載體HepR-pVL從受感染的昆蟲細(xì)胞Sf9中純化多肽，用該多肽以標(biāo)準(zhǔn)方法(Harlow和Lane，抗體實驗手冊，冷泉港實驗室，1988)分別免疫小鼠和兔。
序列表SEQUENCE ID NO1編碼人的類乙酰肝素酶多肽的cDNA的核苷酸序列表長度 3943bp編碼序列區(qū)1-1476bp終止密碼子1477-1479bp下劃線表示兩個推定的聚腺苷酸位點1 gacaggagac ccttgcctgt agacagagct gcaggtttga aggaaaagac51 cctgattcta cttgatgtga gcaccaagaa cccagtcagg acagtcaatg101 agaacttcct ctctctgcag ctggatccgt ccatcattca tgatggctgg151 ctcgatttcc taagctccaa gcgcttggtg accctggccc ggggactttc201 gcccgccttt ctgcgcttcg ggggcaaaag gaccgacttc ctgcagttcc251 agaacctgag gaacccggcg aaaagccgcg ggggcccggg cccggattac301 tatctcaaaa actatgagga tgacattgtt cgaagtgatg ttgccttaga351 taaacagaaa ggctgcaaga ttgcccagca ccctgatgtt atgctggagc401 tccaaaggga gaaggcagct cagatgcatc tggttcttct aaaggagcaa451 ttctccaata cttacagtaa tctcatatta acagagccaa ataactatcg501 gaccatgcat ggccgggcag taaatggcag ccagttggga aaggattaca551 tccagctgaa gagcctgttg cagcccatcc ggatttattc cagagccagc601 ttatatggcc ctaatattgg gcggccgagg aagaatgtca tcgccctcct651 agatggattc atgaaggtgg caggaagtac agtagatgca gttacctggc701 aacattgcta cattgatggc cgggtggtca aggtgatgga cttcctgaaa751 actcgcctgt tagacacact ctctgaccag attaggaaaa ttcagaaagt801 ggttaataca tacactccag gaaagaagat ttggcttgaa ggtgtggtga851 ccacctcagc tggaggcaca aacaatctat ccgattccta tgctgcagga901 ttcttatggt tgaacacttt aggaatgctg gccaatcagg gcattgatgt951 cgtgatacgg cactcatttt ttgaccatgg atacaatcac ctcgtggacc1001 agaattttaa cccattacca gactactggc tctctctcct ctacaagcgc1051 ctgatcggcc ccaaagtctt ggctgtgcat gtggctgggc tccagcggaa1101 accacggcct ggccgagtga tccgggacaa actaaggatt tatgctcact1151 gcacaaacca ccacaaccac aactacgttc gagggtccat tacacttttt1201 atcatcaact tgcatcgakc aagaaagaaa atcaagctgg ctgggactct1251 cagagacaag ctggttcacc agtacctgct gcagccctat gggcaggagg1301 gcctaaagtc caagtcagtg caactgaatg gccagccctt agtgatggtg1351 gacgacggga ccctcccaga attgaagccc cgcccccttc gggccggccg1401 gacattggtc atccctccag tcaccatggg cttttatgtg gtcaagaatg1451 tcaatgcttt ggcctgccgc taccgaTAAg ctatcctcac actcacggct1501 accagtgggc ctgctgggct gcttccactc ctccactcca gtagtatcct1551 ctgttttcag acatcctagc aaccagcccc tgctgcccca tcctgctgga1601 atcaacacag acttgctctc 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tcagctctga gagggcagga aagtgaagta ccaagatggg ggcggggcgg3351 ggggtaggaa ataagagaaa gaagaaacag attgacaggc caaagtgagg3401 aaaagagagg aaaagagaaa tgagactaaa aggtcgttcc cccaactgtt3451 aaaaatgtgt gcagatatca acgtctcttc tacatactgg tacaggtgcg3501 actgcagggc cccctgatat aacaagagta accaaaggtc cctaagagcc3551 tggccctggg gacctatggt ttgctttgcg tccttagtaa ccccatgata3601 aaggggtact actgttatcc ccatttttcc tacgaggcat ggagaggatc3651 catggctcgc cccaggggca cccggggaaa tgggttgccg agcgcgaaat3701 aatccagagc ctgcccactc agccacaagg ctcagcggct ccacaggtcc3751 agacacctcc ttcacatctt tgtaggttct gctcattcag aacagccaga3801 actccactca aacacacttt ctgtaaataa gtgttgattt ttttttacta3851 aaccttgcag aatatgggta attcctgctt cttttatctt tctctgtgta3901 ttaaatgctg ctctcacgag atttaagttt tgtttatttt ttaSEQUENCE ID NO2人乙酰肝素酶相關(guān)多肽的氨基酸序列表翻譯產(chǎn)物長度4921 DRRPLPVDRA AGLKEKTLIL LDVSTKNPVR TVNENFLSLQ LDPSIIHDGW51 LDFLSSKRLV TLARGLSPAF LRFGGKRTDF LQFQNLRNPA KSRGGPGPDY101 YLKNYEDDIV RSDVALDKQK GCKIAQHPDV MLELQREKAA QMHLVLLKEQ151 FSNTYSNLIL TEPNNYRTMH GRAVNGSQLG KDYIQLKSLL QPIRIYSRAS201 LYGPNIGRPR KNVIALLDGF MKVAGSTVDA VTWQHCYIDG RVVKVMDFLK251 TRLLDTLSDQ IRKIQKVVNT YTPGKKIWLE GVVTTSAGGT NNLSDSYAAG301 FLWLNTLGML ANQGIDVVIR HSFFDHGYNH LVDQNFNPLP DYWLSLLYKR351 LIGPKVLAVH VAGLQRKPRP GRVIRDKLRI YAHCTNHHNH NYVRGSITLF401 IINLHRXRKK IKLAGTLRDK LVHQYLLQPY GQEGLKSKSV QLNGQPLVMV451 DDGTLPELKP RPLRAGRTLV IPPVTMGFYV VKNVNALACR YR
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，含有(a)SEQ ID NO1中所列序列或至少其蛋白編碼部分，(b)在遺傳密碼的簡并范圍內(nèi)與(a)序列相應(yīng)的核苷酸序列，或(c)在嚴(yán)格條件下與(a)和/或(b)的序列雜交的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其編碼具有內(nèi)切葡糖醛酸酶生物活性的多肽。
3.權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸，其與SEQ ID NO1所列的核苷酸序列或其片段至少具有70％的相同性。
4.權(quán)利要求1到3中任何一項所述的多核苷酸，其為DNA、RNA或核酸類似物。
5.重組載體，其含有至少一個拷貝的權(quán)利要求1到4中任何一項所述的多核苷酸。
6.權(quán)利要求5所述的載體，其為表達載體。
7.用權(quán)利要求1到4中任何一項所述的多核苷酸或用權(quán)利要求5到6中任何一項所述的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
8.由權(quán)利要求1到4中任何一項所述的多核苷酸編碼的多肽。
9.權(quán)利要求8所述的多肽，其含有(a)SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列或(b)與(a)的氨基酸序列或其片段具有至少70％相同性的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求8或9所述的多肽，其具有內(nèi)切葡糖醛酸酶活性。
11.權(quán)利要求8到10中任何一項所述的多肽或其片段，其具有引起特異性抗體的能力。
12.一種制備權(quán)利要求8到11中任何一項所述多肽的方法，所說的方法包括化學(xué)合成、重組DNA技術(shù)或這些方法的組合。
13.一種制備權(quán)利要求1到3中任何一項所述多核苷酸的方法，所說的方法包括化學(xué)合成、重組DNA技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或這些方法的組合。
14.特異識別并結(jié)合于權(quán)利要求8到11所定義多肽的抗體或寡肽或寡核苷酸或其衍生物。
15.權(quán)利要求1到4中任何一項所述的多核苷酸或權(quán)利要求8到11中任何一項所述的多肽在醫(yī)藥上的用途。
16.權(quán)利要求1到4中任何一項所述的多核苷酸或權(quán)利要求8到11中任何一項所述的多肽在制備藥物組合物中的用途，該藥物組合物用于治療由于所說多肽不足或缺乏或失活所引起的疾病。
17.治療由于權(quán)利要求8到11中所定義多肽的不足或缺乏或失活所引起疾病的方法，所說的方法包括給予適當(dāng)量的權(quán)利要求1到4中任何一項所述的多核苷酸或權(quán)利要求8到11中任何一項所述的多肽。
18.治療由于權(quán)利要求8到11中所定義多肽的過量活性或過表達所引起疾病的方法，所說的方法包含給予適當(dāng)量的權(quán)利要求14所定義的抗體或寡肽或寡核苷酸或其衍生物。
19.鑒別能夠在細(xì)胞中調(diào)節(jié)權(quán)利要求8到11中所定義多肽的生物活性或表達的物質(zhì)的方法，所說的方法包括將該多肽，或其功能衍生物、功能片段或功能類似物，或能夠表達該多肽的細(xì)胞與至少一種欲研究其調(diào)節(jié)所說多肽、功能衍生物、功能片段或功能類似物的生物活性或表達能力的化合物或試劑相接觸，及確定由該物質(zhì)引起的所說多肽、衍生物或片段的生物活性的改變。
20.權(quán)利要求19所述的方法，進一步包括以已被確定為調(diào)節(jié)劑的物質(zhì)或其衍生物作為活性試劑配制藥物組合物。
21.檢測對權(quán)利要求8到11所定義多肽具有結(jié)合能力或有功能效果的物質(zhì)的分析系統(tǒng)，所說的分析系統(tǒng)包含此多肽，或其功能衍生物、功能片段或功能類似物，或能夠表達此多肽或其功能衍生物、功能片段或功能類似物的細(xì)胞，及任選地包括確定由該物質(zhì)所引起的反應(yīng)的手段。
22.通過權(quán)利要求19或20所定義方法獲得的物質(zhì)，所說的物質(zhì)為權(quán)利要求8到11所定義多肽的激動劑或拮抗劑。
23.權(quán)利要求1到4中任何一項所述的多核苷酸或其片段或其衍生物在調(diào)節(jié)權(quán)利要求8到11所定義多肽在細(xì)胞內(nèi)的表達中的應(yīng)用。
24.權(quán)利要求1到4中任何一項所述的多核苷酸在基因治療方面的用途。
25.權(quán)利要求14所定義的抗體或寡肽或寡核苷酸或其衍生物，或權(quán)利要求1到4中任何一項所述的多核苷酸或其片段或其衍生物在診斷由權(quán)利要求8到11所定義多肽的不足或過表達所引起的疾病中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸和由該多核苷酸編碼的多肽、這種多肽的用途及這種多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地，本發(fā)明多肽為乙酰肝素酶相關(guān)的內(nèi)切葡糖醛酸酶(endoglucuronidase)。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明涉及針對本發(fā)明所述多肽的抗體和含有該抗體、多肽或多核苷酸的藥物組合物和診斷試劑。本發(fā)明也涉及改變、修飾或以其它方式調(diào)節(jié)該乙酰肝素酶相關(guān)的內(nèi)切葡糖醛酸酶在細(xì)胞或生物體中表達水平的方法。本發(fā)明另一方面為適于鑒別該多肽的調(diào)節(jié)劑例如激動劑或拮抗劑的分析系統(tǒng)。
文檔編號C12N1/15GK1413249SQ00817680
公開日2003年4月23日 申請日期2000年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日
發(fā)明者格哈德·西梅斯特, 貝爾特拉姆·魏斯 申請人:舍林股份公司