專利名稱：蘇云金芽孢桿菌(bacillus thur_ingiensis)的殺蟲蛋白的制作方法
引言本發(fā)明涉及編碼蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的殺蟲蛋白的新的DNA序列。具體地說，本發(fā)明提供了編碼被命名為Cry9Fa、Cry1Jd和Cry1Bf的蛋白的新的DNA序列，其有益于保護植物免受昆蟲侵害。此處也包括用至少一種該新分離基因轉(zhuǎn)化的微生物和植物，這樣它們通過表達殺蟲蛋白而賦予昆蟲抗性。
背景技術(shù)：
(i)發(fā)明領(lǐng)域Bt或蘇云金芽孢桿菌因其對昆蟲害蟲的特異毒性而廣為所知，并被用于控制植物的昆蟲害蟲幾乎達一個世紀之久。最近幾年，已經(jīng)有了表達Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，其已被發(fā)現(xiàn)能成功控制昆蟲對植物的損害(如Vaeck等，1987)。
盡管許多Bt晶體蛋白基因已經(jīng)得到分離，但是對于編碼殺蟲蛋白的新基因的搜索仍在繼續(xù)。實際上，與化學殺蟲劑相比，Bt殺蟲晶體蛋白的靶標昆蟲范圍公知為相對較窄。而且，對相同靶標昆蟲種類具有多重毒性活性使得可使用具有不同作用方式的蛋白成為可能，從而可以防止或延緩昆蟲抗性的發(fā)展。
(ii)相關(guān)技術(shù)描述先前，Cry1B-、Cry1J-和Cry9蛋白的幾種類型已得到鑒定(見Crickmore等，1998，全部詳情并入此文以作參考)。
新的Cry1Bf蛋白與Cry1Be蛋白的序列同源性最為接近(Payne等，1998，美國專利5,723,758)，但前者毒性蛋白片斷的氨基酸序列與Cry1Be蛋白毒性片斷的氨基酸序列相比，仍有約14％的差異。
與Cry1Jd的毒性片斷序列同源性最接近的為Cry1Jc1蛋白的毒性片斷(美國專利5,723,758)，但這兩個蛋白毒性片斷的氨基酸序列仍有約18％的差異。
如Midoh等人(PCT專利公開WO 98/26073)和Narva等人(PCT專利公開WO 98/00546)所述，與Cry9Fa的毒性片斷序列同源性最接近的為Cry9Ea1蛋白的毒性片斷，但Cry9Fa和Cry9Ea蛋白的毒性片斷仍有約21％的氨基酸序列差異。
本發(fā)明特別優(yōu)選編碼含有下列氨基酸序列的蛋白的DNA序列SEQ IDNo.2蛋白的殺蟲片斷的氨基酸序列、SEQ ID No.4蛋白的殺蟲片斷的氨基酸序列和SEQ ID No.6蛋白的殺蟲片斷的氨基酸序列；或者可選編碼含有下列氨基酸序列的蛋白的DNA序列SEQ ID No.2的氨基酸序列、SEQ IDNo.4的氨基酸序列、SEQ ID No.6的氨基酸序列；或者含有SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、或SEQ ID No.5 DNA序列的DNA序列。
此外，本發(fā)明提供了這樣的DNA序列，其至少編碼新分離蛋白的下列部分SEQ ID No.2從第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列、SEQID No.4從第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列、SEQ ID No.6從第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列。
此外，本發(fā)明提供了含有人工DNA序列的上述DNA序列，該人工DNA序列具有不同于天然存在的DNA序列中的密碼子使用，但卻編碼相同的蛋白或其殺蟲片斷。
更進一步地，本發(fā)明提供了包含選自下列氨基酸序列的蛋白a)由保藏在BCCM-LMBP，保藏號為LMBP 3986的cry1Bf基因所編碼蛋白的殺蟲的胰蛋白酶消化片斷的氨基酸序列，b)由保藏在BCCM-LMBP，保藏號為LMBP3983的cry1Jd基因所編碼蛋白的殺蟲的胰蛋白酶消化片斷的氨基酸序列，c)由保藏在BCCM-LMBP，保藏號為LMBP 3984的cry9Fa基因所編碼蛋白的殺蟲的胰蛋白酶消化片斷的氨基酸序列。
此處尤其優(yōu)選包含選自下列氨基酸序列的蛋白SEQ ID No.2蛋白的殺蟲片斷的氨基酸序列、SEQ ID No.4蛋白的殺蟲片斷的氨基酸序列和SEQID No.6蛋白的殺蟲片斷的氨基酸序列；或者包含選自下列氨基酸序列的蛋白SEQ ID No.2從第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列、SEQID No.4從第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列、SEQ ID No.6從第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列；或者含有SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、或SEQ ID No.6氨基酸序列的蛋白。
此處，本發(fā)明也提供了含有在植物表達啟動子控制下的上述DNA的嵌合基因和由轉(zhuǎn)化而含有那些嵌合基因的植物細胞、植株或種子，其中所述植物細胞、植株或種子尤其選自玉米、棉花、水稻、油菜籽、蕓苔、茄子、大豆、土豆、向日葵、西紅柿、甘蔗、茶葉、豌豆、煙草、草莓、苜蓿、黃瓜、西瓜、胡椒、燕麥、大麥、小麥、天竺牡丹、劍蘭、菊花、甜菜、高粱、紫花苜蓿和花生。按本發(fā)明所述，該嵌合基因整合入植物細胞的染色體DNA或葉綠體DNA。
另外，本發(fā)明也提供了由轉(zhuǎn)化而含有任何上述DNA序列的、尤其是選自土壤桿菌屬(Agrobacterium)、埃希氏菌屬(Escherichia)或芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物。
此處也提供了一種控制昆蟲的方法和使植物抗昆蟲的方法，其中所述控制昆蟲的方法包括在宿主細胞、尤其是植物細胞中表達任何上述DNA序列，并使昆蟲和所述宿主細胞相接觸；其中所述使植物抗昆蟲的方法包括用任何上述DNA序列或嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細胞，并從此類抗昆蟲細胞再生出轉(zhuǎn)化植株。
按本發(fā)明所述，“Cry1Bf蛋白”指含有SEQ ID No.2氨基酸序列的、保留殺蟲活性的最小蛋白片斷的任何蛋白，尤其是含有SEQ ID No.2中第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列的任何蛋白，包括但不限于具有SEQ ID No.2氨基酸序列的完整蛋白。這包括含有該最小毒性蛋白片斷的雜合或嵌合蛋白，也包括至少含有SEQ ID No.2毒性片斷三個功能結(jié)構(gòu)域中之一的蛋白。
此處所用術(shù)語“含有序列X的DNA/蛋白”是指至少包括或含有此序列X的DNA或蛋白，從而在5’(或N-末端)和/或3’(或C-末端)末端可包括其它核苷酸或氨基酸序列，如EP 0 193 259公開的可選擇性標記蛋白(的核苷酸序列)。
按本發(fā)明所述，“Cry9Fa蛋白”或“Cry9F蛋白”是指含有SEQ ID No.6氨基酸序列的、保留殺蟲活性的最小蛋白片斷的任何蛋白，尤其是含有SEQ ID No.6中第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列的任何蛋白，包括但不限于具有SEQ ID No.6氨基酸序列的完整蛋白。這包括含有該最小毒性蛋白片斷的雜合或嵌合蛋白，也包括至少含有SEQ ID No.6毒性片斷三個功能結(jié)構(gòu)域中一個的蛋白。
按本發(fā)明所述，“Cry1Jd蛋白”是指含有SEQ ID No.4氨基酸序列的、保留殺蟲活性的最小蛋白片斷的任何蛋白，尤其是含有SEQ ID No.4中第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列的任何蛋白，包括但不限于具有SEQ ID No.4氨基酸序列的完整蛋白。這包括含有該最小毒性蛋白片斷的雜合或嵌合蛋白，也包括至少含有SEQ ID No.4毒性片斷三個功能結(jié)構(gòu)域中一個的蛋白。
此處所用術(shù)語“cry1Bf DNA”、“cry9Fa DNA”或“cry1Jd DNA”分別是指編碼如上所述的Cry1Bf、Cry9Fa或Cry1Jd蛋白的任何DNA序列。這包括編碼如上所述的新分離蛋白或其殺蟲片斷的天然存在的、人工的或合成的DNA序列。此處也包括與所保藏的基因組DNA序列或序列列表中所提供序列的編碼區(qū)足夠相似的、編碼殺蟲蛋白的DNA序列，從而使它們可以(即有能力)與這些DNA序列在嚴緊的雜交條件下進行雜交。此處所用的嚴緊的雜交條件具體是指下列條件將相關(guān)基因組DNA序列固定在濾膜上，并將該濾膜在42℃、50％甲酰胺、5％SSPE、2x Denhardt’s試劑和0.1％SDS中預(yù)雜交1到2小時，或在68℃、6x SSC、2x Denhardt’s試劑和0.1％SDS中預(yù)雜交1到2小時。然后直接向預(yù)雜交液中加入變性的標記探針并在上述適當?shù)臏囟认聹赜?6到24小時。溫育之后，于室溫在1x SSC、0.1％SDS中洗滌濾膜20分鐘，然后于68℃在0.2x SSC和0.1％SDS中洗滌三次，每次20分鐘。使用增感屏于-70℃將此濾膜曝光于X-射線膠片(Kodak XAR-2或等同物)24到48小時，以進行放射自顯影。當然，在此步中可以使用等同的條件和參數(shù)而仍保持所需的嚴緊雜交條件。這樣的等同條件之一包括將相關(guān)基因組DNA序列固定在濾膜上，并將該濾膜在42℃、50％甲酰胺、5％SSPE、2x Denhardt’s試劑和0.1％SDS中預(yù)雜交1到2小時，或在68℃、6x SSC、2x Denhardt’s試劑和0.1％SDS中預(yù)雜交1到2小時。然后直接向預(yù)雜交液中加入變性的(地高辛或放射性)標記探針，并在上述適當?shù)臏囟认聹赜?6到24小時。溫育之后，于室溫在2x SSC、0.1％SDS中洗滌濾膜30分鐘，然后于68℃在0.5x SSC和0.1％SDS中洗滌兩次，每次30分鐘。使用增感屏于-70℃將此濾膜曝光于X-射線膠片(Kodak XAR-2或等同物)24到48小時，以進行放射自顯影。
此處所用的蛋白的“殺蟲活性”是指當用蛋白喂飼昆蟲時，該蛋白有殺死昆蟲的能力，其中所述蛋白優(yōu)選通過在重組宿主(如植物)中進行表達。此處所用的蛋白的“昆蟲控制量”是指在植物上喂飼昆蟲時，足以將昆蟲對植物的損害限制在可商業(yè)用水平的蛋白量，其例如通過殺死昆蟲或通過抑制昆蟲的發(fā)育或成長從而使它們對植物有較少的損害且對植物產(chǎn)量不產(chǎn)生明顯的副作用。
按本發(fā)明所述，將昆蟲控制量、優(yōu)選殺蟲量的本發(fā)明的新Cry蛋白與易受該蛋白影響的昆蟲接觸。
此處所用的“Cry蛋白”或“本發(fā)明的Cry蛋白”是指按本發(fā)明所述所分離的并被鑒定為Cry1Bf、Cry9Fa或Cry1Jd蛋白的任何一個新的蛋白。此處所用的Cry蛋白可以是全長蛋白(也叫做原毒素)，或是稍微或完全(如N端和C端截短)截短了的形式，只要其保留了殺蟲活性，或者可以是雜合或融合蛋白形式的不同蛋白或蛋白部分的組合物。“Cry原毒素”是指如同由天然存在的Bt DNA序列編碼的全長晶體蛋白，“Cry毒素”是指其殺蟲片斷，尤其指其最小的毒性片斷，用SDS-PAGE電泳測定的一般分子量范圍為約60到約80kD。此處所用的“cry基因”或“cryDNA”是指編碼本發(fā)明所述的Cry蛋白的DNA序列，指上述cry1Bf、cry9Fa和cry1JdDNA序列的任何一個。
此處所用的Cry蛋白的“最小毒性片斷”是指可以通過胰蛋白酶或糜蛋白酶消化溶解了的全長晶體蛋白獲得的保留有毒性的片斷，或由Cry蛋白的DNA片斷編碼的毒性蛋白片斷。與原毒素相比，該蛋白通常有一個短的N末端和長的C末端截短。雖然對于重組表達來說，開始于或大約開始于原始的第1位氨基酸的毒性片斷是本發(fā)明所述的優(yōu)選實施方案，但是我們也應(yīng)該注意到除了C末端截短以外，一些N末端氨基酸也可以缺失而保留該蛋白的殺蟲特點。最小毒性片斷的N末端可以以本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，通過胰蛋白酶或糜蛋白酶處理的可溶性晶體蛋白的N末端氨基酸序列測定方便地進行測定。
編碼本發(fā)明Cry蛋白的DNA可以以傳統(tǒng)方法從1999年11月25日保藏在BCCM-LMBP，保藏號為LMBP 3983、LMBP 3984、LMBP 3985和LMBP 3986的大腸桿菌(E.coli)菌株中分離得到。所編碼的Cry蛋白可以用來以傳統(tǒng)方法制備特異性單克隆或多克隆抗體(Hfte等，1988)。其毒素形式可以通過Cry原毒素的蛋白酶(如胰蛋白酶)水解獲得。
編碼該Cry蛋白的DNA序列可以以常規(guī)方法從各自菌株中分離得到或者可以基于被編碼的氨基酸序列進行合成。
通過用限制酶消化分離自Bt菌株的總DNA對編碼本發(fā)明Cry蛋白的DNA序列進行了鑒定；使DNA片斷化，從而產(chǎn)生5到10Kb的DNA片斷；將這些片斷連入克隆載體；用克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再用從已知的Bt晶體蛋白基因構(gòu)建的DNA探針或用基于特異性PCR片斷(使用與已知的Bt晶體蛋白基因相對應(yīng)的引物，由Bt DNA產(chǎn)生)的DNA探針篩選克隆載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。
而且，在本發(fā)明中使用的DNA序列可以通過合成制得。實際上，由于遺傳密碼的簡并性，一些氨基酸密碼子可以用其它的密碼子進行替換而不改變該蛋白的氨基酸序列。此外，一些氨基酸可以用其它的等同氨基酸代替而對該蛋白的殺蟲活性沒有明顯的改變。而且，與那些負責結(jié)合和毒性的區(qū)域的改變不同，在此分子區(qū)內(nèi)氨基酸序列或組成的改變很少有可能引起該蛋白殺蟲活性的差異。該基因的這些等同物包括在嚴緊條件下與Cry毒素或SEQ ID.No.2、4或6的原毒素的DNA序列雜交并編碼與本發(fā)明(蛋白)毒素具有相同殺蟲特性的蛋白的DNA序列，或者編碼與該蛋白毒素形式(如在Schnepf等人、1998中所述的，從N端到保守序列框5以外2個氨基酸處)或與本發(fā)明Cry1Bf、Cry9FA或Cry1Jd蛋白的原毒素形式具有至少85％、優(yōu)選90％、最優(yōu)選95％氨基酸序列同源性蛋白的DNA序列，序列同源性測定使用威斯康星GCG軟件包的GAP程序(美國威斯康星州麥迪遜，10.0版；在GAP程序中使用GCG的默認值；為進行氨基酸序列比較，使用了blosum62記分模型)。
當然，根據(jù)具體目的的不同，可以構(gòu)建出任何其它的密碼子使用不同而編碼基本上有著相同殺蟲活性的相同蛋白或相似蛋白的DNA序列。這已經(jīng)在原核和真核表達系統(tǒng)中有述，其中將密碼子使用變成在外源宿主中進行基因表達時宿主細胞所偏好的密碼子(Bennetzen & Hall，1982；Itakura，1977)。此外，已知Bt晶體蛋白基因?qū)φ婧嗣艽a子沒有偏好，并非常富含AT(Adang等，1985，Schnepf等，1985)。密碼子使用表可在文獻(Wada等，1990；Murray等，1989)中以及在主要的DNA序列數(shù)據(jù)庫(如德國海德堡的EMBL)中找到。因此，可以構(gòu)建合成的DNA序列從而產(chǎn)生相同的或基本上相同的蛋白。很明顯，一旦知道了本發(fā)明Cry蛋白的氨基酸序列就可以設(shè)計出幾種不同的DNA序列。這些其它的DNA序列包括合成的或半合成的DNA序列，它們?yōu)榱耸够蛑械哪承┪稽c失活已經(jīng)發(fā)生了改變，例如在PCT公開WO 91/16432和WO 93/09218中描述的，選擇性地失活存在于天然序列中的某些隱性調(diào)節(jié)或加工元件，或使總體密碼子使用適合更相關(guān)宿主生物體的密碼子使用，優(yōu)選可在宿主生物體表達的密碼子使用。在構(gòu)建這些基因時，雖然只要該蛋白的毒性不受到負面的影響就可以對氨基酸進行截短或次要的替換或添加，但是還是應(yīng)該最大程度的保持所編碼的氨基酸序列。
通?？梢酝ㄟ^PCR介導(dǎo)的突變對DNA序列進行上述的小的修飾(Ho等，1989，White等，1989)。
在提到蛋白時的術(shù)語“基本上相同”是指包括有些氨基酸不同或有一些氨基酸添加(如融合蛋白，參見Vaeck等，1987)或缺失(如N端或C端截短)的蛋白，只要該蛋白在其殺蟲活性上沒有明顯的差異就行。
此處所用的術(shù)語Cry毒素的“功能結(jié)構(gòu)域”是指具有特定結(jié)構(gòu)的、該毒素的任何部分或結(jié)構(gòu)域，其可被轉(zhuǎn)移到另一種(Cry)蛋白上，以產(chǎn)生一種新的、具有本發(fā)明Cry毒素至少一種功能特性(如結(jié)合和/或毒性特性)的雜合蛋白(Ge等，1991)。這些部分以本發(fā)明Cry蛋白的結(jié)合和/或毒性特性構(gòu)成該雜合Bt蛋白的基本特征。這樣的雜合蛋白可以有較大的宿主范圍，改良的毒性和/或可用于防止昆蟲抗性發(fā)展的策略中(歐洲專利公開(“EP”)408 403；Visser等，1993)。
可將由本發(fā)明Bt菌株的總DNA制備的5到10Kb的片斷連入適當?shù)谋磉_載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后可以通過常規(guī)的菌落免疫探測法(French等，1986)用抗Cry蛋白的單克隆或多克隆抗體篩選表達該毒素的克隆，或通過與DNA探針雜交篩選克隆。
而且，可將由本發(fā)明Bt菌株的總DNA制備的5到10Kb的片斷或其被克隆和/或亞克隆到大腸桿菌中的片斷，連入適當?shù)腂t穿梭載體(Lereclus等，1992)并轉(zhuǎn)化進入晶體缺失的Bt突變體。然后篩選產(chǎn)生晶體(鏡檢)或晶體蛋白(SDS-PAGE檢測)的克隆。
編碼本發(fā)明Cry蛋白的基因可以以常規(guī)方法測序(Maxam和Gilbert，1980；Sanger，1977)以得到其DNA序列。序列比較表明這些基因與以前描述的、編碼具有抗鱗翅類活性的原毒素和毒素(Hfte和Whiteley，1989；Crickmore等，1998)不同；而且可在http//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/index.html上找到1999年11月15日和2000年10月16日Bt命名網(wǎng)站的升級與Crickmore等(1998)的公開相對應(yīng)。
編碼新鑒定的Cry蛋白原毒素形式的有效殺蟲區(qū)段的這些DNA序列的有效殺蟲部分，在對該基因進行序列分析之后，可以按常規(guī)方法制得。在這些片斷中，優(yōu)選保留至少到達Bt蛋白保守序列框5的C端末端(Hofte &Whiteley，1989；Schnepf等1998)，優(yōu)選到達保守序列框5C端2個氨基酸的序列。這些Cry蛋白的氨基酸序列可由分離的DNA序列得以確定。編碼該Cry蛋白的DNA序列的“有效殺蟲部分”，在此也指“截短基因”或“截短DNA”，是指編碼一段多肽的DNA序列，該多肽比Cry蛋白原毒素形式的氨基酸要少但可以殺蟲。
為了在大腸桿菌中、在其它Bt菌株中或在植物中表達編碼本發(fā)明Cry蛋白的全長DNA序列或其有效殺蟲部分，在該DNA序列兩側(cè)可以引入適當?shù)南拗泼盖形稽c。這可以使用已知工藝，通過定點突變來進行(Stanssens等，1989；White等，1989)。為在植物中提高表達，可以對本發(fā)明cry基因或cry基因的有效殺蟲部分的密碼子使用進行修飾以形成與PCT公開WO 91/16432和WO 93/09218；EP 0 358 962和EP 0 359 472等同的、修飾的或人工基因或部分基因；或?qū)t基因或部分基因插入葉綠體基因組中并使用葉綠體活性啟動子進行表達(如Mc Bride等，1995)。為在單子葉植物例如玉米中獲得增強表達，也可以將單子葉內(nèi)含子加到嵌合基因中，并且可以以翻譯中性方式，通過內(nèi)含子定點插入和/或通過引入密碼子使用的改變(例如將密碼子使用調(diào)整至特定植物的最優(yōu)密碼子使用(Murray等，1989)而不明顯改變所編碼的氨基酸序列)，進一步改變本發(fā)明cry基因或其殺蟲部分的DNA序列，以對可能出現(xiàn)在部分基因中的DNA抑制序列進行修飾。
此外，本發(fā)明Cry蛋白的結(jié)合特性可通過本領(lǐng)域已知方法進行評價(Van Rie等，1990)，以確定是否本發(fā)明的Cry蛋白結(jié)合至昆蟲的中腸位點，這與由其它已知的Cry蛋白或Bt蛋白所識別的位點不同。在相關(guān)易感昆蟲中，有著不同結(jié)合位點的Bt毒素對于取代已知的、昆蟲可能已經(jīng)對其產(chǎn)生抗性的Bt毒性是非常有價值的，或者對于與具有不同的、防止或延緩昆蟲對Bt毒素抗性作用模式的Bt毒素的聯(lián)合使用是非常有價值的，尤其是在植物中進行表達的時候。由于此新分離得到的Bt毒素的這些特點，使其在改造植物(例如單子葉植物如玉米或水稻及蔬菜如蕓苔種植物)以保護這些植物免受昆蟲侵害方面十分有用。
編碼Cry原毒素有效殺蟲區(qū)段的cry基因的有效殺蟲部分或其等同物(優(yōu)選cry嵌合基因)可以以常規(guī)方法穩(wěn)定插入單一植物細胞的核基因組，并且這樣轉(zhuǎn)化的植物細胞可以以常規(guī)方法用于生產(chǎn)昆蟲抗性的轉(zhuǎn)化植株。在這點上，可用在根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中的含有cry基因有效殺蟲部分的卸甲Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞，然后使用例如在EP 0116 718、EP 0 270 822、PCT公開WO 84/02913和公開的歐洲專利申請(“EP”)0 242 246和在Gould等(1991)中描述的方法，由該轉(zhuǎn)化的植物細胞再生出轉(zhuǎn)化植株。每種優(yōu)選的Ti質(zhì)粒載體都在Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列之間含有cry基因有效殺蟲部分，或至少位于其邊界序列的左邊或右邊。當然，也可以用其它類型的載體轉(zhuǎn)化植物細胞，所用轉(zhuǎn)化方法例如使用直接的基因轉(zhuǎn)移(例如在EP 0 233 247中所述)、花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如在EP 0 270356、PCT公開WO 85/01856和美國專利4,684,611中所述)、植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如在EP 0 067 553和美國專利4,407,956中所述)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如在美國專利4,536,475中所述)和其它方法例如最近所述的轉(zhuǎn)化玉米的某些特定品系(Fromm等，1990；Gordon-Kamm等，1990)和水稻的某些特定品系(Shimamoto等，1989；Datta等，1990)的方法和最近所述的通常轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法(PCT公開WO 92/09696)。
所得的轉(zhuǎn)化植株可用于常規(guī)的植物育種方法，用于生產(chǎn)更多的具有同樣特性的植株或用于將該cry基因有效殺蟲部分導(dǎo)入其它相同或相關(guān)植物品種中。從轉(zhuǎn)化植株獲得的種子含有作為穩(wěn)定的基因組插入物的cry基因有效殺蟲部分。轉(zhuǎn)化植株的細胞可以以常規(guī)方法進行培養(yǎng)以生產(chǎn)Cry原毒素(優(yōu)選Cry毒素)的有效殺蟲區(qū)段，可以對其進行回收以用于常規(guī)的抗鱗翅類殺蟲組合物中(美國專利5,254,799)。按本發(fā)明所述，本發(fā)明的植物或種子可通過例如在一塊通常有蟲害的地里播種或種植，以獲得對昆蟲的抗性。因此，按照本發(fā)明，通過在一塊地里，優(yōu)選在通常存在或預(yù)期存在吃該類植物的害蟲(其水平為對植物造成了經(jīng)濟上的損害)出現(xiàn)的地里播種或種植產(chǎn)生本發(fā)明Cry蛋白的本發(fā)明的種子植物，提供了獲得昆蟲抗性的方法和獲得提高的產(chǎn)量或減少蟲害的方法。
將cry基因有效殺蟲部分，優(yōu)選截短cry基因，插入植物細胞基因組，使插入的基因位于可指導(dǎo)該基因部分在此植物細胞中進行表達的啟動子的下游(即3’)及其控制之下。優(yōu)選通過在植物細胞基因組中，具體說來就是在核基因組或葉綠體基因組中，插入cry嵌合基因來完成。優(yōu)選的啟動子包括分離物CM 1841(Gardner等，1981)、CabbB-S(Franck等，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)的花椰菜花葉病毒(CaMV)的35 S組成型強啟動子(即“35 S啟動子”)；遍在蛋白家族的啟動子(例如Christensen等，1992的玉米遍在蛋白啟動子，也可參見Cornejo等，1993)，gos2啟動子(de Pater等，1992)，emu啟動子(Last等，1990)，水稻的肌動蛋白啟動子例如Zhang等(1991)描述的啟動子；和分別驅(qū)動1’和2’基因表達的、T-DNA的TR1′啟動子和TR2′啟動子(即分別的“TR1啟動子”和“TR2啟動子”)(Velten等，1984)。另外，啟動子可以為非組成型的、但其對植物的一種或多種組織或器官(如葉和/或根)具特異性，從而使插入的cry基因部分僅在特定組織或器官的細胞中進行表達。例如，通過將有效殺蟲基因部分置于光誘導(dǎo)啟動子(例如在美國專利5,254,799中公開的，植株本身的或另一植株例如豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因的啟動子)的控制之下，使該cry基因有效殺蟲部分可選擇性地在植物(例如玉米、棉花)的葉子中進行表達。再一種選擇為使用誘導(dǎo)表達啟動子(例如通過溫度、愈傷或化學因子誘導(dǎo))。
將cry基因的有效殺蟲部分插入植物基因組中，使插入的基因部分處于適合的3’末端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(即轉(zhuǎn)錄本形成和多聚腺苷酸化信號)的上游。優(yōu)選通過在植物細胞基因組中插入該cry嵌合基因來進行。優(yōu)選的多聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄本形成信號包括章魚堿合成酶基因的那些信號(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)的那些信號，它們在被轉(zhuǎn)化的植物細胞中作為3’非翻譯DNA序列存在。
可任選地將cry基因有效殺蟲部分插入到植物基因組中作為與選擇標記基因(例如編碼卡那霉素抗性的neo基因(EP 0 242 236))處于同一啟動子控制之下的雜合基因(美國專利5,254,799；Vaeck等，1987)，從而使該植物表達融合蛋白。
編碼抗鱗翅類蛋白的全部cry基因的或部分cry基因也可用來轉(zhuǎn)化其它細菌，例如具有抗鱗翅類或鞘翅類殺蟲活性的蘇云金芽孢桿菌。因此，可以生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的Bt菌株，其在同廣譜鱗翅類或鞘翅類昆蟲害蟲斗爭或同其它鱗翅類昆蟲害蟲斗爭方面是十分有用的。用已摻入合適克隆載體的本發(fā)明全部或部分cry基因轉(zhuǎn)化細菌，例如土壤桿菌屬、芽孢桿菌屬或埃希氏菌屬的細菌，可以按常規(guī)方法進行，優(yōu)選使用如Mahillon等(1989)和PCT專利公開WO 90/06999中所述的常規(guī)電穿孔技術(shù)。
含有本發(fā)明cry基因的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化菌株可通過常規(guī)方法(Dulmage，1981；Bernhard和Utz，1993)進行發(fā)酵，以提供高產(chǎn)量的細胞。以提供高產(chǎn)量的細胞。在公知的合適條件下(Dulmage，1981)，這些菌株的每一種都形成孢子以產(chǎn)生高產(chǎn)量的含有Cry原毒素的晶體蛋白。
殺蟲的，尤其是抗鱗翅類的本發(fā)明組合物可以使用用cry基因轉(zhuǎn)化的微生物，或優(yōu)選其各自的Cry蛋白或Cry原毒素、毒素或有效殺蟲原毒素區(qū)段作為活性成分，與適當?shù)妮d體、稀釋劑、乳化劑和/或分散劑(例如由Bernhard和Utz，1993所描述的)一起以常規(guī)方法進行配制?？梢詫⒃摎⑾x組合物制劑為吸濕粉末、丸粒、顆?；驀姺?，或與水性的或非水性的溶劑以泡沫、凝膠、懸液、濃縮物等等制備為液體制劑。
本發(fā)明所述的控制昆蟲，尤其是鱗翅類昆蟲的方法可以包括將本發(fā)明殺蟲量的Cry蛋白或用cry基因轉(zhuǎn)化的宿主細胞應(yīng)用(例如噴灑)到要保護的地點(區(qū)域)。被保護的地點包括，例如昆蟲害蟲的棲息地或種植蔬菜或長有蔬菜的區(qū)域。
為獲得Cry原毒素或毒素，表達Cry蛋白的重組宿主細胞可以以常規(guī)方式在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上進行生長，然后使用常規(guī)的方法，例如酶解或去污劑等等裂解之。然后，可以用標準技術(shù)例如色譜、萃取、電泳等等，將該原毒素分離并純化。然后可以通過該原毒素的胰蛋白酶消化獲得毒素。
下列實施例例證了本發(fā)明，而并非是對本發(fā)明或保護的目標進行限制。在實施例、權(quán)利要求和敘述中所涉及的序列表如下序列表SEQ ID No.1-Cry1Bf蛋白和DNA的氨基酸序列和DNA序列。
SEQ ID No.2-Cry1Bf蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID No.3-Cry1Jd蛋白和DNA的氨基酸序列和DNA序列。
SEQ ID No.4-Cry1Jd蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID No.5-Cry9Fa蛋白和DNA的氨基酸序列和DNA序列。
SEQ ID No.6-Cry9Fa蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID No.7-引物Cry1B.fw的DNA序列。
SEQ ID No.8-引物B.R的DNA序列。
SEQ ID No.9-引物B.F的DNA序列。
SEQ ID No.10-引物JFW的DNA序列。
SEQ ID No.11-引物JRV的DNA序列。
SEQ ID No.12-引物9FW的DNA序列。
SEQ ID No.13-引物9RV的DNA序列。
如果在實施例中沒有其它的說明，所有制備和操作重組DNA的方法都按照在Sambrook等，分子克隆-實驗室手冊，第二版(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Second Edition)，冷泉港實驗室出版社，紐約(1989)一書和在Ausubel等(1994)現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，現(xiàn)代技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology，Current Protoools)，美國的第一卷和第二卷中所述的標準方法進行。植物分子生物學工作的標準材料和方法在由R.R.D.Croy所著的植物分子生物學Labfax(PlantMolecular Biology Labfax)(1993)(由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK))一書中有述。PCR技術(shù)方法可在M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White編輯的“PCR技術(shù)方法與應(yīng)用指南”(“PCR protocolsa guide to methodsand applications”)(Academic Press，Inc.，1990)一書中找到。
每個菌株均可在常規(guī)標準培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，優(yōu)選T3培養(yǎng)基(胰蛋白胨3g/l、胰蛋白 2g/l、酵母抽提物1.5g/l、5mg MnCl2、0.05MNa2HPO4·2H2O、0.05M NaH2PO4·H2O，pH6.8及1.5％瓊脂)，優(yōu)選在28℃進行培養(yǎng)。為長期保存，優(yōu)選將等體積的孢晶懸浮物與等體積的50％甘油混合并于-70℃保存或?qū)㈡呔腋∥飪龈伞槭规咦有纬?，?yōu)選在T3培養(yǎng)基上28℃生長72小時，然后于4℃保存。由菌株在成孢期間產(chǎn)生的晶體蛋白被包裹成晶體狀。
實施例2抗所選鱗翅類昆蟲種的BtS02072BG和BtS02739C菌株的殺蟲活性在人工喂養(yǎng)的美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)、煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)、玉米螟(Ostrinia nubilalis)、草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)和Sesamia nonagrioides的初生幼蟲上用由BtS02072BG或BtS02739C得到的孢晶混合物(約109孢晶/ml)進行毒性分析。
于Costar 24孔板按孔分發(fā)人工飼料(Vanderzant，1962)，以對美洲棉鈴蟲、煙芽夜蛾和玉米螟進行實驗。將50微升孢晶混合物施于飼料表面并在層化氣流中干燥。為對美洲棉鈴蟲、煙芽夜蛾進行實驗，在每個孔里放1條幼蟲，每個樣品用20條幼蟲。為對玉米螟進行實驗，在每個孔里放2條幼蟲，每個樣品用24條幼蟲。于Costar 48孔板按孔分發(fā)人工飼料，以對草地夜蛾進行實驗。將25微升孢晶混合物施于飼料表面并在層化氣流中干燥。在每個孔里放1條幼蟲，每個樣品用18條幼蟲。在第7天計算死亡幼蟲和活幼蟲。死亡幼蟲的百分比如表I所示。表I晶孢混合物施用于昆蟲后死亡幼蟲百分比
實施例3新cry基因的特性使用靶向已知的cry基因中保守區(qū)的簡并引物進行PCR以對BtS02739C基因進行檢測。用Wizard PCR preps(Promega)純化系統(tǒng)對所得的擴增產(chǎn)物進行純化并將其連入pGEM-T載體(Promega)。將連接混合物以電穿孔法轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM 101。一次小規(guī)模制備物中至少由40個含有插入片段的轉(zhuǎn)化子組成，并用所選的限制酶進行消化。對所消化的小規(guī)模制備DNA進行電泳，然后可以觀察到不同的DNA片斷類型。對每種類型至少選擇一個菌落。制備適當?shù)腄NA制備物以對每個所選菌落中質(zhì)粒的插入片段序列進行測定。所測定的擴增產(chǎn)物序列與公開的cry序列的排列表明菌株BtS02739C含有一個新的cry1J-型基因和新的cry9-型基因。
BtS02072BG基因的檢測如下。首先，使用菌株BtS02419J的簡并晶體蛋白基因引物進行PCR。使用簡并晶體蛋白引物，以所得的擴增產(chǎn)物為模板進行二次PCR。
用Wizard PCR preps(Promega)純化系統(tǒng)對所得的擴增產(chǎn)物進行純化并將其連入pGEM-T載體(Promega)。將連接產(chǎn)物以電穿孔法轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL1 Blue。一次小規(guī)模制備至少由40個含有插入片段的轉(zhuǎn)化子組成，并用所選的限制酶進行消化。對所消化的小規(guī)模制備DNA進行電泳，然后可以觀察到不同的DNA片斷類型。對每種類型至少選擇一個菌落。制備適當?shù)腄NA制備物以對每個所選菌落中質(zhì)粒插入片段的序列進行測定。
由菌株BtS02419J的克隆擴增產(chǎn)物中，我們發(fā)現(xiàn)了一段與cry1Be1相應(yīng)片斷一致的序列，二者只相差一個核苷酸。然后，選擇引物對大量Bt菌株(其中一個是BtS02072BG菌株)中是否存在與已測序的BtS02419J菌株的cry基因片斷相似的cry序列進行評測。這些引物序列如下(5′to3′)正向引物cry1B.fwCAG TCC AAA CGG GTA TAA AC反向引物B.RCTG CTT CGA AGG TTG CAG TA所測定的擴增產(chǎn)物的序列與公開的cry序列的排列表明菌株BtS02072BG含有一個新的cry1B-型基因。
實施例4cry基因的克隆與表達為了從菌株BtS02739C中分離出全長的cry1J-型和cry9-型基因，以及從菌株BtS02072BG中分離出cry1B-型基因，制備了這些菌株的總DNA，并以Sau3A進行部分消化。以蔗糖梯度對所消化的DNA依大小分開，并將5Kb到10Kb片斷連入以BamH1消化并以TsAP(溫敏堿性磷酸酶)處理過的克隆載體pUC19(Yannisch-Perron等，1985)中。將連接混合物以電穿孔法轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL1-Blue或大腸桿菌JM109細胞。將轉(zhuǎn)化子鋪于含Xgal和IPTG的LB-triacillin平板上并挑取白色菌落進行濾膜雜交實驗。然后用合適的DIG標記探針篩選含載體的重組大腸桿菌克隆。這些探針按以下方法制得。首先，用來自重組大腸桿菌克隆作為模板細胞(其包含具有特定cry基因片斷的質(zhì)粒)進行PCR，預(yù)先使用表II所示的恰當引物進行擴增。表II用于分離新Bt DNA序列(Y＝C或T，S＝G或C)的引物
將所得的擴增產(chǎn)物進行凝膠純化，并以它為模板用DIG標記的dNTP進行二次PCR反應(yīng)。將適當量的該擴增產(chǎn)物用于雜交反應(yīng)。
用cry1J-型探針和cry9-型探針的混合物進行菌株BtS02739C的菌落雜交。然后將陽性克隆與每個探針分別雜交。菌株BtS02072BG的菌落雜交用cry1B-型探針進行。在鑒定出一個含全長cry基因質(zhì)粒的陽性克隆后，使用染料終止子標記法及Perkin Elmer ABI Prism-377DNA測序儀對該cry基因兩條鏈的序列進行測定。根據(jù)DNA測序的結(jié)果對這些基因命名如下BtS02739C的cry1J-型和cry9-型基因被分別命名為cry1Jd和cry9Fa，BtS02072BG的cry1B-型基因被命名為cry1Bf。
所分離的cry1Jd、cry9Fa和cry1Bf基因的基因組序列及其編碼的蛋白的序列也在本發(fā)明序列表中列出。這些序列與已知的Cry DNA或蛋白序列的比較表明，這些序列是新的并有相當多的核苷酸和氨基酸與已知的Bt基因及蛋白不同。使用10.0版的Wisconsin GCG軟件包(美國，威斯康星麥迪遜)的GAP程序確定最相似基因和蛋白編碼區(qū)(原毒素和毒素兩種形式)的序列同一性，表III-V為其概述。在GAP程序中使用GCG的默認值。對核苷酸序列比較而言，使用的是nwsgapdna計分模型，對氨基酸序列比較而言，使用blosum62計分模型。在表III-V中使用的毒素形式是指起始于Schnepf等(1998)等所定義的保守序列框5的第一個氨基酸并結(jié)束于最后一個氨基酸(通常為脯氨酸)后兩個氨基酸處的蛋白。原毒素形式是指Bt蛋白/基因的整個蛋白或其編碼區(qū)。表IIIcry1Bf/Cry1Bf的序列同一性
表IVcry9Fa/Cry9Fa的序列同一性
表Vcry1Jd/Cry1Jd的序列同一性
這些新分離基因的基因組克隆已保藏于BCCMTM-LMBP(BelgianCoordinated Collections of Microorganisms-Laboratorium voorMoleculaire Biologie-Plasmidencollectie，University of Gent，K.L.Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent，比利時)，保藏號為LMBP 3983-含pUC2739C/1Jd1質(zhì)粒(其中含有cry1Jd基因)的大腸桿菌JM109，1999年11月25日保藏(該基因可以通過用XhoI和SmaI消化該質(zhì)粒，分離得到約8.4kb的DNA片斷)；LMBP 3984-含pUC2739C/9Fa1質(zhì)粒(其中含有cry9Fa基因)的大腸桿菌JM109，1999年11月25日保藏(該基因可以通過用SacI和PstI消化該質(zhì)粒，分離得到約8kb的DNA片斷)；以及LMBP 3986-含pUC2072BG/1Bf1質(zhì)粒(其中含有cry1Bf基因)的大腸桿菌XL1Blue，1999年11月25日保藏(該基因可以通過用SacI和SalI消化該質(zhì)粒，分離得到約7kb的DNA片斷)。
實施例5cry基因的殺蟲活性將含cry9Fa基因的插入片段亞克隆于適當?shù)拇┧筝d體中并通過常規(guī)方法將所得的質(zhì)粒pSL2739C/9Fa1轉(zhuǎn)入晶體缺陷的Bt菌株中。將由該重組Bt菌株結(jié)孢培養(yǎng)物所產(chǎn)生的晶體蛋白在煙芽夜蛾和玉米螟的新生幼蟲上以約109滴度/ml的濃度進行檢測。對玉米螟幼蟲，觀察到100％死亡率，而對煙芽夜蛾幼蟲，死亡率為72％，而用晶體缺陷的對照菌株進行處理以后，幼蟲全都存活。
將含cry1Bf基因的插入片段亞克隆于適當?shù)拇┧筝d體中并通過常規(guī)方法將所得的質(zhì)粒pSL2072BG/1Bf轉(zhuǎn)入晶體缺陷的Bt菌株中。將由該重組Bt菌株結(jié)孢培養(yǎng)物所產(chǎn)生的晶體蛋白在Sesamia nonagrioides、煙芽夜蛾、美洲棉鈴蟲和玉米螟幼蟲上以不同濃度進行檢測。在煙芽夜蛾、玉米螟和Sesamia nonagrioides幼蟲上觀察到了Cry1Bf毒素有相當高的死亡率，而對美洲棉鈴蟲的毒性較低。用晶體缺陷的對照菌株進行處理以后，幼蟲全部存活。
將含cry1Jd基因的插入片段亞克隆于適當?shù)拇┧筝d體中并通過常規(guī)方法將所得的質(zhì)粒pGI2739C/1Jd轉(zhuǎn)入晶體缺陷的Bt菌株中。將由該重組Bt菌株結(jié)孢培養(yǎng)物所產(chǎn)生的晶體蛋白在煙芽夜蛾幼蟲上以不同濃度進行檢測，觀察到了Cry1Bf毒素明顯的致死性。用晶體缺陷的對照菌株進行處理以后，幼蟲全部存活。
實施例6在轉(zhuǎn)化植物中生產(chǎn)新的Cry蛋白。
使用CaMV 35S(Hull和Howell，1987)和遍在蛋白(Christensen等，1992)啟動子，按EP 0 193 259和公開的PCT專利申請WO 94/12264中所描述的方法制得編碼Cry1Bf、Cry1Jd和Cry9Fa蛋白截短形式的嵌合基因。如在公開的PCT專利申請WO 94/12264中所述，開放閱讀框架的密碼子使用與宿主植物的相適應(yīng)為優(yōu)選，以使表達效率最佳。
用所得的嵌合基因轉(zhuǎn)化水稻、棉花和玉米細胞。
如在WO 92/09696或美國專利5,641,664中所述(并入本文以作參考)，使用愈傷的和酶降解的胚芽愈傷組織，通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Ishida等，1996，和美國專利5,591,616)或通過電穿孔法都可以對玉米細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Umbeck等，1987，生物/技術(shù)(Bio/Technology)5，263-266；美國專利；5,004,863，并入本文以作參考)可以對玉米細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
用公開的PCT專利申請WO 92/09696中所描述的方法可對水稻細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
通過ELISA、Northern和Southern印跡及殺蟲效果選擇再生的轉(zhuǎn)化玉米、棉花和水稻植株。與未轉(zhuǎn)化的對照植株相比，含嵌合基因的后代植株表現(xiàn)出增強的昆蟲抵抗力，其具有適當?shù)睦ハx抵抗力分離和轉(zhuǎn)化表型。蛋白與RNA測定表明增強的昆蟲抵抗力與新Cry蛋白在植株中的較高表達相關(guān)。
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245 250 255cga aca att tct caa ttg aca aga gaa att tat aca tcc cca gta agc 816Arg Thr Ile Ser Gln Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Ser Pro Val Ser260 265 270gaa ttt tat tat ggt ccc att tat aat cat aat atg att ggt acc ttt 864Glu Phe Tyr Tyr Gly Pro Ile Tyr Asn His Asn Met Ile Gly Thr Phe275 280 285att gaa cgg cag cta agg cga cca cat ctt atg gac ttc ttt aac tcc 912Ile Glu Arg Gln Leu Arg Arg Pro His Leu Met Asp Phe Phe Asn Ser290 295 300atg acc atg tat aca tca gat aat aga cgg gaa tat tat tgg tca gga 960Met Thr Met Tyr Thr Ser Asp Asn Arg Arg Glu Tyr Tyr Trp Ser Gly305 310 315 320ctt gaa atg acg gct act ctt act tca gga aat caa gtg tca ttc cct 1008Leu Glu Met Thr Ala Thr Leu Thr Ser Gly Asn Gln Val Ser Phe Pro325 330 335tta gcc ggg act aga ggg aat tca gct cca cca gta tct gtt aga aag 1056Leu Ala Gly Thr Arg Gly Asn Ser Ala Pro Pro Val Ser Val Arg Lys340 345 350act ggt gag gga att tat aga ata tta tcg gaa cca ttt tat tca gca 1104Thr Gly Glu Gly Ile Tyr Arg Ile Leu Ser Glu Pro Phe Tyr Ser Ala355 360 365cct ttt cta ggc acc agt gtg cta gga agt cgc ggg gaa gaa ttt gct 1152Pro Phe Leu Gly Thr Ser Val Leu Gly Ser Arg Gly Glu Glu Phe Ala370 375 380ttt gca tct aat act act aca agt ctg cca tct aca ata tat aga aat 1200Phe Ala Ser Asn Thr Thr Thr Ser Leu Pro Ser Thr Ile Tyr Arg Asn385 390 395 400cgt gga aca gta gat tca tta gtc agc ata ccg cca caa gat tat agc 1248Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Val Ser Ile Pro Pro Gln Asp Tyr Ser405 410 415gta cca ccg cac agg ggg tat agt cat tta tta agt cac gtt acg atg 1296Val Pro Pro His Arg Gly Tyr Ser His Leu Leu Ser His Val Thr Met420 425 430cac aat agt tct cct ata ttc cac tgg acg cat cgt agt gcg aca cct 1344His Asn Ser Ser Pro Ile Phe His Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Pro435 440 445aga aat ata att tat cca gat agt atc act caa atc cca gta gtt aag 1392Arg Asn Ile Ile Tyr Pro Asp Ser Ile Thr Gln Ile Pro Val Val Lys450 455 460gct tcg cac ctc tct ggt ggt tca gtt ata aaa gga cct gga cat aca 1440Ala Ser His Leu Ser Gly Gly Ser Val Ile Lys Gly Pro Gly His Thr465 470 475 480ggt gga gat tta ata agc cta cct gta aat aac ttt act cat ttc cga 1488Gly Gly Asp Leu Ile Ser Leu Pro Val Asn Asn Phe Thr His Phe Arg485 490 495atc cca ttt cag gca aac act cca caa agg tat cgt att aga att tgt 1536Ile Pro Phe Gln Ala Asn Thr Pro Gln Arg Tyr Arg Ile Arg Ile Cys500 505 510tat gcg gca gac tca gat ggg act ttg gat agt gga gtt ttc tta agt 1584Tyr Ala Ala Asp Ser Asp Gly Thr Leu Asp Ser Gly Val Phe Leu Ser515 520 525gca gca gca ggg gat ggt ttt aat aca act tct tat agg gcc aca atg 1632Ala Ala Ala Gly Asp Gly Phe Asn Thr Thr Ser Tyr Arg Ala Thr Met530 535 540agc cct gaa ggt tcc tta aca tct cgt gat ttt caa ttt tta gat tta 1680Ser Pro Glu Gly Ser Leu Thr Ser Arg Asp Phe Gln Phe Leu Asp Leu545 550 555 560aac aca tcg ttt acc tcc gat gta gca tct aac tta tgg tta cat ttt 1728Asn Thr Ser Phe Thr Ser Asp Val Ala Ser Asn Leu Trp Leu His Phe565 570 575ata cgt tat ata cga cca ggg aat ttg tat ata gat aga gcg gaa ttt 1776Ile Arg Tyr Ile Arg Pro Gly Asn Leu Tyr Ile Asp Arg Ala Glu Phe580 585 590atc cca gtg gat gca acc ttc gag gca ggt tat aat tta gaa agg gcg 1824Ile Pro Val Asp Ala Thr Phe Glu Ala Gly Tyr Asn Leu Glu Arg Ala595 600 605caa aag gcg gtg aat gcc ctg ttt act tct aca aac caa aaa gga tta 1872Gln Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Ser Thr Asn Gln Lys Gly Leu610 615 620caa aca gat gtg acg gat tat cat att gat caa gta tcc aat cta gtt 1920Gln Thr Asp Val Thr Asp Tyr His Ile Asp Gln Val Ser Asn Leu Val625 630 635 640gat tgt tta tct gat gag ttt tgc tta gat gaa aag cga aaa ttg tcc 1968Asp Cys Leu Ser Asp Glu Phe Cys Leu Asp Glu Lys Arg Lys Leu Ser645 650 655gag aaa gtc aaa cag gcg aag cga ctc agt gat gag cgg aat tta ctt 2016Glu Lys Val Lys Gln Ala Lys Arg Leu Ser Asp Glu Arg Asn Leu Leu660 665 670cag gat tca aat ttc aga ggc atc aat agg gaa caa gac cgt gga tgg 2064Gln Asp Ser Asn Phe Arg Gly Ile Asn Arg Glu Gln Asp Arg Gly Trp
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權(quán)利要求
1.編碼蛋白的DNA，其中蛋白含有下列氨基酸序列a)由保藏于BCCM-LMBP，保藏號為LMBP 3986的cry1Bf基因所編碼蛋白的殺蟲的胰蛋白酶消化片斷的氨基酸序列，b)由保藏于BCCM-LMBP，保藏號為LMBP 3983的cry1Jd基因所編碼蛋白的殺蟲的胰蛋白酶消化片斷的氨基酸序列，和c)由保藏于BCCM-LMBP，保藏號為LMBP 3984的cry9Fa基因所編碼蛋白的殺蟲的胰蛋白酶消化片斷的氨基酸序列。
2.編碼一個蛋白的DNA，該蛋白含有下列氨基酸序列SEQ ID No.2蛋白殺蟲片斷的氨基酸序列，SEQ ID No.4蛋白殺蟲片斷的氨基酸序列，SEQ ID No.6蛋白殺蟲片斷的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2所述的編碼一個蛋白的DNA，該蛋白含有下列氨基酸序列SEQ ID No.2從第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列，SEQ IDNo.4從第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列，SEQ ID No.6從第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3所述的編碼一個蛋白的DNA，該蛋白含有下列氨基酸序列SEQ ID No.2的氨基酸序列，SEQ ID No.4的氨基酸序列，SEQ ID No.6的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1到4中任何一項所述的DNA，其含有SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5的DNA序列。
6.權(quán)利要求5所述的DNA，其含有一段人工DNA序列，該人工DNA序列的密碼子使用與天然存在的DNA序列不同但編碼相同的蛋白或其殺蟲片斷。
7.權(quán)利要求1到4中任何一項所述的DNA，其含有一段人工DNA序列，該人工DNA序列的密碼子使用與天然存在的DNA序列不同但編碼相同的蛋白或其殺蟲片斷。
8.含有下列氨基酸序列的蛋白a)由保藏于BCCM-LMBP，保藏號為LMBP 3986的cry1Bf基因所編碼蛋白的殺蟲的胰蛋白酶消化片斷的氨基酸序列，b)由保藏于BCCM-LMBP，保藏號為LMBP 3983的cry1Jd基因所編碼蛋白的殺蟲的胰蛋白酶消化片斷的氨基酸序列，和c)由保藏于BCCM-LMBP，保藏號為LMBP 3984的cry9Fa基因所編碼蛋白的殺蟲的胰蛋白酶消化片斷的氨基酸序列。
9.含有下列氨基酸序列的蛋白SEQ ID No.2蛋白殺蟲片斷的氨基酸序列，SEQ ID No.4蛋白殺蟲片斷的氨基酸序列，SEQ ID No.6蛋白殺蟲片斷的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9所述的蛋白，其含有下列氨基酸序列SEQ ID No.2從第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列，SEQ ID No.4從第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列，SEQ ID No.6從第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求8到10中任何一項所述的蛋白，其含SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6的氨基酸序列。
12.在植物表達啟動子控制之下的嵌合基因，其含有權(quán)利要求1到7中任何一項所述的DNA。
13.植物細胞，其被轉(zhuǎn)化從而含有權(quán)利要求12所述的嵌合基因。
14.植株或種子，其包含整合在其細胞中的權(quán)利要求12所述的嵌合基因。
15.植株或種子，其包含整合在其細胞的核DNA或葉綠體DNA的權(quán)利要求12所述的嵌合基因。
16.權(quán)利要求14所述的植株或種子，其選自玉米、棉花、水稻、油菜籽、蕓苔、茄子、大豆、土豆、向日葵、西紅柿、甘蔗、茶葉、豌豆、煙草、草莓、苜蓿、黃瓜、西瓜、胡椒、燕麥、大麥、小麥、天竺牡丹、劍蘭、菊花、甜菜、高粱、紫花苜蓿和花生。
17.微生物，其被轉(zhuǎn)化從而含有權(quán)利要求1到7中任何一項所述的DNA。
18.權(quán)利要求17所述的微生物，其選自土壤桿菌屬、埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬。
19.控制昆蟲的方法，其包括在宿主細胞中表達權(quán)利要求1到7中任何一項所述的DNA，并將所說的宿主細胞與昆蟲相接觸。
20.獲得抗昆蟲植株的方法，其包括用權(quán)利要求1到7中任何一項所述的DNA或用權(quán)利要求12所述的嵌合基因轉(zhuǎn)化植物細胞，并從這些抗昆蟲的細胞中再生出轉(zhuǎn)化植株。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其進一步包括由含所述DNA的所述植株獲得種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自蘇云金芽孢桿菌菌株的新殺蟲化合物。本發(fā)明提供了被命名為CrylJd、Cry9Fa、和CrylBf的新蛋白及其殺蟲片斷，以及編碼這些蛋白或其殺蟲片斷的DNA序列。本發(fā)明進一步提供了表達這些蛋白的重組宿主，尤其是植物細胞和植株。
文檔編號C12N15/82GK1414973SQ00817997
公開日2003年4月30日 申請日期2000年12月19日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月28日
發(fā)明者G·阿爾諾, A·伯特斯, N·達默, E·馬蒂厄, S·萬內(nèi)斯特, J·萬瑞 申請人:拜爾作物科學公司