專利名稱：修飾的dhps基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及修飾生物合成的關鍵酶，以使必需氨基酸在細胞中累積。
20種必需氨基酸中有10種以上人和單胃動物不能合成，因此必需從其飲食中獲得這些必需氨基酸。必需氨基酸是賴氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸和色氨酸。另外，酪氨酸和半胱氨酸盡管不是嚴格意義上的必需氨酸，但因為它們只能自必需氨基酸中合成酪氨酸自苯丙氨酸中合成，半胱氨酸自甲硫氨酸中合成，因此也認為它們同必需氨基酸一樣。人類及家畜的飲食(也稱為食物和飼料)主要來自植物。在為動物和人類營養(yǎng)所必需的氨基酸中，有一些氨基酸如賴氨酸通常只以相對低的濃度存在于農(nóng)作物中。因此，通常在谷物為主的飲食和其它飲食中加入合成的氨基酸作為補劑，以提高飲食的營養(yǎng)價值。飲食中的蛋白質(zhì)不是營養(yǎng)等價的，其與不同蛋白質(zhì)中氨基酸的組成相關。食用提供不適當數(shù)量的一種必需氨基酸的飲食導致負氮平衡，因為正常的蛋白質(zhì)分解代謝繼續(xù)進行，但由于必需氨基酸的相對缺乏而導致替代的新合成受限。這種情況甚至在蛋白質(zhì)的總飲食攝入量是適量的時候也會發(fā)生。飲食蛋白可以用于合成組織蛋白質(zhì)的程度，受限于相對于需要存在的最小量的必需氨基酸的含量。這是該蛋白質(zhì)的限制性氨基酸。
許多農(nóng)作物含有非常低水平的賴氨酸。因此，植物中賴氨酸的含量是一個重要的農(nóng)藝學特性，而且在過去通過傳統(tǒng)培育，突變選擇或通過遺傳修飾，已經(jīng)進行了各種嘗試以提高植物中賴氨酸水平。
調(diào)節(jié)氨基酸生物合成主要基于氨基酸終產(chǎn)物途徑的關鍵酶的反饋抑制。提高植物中必需氨基酸的含量所遇到的問題是由于反饋抑制機制所致。
必需氨基酸賴氨酸是與蘇氨酸和甲硫氨酸一起，通過在細菌和高等植物中相似的復雜途徑從天冬氨酸中合成的(


圖1)。天冬氨酸家族途徑已經(jīng)在大腸桿菌中，通過分離參與途徑中的酶而加以了詳細定性，所述酶隨后也從高等植物中純化(Bryan，J.K.(1980)，植物的生物化學(由B.J.Miflin編輯)，第5卷403-452，科學出版社，N.Y.；Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47583-606)。
天冬氨酸家族氨基酸的合成速率，主要通過相應的氨基酸終產(chǎn)物途徑中一些關鍵酶的活性的反饋抑制這一復雜過程調(diào)節(jié)的。與所有天冬氨酸家族氨基酸相同，這個途徑中第一種酶活性，天冬氨酸激酶(AK)活性，是通過賴氨酸和蘇氨酸反饋抑制的。另外，賴氨酸也抑制二氫吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase，DHPS)的活性，這種酶是在分支點后途徑的第一種酶，導致賴氨酸合成。伴隨著ATP水解，AK催化天冬氨酸磷酸化，形成3-天冬氨酰磷酸酯。在大腸桿菌和植物中已經(jīng)鑒別了一些不同的AK同工酶，它們由賴氨酸或蘇氨酸抑制。AK活性的產(chǎn)物，3-天冬氨酰磷酸酯鹽，在接下來的酶促步驟中轉(zhuǎn)換為3-天冬氨酸半醛(3-ASA)，其作為合成賴氨酸和蘇氨酸的共同底物。二氫吡啶二羧酸合酶(DHPS)催化賴氨酸生物合成獨特的第一個反應，即3-天冬氨酸半醛與丙酮酸縮合形成2，3-二氫吡啶二羧酸。在大腸桿菌中，這種酶是由dapA基因座編碼的，并呈現(xiàn)由4個相同的亞單位組成的同型四聚體(Shedlarski，J.G.和Gilvarg，C.(1970)生物化學雜志，2451362-1373)。大腸桿菌基因dapA基因已經(jīng)克隆并測序(Richaud，F(xiàn).等，(1986)細菌學雜志166297-300)。在植物中，DHPS酶也表現(xiàn)為是一種與大腸桿菌酶相似的單酶。目前純化的所有植物DHPS示出具有由賴氨酸強力抑制的活性。在植物中天冬氨酸家族途徑的主要調(diào)節(jié)酶中，DHPS對其終產(chǎn)物反饋抑制最敏感(DHPS對賴氨酸的I50為10-50μM)。DHPS對賴氨酸抑制的敏感性是植物賴氨酸敏感性AKs(I50為100-700μM)的大約10倍，對賴氨酸抑制的敏感性是大腸桿菌DHPS(I50大約為1mM)的大約100倍(Yugari，Y和Gilvarg，C.(1962)生物化學生物物理學學報62612-614；Galili，G.(1995)植物學報7899-906)。
一些跡象表明在植物中，DHPS是賴氨酸合成的主要限速酶。一些具有反饋不敏感AK同工酶的植物物種突變體，發(fā)現(xiàn)超量產(chǎn)生游離蘇氨酸，但賴氨酸水平只微量提高(Bright，S.W.J.等(1982)自然299278-279；Cattoir-Reynaerts A.等(1983)生物化學生理學，Pflanzenl7881-90；Dotson，S.B.等(1990)植物學182546-552；Frankard，V.等(1992)，植物生理學991285-1293)。另一方面，一種反饋不敏感DHPS突變體煙草植物超量產(chǎn)生賴氨酸(Negrutiu，I.等(1984)，應用遺傳學原理611-20；Shaver，J.M.等(1996)P.N.A.S.USA931962-1966)。表達來自大腸桿菌的反饋不敏感DHPS或AK的轉(zhuǎn)基因植物報道了相似結(jié)果(Glassman，K.F.(1992)植物中氨基酸的生物合成和分子調(diào)節(jié)(由B.K.Singh等編輯)，217-228；Perl，A.等(1992)植物分子生物學19815-823；Shaul，O.和Galili，G.(1992a)植物雜志2203-209；Shaul，O.和Galili，G.(1992b)植物生理學1001157-1163)。表達大腸桿菌DHPS的轉(zhuǎn)基因植物超量產(chǎn)生賴氨酸，而那些表達大腸桿菌AK的轉(zhuǎn)基因植物超量產(chǎn)生蘇氨酸，并呈現(xiàn)出賴氨酸水平只微量提高。
歐洲專利申請No.429458揭示了一種提高植物中游離賴氨酸水平的方法，包括(a)將一個外源基因?qū)胫参锝M織來源的細胞中，及(b)在細胞中表達此外源基因，其中此基因的第一個DNA序列編碼DHPS，其通過內(nèi)源性產(chǎn)生游離L-賴氨酸而對反饋抑制有抗性。所述外源基因可以包含附著于第一個DNA序列5，末端的第二個序列，其編碼將DHPS定位于細胞葉綠體中的葉綠體轉(zhuǎn)運肽(CTP)。所述植物產(chǎn)生的賴氨酸水平提高。歐洲專利申請No.EP93908395闡述了兩個分離的DNA片段，包括一個編碼對賴氨酸抑制不敏感的AK的片段，和另一個編碼DHPS的片段，所述DHPS對賴氨酸抑制的敏感性比植物DHPS至少低20倍。據(jù)稱在轉(zhuǎn)化植物中，賴氨酸不敏感性AK導致產(chǎn)生高于正常的蘇氨酸產(chǎn)量，DHPS導致產(chǎn)生高于正常的賴氨酸產(chǎn)量。
當分別由棒桿菌dapA基因和突變的大腸桿菌lysC基因編碼的反饋不敏感細菌DHPS和AK酶，一起在轉(zhuǎn)基因canola和大豆種子中表達時，獲得相同結(jié)果。在轉(zhuǎn)基因種子中觀測到游離賴氨酸水平提高幾百倍，而在只表達反饋不敏感AK的轉(zhuǎn)基因種子中觀測到的蘇氨酸超量積累卻由與DHPS共表達而阻止(Falco，S.C.等(1995)，生物/技術13577-582)。美國專利申請No.577369l涉及四種嵌合基因，第一種編碼細菌賴氨酸不敏感性天冬氨酸激酶(AK)，其可操縱地與植物葉綠體轉(zhuǎn)運序列連接，第二種編碼細菌賴氨酸不敏感性DHPS，其可操縱地與植物葉綠體轉(zhuǎn)運序列連接，第三種編碼富賴氨酸蛋白，第四種編碼植物賴氨酸酮戊二酸還原酶，所有這些均可操縱地與植物特異性調(diào)節(jié)序列連接。所述轉(zhuǎn)基因植物的種子比未轉(zhuǎn)化的植物積累較高水平的賴氨酸或蘇氨酸。
本發(fā)明提供了一種編碼DHPS或其功能性片段的重組或分離的核酸或其功能性片段，該核酸有一突變導致至少一個單一氨基酸殘基被半胱氨酸殘基置換。存在一個額外的半胱氨酸殘基例如可以導致不同的或額外的硫橋形成。結(jié)果影響酶的整體結(jié)構(gòu)和/或柔性，優(yōu)選的情況下導致賴氨酸反饋抑制的喪失。在本申請中，使用的DHPS基因?qū)嚢彼岵幻舾校峭ㄟ^優(yōu)選在野生型酶保守天冬氨酸殘基的位點的至少一個定向氨基酸殘基修飾，并再插入原來的細胞中進行脫敏的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，置換位于或大約在DHPS的推定的賴氨酸結(jié)合位點進行，大腸桿菌中所述位點位于75-85位之間，置換優(yōu)選在野生型酶保守的天冬氨酸殘基的位點。
優(yōu)選將突變的基因移回最適于其表達，活性和與其它成分相互作用的原始環(huán)境中。通過改變其原始宿主如酵母，真菌，植物或細菌中的酶中至少一個氨基酸殘基而改變內(nèi)源性酶，也遠比用異源基因置換更為公眾和消費者接受。
本發(fā)明尤其提供了突變的植物DHPS基因；編碼來自各種植物物種的DHPS的基因已經(jīng)克隆，如來自Nicotiana sylvestris(Ghislain，M.等(1995)植物雜志8733-743)，大豆(SilkG.W.(1994)植物分子生物學26989-993)，小麥(Kaneko，T.等(1990)生物化學雜志26517451-17455)和玉米(Frisch，D.A.等(1991)分子基因遺傳288287-293)的DHPS基因。已經(jīng)在尋求對賴氨酸敏感性降低的植物DHPS突變體，以使用突變的植物基因提高植物中游離賴氨酸的水平。直接選擇煙草(Nicotiana sylvestris)UV照射的組織培養(yǎng)物以選擇賴氨酸類似物S-2-氨乙基-L-半胱氨酸(AEC)，產(chǎn)生DHPS的賴氨酸抑制降低及葉片和種子中游離賴氨酸的濃度提高的顯性突變(Negrutiu，I.等(1984)應用遺傳學原理6811-20)。然而，通過AEC選擇沒有獲得其它具有改變的DHPS抑制的植物。煙草突變的DHPS基因示出在一個10個氨基酸長的區(qū)域內(nèi)含有一個二核苷酸突變，所述區(qū)域預測是DHPS酶的賴氨酸結(jié)合位點(Ghislain，M.等(1995)植物雜志8733-743)。突變導致保守的天冬氨酸殘基變?yōu)楫惲涟彼釟埢?。通過UV照射獲得將天冬氨酸轉(zhuǎn)換為異亮氨酸所需的二核苷酸突變的變化是非常低的，這可以解釋沒有其它AEC抗性植物可以拯救這一事實。
另外兩個研究小組試圖以不同的方式突變參與植物DHPS酶賴氨酸結(jié)合的保守區(qū)域。Shaver等((1996美國科學院院報931962-1966)在大腸桿菌dapA-營養(yǎng)缺陷體中表達玉米DHPS cDNA，用誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)處理細胞，并在賴氨酸類似物AEC上選擇細胞。他們發(fā)現(xiàn)一些單核苷酸變化導致氨基酸置換，引起賴氨酸抑制幾乎全部喪失。然而，在馬鈴薯DHPS酶中改變的保守天冬氨酸殘基未觀測到突變。將含有這些突變的玉米DHPS基因的基因構(gòu)建體導入玉米細胞培養(yǎng)物中，突變體DHPSl66ay與野生型細胞相比，轉(zhuǎn)化的細胞中賴氨酸含量提高4倍(Bittel，D.C.等(1996)營養(yǎng)遺傳學原理9270-77)。美國專利申請No.5545545中也提及了這種突變的玉米DHPS基因的應用。
Silk和Mattews的小組((1997)植物分子生物學33931-933)使用上述在煙草和玉米中的突變信息，改變大豆DHPS酶中保守的氨基酸。克隆的大DHPS cDNA通過PCR進行定位突變。一種突變體含有在104位密碼子的一個單氨基酸取代(在煙草DHPS突變體中在相同位置保守的天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼?，在另一種突變體中在112位進行一個單氨基酸取代(在玉米DHPS突變體中相同位置保守的丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸)。第三種突變體含有這兩種突變。當在大腸桿菌dapA-營養(yǎng)缺陷體細胞中表達時，所有突變體示出相同的賴氨酸不敏感性。沒有關于這些突變體DHPS基因構(gòu)建體在植物中的表達數(shù)據(jù)。
當對比一些細菌和植物DHPS酶的氨基酸序列時，一些保守的氨基酸序列變得清晰了(Shaver等((1996)美國科學院院報931962-1966)。在大腸桿菌中161位的不變的賴氨酸殘基是結(jié)合丙酮酸所需的。另外，在DHPS酶的長度為10個氨基酸的節(jié)段中有非常保守的3個氨基酸殘基，所述節(jié)段可能或推定參與賴氨酸結(jié)合。這個位點包含78位(在大腸桿菌中的位置)的保守的甘氨酸，80位的保守的天冬酰胺，和82位的保守的蘇氨酸。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選由半胱氨酸置換的一個氨基酸殘基是80位(在馬鈴薯DHPS中是134位，在玉米中是158位)的保守的天冬酰胺。這個相同保守的氨基酸殘基在煙草DHPS突變體中被突變，然而其轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼岫皇前腚装彼帷Ｌ於０坊蚺c該天冬酰胺鄰近的氨基酸突變成半胱氨酸表觀上導致提高轉(zhuǎn)基因生物體的賴氨酸產(chǎn)量，然而令人驚奇地，直至目前克隆的野生型和突變的細菌，真菌或植物DHPS基因中，無一在(在野生型酶中)保守的天冬酰胺位或其周圍發(fā)現(xiàn)半胱氨酸殘基。
本發(fā)明還提供了一種選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的方法，該宿主細胞包含一種編碼DHPS酶或其功能片段的重組核酸或其功能片段，所述方法包括在存在S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸的情況下培養(yǎng)宿主細胞，并選擇對S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸相對反饋不敏感的所需的宿主細胞。由于組合使用了隨機定點誘變方法和反饋不敏感性的選擇，本發(fā)明提供了一種極端不敏感的DHPS突變體，當例如在馬鈴薯植物中表達時，導致積累的游離賴氨酸含量占塊莖中總游離氨基酸水平的30％多。在馬鈴薯中提高賴氨酸水平遠比在例如煙草中困難，通過Perl等((1993)植物分子生物學19815-823)所進行的實驗可以得出這個結(jié)論，在這個實驗中，在馬鈴薯中表達細菌DHPS(dapA)基因產(chǎn)生的賴氨酸積累遠比在煙草中表達此基因所產(chǎn)生的賴氨酸少。
本發(fā)明還提供了編碼馬鈴薯DHPS或其功能片段的重組的或分離的核酸或其功能片段，優(yōu)選其中所述核酸與圖2A所示核酸有至少60％，更優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少90％的同源性。我們通過PCR非常特異性地將在所述馬鈴薯DHPS酶中134位的天冬酰胺殘基誘變?yōu)樗衅渌赡艿陌被釟埢?。將以此方式獲得的在134位含有所有可能的氨基酸殘基的突變的DHPS克隆集合，在大腸桿菌dapA-營養(yǎng)缺陷體細胞中表達，并用賴氨酸類似物AEC選擇賴氨酸不敏感性。待突變的保守氨基酸殘基由我們選擇，但是轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌被釟埢峭ㄟ^在大腸桿菌dapA細胞中選擇。
本發(fā)明還提供了一種驅(qū)動本發(fā)明提供的DHPS基因表達的啟動子或其功能片段。本領域已知適當?shù)膯幼樱缰参锾禺愋詥幼?。尤其地，本發(fā)明提供了一種還包含組織特異性啟動子或其功能片段的本發(fā)明的核酸。驅(qū)動本發(fā)明DHPS酶表達的優(yōu)選的啟動子是塊莖特異性顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)啟動子(Visser，R.G.植物分子生物學17691-699，1991)。其它可用于驅(qū)動DHPS表達的塊莖特異性啟動子如是來自Solanum tuberosum的I型patatin啟動子(Mignery，C.A.等(1988)基因6227-44；Wenzler，H.C.等(1989)植物分子生物學1241-50)，AGP酶啟動子(Muller-Rober，B.等，植物細胞6601-612，1994)，來自馬鈴薯的蛋白酶抑制劑II啟動子(Keil，M.等(1989)EMBO雜志81323-1330)，或來自馬鈴薯的組織蛋白酶D抑制劑啟動子(Herbers，K.等(1994)植物分子生物學2673-83)。也可以使用其它組織特異性啟動子，如來自馬鈴薯多聚半乳糖醛酸酶基因的果實特異性啟動子(Grierson，D.等，核酸研究148595-8603)，或來自菜豆的種子特異性菜豆堿啟動子(Sengupta-Gopalan，C.(1985)，美國科學院院報823320-3324)。其它可以使用的啟動子是誘導型啟動子，如衍生自豌豆rbcS基因的誘導型啟動子(CoruzziG.等(1984)，EMBO雜志31671-1679)和來自水稻的肌動蛋白啟動子(McElroy，D.等(1990)植物細胞2163-171)。
啟動子通常在每個基因的5’區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)。由于在高等植物中發(fā)生賴氨酸生物合成的細胞器是質(zhì)體，因此基因構(gòu)建體還包含一個編碼轉(zhuǎn)運肽的DNA序列，所述轉(zhuǎn)運肽參與蛋白質(zhì)從細胞溶膠中進入質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(Van和Broeck，G.等(1985)自然313358-363；Schreier，P.H.等(1985)EMBO雜志425-32)。葉綠體定向信號可以天然存在于源于植物的DHPS基因中，或當DHPS基因源自細菌，真菌或藻類時葉綠體定向信號被加入其中。融合于編碼DHPS的DNA序列的編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽的DNA序列，在轉(zhuǎn)化的植物細胞的胞質(zhì)中表達產(chǎn)生融合的DHPS/轉(zhuǎn)運肽嵌合蛋白，將其轉(zhuǎn)運至質(zhì)體，從而獲得賴氨酸產(chǎn)量增加。
在本發(fā)明的一個具體的實施方案中，將編碼轉(zhuǎn)運肽的DNA序列的3’末端融合于編碼DHPS的DNA序列中，將其融合于一轉(zhuǎn)錄終止DNA信號。此終止信號包含一個3’轉(zhuǎn)錄終止信號和一個mRNA聚腺苷酸化信號?？梢允褂迷谌魏慰寺〉幕?’側(cè)翼區(qū)的終止信號，所述基因例如是豌豆rbcS基因，菜豆菜豆堿基因，或衍生自Agrobacterium tumefaciens的Ti質(zhì)粒的胭脂氨酸合酶基因。優(yōu)選的終止子序列源自來自Agrobacterium tumefaciens的Ti質(zhì)粒的章魚氨酸合酶基因的3’側(cè)翼區(qū)(圖3；Greve，H.D.等(1983)分子應用遺傳學雜志1499-511)。
本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明核酸的載體。例如，表達載體可以是高拷貝數(shù)pUC或pBR322衍生的質(zhì)粒類型，可用于直接轉(zhuǎn)化方法，如電穿孔，顆粒轟擊或聚乙二醇介導的轉(zhuǎn)化方法?；蛘撸磉_構(gòu)建體包含在Ti質(zhì)粒衍生的所謂二元載體(binary vector)如pBINPLUS(Van Engelen，F(xiàn).A.等(1995)轉(zhuǎn)基因研究4288-290)上。Ti質(zhì)?？梢栽贏grobacterium tumefaciens中增殖，從中將插入在左右邊界之間的DNA片段移至植物細胞中。
將表達載體導入宿主細胞中如真菌，細菌，藻類或植物細胞中，所述表達載體中克隆有本發(fā)明提供的基因構(gòu)建體如嵌合的基因構(gòu)建體?？梢允褂萌魏文苻D(zhuǎn)移DNA的轉(zhuǎn)化方法進行導入；針對植物，已經(jīng)開發(fā)了針對單子葉或雙子葉植物細胞的方法。例如，通過電穿孔(Dekeyser，R.A.等(1990)植物細胞2591-602)，通過PEG沉淀(Hayashimoto，A.等(1990)植物生理學93857-863)，或通過顆粒轟擊(Gordon-Kann，W.J.等植物細胞2603-618)直接轉(zhuǎn)移DNA而轉(zhuǎn)化植物細胞，及通過用農(nóng)桿菌感染將DNA移至植物細胞中。優(yōu)選的方法是用Agrobacterium tumefaciens感染植物細胞(Horsch，R.B.等(1985)，科學2271229-1231；Visser，R.G.F.(1991)植物組織培養(yǎng)手冊B5(K.Lindsey編輯)1-9，Kluwer科學出版社，荷蘭)。本發(fā)明所用的馬鈴薯或草的方法也可用于改良許多其它農(nóng)作物如轉(zhuǎn)基因甜菜，胡蘿卜，木薯，canola，紫花苜蓿，豆類，和禾本科植物如水稻，玉米，小麥，高粱，大麥，及草類如Lolium perenne。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述植物包含一個塊莖，如馬鈴薯，從中通過本發(fā)明所述的組織特異性表達可以獲得富集賴氨酸的植物?？梢詢?yōu)先表達DHPS基因的其它特異性組織包括根和種子。
轉(zhuǎn)化的植物例如是通過對卡那霉素或其它抗生素如潮霉素，或?qū)Τ輨┤鏱ialaphos或phosphinotricin的抗性加以選擇的。
或者，具有高賴氨酸含量的所需轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因宿主細胞(從中可獲得植物)，是通過在存在賴氨酸類似物如S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)的情況下培養(yǎng)而加以選擇，而不用通過如上所述選擇大腸桿菌宿主細胞時使用的對抗生素或除草劑的抗性加以選擇。在一個優(yōu)選的實施例中，用于驅(qū)動DHPS表達的組織特異性啟動子在AEC選擇期間被激活。例如，塊莖特異性顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)啟動子由高水平蔗糖誘導(Visser，R.G.F.等(1991)植物分子生物學17691-699)，AGP酶啟動子(Muller-Rober，B.等(1990)分子基因遺傳學224136-146)和I型patatine啟動子(Wenzler，H.C.等(1989)植物分子生物學1241-50)同樣如此。其它組織特異性啟動子如來自菜豆的種子特異性菜豆堿啟動子，和來自玉米的玉米醇溶蛋白啟動子是在AEC選擇期間通過加入ABA誘導的(Muller，M.等(1997)植物雜志12(2)281；Bustos，M.M.等(1998)植物分子生物學37(20)265)。因此除了DHPS基因之外，不需導入標記基因。
本發(fā)明還提供了一種獲得具有相對高賴氨酸含量的植物的方法，包括收獲至少一部分本發(fā)明的植物。本領域已知收獲農(nóng)作物和獲得特異性植物原料如種子，葉，莖，根，塊莖或果實的方法，根據(jù)這些方法從本發(fā)明的植物中獲得植物原料。本發(fā)明因此提供了一種提高賴氨酸含量相對較低的食物中賴氨酸含量的方法，包括將本發(fā)明的植物原料加入所述食物中。本發(fā)明還提供了富含賴氨酸的食物，而且還可使用本發(fā)明的富含賴氨酸的植物原料本身，如將富含賴氨酸的馬鈴薯，草類，種子或果實作為食物。在以下非限制性詳述中進一步闡述了本發(fā)明。
詳述實施例1克隆馬鈴薯DHPS cDNA使用標準方法進行DNA分離，亞克隆，限制分析和DNA測序分析(Sambrook，J.等(1989)分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版；Ausubel，F(xiàn).M.等(1994)分子生物學通用方法，JohnWiley&Sons)。
為分離編碼DHPS的Solanum tuberosum cv Kardal基因，在載體λTriplEx(Clontech)中構(gòu)建制備自幼塊莖的mRNA的cDNA文庫。將用于通過異源雜交篩選cDNA文庫的一個特異的600堿基對的DHPS DNA片段在分離自Arabidopsis thaliana的總RNA上，通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)克隆，隨后與載體pMOSBlue(Amersham)連接，產(chǎn)生pAAP15。為此，使用基于Arabidopsis thalianaDHPS基因的序列的合成寡核苷酸(Vauterin&Jacobs，1994)。
選擇來自與pAAP15雜交的cDNA的一個單噬斑，并對其1190bp的DNA插入體完全測序(圖2A)。推斷其編碼DHPS酶。將包含完整編碼序列的DNA片段，通過基于PCR的方法克隆入克隆載體pBluescript SK(+)(Stratagene)中，以使β-半乳糖苷酶-DHPS融合蛋白在lac啟動子控制下可以在大腸桿菌中表達。所得質(zhì)粒稱為pAAP57。這個基因構(gòu)建體能互補大腸桿菌AT997(Yeh等，1988)，這是一種DHPS缺陷菌株，使其能在沒有DL-α，ε-二氨基庚二酸的情況下在基本培養(yǎng)基上生長。實施例2產(chǎn)生賴氨酸不敏感性DHPS基因的誘變?yōu)楫a(chǎn)生反饋不敏感DHPS，將pAAP57中相應于進化保守的氨基酸殘基134(天冬酰胺)的核苷酸，通過基于PCR的方法隨機改變換(QuickChange定位誘變，Stratagen)，產(chǎn)生編碼在134位具有不同氨基酸殘基的DHPS酶的質(zhì)粒群。在用這些質(zhì)粒群轉(zhuǎn)化大腸桿菌AT997后，在存在1mM賴氨酸類似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)的情況下，選擇反饋不敏感性。挑取一些AEC抗性菌落，并對產(chǎn)生AEC抗性的質(zhì)粒DHPS編碼區(qū)進行測序(圖2B)。將AAC轉(zhuǎn)變?yōu)門GT或TGC導致在DHPS的134位的天冬酰胺相應轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼釟埢?。將編碼突變DHPS的DNA片段(稱為DHPS-134ncl)用于在馬鈴薯植物中表達。實施例3具有突變的馬鈴薯DHPS基因的嵌合基因構(gòu)建體將來自pTriplex載體(pAAP42)的DHPS cDNA首先亞克隆在pCR-Script SK(+)(pAAP55)中，并從這個載體中將其作為用XbaI-EcoR消化的XbaI-EcoRI片段亞克隆在pBluescript SK載體(pAAP57)中，構(gòu)建含有突變的DHPS基因的嵌合基因。用這個克隆進行誘變，產(chǎn)生pAAP57-134ncl克隆。在5’末端，將突變的DHPScDNA融合于800bp長的GBSS啟動子片段的HindIII-SalI片段(Visser等，如前)。在突變的DHPS序列的下游，插入作為SstI-EcoRI片段的來自Agrobacterium tumefaciens的胭脂氨酸合酶基因的終止信號(Greve，H.D.等(1983)分子應用遺傳學1499-511)。將完整的嵌合基因亞克隆入pBINPLUS的HindII-EcoRI位點(Van Engelen，F(xiàn).A.等(1995)轉(zhuǎn)基因研究4288-290)(pAAP105，圖3)。實施例4將嵌合基因?qū)腭R鈴薯4.1轉(zhuǎn)化馬鈴薯植物將二元級載體pAAP105用于凍-融轉(zhuǎn)化Agrobacteriumtumefaciens菌株AGLO(Hofgen，R.和Willmitzer，L.(1988)核酸研究169877)。接著將轉(zhuǎn)化的AGLO用于接種馬鈴薯(Solanumtuberosum，Kardal的變種)莖外植體，如Visser所述(Visser，R.G.F.(1991)植物組織培養(yǎng)手冊B5(K.Lindsey編輯)1-9，Kluwer科學出版社，荷蘭)。在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上再生莖與根之后，將植物置于土壤中，并移至溫室中。將從莖外植體中再生的植物(在沒有卡那霉素的培養(yǎng)基上再生的)，用沒有二元載體的農(nóng)桿菌菌株AGLO處理作為對照。4.2在AEC上選擇轉(zhuǎn)化的植物細胞除了以上(4.1)中如Visser所述在含有卡那霉素培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化的植物細胞(Visser，R.G.F.(1991)植物組織培養(yǎng)手冊B5(K.Lindsey編輯)1-9，Kluwer科學出版社)，含有突變的DHPS基因的轉(zhuǎn)化的植物細胞也可以在賴氨酸類似物AEC之上進行選擇。在用轉(zhuǎn)化的(AGI0)菌株接種例如馬鈴薯莖外植體之后，一般將外植體首先在沒有AEC的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在短期例如12-20天，如16天后，將它們移至具有0.1mM AEC和足夠濃度(例如5％)蔗糖的培養(yǎng)基中。當觀測到第一個原基后，將外植體移至0.025mM AEC和蔗糖中。在沒有AEC/蔗糖選擇的情況下進行根誘導。4.3體外塊莖形成為在體外誘導塊莖形成，將轉(zhuǎn)化的馬鈴薯小植株的節(jié)段(大約4-5cm長)垂直置于固體Murashige和Skoog培養(yǎng)基中(Murashige，T.和Skoog，F(xiàn).(1962)植物生理學15473-497)，該培養(yǎng)基補加了10％(w/v)蔗糖，5TM BAP。將培養(yǎng)物在黑暗中保持在19℃。在14天之后，收獲直徑4mm的微塊莖并分析游離賴氨酸和蘇氨酸含量，及AK和DHPS活性。如下所述分析蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)組成。4.4通過在氨乙基半胱氨酸(AEC)上選擇具有高DHPS*表達的轉(zhuǎn)化的嫩莖除了通過農(nóng)桿菌接種，用pAAP105構(gòu)建體轉(zhuǎn)化之后在卡那霉素上進行選擇(見實施例4.1)，可以通過在含有賴氨酸類似物的培養(yǎng)基上生根選擇轉(zhuǎn)化的嫩莖。突變的DHPS基因可以用作選擇標記，因為具有高含量賴氨酸的植物細胞可以在毒性賴氨酸類似物上生長，毒性賴氨酸類似物例如是氨乙基半胱氨酸(AEC)。由于反饋不敏感和所得高內(nèi)源性賴氨酸水平，毒性類似物被稀釋且不能結(jié)合突變的酶中的賴氨酸結(jié)合位點。
在用含有pAAP105的農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化馬鈴薯莖外植體(見4.1)之后，將外植體置于沒有卡那霉素的嫩莖再生培養(yǎng)基上。當出現(xiàn)嫩莖時，將它們直接置于含有0.06mM AEC和50g/l蔗糖(為誘導GBSS啟動子)的生根培養(yǎng)基上，或首先在沒有AEC的生根培養(yǎng)基上生根，隨后再在含有0.06mM AEC和50g/l蔗糖的培養(yǎng)基中生根。切下能在這種AEC濃度生根的嫩莖，在含有0.1mM AEC和50g/l蔗糖的培養(yǎng)基上生根。耐受0.06和0.1mM AEC的生根標準如下—根應在嫩莖的切口處出現(xiàn)—切口不應是黃褐色和腐爛的—根尖應是淡色的。
使轉(zhuǎn)基因植物塊莖中具有高賴氨酸水平的轉(zhuǎn)化頻率為大約0.5％。實施例5多年生黑麥草(Lolium perenneL)的DHPS修飾植物材料來自不同的Lolium perenne栽培品種如栽培品種Moronda和Aurora的胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物，直接來自種子產(chǎn)生的成熟胚，或來自得自未成熟的花序節(jié)片的胚發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)物，基本如Creemers-Molenaar等，植物科學63167-176(1989)所述。對于直接方法，將種子在10％次氯酸中滅菌，漂洗及在無菌自來水中浸泡2天，并再次滅菌。在徹底漂洗后，從40個種子中割裂成熟胚，剁碎并移至在60ml塑料樣品容器(Thovadex)中的5ml MS10培養(yǎng)基(即Murashige和Skoog基本鹽和維生素，補加10mg/l 2，4-D和3％蔗糖，pH5.8)中。準備多份。胚發(fā)生愈傷組織是在用5％次氯酸滅菌和用無菌水漂洗后，在溫室中生長的植物的未成熟的花序節(jié)片上誘導的。將花序的基底部分切成2個1-2mm長的節(jié)段，并置于用0.8％Daichin瓊脂固化的MSt5培養(yǎng)基(即MS基本鹽和維生素，補加0.4mg/l(＝額外的)維生素B1，5mg/l 2，4-D和3％蔗糖)上。在25℃在黑暗中培養(yǎng)。在4-8周后，從2-5個植物的外植體(即基因型)切下胚發(fā)生愈傷組織。將愈傷組織混合，用解剖刀剁碎，并將0.1g FW等分移至樣品容器中5ml MS10培養(yǎng)基中。從此，同樣處理這兩個來源的培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)混合器中在25℃在持續(xù)間接光照下(200-4001ux)溫育(140revs./分)。
在10天后，將培養(yǎng)基用MS5(與MS10相同，但具有5mg/l2，4-D)置換。在培養(yǎng)物中一周加入一次2ml的新鮮培養(yǎng)基，直至終體積為15ml。接著，將培養(yǎng)物移至新的190ml透明的聚苯乙烯容器中(Greiner)，并加入5ml新鮮的培養(yǎng)基。為進行進一步的實驗，選擇良好增殖的，充分分散的培養(yǎng)物，并保持每周在20ml新鮮MS5培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)2.5g FW材料。溫育是在黑暗中在25℃以120revs./分持續(xù)搖動進行。
培養(yǎng)物的再生潛力通過將0.5-1.0g FW原料置于固體MS0(0mg/l 2，4-D；0.8％瓊脂)上確定。在前兩周在25℃在黑暗中培養(yǎng)后，將愈傷組織在后兩周置于暗光(500-1000lux)中16小時/天。最后，在移至新鮮MS0中后，將它們置于4000lux，16小時/天條件下，并在4周后評估產(chǎn)生嫩莖的愈傷組織數(shù)目。轉(zhuǎn)化在傳代培養(yǎng)3天后，將由對數(shù)期細胞組成的0.25g FW愈傷組織材料均勻分散于直徑42mm的Whatman濾紙圓片(Schleicher&Schuell #604)表面。接著，將濾紙片通過加入0.5ml新鮮培養(yǎng)基而濕潤，并將它們置于用0.2％Gelrite固化的培養(yǎng)基上，在25℃在黑暗中過夜。第二天，將攜帶多年生黑麥草懸浮材料的濾紙用于使用PDS1000-He粒子槍(BioRad)進行biolistic基因轉(zhuǎn)移。將平均直徑為1μm的0.375mg金粒用0.625μg質(zhì)粒pAAP205的DNA包被，質(zhì)粒pAAP205是實施例3中所述的質(zhì)粒pAAP105的衍生物，其沒有T-DNA邊界，及nptII基因由hpt基因置換，以選擇轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草細胞。為進行包被，將50μl(＝3mg)洗過的粒子通過渦旋徹底懸浮。接著，加入5μl質(zhì)粒DNA(濃度為1μg/ul)和50μl 2.5MCaCl2，并渦旋10秒鐘。然后，加入20μl 0.1M游離堿亞精胺，并通過渦旋2秒鐘混合。將此混合物離心5秒鐘，除去上清，之后加入250μl 96％的乙醇，保持在冰上直至使用。可以在1100-2200psi壓力范圍內(nèi)進行轟擊，但在此實施例中特別使用1800psi的壓力，同時將含有濾紙的培養(yǎng)皿置于9cm處。在biolistics后，將濾紙在25℃在黑暗中在培養(yǎng)基上溫育24小時，之后將它們移至選擇培養(yǎng)基中。為進行選擇，將濾紙首先置于用0.2％Gelrite固化的含有80mg/l潮霉素的MSt5培養(yǎng)基上；1周后將濾紙移至含有150mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基中。迄今為止，這基本如前所述(Van der Maas等，植物分子生物學24401-405(1994))。4周后，將活性生長的愈傷組織分別移至新鮮的選擇培養(yǎng)基中(150Hyg)。在這個第二次選擇循環(huán)后，將存活的愈傷組織置于補加50mg/l潮霉素的再生培養(yǎng)基上。由此獲得轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草植物并在8周后收獲。將它們保持在含有一半濃度MS0(Creemers-Molenaar等，植物科學57165-172(1988))的試管中，接著通過PCR和Southern雜交分析進行分子學定性，及通過實施例6-9所述的氨基酸，酶活性和蛋白質(zhì)分析進行生物化學定性，以證實新導入的基因構(gòu)建體存在并表達。實施例6分析轉(zhuǎn)基因植物中游離氨基酸含量將組織(0.5-1.0g)用研缽和研杵在含有1mM二硫蘇糖醇的2ml50mM Pi緩沖液(pH7.0)中均質(zhì)。加入正亮氨酸作為內(nèi)部標準。將游離氨基酸通過用5ml水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12)提取而部分純化。收集水相并將剩余物再提取兩次。在通過凍干至3ml濃縮后，將20μl樣品通過使用陽離子交換層析柱進行HPLC分析，及在570和440nm檢測的氨基酸的柱后茚三酮衍生化(BIOCHROM 20，Amersham Pharmacia Biotech)。圖4示出了27個未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物和含有突變的DHPS基因構(gòu)建體pAAP105的30個馬鈴薯植物塊莖中的以總氨基酸的百分比表示的賴氨酸水平。賴氨酸水平從對照的野生型塊莖中的2-2.5％提高至轉(zhuǎn)化的塊莖中的最大30％，說明賴氨酸是“豐富”氨基酸而不是“低水平”必需氨基酸。實施例7分析轉(zhuǎn)基因植物中DHPS酶活性將微塊莖或成熟塊莖用研缽和研杵在等體積的含有2mMEDTA，1.4％抗壞血酸鈉，1mM苯甲基磺酰氟和0.5Tg/ml亮抑蛋白酶肽的冷的100mM Tris-HCl，pH7.5中均質(zhì)。在離心5分鐘后(16000g，4℃)，收集上清。使用Yugari和Gilvarg的O-氨基苯醛(O-ABA)方法(Yugari，Y和Gilvarg，C.(1965)生物化學雜志2404710-4716)，測定DHPS活性。正如所期望的，當分別對比對照組(未轉(zhuǎn)化的)及轉(zhuǎn)化的馬鈴薯塊莖的野生型和突變的DHPS活性時，轉(zhuǎn)化的AEC敏感性降低，甚至即使在AEC提高的水平下也示出DHPS活性。實施例8轉(zhuǎn)基因植物的DNA分析基因組DNA分離自生長于溫室中的馬鈴薯植物的塊莖。將凍干的組織在液氮中研磨，并加入至15ml提取緩沖液(100mMTris-HCl，pH8，500mM NaCl，50mM EDTA和10mMβ-巰基乙醇)和2ml 10％SDS中。在65℃溫育20分鐘后，加入5ml的5M KAc，并在冰上溫育15分鐘。在離心后，過濾上清，并用15ml異丙醇沉淀，將沉淀再懸浮于400μl TE中，并用1μg RNAse處理。接著將DNA用CTAB(N-十六烷基-NNN-三乙基溴化銨)純化，通過加入400μl的CTAB緩沖液(200mM Tris-HCl pH7.5，50mM EDTA，2mM NaCl和2％CTAB)提取，在65℃溫育15分鐘。在用800μl氯仿/異戊醇24∶1提取后，將DNA用800μl異丙醇沉淀。將沉淀用70％乙醇洗并再懸浮于TE中。在將DNA用限制酶消化后，將DNA在瓊脂糖凝膠上按大小分級，并印跡于Hybond-N+(Amersham)上。從DHPScDNA產(chǎn)生隨機引物標記的探針(從337至811位，圖2)。將濾膜在65℃在10％硫酸葡聚糖，1％SDS和1M NaCl中雜交16-20小時，接著在55℃和60℃用2×SSC，0.1％SDS洗，在65℃用0.1×SSC，0.1％SDS洗。實施例9轉(zhuǎn)基因植物在RNA水平的表達分析根據(jù)Ausubel等(1994)所述的方法，從在溫室中生長的馬鈴薯植物塊莖中分離總RNA。將RNA在甲醛瓊脂糖凝膠上按大小分級，并印跡于Hybond-N+(Amersham)上。將印跡短時染色以保證存在等量RNA。從DHPS cDNA產(chǎn)生隨機引物標記的探針(從337至811位，圖2)。將濾膜在65℃在10％硫酸葡聚糖，1％SDS和1M NaCl中雜交16-20小時，接著在55℃和60℃用2×SSC，0.1％SDS洗，在65℃用0.1×SSC，0.1％SDS洗。
附圖簡述
圖1天冬氨酸家族生物合成途徑圖式。只示出了主要的關鍵酶。曲線箭頭代表由終產(chǎn)物氨基酸的反饋抑制；DHPS，二氫吡啶二羧酸合酶；HSD，高絲氨酸脫氫酶；TDH，蘇氨酸水解酶。
圖2(A)編碼分離自馬鈴薯的DHPS的核酸片段。產(chǎn)生的氨基酸序列用單字母代碼表示。(B)突變的DHPS(DHPS-134nc)的賴氨酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸序列及衍生的氨基酸序列。
圖3質(zhì)粒pAAP105的T-DNA區(qū)域的示意圖，涵蓋了在顆粒結(jié)合淀粉合酶啟動子(P-GBSS)控制下的突變的DHPS編碼區(qū)(DHPS)，和在胭脂氨酸合酶啟動子(P-NOS)控制下的作為選擇標記的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶11編碼區(qū)(NPT11)；I-NOS，胭脂氨酸合酶轉(zhuǎn)錄終止子。
圖4產(chǎn)生自不同的，獨立的轉(zhuǎn)化體或?qū)φ罩参飰K莖的游離賴氨酸濃度(μmol/g鮮重)。將植物在溫室的罐中生長直至成熟。在收獲后，將塊莖在分析之前干燥一周。將大約10g的塊莖材料在50ml的1mM二硫蘇糖醇(DTT)溶液中研磨。將2ml所得懸浮液用甲醇∶水∶氯仿混合物(12∶3∶5)提取。在濃縮至0.5ml后，將25μl在Biochrom20(Amersham-Phamacia)基于鋰的離子交換氨基酸分析系統(tǒng)上進行分析。在研磨前在樣品中摻加L-正亮氨酸，以使其校正。
圖5一些轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物的Southern印跡DNA分析。從一些獨立轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物中分離基因組DNA，并用HindII或HindII和BamHI組合消化。在分離和印跡后，將DNA片段與放射標記的DHPS探針雜交。未轉(zhuǎn)化的對照植物(C)只示出內(nèi)源性DHPS片段的雜交。在這些條帶的上部，轉(zhuǎn)化的植物示出一條(泳道7)或多條雜交條帶(例如泳道5)，表明插入了一或多拷貝的GBSS-DHPS*構(gòu)建體。C對照植物；M分子大小標記。
圖6一些轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物塊莖的Northern印跡RNA分析。從一些轉(zhuǎn)化的植物(泳道1-15)和對照的未轉(zhuǎn)化的植物(泳道C)的塊莖中分離總RNA。將RNA通過凝膠電泳分離并印跡于尼龍膜上。將印跡與放射標記的DHPS DNA探針雜交。來自未轉(zhuǎn)化植物的對照RNA示出內(nèi)源性DHPS RNA雜交(泳道C)。來自一些轉(zhuǎn)化植物的RNA示出與背景DHPS雜交相等的雜交(例如泳道4和9)。大多數(shù)轉(zhuǎn)化植物示出與表達的外源性DHPS*RNA強雜交(例如泳道10-12)。
參考文獻Ausubel，F(xiàn).M.等(1994)分子生物學當前方案，John Wiley&SonsBenfey，P.N.等(1990)EMBO J.91685-1696.Black，S.等(1955)生物化學雜志21327-38.Brederode，F(xiàn).T.等(1980)核酸研究82213-2223.Bright，S.W.J.等(1982)自然299278-279.Bryan，J.K.(1980)，植物生物化學(B.J.Miflin編輯)Vol.5403-452，Academic Press，N.Y.Casan，M.等(1986)，生物化學雜志2611052-1057.Cattoir-Reynaerts A.等(1983)Biochem.Physiol.Pflanzen 17881-90.Cohen和De Antonis(1994)色譜學雜志66125-34.Coruzzi G.等(1984)EMBO J.31671-1679.Dekeyser，R.A.等(1990)植物細胞2591-602Dotson，S.B.等(1990)Planta 182546-552.Dunn，M.J.，Corbett，J.M.酶學方法(1996)V271，177-203.Falco，S.C.等(1995)，生物/技術13577-582.Fluhr，R.等(1986)EMBO J.52063-2071.Frankard，V.等(1992)植物生理學991285-1293.Galili，G.(1995)植物細胞7899-906.Gallie，D.R.等(1987)核酸研究153257-3273.Glassman，K.F.(1992)植物中氨基酸生物合成和分子調(diào)節(jié)(B.K.Singh等編輯)217-228.Grg，A.et.al，(1985)電泳V6，599-604.Gordon-Kann，W.J.等(1990)植物細胞2603-618.Greve，H.D.等(1983)分子及應用遺傳學雜志1499-511.Grierson，D.等(1986)核酸研究148595-8603.Hayashimoto，A.等(1990)植物生理學93857-863.Herbers，K.等(1994)Plant Mol.Biol.2673-83.Htgen，R.和Willmitzer，L.(1988)核酸研究169877.Horsch，R.B.等(1985)科學2271229-1231.Keil，M.等(1989)EMBO J.81323-1330).Laemmli，U.K.(1970)Nature V227，680-685Lea，P.J.等(1985)氨基酸化學及生物化學(G.C.Barrett編輯)197-226，倫敦Chapman andHall.Manneberg，M等(1995)分析生物化學224122-127.Matthews，B.F.等(1989)植物生理學911569-1574.McElroy，D.等(1990)植物細胞2163-171.Mignery，C.A.等(1988)基因6227-44.Murashige，T.和Skoog，F(xiàn).(1962)植物生理學.15473-497.Negrutiu，I.等(1984)理論及應用遺傳學611-20.Pen，J.等(1992)生物/技術10292-296.Perl，A.等(1992)植物分子生物學19815-823.Richaud，C.等(1973)歐洲生物化學雜志40619-629.Richaud，F(xiàn).等(1986)細菌學雜志166297-300.Sambrook，J.等(1989)分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室出版社.Schreier，P.H.等(1985)EMBO J.425-32.Sengupta-Gopalan，C.(1985)美國科學院院刊823320-3324.Shaul，O.和Galili，G.(1992a)植物雜志2203-209.Shaul，O.和Galili，G.(1992b)植物生理學1001157-1163.Shaul，O.和Galili，G.(1993)植物分子生物學23759-768.Shedlarski，J.G.和Gilvarg，C.(1970)生物化學雜志2451362-1373.Smeekens，S.等(1985a)核酸研究133179-3194.Smeekens，S.等(1985b)自然317456-458.Umbarger，H.E.(1978)生物化學年度綜述47533-606.Vauterain，M.和Jacobs，M.(1994)植物分子生物學14545-550.Van den Broeck，G.等(1985)自然313358-363.Van Engelen，F(xiàn).A.等(1995)轉(zhuǎn)基因研究4288-290.Van Gelder，W.M.J.和Vonk，C.R.(1980)馬鈴薯研究V23 427-434.Visser，R.G.F.(1991)植物組織培養(yǎng)手冊B5(K.Lindsey編輯)1-9，Kluwer學術出版社，荷蘭.Wenzler，H.C.等(1989)植物分子生物學1241-50.Yeh，P.等(1988)分子及普通遺傳學212105-111.Yugari，Y.和Gilvarg，C.(1962)生物化學生物物理學報62612-614.Yugari，Y.和Gilvarg，C.(1965)生物化學雜志2404710-4716.
權利要求
1.一種編碼二氫吡啶二羧酸合酶(DHPS)或其功能片段的重組或分離的核酸，或其功能片段，其具有一導致至少一個單氨基酸殘基被半胱氨酸殘基置換的突變。
2.權利要求1的核酸，其中所述氨基酸置換位于或大約在DHPS的推定的賴氨酸結(jié)合位點，所述位點在大腸桿菌中位于大約75-85位。
3.權利要求1或2的核酸，其中所述單氨基酸殘基包括天冬酰胺殘基。
4.權利要求1-3任一項的核酸，其中在馬鈴薯DHPS中所述天冬酰胺殘基位于134位。
5.權利要求1-4任一項的核酸，其中所述DHPS是細菌，真菌，藻類或植物來源的。
6.權利要求5的核酸，其中所述植物是馬鈴薯。
7.一種編碼馬鈴薯DHPS或其功能片段的重組或分離的核酸或其功能片段。
8.權利要求7的核酸，其中所述核酸與圖2A所示核酸有至少90％同源性。
9.權利要求1-8任一項的核酸，還包含一種組織特異性啟動子或其功能片段。
10.權利要求9的核酸，其中所述啟動子衍生自塊莖特異性顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)啟動子。
11.一種包含權利要求1-10任一項的核酸的載體。
12.一種包含權利要求1-10任一項的核酸或權利要求11的載體的宿主細胞。
13.權利要求12的宿主細胞，包括植物細胞。
14.權利要求13的宿主細胞，其中所述植物細胞來自馬鈴薯。
15.一種選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的方法，所述宿主細胞包含編碼二氫吡啶二羧酸合酶(DHPS)或其功能片段的重組核酸或其功能片段，所述方法包括在存在S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸的情況下培養(yǎng)宿主細胞，并選擇對S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸有相對反饋不敏感性的所需宿主細胞。
16.權利要求15的方法，其中所述核酸包含權利要求1-10任一項的核酸。
17.用權利要求15或16的方法獲得的宿主細胞。
18.一種包含權利要求14或17的宿主細胞的植物。
19.權利要求18的植物，包括農(nóng)作物。
20.權利要求18或19的植物，包括塊莖。
21.一種來自權利要求20的植物的塊莖。
22.一種獲得具有相對高賴氨酸含量的植物材料的方法，包括收獲權利要求18的植物的至少一部分。
23.通過權利要求22的方法獲得的植物材料。
24.一種提高賴氨酸含量相對較低的食物或飼料的賴氨酸含量的方法，包括在所述食物或飼料中加入權利要求23的植物材料。
25.根據(jù)權利要求24的方法獲得的食物或飼料。
26.包含權利要求24的植物材料的食物或飼料。
全文摘要
本發(fā)明涉及導致必需氨基酸在細胞中累積的生物合成關鍵酶的修飾。編碼二氫吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase，DHPS)或其功能片段的重組或分離核酸或其功能片段中已被引入一突變，以用半胱氨酸置換至少一個單氨基酸殘基。
文檔編號C12N9/88GK1413256SQ00817683
公開日2003年4月23日 申請日期2000年12月21日 優(yōu)先權日1999年12月24日
發(fā)明者奧斯卡·弗雷德里克·約瑟夫·福斯特, 英格麗德·瑪麗亞·范德梅爾, 尼古拉斯·克萊門茨·瑪麗亞·亨里克斯·德費滕 申請人:馬鈴薯及衍生產(chǎn)品合作銷售生產(chǎn)阿韋貝公司