專利名稱：制備芳香醛和/或羧酸的微生物方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用表達(dá)二甲苯單加氧酶或鏈烷單加氧酶的重組微生物制備芳香醛和/或羧酸衍生物的氧化微生物方法。
二甲苯單加氧酶(XMO)，例如通過(guò)惡臭假單胞菌mt-2的TOL質(zhì)粒pWWO編碼的，是在分解甲苯和二甲苯中起關(guān)鍵作用的一種酶體系。XMO屬于烷基羥化酶族并選擇性地羥化芳香環(huán)上的甲基。這是代謝途徑的第一步(參見


圖1(A))，它導(dǎo)致形成羧酸衍生物，然后羧酸衍生物通過(guò)分支分解代謝途徑(meta-Abbauweg)轉(zhuǎn)變成三羧酸循環(huán)的底物。
XMO是由基因xylM和xylA(xylMA基因庫(kù)登記號(hào)M37480)編碼的兩個(gè)多肽亞單元XylM和XylA組成的。XylA是一種NADH受體還原酶，即一種從NADH向XylM轉(zhuǎn)移還原當(dāng)量的電子傳遞蛋白，一種位于膜中的羥化酶。
XylM活性依賴于磷脂類和Fe(II)離子的存在并且pH最佳值為7。XylM的氨基酸系列顯示與食油假單胞菌GPol鏈烷羥化酶的羥化酶組分AlkB的氨基酸系列有25％相同。
鏈烷羥化酶是中度鏈長(zhǎng)鏈烷的分解代謝途徑中的第一種酶，在該途徑中有一系列酶參與，它們是在分解代謝OCT質(zhì)粒上由兩個(gè)alk基因簇編碼的。
圖1(A)所示代謝途徑中的第二種酶是苯甲醇脫氫酶(BADH)，它是含鋅脫氫酶族中的一種同源二聚體成員，其底物是長(zhǎng)鏈醇。這種酶由xylB基因編碼。
圖1(A)所示代謝途徑中的第三種酶是苯甲醛脫氫酶(BZDH)，又是一種同源二聚體，并且是由xylC基因編碼的。
上述基因和酶的功能和性能的更詳細(xì)的信息可以在參考文獻(xiàn)(1)-(18)中找到。
以它們表達(dá)XMO的方式遺傳工程的大腸桿菌證實(shí)不僅能夠氧化甲苯和二甲苯，而且能夠氧化間-和對(duì)-乙基-、甲氧基-、硝基-和氯-取代的甲苯和間-溴-取代的甲苯，從而得到相應(yīng)的苯甲醇衍生物(19，20)。將苯乙烯氧化為氧化苯乙烯(ee 95％)。此外，還猜測(cè)XMO催化
圖1(A)所示代謝途徑中的第二步，即體內(nèi)氧化(即在試驗(yàn)中在完全活的細(xì)胞上)苯甲醇得到相應(yīng)的醛(2，21)。也已經(jīng)觀察到在
圖1(A)所示的代謝途徑第三步之后苯甲醛轉(zhuǎn)變成苯甲酸，但是將其歸于大腸桿菌中的非特異性脫氫酶(2)。與之相反，用部分純化的XylMA(也同含義地用于XMO的本說(shuō)明書中，即用于由兩個(gè)多肽亞單元，即XylM和XylA組成的功能酶)在體外進(jìn)行的進(jìn)一步試驗(yàn)，已顯示這種酶相對(duì)于苯甲醇沒(méi)有活性(9)。這種不符合的原因還不清楚。
由于二甲苯單加氧酶和鏈烷單加氧酶之間的優(yōu)異同源性(AMO，也稱之為鏈烷羥化酶；基因庫(kù)登記號(hào)AJ245436)，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員希望就催化反應(yīng)的性質(zhì)和程度而言的兩個(gè)體系具有相似的限制。
現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于制備芳香醛或羧酸的生物催化方法，由于似乎需要大量酶才能進(jìn)行這些方法，因此一直不令人滿意。同樣地，由于需要區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性，因此證實(shí)難以化學(xué)合成。
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單地制備芳香醛和/或羧酸的方法。
已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明，出人意料地，通過(guò)簡(jiǎn)單的微生物制備方法就實(shí)現(xiàn)了該目的。具體地說(shuō)，本發(fā)明基于出人意料地發(fā)現(xiàn)XMO和AMO分別能夠催化
圖1(A)和1(B)中所示反應(yīng)途徑的每一步，即將烷基取代的芳香化合物經(jīng)過(guò)相應(yīng)的醇衍生物和相應(yīng)的醛衍生物作為中間產(chǎn)物氧化得到其羧酸衍生物。還出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用XMO基因的特定表達(dá)體系，即xylM和xylA，可以獲得在表達(dá)XMO的重組大腸桿菌上比早期研究高10-20倍的活性(20，21)。
因此本發(fā)明的第一個(gè)主題是一種制備通式I的芳香醛和/或羧酸的方法Ar-(CH2)n-R1(I)其中Ar是任選地單取代或多取代的單核芳香環(huán)，R1是含氧基團(tuán)-CHO或-COOH，和n是0-15的整數(shù)，例如0-12，1-6或6-12，所述方法包括a)培養(yǎng)，具體地說(shuō)在含有通式II的芳香底物的培養(yǎng)基中需氧培養(yǎng)表達(dá)選自以下酶的微生物二甲苯單加氧酶(XMO)和鏈烷單加氧酶(AMO)，Ar-R2(II)其中
Ar定義如上，并且R2是-CH＝CH2或-(CH2)n+1R3，其中n定義如上，并且R3是H或OH；或者，如果R1是-COOH時(shí)，R2也可以是-(CH2)nR4，其中n定義如上，并且R4是-CHO，和b)將通式I的化合物與培養(yǎng)基分離。
因此，本發(fā)明的反應(yīng)可以使用相同酶以一步或多步進(jìn)行?？梢允褂玫牡孜锸峭榛枷慊衔?、相應(yīng)的醇或相應(yīng)的醛。所用底物的氧化程度可以以如上所述的簡(jiǎn)單方式加以控制。
無(wú)需受理論的約束，根據(jù)質(zhì)譜法獲得的碎片化模式的18O加入試驗(yàn)顯示XMO催化的醇氧化的最可能的機(jī)理是通過(guò)形成作為中間產(chǎn)物的偕二醇(geminalen Diols)，然后將其脫氫，可能以非立體專一性方式，得到其醛進(jìn)行的(參見圖6)。
本發(fā)明制備或者用作底物的通式I和II的化合物中的芳環(huán)體系可以經(jīng)過(guò)單取代或多取代。該環(huán)取代基的位置可以按所需進(jìn)行選擇。然而，優(yōu)選待氧化的側(cè)鏈的間位和/或?qū)ξ弧?br> 可以根據(jù)本發(fā)明的方法通過(guò)XMO氧化的通式II的底物的特定非限制性實(shí)例是甲苯、二甲苯、苯乙烯、間-和/或?qū)?甲基-、乙基-、甲氧基-、硝基-和氯-取代的甲苯、和間-溴-取代的甲苯和假枯烯(即三甲基苯)；和這些化合物的相應(yīng)的醇和醛。根據(jù)本發(fā)明的方法可以被AMO氧化的通式II的底物的特定非限制性實(shí)例是甲苯、乙基苯、正-和異-丙基苯、正丁基苯和這些化合物的間-和/或?qū)?甲基-、乙基-、甲氧基-、硝基-和氯-取代的類似物；和這些化合物的相應(yīng)的醇和醛。
優(yōu)選使用以下酶進(jìn)行本發(fā)明的方法XMO，根據(jù)xylMA基因庫(kù)登記號(hào)M37480的基因xylA和xylB編碼，以及相應(yīng)的同工酶。XMO優(yōu)選得自假單胞菌屬，具體地說(shuō)是惡臭假單胞菌，優(yōu)選菌株mt-2(ATCC 33015)。
AMO，根據(jù)基因庫(kù)登記號(hào)AJ245436的基因alkB、alkG和alkT編碼的，以及相應(yīng)的同工酶(例如alkB的同工酶)。AMO優(yōu)選得自假單胞菌屬，具體地說(shuō)是食油假單胞菌，優(yōu)選菌株GPol(ATCC 29347)。
本發(fā)明還包括已具體公開的XMO和AMO的“功能等價(jià)物”的用途。
已具體公開的單加氧酶的“功能等價(jià)物”或類似物就本發(fā)明目的而言是彼此不同、連續(xù)顯示所需反應(yīng)并且可用于制備上面通式I的醛和/或羧酸的酶。
根據(jù)本發(fā)明，“功能等價(jià)物”應(yīng)理解為，特別是，在至少一個(gè)系列位置具有除最初氨基酸之外的氨基酸的酶突變體，盡管如此，但是它催化上述氧化反應(yīng)中的一種。因此，“功能等價(jià)物”包括能夠通過(guò)添加、置換、缺失和/或翻轉(zhuǎn)一個(gè)或多個(gè)氨基酸獲得的突變體，可以在任意系列位置發(fā)生所述修飾，只要它們使得突變體具有本發(fā)明的催化活性。功能等價(jià)物尤其還存在于當(dāng)突變體和未修飾酶之間的反應(yīng)性圖譜(Reaktivit_tsmuster)在量方面相同時(shí)，即例如當(dāng)相同的底物以不同速度轉(zhuǎn)化時(shí)。
自然，“功能等價(jià)物”還包括可以由其它生物體，例如由本文具體提及的那些之外的細(xì)菌獲得，并且天然存在變體或同工酶的單加氧酶。例如，同源系列區(qū)域的區(qū)域可以通過(guò)系列對(duì)比的方式確定，并且可以參照本發(fā)明的特定說(shuō)明測(cè)定等價(jià)酶。
本發(fā)明還包括除了特定提及的那些(單鏈和雙鏈DNA和RNA系列)之外編碼上述單加氧酶及其功能等價(jià)物之一的核酸系列的用途?？捎糜诒景l(fā)明的其它核酸系列因此與通過(guò)添加、置換、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸特異性使用的系列不同，但是連續(xù)編碼具有所需性能圖譜的單加氧酶。
與具體提及的系列相比，含有所謂的沉默突變或者通過(guò)使用特定來(lái)源的微生物或宿主微生物的密碼子經(jīng)過(guò)修飾的這些核酸系列的用途也包括在本發(fā)明內(nèi)，如天然存在的變體，例如其剪接變體。另一主題是能夠通過(guò)保守核苷酸置換獲得的系列(即，所討論的氨基酸被相同電荷、大小、極性和/或溶解度的氨基酸替換)。
而且本發(fā)明的主題還有表達(dá)構(gòu)建體，含有在調(diào)節(jié)核酸系列的遺傳控制下，編碼用于本發(fā)明的單加氧酶的核酸系列；以及含有至少一種這些表達(dá)構(gòu)建體的載體。本發(fā)明的這些構(gòu)建體優(yōu)選包括所討論的編碼系列的5′-上游、啟動(dòng)子和3′-下游、終止子系列和，如果適宜的話，其它常規(guī)調(diào)節(jié)成分，在每種情況下與編碼系列可操縱地相連?！安倏v相連”應(yīng)理解為啟動(dòng)子、編碼序列、終止子和，如果適宜的話，其它調(diào)節(jié)成分以表達(dá)其編碼序列時(shí)每個(gè)調(diào)節(jié)成分可以實(shí)現(xiàn)其所需的功能的序列排列。能夠可操縱地相連的序列的例子是靶序列和翻譯增強(qiáng)子、其它增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)等。其它調(diào)節(jié)成分包括可選擇性標(biāo)記、擴(kuò)增信號(hào)、復(fù)制源等。
除了人工調(diào)節(jié)序列之外，在實(shí)際構(gòu)建基因之前也可以存在天然調(diào)節(jié)序列。該天然調(diào)節(jié)可以(如果合適的話)通過(guò)遺傳修飾來(lái)關(guān)掉，并且可以增加或減少基因的表達(dá)。然而，所述基因構(gòu)建體也可以具有較簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，也就是說(shuō)在構(gòu)建基因之前沒(méi)有插入其它調(diào)節(jié)信號(hào)，并且沒(méi)有除去具有其調(diào)節(jié)作用的天然啟動(dòng)子。相反，天然調(diào)節(jié)序列以不再進(jìn)行調(diào)節(jié)并且使基因表達(dá)增加或減少的方式突變。核酸序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝可以存在于所述基因構(gòu)建體中。
有用的啟動(dòng)子的例子是cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、1-PR或1-PL啟動(dòng)子(它們都有益地用于革蘭氏陰性菌中)、和革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子amy和SPO2、酵母啟動(dòng)子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH或植物啟動(dòng)子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、not、或遍在蛋白或菜豆球蛋白啟動(dòng)子。特別優(yōu)選使用可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，例如光-或溫度-可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，例如PrPl啟動(dòng)子。
原則上，可以使用所有具有其調(diào)節(jié)序列的天然啟動(dòng)子。此外，也可以有益地使用合成啟動(dòng)子。
希望上述調(diào)節(jié)序列能夠靶表達(dá)核酸序列和蛋白質(zhì)表達(dá)。例如，根據(jù)宿主生物體，這可以意思是該基因僅在誘導(dǎo)之后表達(dá)或超表達(dá)，或者它立即表達(dá)和/或超表達(dá)。
調(diào)節(jié)序列或因子可以優(yōu)選對(duì)表達(dá)具有正效果，因此使其增加或降低。因此，可以使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)，如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子以轉(zhuǎn)錄水平使調(diào)節(jié)成分有益地增強(qiáng)。然而，也可以增強(qiáng)翻譯，例如通過(guò)提高mRNA穩(wěn)定性。
本發(fā)明的表達(dá)試劑盒可以通過(guò)將合適的啟動(dòng)子與合適的單加氧酶核苷酸序列和終止子信號(hào)或多腺苷酸化信號(hào)融合來(lái)產(chǎn)生。為此可以使用常規(guī)重組和克隆技術(shù)，如T.Maniatis等(24)、以及T.J.Silhavy等(32)和Ausubel，F(xiàn).M.等(33)中所述的。
就合適宿主生物體中的表達(dá)而言，有益地將重組核酸構(gòu)建體或基因構(gòu)建體插入宿主特異性載體中，所述載體能夠在宿主中最佳地表達(dá)所述基因。載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為公知并且可以在例如“CloningVectors”(Pouwels P.H.等(34))中找到。
除了質(zhì)粒之外，載體也可以理解為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有載體，例如噬菌體、病毒，如SV40、CMV、桿狀病毒和腺病毒、轉(zhuǎn)座子、插入序列、質(zhì)粒、粘粒和線性或環(huán)DNA。
這些載體可以在宿主生物體中自動(dòng)或染色地復(fù)制。
借助本發(fā)明的這些載體，可以產(chǎn)生重組微生物，所述微生物例如用本發(fā)明的至少一個(gè)載體轉(zhuǎn)化并且可以用于本發(fā)明的方法中。將本發(fā)明的上述重組構(gòu)建體有益地加入合適宿主體系中并在其中表達(dá)。為此，優(yōu)選使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)克隆轉(zhuǎn)染法，例如共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等，以便在討論的表達(dá)體系中表達(dá)上述核酸。合適的體系例如描述在Current Protocols inMolecular Biology，F(xiàn).Ausubel等(35)。
合適的宿主生物體原則上是能夠表達(dá)本發(fā)明核酸、其等位變體、其功能等價(jià)物或其衍生物、并且能夠用于本發(fā)明的微生物氧化反應(yīng)的所有生物體。宿主生物體應(yīng)理解為例如細(xì)菌、真菌、酵母、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選的生物體是細(xì)菌。
然而，使用的優(yōu)選的表達(dá)XMO的微生物是基本上沒(méi)有苯甲醇脫氫酶(BADH)和/或苯甲醛脫氫酶(BZDH)活性的那種。
進(jìn)一步優(yōu)選使用那些基本上沒(méi)有鏈烷醇脫氫酶(AODH)和/或鏈烷醛脫氫酶(AADH)活性并且分別由基因alkJ和alkH編碼的表達(dá)AMO的微生物。例如，可以使用的微生物是埃希氏桿菌屬，例如大腸桿菌如菌株W3110、以及K12菌株之一，如JM101和DH5α、或者惡臭假單胞菌菌株之一，如菌株KT 2440。一些優(yōu)選的大腸桿菌菌株的特性示于表I。
根據(jù)本發(fā)明使用建立的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(24)來(lái)用載體轉(zhuǎn)化微生物，因此省去其詳細(xì)說(shuō)明。
可以通過(guò)標(biāo)記基因?qū)Τ晒D(zhuǎn)化的生物體進(jìn)行選擇，這些基因也存在于載體或表達(dá)試劑盒中。這些標(biāo)記基因的例子是抗抗生素的基因和催化著色反應(yīng)以使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞染色的酶的基因。然后可以通過(guò)自動(dòng)細(xì)胞分選對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行選擇。用載體成功轉(zhuǎn)化且載有抗抗生素(例如G418或潮霉素)的合適基因的微生物可以通過(guò)含有抗生素的合適固體或液體培養(yǎng)基來(lái)選擇。存在于細(xì)胞表面的標(biāo)記蛋白可用于通過(guò)親和力色譜法選擇。
將宿主生物體和載體匹配性生物體，例如質(zhì)粒、病毒或噬菌體，例如具有RNA聚合酶/啟動(dòng)子體系的質(zhì)粒、噬菌體λ或μ或其它溫和噬菌體或轉(zhuǎn)座子和/或其它有益調(diào)節(jié)序列結(jié)合構(gòu)成表達(dá)體系。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過(guò)的重組微生物，所述表達(dá)載體含有編碼XMO的基因xylM和xylA或者編碼AMO的基因alkB、alkG和alkT，它們可操縱地和例如在遺傳控制食油假單胞菌GPol的alk調(diào)節(jié)體系下相連。
特別優(yōu)選微生物用編碼xylMA的表達(dá)質(zhì)粒pSPZ3轉(zhuǎn)化。
食油假單胞菌GPol的alk調(diào)節(jié)體系本身已知。上述兩個(gè)alk基因簇中第一個(gè)的表達(dá)是在控制alkBp、alk啟動(dòng)子下并在有功能性調(diào)節(jié)蛋白alkS的情況下開始的，所述alkS是通過(guò)第二個(gè)alk基因簇并在有誘導(dǎo)體如鏈烷，例如正辛烷、或者與其顯示相關(guān)性小的化合物，如二環(huán)丙基酮(DCPK)的情況下編碼的(8，22，23)。在大腸桿菌中使用alk調(diào)節(jié)體系的優(yōu)點(diǎn)是不發(fā)生分解代謝物阻抑。
在本發(fā)明的方法中優(yōu)選將正辛烷和DCPK用作誘導(dǎo)體，為正辛烷時(shí)特別優(yōu)選其量為0.001-0.5％(V/V)，為DCPK時(shí)特別優(yōu)選其量為0.005-0.05％(V/V)。當(dāng)然，也可以使用正辛烷和DCPK的混合物。如果使用這些濃度范圍，那么可以獲得誘導(dǎo)最大值。
本發(fā)明還涉及一種使用上面剛描述的重組微生物氧化上述類型的有機(jī)化合物的微生物方法。本發(fā)明所用的重組微生物可以通過(guò)已知方法培養(yǎng)和發(fā)酵。例如，細(xì)菌可以在TB或LB培養(yǎng)基中在20-40℃的溫度和6-9的pH下繁殖。特別適合的培養(yǎng)條件描述在例如T.Maniatis等，loc.cit。
在使用上述重組維生素的本發(fā)明微生物氧化中，優(yōu)選首先在有氧的情況下并在復(fù)合培養(yǎng)基，例如TB或LB培養(yǎng)基中在約20-40℃的培養(yǎng)溫度或更高的溫度和約6-9的pH下將所述微生物培養(yǎng)，直到達(dá)到足夠的細(xì)胞密度。為了更好地控制氧化反應(yīng)，優(yōu)選使用可誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。誘導(dǎo)生產(chǎn)單加氧酶之后，在有氧的情況下將該培養(yǎng)連續(xù)例如1小時(shí)-3天。然后將形成的氧化產(chǎn)物或氧產(chǎn)物混合物從培養(yǎng)基中分離出來(lái)并以常規(guī)方式純化，例如通過(guò)萃取或色譜法。
本發(fā)明的反應(yīng)也可以有利地在例如以固定化形式含有本發(fā)明的重組微生物的生物反應(yīng)器中進(jìn)行。
可以簡(jiǎn)單方式控制本發(fā)明所用物質(zhì)的氧化度。例如，從培養(yǎng)基中規(guī)則地取出樣品，并通過(guò)氣相色譜法、使用聯(lián)合的氣相色譜和質(zhì)譜系統(tǒng)(GC-MS)或高壓液相色譜法測(cè)定其相應(yīng)的醇衍生物、醛衍生物和/或羧酸衍生物的含量。根據(jù)所需的氧化衍生物、或者如果獲得所需的混合比，那么停止培養(yǎng)。這可以例如通過(guò)從培養(yǎng)基中除去微生物或者將它們破壞，例如通過(guò)離心和傾析和/或通過(guò)用酸，如三氯乙酸處理、或者通過(guò)熱處理來(lái)進(jìn)行。也可以通過(guò)在氧化底物(例如甲苯或假枯烯)中計(jì)量來(lái)抑制酸形成。
然后可以借助常規(guī)分離方法，例如通過(guò)簡(jiǎn)單的蒸餾、分餾、精餾、如果合適的話在真空中、或者通過(guò)使用合適的色譜法，優(yōu)選通過(guò)蒸餾將氧化的芳香物從培養(yǎng)基中分離出來(lái)。在這些產(chǎn)品分離之前方便地將微生物細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離出來(lái)。
本發(fā)明優(yōu)選的表達(dá)載體pSPZ3的構(gòu)建描述在(31)Panke等，Applied and Environmental Microbiology(1999)2324-2332中，將其解釋明確地引入本文作為參考。
為了本發(fā)明研究的目的，另一用于轉(zhuǎn)化微生物的載體是除XMO基因xylM和xylA之外另外也以可表達(dá)的形式含有惡臭假單胞菌mt-2的苯甲醇脫氫酶(BADH)基因xylB的那種。為了將所述苯甲醇脫氫酶基因xylB在相對(duì)xylA基因的下游直接引入上述質(zhì)粒pSPZ3，首先將質(zhì)粒pCK04的含有xylB基因的2.3kb XhoI/FspI片段(25)引入XhoI和SmaI消化過(guò)的載體pGEM-7Zf(+)(Promega，Zurich，Switzerland)以產(chǎn)生pGEMAB。所述2.3kb片段從該構(gòu)建體用XhoI和BamHI切除并連接至XhoI-和BamHI-消化過(guò)的質(zhì)粒pSPZ3中。所得質(zhì)粒命名為pRMAB(圖2)。
然而，對(duì)pRMAB試驗(yàn)顯示，如果除了XMO之外存在BADH，不僅苯甲醇較低活性地氧化成苯甲醛，而且的確發(fā)生逆反應(yīng)并形成苯甲醇。
為了本發(fā)明研究的目的，質(zhì)粒pRS(不含xyl基因)，構(gòu)建成負(fù)對(duì)照。將pRMAB用BamHI和SmaI消化并用Klenow酶處理。將較大的片段分離并且然后將載體歸類。
在下文中，參照具體非顯著性實(shí)施例和圖描述本發(fā)明的方法。
圖1顯示(A)通過(guò)上TOL代謝途徑的酶逐步將甲苯氧化成苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸，并將上TOL操縱子的xyl基因組織化。BADH和BZDH分別代表苯甲醇脫氫酶和苯甲醛脫氫酶。Pu代表上TOL操縱子啟動(dòng)子，xylW是具有未知功能的基因，xylC是編碼BZDH的基因，xylM是編碼XMO的末端羥化酶組分的基因，xylA是編碼NADHXMO的受體還原酶組分的基因，xylB是編碼BADH的基因并且xylN是具有未知功能的基因；(B)顯示了將芳基取代的鏈烷通過(guò)鏈烷羥化酶(AMO)、鏈烷醇脫氫酶(AODH)和鏈烷醛脫氫酶(AADH)催化經(jīng)相應(yīng)的鏈烷醇和鏈烷醛逐步氧化得到鏈烷羧酸。
圖2顯示了在alk調(diào)節(jié)體系的控制下構(gòu)建具有基因xylMA和xylMAB的表達(dá)質(zhì)粒pSPZ3和pRMAB的示意圖。alkBp代表alk操縱子的啟動(dòng)子，alkS是正調(diào)節(jié)物AlkS的基因?；騲ylM*和xylA編碼二甲苯單加氧酶(*意思是在xylM基因中已去掉NdEI位置。xylB基因編碼BADH。Km代表抗卡那霉素的基因，并且T4t是T4噬菌體的轉(zhuǎn)錄終止子。
圖3顯示了通過(guò)大腸桿菌JM101(pSPZ3)(A)和大腸桿菌JM101(pRMAB)(B)氧化甲苯。將甲苯(1.37mM)加入到靜息大腸桿菌JMIOI(pSPZ3/pBRMAB)細(xì)胞(2.07-2.14g*l-1CDW)的磷酸鉀緩沖液(50mM)pH 7.4，1％(w/v)葡萄糖的懸液中。圓圈甲苯，方塊苯甲醇、三角形苯甲醛，菱形苯甲酸，叉四種濃度的總和。
圖4顯示了通過(guò)大腸桿菌JM101(pSPZ3)(A、C、E)和大腸桿菌JM101(pRMAB)(B、D)氧化假枯烯、相應(yīng)的醇和相應(yīng)的醛。將所述底物(0.46mM)加入到靜息大腸桿菌JM101(pSPZ3/pBRMAB)細(xì)胞(0.86-0.92g*l-1CDW)的磷酸鉀緩沖液(50mM)pH 7.4，1％(w/v)葡萄糖的懸液中。圖(A)和(B)顯示假枯烯的氧化，圖(C)和(D)顯示3，4-二甲基苯甲醇的氧化，圖(E)顯示3，4-二甲基苯甲醛的氧化。圓圈假枯烯，方塊3，4-二甲基苯甲醇，三角形3，4-二甲基苯甲醛，菱形3，4-二甲基苯甲酸，叉所有濃度的總和。
圖5顯示了XMO在大腸桿菌JM101(pSPZ3)中的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)。圖(A)顯示了通過(guò)正辛烷誘導(dǎo)之后不同時(shí)間點(diǎn)下的二甲苯單加氧酶活性和細(xì)胞干重(CDW)，而圖(B)和(C)代表了分別用不同量的正辛烷和二環(huán)丙基酮(DCPK)誘導(dǎo)3.5小時(shí)之后的相同值。對(duì)獨(dú)立的培養(yǎng)物上進(jìn)行各自的活性測(cè)定。將假枯烯(1.37mM)加入到靜息大腸桿菌JM101(pSPZ3)細(xì)胞(2.04-2.44g*l-1CDW)的磷酸鉀緩沖液(50mM)pH 7.4，1％(w/v)葡萄糖的懸液中。比活性以反應(yīng)頭5分鐘時(shí)產(chǎn)物形成為基礎(chǔ)。圖(A)的箭頭代表定時(shí)加入0.1％(v/v)正辛烷以便誘導(dǎo)XylMA合成。實(shí)心圓未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的CDW，空心圓誘導(dǎo)過(guò)的培養(yǎng)物的CDW，叉誘導(dǎo)過(guò)的培養(yǎng)物的比活性。
圖6顯示了苯甲醇經(jīng)XMO催化形成苯甲醛的可能的機(jī)理解釋。
常規(guī)方法，所用材料a)細(xì)菌和質(zhì)粒表I細(xì)菌菌株和質(zhì)粒
A*質(zhì)粒僅含部分xylA基因。b)化學(xué)物質(zhì)和酶所用的所有化學(xué)物質(zhì)和酶都可商購(gòu)獲得，例如從Boehringer，Mannheim(Rotkreuz，Switzerland)、NEB(Schwalbach，Germany)、Gibco(Basel，Switzerland)、AGS(Heidelberg，Germany)、Promega(Zurich，Switzerland)、Fluka(Buchs，Switzerland)、Aldrich(Buchs，Switzerland)和Lancaster(Muhlheim，Germany)。根據(jù)廠商說(shuō)明將得自Qiagen(Basel，Switzerland)的QIAprep-Spin-Miniprep-Kit用于質(zhì)粒DNA的小規(guī)模制備。
c)重組方法為了構(gòu)建所用的載體/質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化細(xì)菌，使用例如Sambrook、Fritsch和Maniatis的教科書(24)中詳細(xì)描述的標(biāo)準(zhǔn)重組方法。而且，優(yōu)選參考節(jié)中所列的開始幾頁(yè)中的材料和方法。因此進(jìn)一步的討論可以省去。
d)細(xì)菌培養(yǎng)物將細(xì)菌在Luria-Bertani(LB)肉湯(Difco，Detroit，Mich.)或者在M9最小培養(yǎng)基(24)中培養(yǎng)，所述M9最小培養(yǎng)基含有3倍濃度的磷酸鹽(M9*)和0.5％(w/v)葡萄糖作為唯一碳源。如果合適的話，向培養(yǎng)物中補(bǔ)充卡那霉素(最終濃度50mg/L)、氨芐青霉素(100mg/L)、氯霉素(30mg/L)、維生素B1(10-3％，w/v)、1mM吲哚和0.5mM IPTG(異丙基-β-D-l-硫代吡喃半乳糖苷)。固體培養(yǎng)基含有1.5％(w/v)瓊脂。將液體培養(yǎng)物于30或37℃下在水平搖動(dòng)器上以200rpm常規(guī)地生長(zhǎng)。
e)測(cè)定酶活性為了簡(jiǎn)單起見，使用完整細(xì)胞測(cè)定酶活性。
1單位(U)定義為每分鐘獲得1μmol總產(chǎn)物的活性。比活性在這里以活性/g細(xì)胞干重(CDW)(Ug-1CDW)表示，本文下面將其簡(jiǎn)稱為活性。平均活性是以轉(zhuǎn)化開始5分鐘內(nèi)每g CDW形成的產(chǎn)物量為基礎(chǔ)計(jì)算的。將試驗(yàn)各自獨(dú)立地重復(fù)至少3次。
如下進(jìn)行測(cè)定。將與討論的載體重組過(guò)的大腸桿菌JM101在40或100ml培養(yǎng)基中在有卡那霉素的情況下培養(yǎng)。當(dāng)450nm下的光密度為約0.3時(shí)，將這些細(xì)胞通過(guò)加入0.05％(v/v)DCPK或0.1％(v/v)正辛烷誘導(dǎo)，并連續(xù)培養(yǎng)3-3.5小時(shí)直到OD450通常升高至0.8-0.9。然后將這些細(xì)胞收獲并在含1％(w/v)葡萄糖的50mM磷酸鉀緩沖液pH7.4中再次懸浮至細(xì)胞干重為2.5g/l。將1或2ml份引入用塞子密封的Pyrex管中并在軌道搖動(dòng)器上于30℃和250rpm下水平培養(yǎng)。5分鐘之后，將正在討論的底物以20倍濃原料乙醇液的形式加入至最終濃度為1.5mM。在測(cè)定3，4-二甲基苯甲酸形成的這些試驗(yàn)中，細(xì)胞干重降低至1g/l，并且討論的底物由于微溶于水因此將其加入至最終濃度0.5mM。在搖動(dòng)器上轉(zhuǎn)化5分鐘，然后將樣品放置于冰中將其終止并立即用40或80μl高氯酸儲(chǔ)備溶液(10％V/V)處理以便該懸液的pH為2。
f)測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的產(chǎn)物形成為了測(cè)定作為時(shí)間函數(shù)的產(chǎn)物形成，用討論的底物將細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)、收集、再懸浮和培養(yǎng)不同的時(shí)間，即5，10，20，30，40和80分鐘。然后，如上所述將轉(zhuǎn)化終止，離心取出細(xì)胞(7800g，8min)，并分析上清液。
使用高效液相色譜法(HPLC)分離苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸。所用柱是Nucleosil C18(孔徑100_，粒徑5μm，長(zhǎng)度25cm，內(nèi)徑4mm)(Macherey-Nagel，Oensingen，Switzerland)，并且流動(dòng)相為69.9％H2O/30％乙腈/0.1％ H3PO4，流速為0.7ml/min。使用具有相同流速但是具有64.9％ H2O/35％乙腈/0.1％ H3PO4的相同柱分離3，4-二甲基苯甲醇、3，4-二甲基苯甲醛和3，4-二甲基苯甲酸。檢測(cè)是于210nm下通過(guò)紫外線吸收進(jìn)行的。分離的化合物通過(guò)將其保留時(shí)間與商購(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)的化合物比較進(jìn)行檢測(cè)。
當(dāng)為甲苯/假枯烯以及相應(yīng)的醇、醛和酸時(shí)，通過(guò)氣相色譜法進(jìn)行分離。所述氣相色譜儀(Fisons Instruments，England)配備有Macherey-Nagel(Oensingen，Switzerland)的OPTIMA-5型毛細(xì)管柱(長(zhǎng)度25m，內(nèi)徑0.32mm，膜厚0.25μm)。所用載氣體是氫，并在沒(méi)有分開的情況下進(jìn)行注射。使用以下溫度曲線40℃-70℃以15℃/min、70℃-105℃以5℃/min和105℃-240℃以20℃/min。通過(guò)火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)這些化合物。分離的化合物通過(guò)將其保留時(shí)間和商購(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)的化合物比較進(jìn)行檢測(cè)?；蛘?，也可以使用質(zhì)譜儀(聯(lián)合GC-MS系統(tǒng))進(jìn)行檢測(cè)。后者的優(yōu)點(diǎn)是不僅其特定色譜保留時(shí)間、而且單個(gè)峰的碎片化模式和強(qiáng)度分布可用于定量和定性測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物。
聯(lián)合的GC-MS系統(tǒng)由Fisons MD-800型質(zhì)譜儀和配備有CP-Sil-5CB柱(Chrompack，Netherlands)的氣相色譜儀(FisonsInstruments，England)組成。所用載氣體是氦。注入是分開的(20∶1)。溫度程序與上述氣相色譜法分離中的相同。
將相同體積的含有0.1mM十二碳烷作為內(nèi)標(biāo)的冰冷醚加入到氣相色譜法和聯(lián)合的GC-MS系統(tǒng)中的樣品中。然后，加入氯化鈉至飽和并在30℃下通過(guò)劇烈振動(dòng)5分鐘來(lái)萃取水相，其中，相通過(guò)離心分離。將有機(jī)相在無(wú)水硫酸鈉上干燥然后分析。
實(shí)施例1用二甲苯單加氧酶氧化甲苯及其衍生物在下面的試驗(yàn)中，所有的細(xì)胞都生長(zhǎng)至細(xì)胞密度為0.09g CDW/l并用0.1％(V/V)正辛烷進(jìn)行常規(guī)誘導(dǎo)。然后，將培養(yǎng)物培養(yǎng)另外3-3.5小時(shí)并生長(zhǎng)至細(xì)胞密度為0.23-0.27g CDW/l。
表II顯示了XMO將甲苯氧化為苯甲醇、苯甲醇氧化成苯甲醛以及苯甲醛氧化為苯甲酸。在最先的兩個(gè)氧化反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)活性高達(dá)95-100U/g CDW，而苯甲醛僅以較低的活性10U/g CDW氧化。
用假枯烯獲得相似的結(jié)果。假枯烯氧化成3，4-二甲基苯甲醇、3，4-二甲基苯甲醇氧化為3，4-二甲基本甲醛，3，4-二甲基苯甲醛氧化為3，4-二甲基苯甲酸。氧化假枯烯時(shí)發(fā)現(xiàn)活性為100U/g CDW，而以50U/gCDW的活性較緩慢地形成3，4-二甲基苯甲醛，并以比苯甲醛顯著高的活性(55U/g CDW)氧化成3，4-二甲基苯甲酸。
當(dāng)加入酸作為底物時(shí)，既沒(méi)有檢測(cè)出反應(yīng)產(chǎn)物也沒(méi)有檢測(cè)出酸降低。
未誘導(dǎo)的大腸桿菌JM101，含有質(zhì)粒pSPZ3和誘導(dǎo)的大腸桿菌JM101，不含任何起對(duì)照作用的質(zhì)粒。為了排除alk調(diào)節(jié)體系對(duì)大腸桿菌的任何影響，將含有質(zhì)粒pRS的大腸桿菌JM101用作附加對(duì)照。質(zhì)粒pRS仍然含有alkS基因，但是不含xyl基因。表II證實(shí)當(dāng)使用甲苯、假枯烯和相應(yīng)的醇作為底物時(shí)在對(duì)照試驗(yàn)中沒(méi)有檢測(cè)出轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
然而，下表III顯示了在該試驗(yàn)中加入作為底物的醛以恒定活性還原成其醇。也鑒定出形成了3，4-二甲基苯甲酸，但是活性非常低，為2-2.5U/g CDW。這樣得出結(jié)論通過(guò)誘導(dǎo)的大腸桿菌JM101(pSPZ3)(其縮寫在本文中意思是微生物含有所述的質(zhì)粒)形成的大多數(shù)酸可以歸因于XMO的存在。
這里，應(yīng)提到的是，在常規(guī)使用的誘導(dǎo)體0.1％(V/V)正辛烷和作為另一種選擇的誘導(dǎo)體0.05％(V/V)DCPK之間，在形成的產(chǎn)物和活性、或形成速度方面沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異。
表II通過(guò)XMO氧化甲苯和衍生物
a 如上所述進(jìn)行活性測(cè)定試驗(yàn)。單位(U)如上面定義的，并且如上所述計(jì)算比活性。b 細(xì)胞通過(guò)加入0.1％(v/v)正辛烷進(jìn)行誘導(dǎo)。c 參見下面(表III)表III在對(duì)照試驗(yàn)中轉(zhuǎn)化醛
a、b參見表II在使用未誘導(dǎo)的大腸桿菌JM101(pSPZ3)和誘導(dǎo)過(guò)的大腸桿菌JM101(pRS)的這些對(duì)照試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)醛還原為醇，這可以解釋為大腸桿菌醇脫氫酶催化其平衡由于熱力學(xué)緣故而在醇這邊的反應(yīng)的作用。在通過(guò)大腸桿菌JM101(pSPZ3)生物轉(zhuǎn)化甲苯結(jié)束時(shí)再形成苯甲醇(參見圖5A)也可以歸因于這些大腸桿菌脫氫酶，其活性因XMO活性在整個(gè)時(shí)間內(nèi)降低而變得顯著。
實(shí)施例2測(cè)定整個(gè)時(shí)間內(nèi)各種底物的氧化過(guò)程甲苯、假枯烯、3，4-二甲基苯甲醇和3，4-二甲基苯甲醛在整個(gè)時(shí)間內(nèi)的氧化過(guò)程示于圖3和4。如上所述進(jìn)行試驗(yàn)。在每種情況下將討論的底物加入到各自靜息細(xì)胞的含1％(w/v)葡萄糖的50mM磷酸鉀緩沖液pH 7.4的懸液中。
當(dāng)甲苯或假枯烯作為底物加入時(shí)，開始順序形成相應(yīng)的醇、醛和酸(圖3A和4A)。同樣開始活性試驗(yàn)，形成苯甲醇、3，4-二甲基苯甲醇和苯甲醛的活性高。形成3，4-二甲基苯甲醛和3，4-二甲基苯甲酸的活性適中，并且以低活性形成苯甲酸。在開始5分鐘內(nèi)，兩個(gè)底物假枯烯和甲苯的產(chǎn)物以100U/g CDW的比活性形成(還參見表II)。在5分鐘至10分鐘之間的間隔中，以80U/g CDW的比活性形成苯甲醛，而形成3，4-二甲基苯甲醛更慢(37U/g CDW)。當(dāng)甲苯或假枯烯完全消耗時(shí)開始形成酸，當(dāng)為苯甲酸和3，4-二甲基苯甲酸時(shí)在10分鐘至30分鐘之間的間隔中其活性分別為3.2U/g和21U/g CDW?？偸潜３值捅郊状紳舛?。40-80分鐘之間，苯甲醇濃度再次升高，而苯甲醛濃度降低(圖3A)。假枯烯、3，4-二甲基苯甲醇和3，4-二甲基苯甲醛完全消耗掉，同時(shí)形成3，4-二甲基苯甲酸(圖4A)。
當(dāng)加入3，4-二甲基苯甲醇作為底物時(shí)，在10-30分鐘的整個(gè)時(shí)間內(nèi)，形成3，4-二甲基苯甲醛的活性是50U/g CDW(表II)，而形成3，4-二甲基苯甲酸的活性是23U/g CDW(圖4C)。當(dāng)使用苯甲醇作為底物時(shí)，形成苯甲醛的活性是95U/g CDW并且形成苯甲酸的活性是常數(shù)2.9U/g CDW(結(jié)果未顯示)。在該試驗(yàn)過(guò)程中，所有3，4-二甲基苯甲醇完全轉(zhuǎn)變成其酸，這與苯甲醇正好相反。
當(dāng)加入3，4-二甲基苯甲醛作為底物(圖4E)時(shí)，3，4-二甲基苯甲酸以活性55U/g CDW形成并且在短至20分鐘之后成為主要物質(zhì)。當(dāng)使用苯甲醛作為底物時(shí)，慢且恒定地形成苯甲酸(3U/g CDW)(結(jié)果未顯示)。這里，開始5分鐘內(nèi)的最初活性為10U/g CDW(表II)。
實(shí)施例3通過(guò)大腸桿菌JM101(pRMAB)轉(zhuǎn)化甲苯和假枯烯這些試驗(yàn)打算弄清楚由甲苯和假枯烯形成醛的活性是否因同時(shí)存在BADH和XMO而增加或降低。由于一些醇脫氫酶催化在生理pH下平衡偏向醇的反應(yīng)，因此后面提及的可能性可能的確存在并且BADH因此降低了形成醛的速度。
事實(shí)上，與大腸桿菌JM101(pSPZ3)比較觀察到生物轉(zhuǎn)化活性的明顯差異。甲苯以最初比活性87U/g CDW轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)的氧化產(chǎn)物。苯甲醇、假枯烯和3，4-二甲基苯甲醇的相應(yīng)活性為66、73和42U/gCDW。BADH的存在似乎還使作為生物催化劑的重組大腸桿菌MJ101的生物轉(zhuǎn)化活性降低。
加入甲苯使得連續(xù)地形成苯甲醇、苯甲醛和苯甲酸(圖3B)。在5-10分鐘之間，苯甲醇以活性34U/g CDW形成，并且在10-40分鐘之間其酸以1U/g CDW形成。約20分鐘之后，苯甲醇濃度再次開始升高(可能由于逆反應(yīng)開始了)。在80分鐘之后幾乎沒(méi)有留下苯甲醛，并且僅形成很少量的苯甲酸。
當(dāng)加入苯甲醇作為底物時(shí)，結(jié)果非常相似(未顯示)。再次，在形成醇的過(guò)程中在約20分鐘之后醛濃度降低。因此，加入xylB基因使得醛大量還原為醇，這暗示醛的形成不會(huì)因加入BADH而增加。
當(dāng)加入假枯烯作為底物時(shí)，同樣，連續(xù)形成3，4-二甲基苯甲醇、3，4-二甲基苯甲醛和3，4-二甲基苯甲酸(圖4B)。在5-10分鐘之間，3，4-二甲基苯甲醛形成的活性是15U/g CDW。在30-40分鐘之間，約以相同活性形成酸(13U/g CDW)。快速形成醇之后，醛濃度相對(duì)高地保持20分鐘。然而，在反應(yīng)結(jié)束時(shí)所有醇和醛都轉(zhuǎn)化成酸。
當(dāng)加入3，4-二甲基苯甲醇作為底物時(shí)，形成3，4-二甲基苯甲醛和3，4-二甲基苯甲酸(圖5B)。在20-30分鐘之間，酸以比活性8U/g CDW形成。醛濃度從未超過(guò)過(guò)醇濃度。3，4-二甲基苯甲醇存在的時(shí)間更長(zhǎng)說(shuō)明，除了氧化之外，醛再次還原為醇，其原因似乎歸因于BADH。
實(shí)施例4大腸桿菌JM101(pSPZ3)的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)對(duì)每個(gè)活性點(diǎn)使單個(gè)培養(yǎng)物生長(zhǎng)。如上所述進(jìn)行活性測(cè)定。在圖5A中，將假枯烯(1.37mM)加入到靜息大腸桿菌JM101(pSPZ3)(2.04-2.26gl-1CDW)于含1％(w/v)葡萄糖的50mM磷酸鉀緩沖液pH 7.4的懸液中。比活性是借助轉(zhuǎn)化開始5分鐘內(nèi)形成的量計(jì)算的，它是通過(guò)氣相色譜法測(cè)定的。箭頭代表加入0.1％(V/V)正辛烷以誘導(dǎo)xylMA合成時(shí)的點(diǎn)。實(shí)心圓代表未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的細(xì)胞干重(CDW)，而空心圓代表誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的細(xì)胞干重，叉代表誘導(dǎo)過(guò)的培養(yǎng)物的比活性。
圖5(B)和(C)是如圖5(A)所述獲得的，只是細(xì)胞密度為2.26-2.44gl-1CDW。圖5(B)顯示了不同量的正辛烷的影響，并且圖5(C)是DCPK的影響。圓圈代表誘導(dǎo)3.5小時(shí)之后的細(xì)胞干重，并且叉代表誘導(dǎo)過(guò)的培養(yǎng)物的比活性。
在用0.1％(V/V)正辛烷(圖5(A))或0.05％(V/V)DCPK誘導(dǎo)之后監(jiān)控XMO活性。在正辛烷和DCPK的情況下，XMO活性被這兩種化合物快速誘導(dǎo)并在3-3.5小時(shí)之后分別達(dá)到恒定值約115和105U/g CDW。誘導(dǎo)過(guò)的細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯低于未誘導(dǎo)的細(xì)胞的速度。
通過(guò)將大腸桿菌JM101(pSPZ3)生長(zhǎng)至最高濃度0.09g CDW/L并用不同量的正辛烷和DCPK誘導(dǎo)細(xì)胞來(lái)測(cè)定XMO活性對(duì)誘導(dǎo)體濃度[范圍0.00001-1％(V/V)]的依賴性。進(jìn)一步培養(yǎng)3.5小時(shí)之后，針對(duì)每個(gè)誘導(dǎo)體濃度測(cè)定細(xì)胞干重和XMO活性(圖5(B)和(C))。當(dāng)將低于0.0001％(V/V)的正辛烷或0.001％(V/V)的DCPK加入培養(yǎng)基時(shí)，所得XMO活性非常低。發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)最大值時(shí)DCPK濃度為0.005-0.01％(V/V)，正辛烷濃度為0.001-0.004％(V/V)。XMO活性在較高誘導(dǎo)體濃度下保持恒定。由于正辛烷的高蒸汽壓，使用密封的搖動(dòng)瓶，但是即使這樣也僅有一部分正辛烷溶于含水培養(yǎng)基中。正辛烷在蒸餾水中的溶解度非常低，其量為0.7mg/l或0.0001％(V/V)。
在酶活性增加至其最大值的誘導(dǎo)體濃度范圍內(nèi)細(xì)胞密度降低。酶活性在較高正辛烷濃度下保持恒定。相反，較高DCPK濃度使得細(xì)胞密度進(jìn)一步降低(圖5(B)和(C))。此外，測(cè)定沒(méi)有質(zhì)粒的情況下不同誘導(dǎo)體濃度對(duì)大腸桿菌JM101的生長(zhǎng)的直接影響。高正辛烷濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有影響。相反，DCPK濃度高于0.01％(V/V)使得生長(zhǎng)速度降低。在0.5％(V/V)的DCPK濃度下，誘導(dǎo)3.5小時(shí)之后測(cè)定細(xì)胞干重僅為0.073g/l。顯而易見，高DCPK濃度對(duì)細(xì)胞有毒。因此，正辛烷是較好的誘導(dǎo)體。
總結(jié)如下。在逐步氧化甲苯和假枯烯時(shí)存在兩個(gè)明顯的差異。3，4-二甲基苯甲醇比苯甲醇氧化更慢，并且3，4-二甲基苯甲酸形成時(shí)的活性明顯比苯甲酸的高。這說(shuō)明取代基不同對(duì)氧化底物(醇、醛)的XMO比活性與未氧化的底物如甲苯和假枯烯的比活性的影響不同，對(duì)這些底物XMO顯示了非常相似的活性。另一重要結(jié)果是只要或多或少所有的甲苯或假枯烯消耗掉就不形成酸。如果這是常規(guī)事實(shí)的話，XMO顯然對(duì)甲苯和假枯烯比對(duì)相應(yīng)的醛具有更高的親和力。BADH的存在使得產(chǎn)物形成的活性降低，并且甚至是在再次形成苯甲醇中。含有BADH的細(xì)胞顯然更慢地聚集醛。BADH似乎大大增加了大腸桿菌脫氫酶的影響，并且似乎該脫氫酶反應(yīng)的平衡偏向醇一側(cè)。這通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法(26-29)以及對(duì)酶動(dòng)力學(xué)的研究(16-18)經(jīng)熱動(dòng)力學(xué)計(jì)算得以證實(shí)。
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權(quán)利要求
1.一種制備通式I的芳香醛和/或羧酸的方法，Ar-(CH2)n-R1(I)其中Ar是任選地單取代或多取代的單核芳香環(huán)，R1是含氧基團(tuán)-CHO或-COOH，和n是0-15的整數(shù)，所述方法包括a)在含有通式II的芳香底物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)選自以下酶的微生物二甲苯單加氧酶(XMO)和鏈烷單加氧酶(AMO)，Ar-R2(II)其中Ar定義如上，并且R2是-CH＝CH2或-(CH2)n+1R3，其中n定義如上，并且R3是H或OH；或者，如果R1是-COOH時(shí)，R2也可以是-(CH2)nR4，其中n定義如上，并且R4是-CHO，和b)將通式I的化合物與培養(yǎng)基分離。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表達(dá)XMO的微生物基本上沒(méi)有苯甲醇脫氫酶(BADH)和/或苯甲醛脫氫酶(BZDH)活性。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表達(dá)AMO的微生物基本上沒(méi)有鏈烷醇脫氫酶和/或鏈烷醛脫氫酶(AADH)活性。
4.如前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)所述的方法，其中使用用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化過(guò)的重組微生物，所述表達(dá)載體含有編碼XMO的基因xylM和xylA或者編碼AMO的基因alkB、alkG和alkT，它們可操縱地和在遺傳控制食油假單胞菌GPol的alk調(diào)節(jié)體系下相連。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述微生物已用表達(dá)質(zhì)粒pSPZ3轉(zhuǎn)化。
6.如前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物是大腸桿菌屬的細(xì)菌。
7.如權(quán)利要求4-6任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述酶表達(dá)是通過(guò)向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)體開始的。
8.如前面權(quán)利要求任意一項(xiàng)所述的方法，其中將R2是-CH＝CH2、-CH3或-CH2OH的通式II的化合物用表達(dá)XMO活性的微生物轉(zhuǎn)化。
9.如權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的方法，其中將R2是-(CH2)m-R3，R3定義如上且m是6-13的整數(shù)的通式II的化合物用表達(dá)AMO活性的微生物轉(zhuǎn)化。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其中表達(dá)惡臭假單胞菌mt-2的二甲苯單加氧酶。
11.具有表達(dá)載體的重組微生物，所述表達(dá)載體含有編碼XMO的基因xylM和xylA或者編碼AMO的基因alkB、alkG和alkT，它們可操縱地和在遺傳控制食油假單胞菌GPol的alk調(diào)節(jié)體系下相連。
12.如權(quán)利要求11所述的微生物，選自大腸桿菌屬和假單胞菌屬的細(xì)菌。
13.如權(quán)利要求11或12所述的微生物，已用質(zhì)粒pSPZ3轉(zhuǎn)化。
14.一種表達(dá)構(gòu)建體，含有編碼XMO的基因xylM和xylA或者編碼AMO的基因alkB、alkG和alkT，它們可操縱地和在遺傳控制食油假單胞菌GPol的alk調(diào)節(jié)體系下相連。
15.如權(quán)利要求11-13所述的微生物或者權(quán)利要求14所述的表達(dá)構(gòu)建體用于微生物生產(chǎn)通式I的芳香化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用表達(dá)二甲苯單加氧酶或鏈烷單加氧酶的基因工程重組微生物逐步氧化芳香化合物得到相應(yīng)的醛和/或羧酸衍生物的方法。
文檔編號(hào)C12R1/38GK1415018SQ00817866
公開日2003年4月30日 申請(qǐng)日期2000年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月27日
發(fā)明者A·施密德, B·維托爾特, B·豪爾, B·比勒 申請(qǐng)人:Basf公司