專利名稱：結合人酪氨酸激酶Hck的人蛋白質及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有人酪氨酸激酶Hck結合活性的新型蛋白質及編碼該蛋白質的核酸。
背景技術：
細胞外各種信號通過細胞表面受體的介導傳送到細胞內。這些信息通過由種種信號傳遞分子構成的信息傳遞系統傳遞到核內，并激活轉錄因子，結果導致一組基因的表達被誘導或抑制。迄今為止，已發(fā)現細胞內存在多個酪氨酸激酶，并已明確其中的大部分作為信號傳遞分子發(fā)揮作用。酪氨酸激酶分為受體型和非受體型兩種類型的酪氨酸激酶。其中，非受體型酪氨酸激酶又進一步分為膜結合型和細胞質型。Src家族的酪氨酸激酶已知共有Src、Yes、Yrk、Fgr、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck 9個成員。它們是由約500個氨基酸組成的分子量約6萬的酪氨酸激酶，并且是不跨膜、結合在細胞內膜的膜結合型酪氨酸激酶。這些Src家族的基本結構類似，均具有SH(Src同系Src homology)2功能域、SH3功能域以及蛋白激酶功能域。SH2功能域和SH3功能域參與蛋白質相互之間的結合，SH2功能域識別含有磷酸化酪氨酸殘基的序列，并與之特異性結合。另一方面，SH3功能域特異性結合富含脯氨酸的序列，并認為通過蛋白激酶功能域將靶蛋白磷酸化。目前，認為該SH2功能域和SH3功能域在多種信號傳遞途徑中作為蛋白質-蛋白質相互作用的中介發(fā)揮重要的作用。
Hck是Src家族的一種酪氨酸激酶，并推測是承擔信號傳遞功能的分子(ZIEGLER，S.F.et al.，Molecular and Cellular Biology，72276～2285(1987))，已有報道稱Hck與存在于胎兒干細胞的LIF(白血病抑制因子leukaemia inhibitory factor)/IL-6(白介素6)受體的亞基(gp130)結合，并參與它的信號傳遞過程(Emist M.，ra，et al.，The EMBOJournal，131574～1584(1994))；以及Hck與單核細胞THP-1的FcγRII結合，并參與它的信號傳遞過程(Ghazizadeh.S.et al.，Journal ofBiological Chemistry，2698878～8884(1994))。但是，包括它們在內，對Hck的信號傳遞的詳細機制并不是很明確。最近，由于發(fā)現艾滋病病毒(HIV)的nef蛋白結合人SH3功能域的能力比結合其它Src型酪氨酸激酶的SH3功能域的能力高10倍(Lee C-H，et al.，EMBO Journal，145006-5015(1995))，所以Hck在HIV感染中的作用已受到關注。另外，已知存在于嗜中性粒細胞分泌顆粒中的Hck可能參與粒細胞吞噬感染菌(phagocytosis)后的信號傳遞(Welch，H.，and Maridonneau-Parini，I.，Journal of Biological Chcmistry，272102-109(1997))。
如上所述，可以認為具有人細胞內酪氨酸磷酸化酶Hck結合活性的蛋白質及編碼該蛋白質的基因，在上述Hck參與的信號傳遞的研究中以及在闡明HIV的nef蛋白功能的研究等中有用。
發(fā)明的公開本發(fā)明的目的在于，提供具有細胞內酪氨酸磷酸化酶Hck結合活性的蛋白質和編碼該蛋白質的核酸。
為了解決上述課題，本發(fā)明者們進行了悉心研究，結果成功分離出編碼具有細胞內酪氨酸磷酸化酶Hck結合活性的蛋白質的DNA，從而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供以下(a)或(b)的蛋白質。
(a)具有序列號1所示氨基酸序列的蛋白質。
(b)具有序列號1所示氨基酸序列中1個或數個氨基酸發(fā)生缺失、置換、插入或附加的氨基酸序列，且具有人酪氨酸激酶Hck結合活性的蛋白質。
另外，本發(fā)明提供與序列號1所示氨基酸序列或其一區(qū)域有80％以上同源性，且具有人酪氨酸激酶Hck結合活性的蛋白質。本發(fā)明還提供編碼上述本發(fā)明蛋白質的核酸。再者，本發(fā)明還提供含有上述本發(fā)明的核酸，并能在宿主細胞中表達上述本發(fā)明的蛋白質的重組載體。本發(fā)明還提供用上述本發(fā)明的重組載體轉化，并產生上述本發(fā)明的蛋白質的轉化體。
因為本發(fā)明的蛋白質具有結合人酪氨酸激酶Hck的功能，所以對于闡明人Hck的信號傳遞機制及闡明人Hck在HIV感染中的作用極為有用。并且，將有助于開發(fā)人Hck參與的疾病或感染癥的治療藥。再者，本發(fā)明的蛋白質由于具有促進腫瘤壞死因子(TNF-α)刺激產生的細胞凋亡的作用，所以通過與腫瘤壞死因子的并用，可用作腫瘤壞死因子的抗腫瘤活性促進劑。
附圖的簡單說明


圖1是在大腸桿菌中表達本發(fā)明蛋白質的一個例子HSB-1的結果的電泳模式圖。
泳道1分子量標準泳道2添加IPTG前的菌體抽提液泳道3添加IPTG 4小時后的菌體抽提液泳道4純化的HSB-1圖2表示在細胞中共表達人Hck和HSB-1后，結合了人Hck的HSB-1與人Hck免疫共沉淀的電泳模式圖。
泳道1分子量標準泳道2免疫沉淀人Hck并檢測HSB-1泳道3對照圖3表示將人Hck分別與HSB-1及其部分序列HSB-1(1-131)、HSB-1(70-404)在細胞中共表達，結合人Hck的HSB-1和HSB-1(70-404)與人Hck免疫共沉淀，HSB-1(1-131)與人Hck不產生免疫共沉淀的電泳模式圖。上部表示用抗Xpress抗體檢測，下部表示用抗FLAG抗體檢測。
泳道1用對照載體pcDNA4/HisMaxC和Hck/pFLAG-CMV2轉化的細胞抽提液與抗人Hck抗體進行免疫沉淀的沉淀物泳道2HSB-1與人Hck共表達的細胞抽提液與抗人Hck抗體進行免疫沉淀的沉淀物泳道3HSB-1(1-131)與人Hck共表達的細胞抽提液與抗人Hck抗體進行免疫沉淀的沉淀物泳道4HSB-1(70-404)與人Hck共表達的細胞抽提液與抗人Hck抗體進行免疫沉淀的沉淀物泳道5用對照載體pcDNA 4/HisMaxC和Hck/pFLAG-CMV 2轉化的細胞抽提液泳道6共表達HSB-1和人Hck的細胞抽提液泳道7共表達HSB-1(1-131)和人Hck的細胞抽提液泳道8共表達HSB-1(70-404)和人Hck的細胞抽提液圖4表示對表達了HSB-1的CEM細胞的TNF-α的細胞凋亡誘導效果。
實施發(fā)明的最佳方案本發(fā)明的蛋白質是與人Src型酪氨酸激酶中稱為人酪氨酸激酶Hck的蛋白(以下，略作“人Hck”)結合的蛋白質，其代表例是在下述實施例中得到的HSB-1。另一方面，本發(fā)明的核酸是編碼上述本發(fā)明的蛋白質的核酸，它是從用人胎盤等組織制備的cDNA文庫中，通過應用所謂的酵母雙雜交系統(Yeast two-hybrid system)進行篩選等而制備出來的，其代表例是在后面的實施例中得到的編碼HSB-1的核酸(以下叫做“HSB-1 DNA”)。本發(fā)明的核酸是如下克隆出的。
雖然本發(fā)明的核酸是按以下的方法制備的，但由于其堿基序列由本發(fā)明所確定，所以可以以本發(fā)明的發(fā)現為基礎，以人胎盤cDNA文庫為模型，通過RT-PCR等很容易地制備。1.HSB-1 DNA的克隆(1)cDNA文庫的獲得作為mRNA的供給源，例如人胎盤等組織。另外，來源于這些組織的已建立的細胞株也可作為供給源。可用通常應用的方法來進行mRNA的制備。例如，通過用胍試劑處理上述細胞或組織而得到總RNA，然后通過應用oligodT-纖維素或polyU-纖維素的親和柱法或者批處理法獲得poly(A+)RNA(mRNA)。再通過蔗糖密度梯度離心法等再對poly(A+)RNA進行分級。
以所得mRNA為模板合成單鏈cDNA后，再由該單鏈cDNA合成雙鏈cDNA，制備成與適當載體DNA的重組質粒。用該質粒轉化大腸桿菌等，獲得cDNA文庫?；蛘邞檬惺鄣?CLONTECH公司等)作為cDNA文庫。(2)餌質粒pAS2-1的構建從上述1所得的cDNA文庫中，如下制備能篩選出目的克隆的質粒。
質粒例如通過將人Hck全長編碼DNA與編碼GAL4的DNA結合功能域的DNA進行連接，制備嵌合DNA，將該嵌合DNA與餌質粒(baitplasmid)pAS2-1連接整合進行構建；或者將在信號傳遞途徑中的蛋白質-蛋白質相互作用中發(fā)揮重要作用的、SH2功能域和SH3功能域的編碼DNA一起或分別與編碼GAL4 DNA結合功能域的DNA進行連接，制備嵌合DNA，將該嵌合DNA與餌質粒pAS2-1連接而進行構建。(3)篩選然后用上述質粒篩選cDNA文庫?？蓱媒湍鸽p雜交系統(yewsttwo-hybrid system)進行篩選。酵母雙雜交系統是能檢測酵母體內蛋白質間相互作用的實驗體系，可從文庫中篩選出與目的蛋白(誘餌)相互作用的蛋白質的cDNA?？捎靡鹊鞍酌?-)的培養(yǎng)基篩選出用餌質粒轉化的轉化體。再用能表達GAL4轉錄活化功能域融合蛋白的cDNA文庫進行轉化，所得轉化體可在色氨酸(-)、亮氨酸(-)的培養(yǎng)基中生長。若餌質粒來源的融合蛋白能與文庫來源的融合蛋白結合，由于報告基因HIS3基因和LacZ基因轉錄，陽性克隆可在色氨酸(-)、亮氨酸(-)、組氨酸(-)的培養(yǎng)基中生長，還具有β-半乳糖苷酶活性。因此，可以將在不含組氨酸、色氨酸和亮氨酸的選擇培養(yǎng)基中的增殖及β-半乳糖苷酶活性作為指標來篩選陽性克隆。(4)堿基序列的確定對所得克隆進行堿基序列的測定。可用Maxam-Gilbert法、雙脫氧法等公知的方法進行堿基序列的測定，但通常應用堿基序列自動測序儀進行序列測定。再通過5′-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法、3′-RACE法、寡核苷酸帽(oligocap)等公知的方法，由前面所得堿基序列得到全長cDNA堿基序列。如此確定的本發(fā)明HSB-1 DNA的堿基序列為序列號2中所示的序列，序列號1中給出了本發(fā)明HSB-1的氨基酸序列。只要具有該氨基酸序列的蛋白質具有人Hck結合活性，該氨基酸序列中1個或多個氨基酸可產生缺失、置換、附加等變異。例如序列號12的氨基酸序列中1個(第121位的脯氨酸置換為亮氨酸)發(fā)生了置換的變異體。2.重組載體及轉化體的制備(1)重組載體的構建可通過將本發(fā)明的HSB-1 DNA連接插入到適當的載體中而得到本發(fā)明的重組載體。用于連接插入本發(fā)明的HSB-1 DNA的載體沒有特殊限制，只要該DNA能在宿主中進行復制即可，例如可應用質粒DNA、噬菌體DNA等?？捎脡A提取法從大腸桿菌和土壤桿菌中制備質粒DNA。另外，也可應用市售的質粒，例如應用Clontech公司、寶灑造公司、Amersham-Pharmacia Biotech等公司提供的產品。
作為噬菌體DNA，例如可應用M13mp18、λgt11等。將本發(fā)明的DNA插入到載體時，采用首先將純化的DNA插入到適當載體DNA的限制性酶位點或多克隆位點，然后將之連接到載體的方法等。
為了發(fā)揮DNA的功能，有必要將本發(fā)明的DNA整合到載體中。因此，本發(fā)明的載體中除有啟動子和本發(fā)明的DNA之外，還可整合終止子，核糖體結合序列等。因為具備這些條件的表達載體大多有商品化的產品，所以可通過將本發(fā)明的DNA片段插入到這些表達載體的多克隆位點，輕松地制備表達本發(fā)明的蛋白質的重組載體。(2)轉化體(或轉化細胞)的制備可通過將用于表達本發(fā)明基因的重組載體導入到能表達目的基因的宿主中而得到本發(fā)明的轉化體。其中，作為宿主沒有特殊限定，只要能表達本發(fā)明的DNA即可。例如可應用大腸桿菌(Escherichia Coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等細菌，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等酵母，COS細胞、CHO細胞等動物細胞或昆蟲細胞(Sf9)等。
作為將重組載體導入細菌的方法沒有特殊限制，只要是將DNA導入細菌的方法即可。例如應用鈣離子的方法、電穿孔法等。將重組載體導入酵母的方法，如電穿孔法、醋酸鋰法等。將重組載體導入動物細胞的方法，如電穿孔法、磷酸鈣法等。3.HSB-1的生產在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述轉化體，從培養(yǎng)物中可采集到本發(fā)明的重組蛋白HSB-1。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明轉化體的方法，可按照培養(yǎng)各宿主時所應用的常規(guī)方法進行。培養(yǎng)以大腸桿菌和酵母等微生物為宿主而得到的轉化體時的培養(yǎng)基，可以用天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基，只要它含有微生物可利用的碳源、氮源、無機鹽類等并可有效地進行轉化體的培養(yǎng)即可。通常在振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等需氧條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)用以誘導性啟動子作啟動子的表達載體轉化的微生物時，必要時可向培養(yǎng)基中添加誘導劑。例如培養(yǎng)用應用Lac啟動子的表達載體轉化的微生物時，可向培養(yǎng)基中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等。
一般應用RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基作為培養(yǎng)以動物細胞作宿主而得到的轉化體的培養(yǎng)基，或者可應用向這些培養(yǎng)基中添加了胎牛血清的培養(yǎng)基。通常在存在5％CO2的條件下進行培養(yǎng)。
培養(yǎng)后，當本發(fā)明的HSB-1產生在菌體內或細胞內時，可通過打碎菌體或細胞等提取HSB-1。另外，當本發(fā)明的HSB-1生產到菌體外或細胞外時，可從培養(yǎng)液中除去菌體或細胞后，通過單獨或適當組合應用在蛋白質分離純化中應用的常規(guī)方法從培養(yǎng)物中分離、純化本發(fā)明的HSB-1。
通過上面概述的方法或者下面的實施例中具體記載的方法，分離出具有序列號1所示氨基酸序列的蛋白質。一般情況下，具有某種生理活性的蛋白質的氨基酸序列中即便有少數氨基酸發(fā)生缺失、置換、插入或附加時，該蛋白質有時仍維持其生理活性，對于這一點業(yè)內人士已達成廣泛共識。因此，具有序列號1所示氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、置換、插入或附加的氨基酸序列且具有人酪氨酸激酶Hck結合活性、氨基酸序列的同源性在80％以上(以下，方便起見有時也叫做“修飾蛋白質”)的蛋白質及編碼該修飾蛋白質的核酸(以下，方便起見有時也叫做“修飾核酸”)也包含在本發(fā)明的范圍內。另外，如在下面實施例中證明的那樣，與人酪氨酸激酶Hck結合的HSB-1的區(qū)域為N末端起第130～404位氨基酸構成的區(qū)域。因此，在序列號1所示氨基酸序列中與Hck結合所必要的一部分區(qū)域所構成的蛋白質，以及該一區(qū)域的氨基酸序列中1個或數個氨基酸發(fā)生缺失、置換、插入或附加的氨基酸序列所構成的具有人酪氨酸激酶Hck結合活性，且與上述一區(qū)域的氨基酸序列的同源性達80％以上的蛋白質也包含在上述修飾蛋白質內，屬于本發(fā)明的范圍。這種修飾蛋白質的氨基酸序列與序列號1所示的氨基酸序列或其一部分區(qū)域有80％以上的同源性，優(yōu)選有90％以上的同源性，更優(yōu)選95％以上，進而優(yōu)選有98％以上的同源性。再者，編碼上述本發(fā)明蛋白質(包含上述修飾蛋白質)的任一種核酸均屬于本發(fā)明的范圍。上述修飾核酸與序列號2所示堿基序列或其一部分區(qū)域優(yōu)選有70％以上的同源性，更優(yōu)選85％以上，進而優(yōu)選90％以上，特別優(yōu)選有95％以上的同源性。另外，優(yōu)選修飾核酸能與具有序列號2所示堿基序列的核酸在嚴緊條件下(即，應用5×Denhardt′s試劑，6×SSC，0.5％SDS等常規(guī)雜交液，在60～65℃進行反應)雜交?？蓱肍ASTA等周知的計算機軟件容易地計算氨基酸序列及堿基序列的同源性。4.HSB-1的功能(1)HSB-1的結構和與Hck的結合HSB-1具有與人酪氨酸激酶Hck結合的功能，人們認為它起著將信號從Hck傳遞到下一個蛋白質的作用。從氨基酸序列結構分析的結果看出其氨基末端具有SH3功能域。另外，如下述實施例所述，認為HSB-1在序列號12所示氨基酸序列的第130-404位范圍內與Hck的SH3功能域結合。(2)促進腫瘤壞死因子(TNF-α)刺激產生的細胞凋亡的功能如下面實施例中的具體描述，用HSB-1/pEF/V5-HisC轉化的CEM A301細胞(以下，略作CEM細胞)能恒定地過剩生產HSB-1。另一方面，已知通過腫瘤壞死因子(TNF-α)的刺激可誘導細胞的程序性凋亡。過剩生產HSB-1的轉化CEM細胞與野生型CEM細胞和用pEF/V5-HisC轉化的CEM細胞相比，在1/5～1/10低濃度TNF刺激下即可誘導細胞凋亡。也就是說，HSB-1參與并促進由TNF-α誘導至細胞凋亡的過程的信號傳遞。
實施例以下，結合實施例對本發(fā)明進行具體說明。但本發(fā)明并不限于以下然后用TA Cloning kits(Invitrogen公司)將PCR產物克隆到質粒pCR 2.1中，用EcoRI/SalI酶切，得到包含人Hck SH2功能域和SH3功能域的約500bp的片段。將該片段連接到用EcoRI/SalI酶切的pAS-2載體中(將該載體叫做“Hck(SH2+SH3)/pAS-2”)。按常規(guī)方法用Hck(SH2+SH3)/pAS-2轉化大腸桿菌MC1061rec-，用堿法，然后用氯化銫/溴化乙錠密度平衡離心法從中純化質粒。(3)篩選用醋酸鋰法將作為誘餌的質粒Hck(SH2+SH3)/pAS-2轉化酵母Y190株。用CLONTECH公司的MATCHMAKER Two-hybrid System kit進行轉化。用胰蛋白酶(-)培養(yǎng)基篩選轉化體。再用能表達GAL4轉錄活化功能域融合蛋白的cDNA文庫(CLONTECH公司的人胎盤MATCHMAKER cDNA文庫)進行轉化。從轉化體中篩選出陽性克隆時，先篩選出在色氨酸(-)、亮氨酸(-)、組氨酸(-)及添加了3-氨基三唑(25mM)的培養(yǎng)基中增殖的克隆(150克隆)，再按β-半乳糖苷酶活性從中篩選出陽性克隆(51克隆)。用添加了環(huán)已酰亞胺(1μg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)陽性克隆，從增殖的克隆中純化質粒(用CLONTECH公司的MATCHMAKER Two-hybrid System kit進行)，然后轉化大腸桿菌，從中純化出質粒。應用Perkin-Elmer公司的DNA測序儀(373A型)，按雙脫氧終止子法測定所得質粒的cDNA文庫部分的堿基序列。應用試劑盒中附帶的引物作為堿基序列分析時用的引物。利用GENETYX的數據庫檢索所得堿基序列的同源性。結果發(fā)現含有與已報道的基因不一致的新序列的克隆(Hck-c-58/pACT2)。
由于Hck-c-58/pACT2中所含的新序列缺少HSB-1的N末端一部分序列，所以如下從人胎盤cDNA λgt11文庫(CLONTECH公司制)中獲得包含全部堿基序列的HSB-1基因。用EcoRI/XhoI酶切出Hck-c-58/pACT 2中所含的新序列，進行純化，以此為基礎通過隨機引物法制備32P-CTP標記的放射性標記探針。將人胎盤cDNAλgt11文庫與大腸桿菌(Y1090r-)一起接種到LB瓊脂培養(yǎng)基上，制作噬菌斑，將之印跡到硝酸纖維素膜上，UV交聯后，用上述放射性標記探針進行放射自顯影。然后刮下陽性菌斑，稀釋后重復進行同樣的篩選，得到多個陽性克隆。通過PCR(正向引物序列號5，反向引物序列號6；反應條件為94℃1分鐘，然后以94℃30秒、68℃4分鐘的反應為1個循環(huán)，進行30個循環(huán)的反應，最后68℃反應4分鐘)從所得λgt11噬菌體中擴增出cDNA文庫插入片段，將包含HSB-1 N末端序列的PCR產物克隆到上述pCR 2.1中，用雙脫氧終止子法分析插入部分的堿基序列，結合Hck-c-58/pACT2的序列確定出HSB-1的全長堿基序列。序列號2顯示了HSB-1的堿基序列。另外，由序列號2中的堿基序列所編碼的氨基酸序列示于序列號1。
同樣應用TA Cloning kits(Invitrogen公司)將從陽性λgt11噬菌體克隆中獲得的最長的PCR產物克隆到質粒pCR2.1中，用雙脫氧終止子法分析插入部分的堿基序列后，得到與序列號2所示的HSB-1堿基序列只差別1個堿基的堿基序列(362位的胞嘧啶(C)置換成胸腺嘧啶(T))。該堿基序列示于序列號13中。另外，由序列號13中所示堿基序列所編碼的氨基酸序列示于序列號12中(121位的脯氨酸置換成亮氨酸)。實施例2重組載體的構建、轉化體的制備及HSB-1的表達用PCR方法合成編碼HSB-1的cDNA(序列號13)，用于制備HSB-1DNA的重組載體。引物應用以下的引物，PCR反應液的組成與上述相同。正向引物序列號7反向引物序列號8PCR的反應條件是94℃50秒，然后以94℃30秒、65℃30秒、72℃2分鐘的反應為1個循環(huán)，進行30個循環(huán)，最后72℃反應3分鐘。然后應用TA Cloning kits(Invitrogen公司)將PCR產物克隆到質粒pCRII中，用EcoRI/BamHI進行酶切，插入到表達載體pGEX-6P-1(AmershamPharmacia Biotech)中。再用該表達載體轉化大腸桿菌BL21-CodmPlus-R1L(Stratagcnc公司)。
在LB培養(yǎng)基(添加氨芐青霉素)中培養(yǎng)轉化的大腸桿菌，進行HSB-1的表達。將0.4ml預培養(yǎng)的培養(yǎng)液接種到10ml培養(yǎng)基中，32℃振蕩培養(yǎng)4小時。加入0.1ml 100mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，再培養(yǎng)4小時。分別從1ml添加IPTG前的培養(yǎng)液和1ml添加IPTG培養(yǎng)4小時后的培養(yǎng)液中收集菌體，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析菌體中的蛋白質。電泳后蛋白質的染色圖如
圖1所示。HSB-1和GST的融合蛋白表達在分子量7萬附近。實施例3HSB-1與人Hck的結合用以下萬法驗證HSB-1和人Hck的結合用與實施例2中表達載體的構建方法同樣的方法，將編碼HSB-1的cDNA(序列號13)插入到表達載體pEF/V5-HisC(Invitrogcn公司制)中(HSB-1/pEF/V5-HisC)。
另一方面，通過PCR方法合成編碼人Hck的cDNA。應用下面的引物作引物，PCR反應液的組成與前面相同。正向引物序列號9反向引物序列號10PCR的反應條件是94℃30秒，然后以94℃30秒、65℃30秒、72℃3分鐘的反應為1個循環(huán)進行30個循環(huán)，最后72℃反應3分鐘。然后應用TA Cloning kits(Invitrogen公司)將PCR產物克隆到質粒pCRII中，用EcoRI/XhoI進行酶切，插入到用EcoRI/SalI酶切的表達載體pFLAG-CMV2(Eastman kodak公司制)中(Hck/pFLAG-CMV2)。
然后應用磷酸鈣法(使用Prime公司制的試劑盒)將HSB-1/pEF/V5-HisC和Hck/pFLAG-CMV2這2種質粒同時轉化293T細胞。另外，同時轉化HSB-1/pEF/V5-HisC和pFLAG-CMV2作為對照。培養(yǎng)2天后收集細胞，制備細胞內溶液。將之與抗人Hck抗體進行免疫共沉淀，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離沉淀物，進行Western blot，用抗V5抗體進行檢測。檢測結果示于圖2。由于用抗V5抗體可檢測出HSB-1，所以可以確認與人Hck共表達的HSB-1(用V5標記)與人Hck結合，并與人Hck一起免疫共沉淀。實施例4Hck的HSB-1結合位點的推定用與實施例1(2)同樣的方法，通過PCR方法獲得編碼人Hck SH2功能域(人Hck氨基酸序列(序列號11)的第121～217位)和SH3功能域(第62～120位)的cDNA。SH2功能域正向引物序列號14反向引物序列號4SH3功能域正向引物序列號3反向引物序列號15再用同樣的方法，將該PCR產物分別與pAS-2載體連接，獲得Hck(SH2)/pAS-2和Hck(SH3)/pAS-2。
按與實施例1(3)同樣的方法，用這些質粒轉化酵母Y190珠，然后分別用Hck-c-58/pACT2或pACT2轉化。獲得在色氨酸(-)、亮氨酸(-)培養(yǎng)基中能增殖的轉化體，3種人Hck片段(SH2+SH3，SH2，SH3)與HSB-1的結合用有無β-半乳糖苷酶活性測定。結果示于表1中。用Hck-c-58/pACT2和Hck(SH2+SH3)/pAS-2轉化的酵母具有β-半乳糖苷酶活性，而用Hck-c-58/pACT2和Hck(SH2)/pAS-2轉化的酵母沒有β-半乳糖苷酶活性。用Hck(SH3)/pAS-2轉化的酵母用pACT-2轉化后具有β-半乳糖苷酶活性，而對人Hck片段與HSB-1有無結合則無法判斷。由以上結果，我們認為HSB-1不與人Hck的SH2結合，但與SH3功能域結合。
表1應用酵母雙雜交系統的β-半乳糖苷酶活性

實施例5HSB-1的人Hck結合位點的推定用與實施例2中表達載體構建方法同樣的方法，構建表達HSB-1及其部分序列(序列號12的1～131位，70～404位)的表達載體。用PCR方法分別制備編碼序列號12中1～131位和70～404位的cDNA，然后分別插入到表達載體pcDNA4/HisMaxC(Invitrogcn公司制)中(以下，分別叫做HSB-1/HisMaxC，HSB-1(1～131)/HisMaxC，HSB-1(70～404)/HisMaxC)。制備編碼HSB-1(1～131)的cDNA的PCR引物正向引物序列號7反向引物序列號16制備編碼HSB-1(70-404)的cDNA的PCR引物正向引物序列號17反向引物序列號8然后用磷酸鈣法(使用Prime公司制的試劑盒)將Hck/pFLAG-CMV2和HSB-1/HisMaxC或與HSB-1(1～131)/HisMaxC或與HSB-1(70～404)/HisMaxC兩種質粒一起轉化293T細胞。另外，同時轉化pcDNA4/HisMaxC和Hck/pFLAG-CMV2作為對照。培養(yǎng)2天后收集細胞，制備細胞胞內溶液。將之與抗人Hck抗體進行免疫共沉淀，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離沉淀物，進行Western blot，用抗Xpress抗體進行檢測。檢測結果示于圖3中。由于用抗Xpress抗體可檢測出HSB-1和HSB-1(70～404)但檢測不出HSB-1(1～131)，所以可確認與人Hck共表達的HSB-1或HSB-1(70～404)(均用Xpress標記)結合人Hck，并與人Hck免疫共沉淀，而由于HSB-1(1～131)不與人Hck結合，所以不與人Hck免疫共沉淀。實施例6表達HSB-1的CEM細胞穩(wěn)定轉化體的制備用電穿孔法將實施例3中制備的HSB-1/pEF/V5-HisC導入CEM細胞內。用添加了抗生素G418硫酸鹽(購自Lifetech Oriental)(1.2mg/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，從能生長的抗性克隆中篩選出表達HSB-1(用V5標記)的克隆(叫做CEM/HSB-1)。同樣用電穿孔法將pEF/V5-HisC導入CEM細胞內，在添加了抗生素G418硫酸鹽(1.2mg/ml)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，篩選出能夠生長的抗性克隆(叫做CEM/pEF)。實施例7TNF-α誘導細胞凋亡的測定分別將實施例6中制備的細胞接種到48孔微量板中，每孔接種5000個細胞，向孔中分別加入終濃度為0、0.3、1、3、10mg/ml的人重組TNF-α，37℃培養(yǎng)3天，計算細胞數。將未添加TNF-α組的細胞數作為100％，用相對值表示計算出的細胞數。其結果如圖4所示。與CEM細胞和CEM/pEF細胞相比，CEM/HSB-1細胞在更低濃度下就可觀察到細胞死亡，所以認為HSB-1促進TNF誘導的CEM細胞程序性凋亡。
序列表序列表<110>愛詩愛詩制藥株式會社(SSP CO.，LTD.)<120>結合人酪氨酸激酶Hck的人蛋白質HSB-1及其編碼基因<130>00PF213-PCT<150>JP11-309957<151>1999-10-29<160>17<210>1<211>404<212>PRT<213>智人(Homo Sapience)<400>1Met Asp Ser Arg Thr Lys Ser Lys Asp Tyr Cys Lys Val Ile Phe Pro1 5 10 15Tyr Glu Ala Gln Asn Asp Asp Glu Leu Thr Ile Lys Glu Gly Asp Ile20 25 30Val Thr Leu Ile Asn Lys Asp Cys Ile Asp Val Gly Trp Trp Glu Gly35 40 45Glu Leu Asn Gly Arg Arg Gly Val Phe Pro Asp Asn Phe Val Lys Leu50 55 60Leu Pro Pro Asp Phe Glu Lys Glu Gly Asn Arg Pro Lys Lys Pro Pro65 70 75 80Pro Pro Ser Ala Pro Val Ile Lys Gln Gly Ala Gly Thr Thr Glu Arg85 90 95Lys His Glu Ile Lys Lys Ile Pro Pro Glu Arg Pro Glu Met Leu Pro100 105 110Asn Arg Thr Glu Glu Lys Glu Arg Pro Glu Arg Glu Pro Lys Leu Asp115 120 125Leu Gln Lys Pro Ser Val Pro Ala Ile Pro Pro Lys Lys Pro Arg Pro130 135 140Pro Lys Thr Asn Ser Leu Ser Arg Pro Gly Ala Leu Pro Pro Arg Arg145 150 155 160Pro Glu Arg Pro Val Gly Pro Leu Thr His Thr Arg Gly Asp Ser Pro165 170 175Lys Ile Asp Leu Ala Gly Ser Ser Leu Ser Gly Ile Leu Asp Lys Asp180 185 190Leu Ser Asp Arg Ser Asn Asp Ile Asp Leu Glu Gly Phe Asp Ser Val195 200 205Val Ser Ser Thr Glu Lys Leu Ser His Pro Thr Thr Ser Arg Pro Lys210 215 220Ala Thr Gly Arg Arg Pro Pro Ser Gln Ser Leu Thr Ser Ser Ser Leu225 230 235 240Ser Ser Pro Asp Ile Phe Asp Ser Pro Ser Pro Glu Glu Asp Lys Glu245 250 255Glu His Ile Ser Leu Ala His Arg Gly Val Asp Ala Ser Lys Lys Thr260 265 270Ser Lys Thr Val Thr Ile Ser Gln Val Ser Asp Asn Lys Ala Ser Leu275 280 285Pro Pro Lys Pro Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Gly Pro Ala Pro290 295 300Leu Ser Ser Ala Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ser Ser Leu Gly Thr Ala305 310 315 320Gly His Arg Ala Asn Ser Pro Ser Leu Phe Gly Thr Glu Gly Lys Pro325 330 335Lys Met Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gln Ala Ala Val Glu Glu Leu Arg340 345 350Thr Gln Val Arg Glu Leu Arg Ser Ile Ile Glu Thr Met Lys Asp Gln355 360 365Gln Lys Arg Glu Ile Lys Gln Leu Leu Ser Glu Leu Asp Glu Glu Lys370 375 380Lys Ile Arg Leu Arg Leu Gln Met Glu Val Asn Asp Ile Lys Lys Ala385 390 395 400Leu Gln Ser Lys<210>2<211>1215<212>DNA<213>智人(Homo Sapience)<400>2atg gac agc agg aca aag agc aag gat tac tgc aaa gta ata ttt cca48Met Asp Ser Arg Thr Lys Ser Lys Asp Tyr Cys Lys Val Ile Phe Pro1 5 10 15tat gag gca cag aat gat gat gaa ttg aca atc aaa gaa gga gat ata96Tyr Glu Ala Gln Asn Asp Asp Glu Leu Thr Ile Lys Glu Gly Asp Ile20 25 30gtc act ctc atc aat aag gac tgc atc gac gta ggc tgg tgg gaa gga 144Val Thr Leu Ile Asn Lys Asp Cys Ile Asp Val Gly Trp Trp Glu Gly35 40 45gag ctg aac ggc aga cga ggc gtg ttc ccc gat aac ttc gtg aag tta 192Glu Leu Asn Gly Arg Arg Gly Val Phe Pro Asp Asn Phe Val Lys Leu50 55 60ctt cca ccg gac ttt gaa aag gaa ggg aat aga ccc aag aag cca ccg 240Leu Pro Pro Asp Phe Glu Lys Glu Gly Asn Arg Pro Lys Lys Pro Pro65 70 75 80cct cca tcc gct cct gtc atc aaa caa ggg gca ggc acc act gag aga 288Pro Pro Ser Ala Pro Val Ile Lys Gln Gly Ala Gly Thr Thr Glu Arg85 90 95aaa cat gaa att aaa aag ata cct cct gaa aga cca gaa atg ctt cca 336Lys His Glu Ile Lys Lys Ile Pro Pro Glu Arg Pro Glu Met Leu Pro100 105 110aac aga aca gaa gaa aaa gaa aga cca gag aga gag cca aaa ctg gat 384Asn Arg Thr Glu Glu Lys Glu Arg Pro Glu Arg Glu Pro Lys Leu Asp115 120 125tta cag aag ccc tcc gtt cct gcc ata ccg cca aaa aag cct cgg cca 432Leu Gln Lys Pro Ser Val Pro Ala Ile Pro Pro Lys Lys Pro Arg Pro130 135 140cct aag acc aat tct ctc agc aga cct ggc gca ctg ccc ccg aga agg 480Pro Lys Thr Asn Ser Leu Ser Arg Pro Gly Ala Leu Pro Pro Arg Arg145 150 155 160ccg gag aga ccg gtg ggt ccg ctg aca cac acc agg ggt gac agt cca 528Pro Glu Arg Pro Val Gly Pro Leu Thr His Thr Arg Gly Asp Ser Pro165 170 175aag att gac ttg gcc ggc agt tcg cta tct ggc atc ctg gac aaa gat 576Lys Ile Asp Leu Ala Gly Ser Ser Leu Ser Gly Ile Leu Asp Lys Asp180 185 190ctc tcg gac cgc agc aat gac att gac tta gaa ggt ttt gac tcc gtg 624Leu Ser Asp Arg Ser Asn Asp Ile Asp Leu Glu Gly Phe Asp Ser Val195 200 205gta tca tct act gag aaa ctc agt cat ccg acc aca agc aga cca aaa 672Val Ser Ser Thr Glu Lys Leu Ser His Pro Thr Thr Ser Arg Pro Lys210 215 220gct aca ggg agg cgg cct ccg tcc cag tcc ctc aca tct tca tcc ctt 720Ala Thr Gly Arg Arg Pro Pro Ser Gln Ser Leu Thr Ser Ser Ser Leu225 230 235 240tca agc cct gat atc ttc gac tcc cca agt ccc gaa gag gat aag gag 768Ser Ser Pro Asp Ile Phe Asp Ser Pro Ser Pro Glu Glu Asp Lys Glu245 250 255gaa cac att tca ctt gcg cac aga gga gtg gac gcg tca aag aaa act 816Glu His Ile Ser Leu Ala His Arg Gly Val Asp Ala Ser Lys Lys Thr260 265 270tcc aag act gtt acc ata tcc caa gtg tct gac aac aaa gca tcc ctg 864Ser Lys Thr Val Thr Ile Ser Gln Val Ser Asp Asn Lys Ala Ser Leu275 280 285ccg ccc aag ccg ggg acc atg gca gca ggt ggc ggt ggg cca gcc cct 912Pro Pro Lys Pro Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Gly Pro Ala Pro290 295 300ctg tcc tca gcg gcg ccc tcc ccc ctg tca tcc tct ttg gga aca gct 960Leu Ser Ser Ala Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ser Ser Leu Gly Thr Ala305 310 315 320gga cac aga gcc aac tcc ccg tct ctg ttc ggc acg gaa gga aaa cca 1008Gly His Arg Ala Asn Ser Pro Ser Leu Phe Gly Thr Glu Gly Lys Pro325 330 335aag atg gag cct gcg gcc agc agc cag gcg gcc gtg gag gag cta agg 1056Lys Met Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gln Ala Ala Val Glu Glu Leu Arg340 345 350aca cag gtc cgc gag ctg agg agc atc atc gag acc atg aag gac cag 1104Thr Gln Val Arg Glu Leu Arg Ser Ile Ile Glu Thr Met Lys Asp Gln355 360 365cag aaa cga gag att aaa cag tta ttg tct gag ttg gat gaa gag aag 1152Gln Lys Arg Glu Ile Lys Gln Leu Leu Ser Glu Leu Asp Glu Glu Lys370 375 380aaa atc cgg ctt cgg ttg cag atg gaa gtg aac gac ata aag aaa gct 1200Lys Ile Arg Leu Arg Leu Gln Met Glu Val Asn Asp Ile Lys Lys Ala385 390 395 400cta caa tca aaa tga 1215Leu Gln Ser Lys<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增人酪氨酸激酶Hck的SH2功能域和SH3功能域時作為正向引物的核酸<400>3aagaattcgt ggttgccctg tatgattacg ag32<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增人酪氨酸激酶Hck的SH2功能域和SH3功能域時作為反向引物的核酸<400>4aagtcgaccg acagtttctg gcagagcccg tc32<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增HSB-1的N末端區(qū)域時作為正向引物的核酸<400>5gacaccagac caactggtaa tggtagcgac 30<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增HSB-1的N末端區(qū)域時作為反向引物的核酸<400>6GAAGGCACAT GGCTGAATAT CGACGGTTTC 30<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增HSB-1編碼DNA時作為正向引物的核酸<400>7aaggatccac agaaatggac agcaggacaa agagc35<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增HSB-1編碼DNA時作為反向引物的核酸N<400>8aagaattcct tttgattgta gagctttctt tatgtcgtt39<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增人酪氨酸激酶Hck編碼DNA時作為正向引物的核酸<400>9gaattccatg gggtgcatga agtccaagtt cctc 34<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增人酪氨酸激酶Hck編碼DNA時作為反向引物的核酸<400>10ctcgagtggc tgctgttggt actggctctc tgt 33<210>11<211>505<212>PRT<213>智人(Homo Sapience)<400>11Met Gly Cys Met Lys Ser Lys Phe Leu Gln Val Gly Gly Asn Thr Phe1 5 10 15Ser Lys Thr Glu Thr Ser Ala Ser Pro His Cys Pro Val Tyr Val Pro20 25 30Asp Pro Thr Ser Thr Ile Lys Pro Gly Pro Asn Ser His Asn Ser Asn35 40 45Thr Pro Gly Ile Arg Glu Ala Gly Ser Glu Asp Ile Ile Val Val Ala50 55 60Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Ile His His Glu Asp Leu Ser Phe Gln Lys65 70 75 80Gly Asp Gln Met Val Val Leu Glu Glu Ser Gly Glu Trp Trp Lys Ala85 90 95Arg Ser Leu Ala Thr Arg Lys Glu Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val100 105 110Ala Arg Val Asp Ser Leu Glu Thr Glu Glu Trp Phe Phe Lys Gly Ile115 120 125Ser Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ala Pro Gly Asn Met Leu130 135 140Gly Ser Phe Met Ile Arg Asp Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ser Tyr Ser145 150 155 160Leu Ser Val Arg Asp Tyr Asp Pro Arg Gln Gly Asp Thr Val Lys His165 170 175Tyr Lys Ile Arg Thr Leu Asp Asn Gly Gly Phe Tyr Ile Ser Pro Arg180 185 190Ser Thr Phe Ser Thr Leu Gln Glu Leu Val Asp His Tyr Lys Lys Gly195 200 205Asn Asp Gly Leu Cys Gln Lys Leu Ser Val Pro Cys Met Ser Ser Lys210 215 220Pro Gln Lys Pro Trp Glu Lys Asp Ala Trp Glu Ile Pro Arg Glu Ser225 230 235 240Leu Lys Leu Glu Lys Lys Leu Gly Ala Gly Gln Phe Gly Glu Val Trp245 250 255Met Ala Thr Tyr Asn Lys His Thr Lys Val Ala Val Lys Thr Met Lys260 265 270Pro Gly Ser Met Ser Val Glu Ala Phe Leu Ala Glu Ala Asn Val Met275 280 285Lys Thr Leu Gln His Asp Lys Leu Val Lys Leu His Ala Val Val Thr290 295 300Lys Glu Pro Ile Tyr Ile Ile Thr Glu Phe Met Ala Lys Gly Ser Leu305 310 315 320Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Glu Gly Ser Lys Gln Pro Leu Pro Lys325 330 335Leu Ile Asp Phe Ser Ala Gln Ile Ala Glu Gly Met Ala Phe Ile Glu340 345 350Gln Arg Asn Tyr Ile His Arg Asp Leu Arg Ala Ala Asn Ile Leu Val355 360 365Ser Ala Ser Leu Val Cys Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val370 375 380Ile Glu Asp Asn Glu Tyr Thr Ala Arg Glu Gly Ala Lys Phe Pro Ile385 390 395 400Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Asn Phe Gly Ser Phe Thr Ile Lys405 410 415Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Met Glu Ile Val Thr Tyr420 425 430Gly Arg Ile Pro Tyr Pro Gly Met Ser Asn Pro Glu Val Ile Arg Ala435 440 445Leu Glu Arg Gly Tyr Arg Met Pro Arg Pro Glu Asn Cys Pro Glu Glu450 455 460Leu Tyr Asn Ile Met Met Arg Cys 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Ser Pro165 170 175Lys Ile Asp Leu Ala Gly Ser Ser Leu Ser Gly Ile Leu Asp Lys Asp180 185 190Leu Ser Asp Arg Ser Asn Asp Ile Asp Leu Glu Gly Phe Asp Ser Val195 200 205Val Ser Ser Thr Glu Lys Leu Ser His Pro Thr Thr Ser Arg Pro Lys210 215 220Ala Thr Gly Arg Arg Pro Pro Ser Gln Ser Leu Thr Ser Ser Ser Leu225 230 235 240Ser Ser Pro Asp Ile Phe Asp Ser Pro Ser Pro Glu Glu Asp Lys Glu245 250 255Glu His Ile Ser Leu Ala His Arg Gly Val Asp Ala Ser Lys Lys Thr260 265 270Ser Lys Thr Val Thr Ile Ser Gln Val Ser Asp Asn Lys Ala Ser Leu275 280 285Pro Pro Lys Pro Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly Gly Gly Pro Ala Pro290 295 300Leu Ser Ser Ala Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ser Ser Leu Gly Thr Ala305 310 315 320Gly His Arg Ala Asn Ser Pro Ser Leu Phe Gly Thr Glu Gly Lys Pro325 330 335Lys Met Glu Pro Ala Ala Ser Ser Gln Ala Ala Val Glu Glu Leu Arg340 345 350Thr Gln Val Arg Glu Leu Arg Ser Ile Ile Glu Thr Met Lys Asp Gln355 360 365Gln Lys Arg Glu Ile Lys Gln Leu Leu Ser Glu Leu Asp Glu Glu Lys370 375 380Lys Ile Arg Leu Arg Leu Gln Met Glu Val Asn Asp Ile Lys Lys Ala385 390 395 400Leu Gln Ser Lys<210>13<211>1215<212>DNA<213>智人(Homo Sapience)<400>13atg gac agc agg aca aag agc aag gat tac tgc aaa gta ata ttt cca48Met Asp Ser Arg Thr Lys Ser Lys Asp Tyr Cys Lys Val Ile Phe Pro1 5 10 15tat gag gca cag aat gat gat gaa ttg aca atc aaa gaa gga gat ata96Tyr Glu Ala Gln Asn Asp Asp Glu Leu Thr Ile Lys Glu Gly Asp Ile20 2530gtc act ctc atc aat aag gac tgc atc gac gta ggc tgg tgg gaa gga 144Val Thr Leu Ile Asn Lys Asp Cys Ile Asp ValGly Trp Trp Glu Gly35 4045gag ctg aac ggc aga cga ggc gtg ttc ccc gat aac ttc gtg aag tta 192Glu Leu Asn Gly Arg Arg Gly Val Phe Pro Asp Asn Phe Val Lys Leu50 55 60ctt cca ccg gac ttt gaa aag gaa ggg aat aga ccc aag aag cca ccg 240Leu Pro Pro Asp Phe Glu Lys Glu Gly Asn Arg Pro Lys Lys Pro Pro65 70 75 80cct cca tcc gct cct gtc atc aaa caa ggg gca ggc acc act gag aga 288Pro Pro Ser Ala Pro Val Ile Lys Gln Gly Ala Gly Thr Thr Glu Arg85 90 95aaa cat gaa att aaa aag ata cct cct gaa 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32<210>16<211>38<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增HSB1(1-131)編碼DNA時作為反向引物的核酸<400>16aagaattcct tctgtaaatc cagttttggc tctctctc 38<210>17<211>44<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>PCR擴增HSB-1(70-404)編碼DNA時作為正向引物的核酸<400>17aaggatccac catggaaaag gaagggaata gacccaagaa gcca 4權利要求
1.以下(a)或(b)的蛋白質(a)具有序列號1所示的氨基酸序列的蛋白質；(b)具有序列號1所示的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、置換、插入或附加的氨基酸序列，且具有人酪氨酸激酶Hck結合活性的蛋白質。
2.權利要求1所述的蛋白質，它具有序列號1或序列號12所示的氨基酸序列。
3.一種蛋白質，它與序列號1所示的氨基酸序列或其一部分區(qū)域有80％以上的同源性，且具有人酪氨酸激酶Hck結合活性。
4.一種核酸，它編碼權利要求1～3任一項所述的蛋白質。
5.權利要求4所述的核酸，它具有序列號2或13所示的堿基序列，或具有這些堿基序列中1個或多個核苷酸發(fā)生缺失、置換、插入或附加的堿基序列。
6.權利要求5所述的核酸，它具有序列號2或13所示的堿基序列。
7.權利要求4所述的核酸，它與序列號2或13所示的堿基序列有70％以上的同源性。
8.權利要求4所述的核酸，在嚴緊條件下它能與具有序列號2或13所示的堿基序列的核酸雜交。
9.一種重組載體，它含有權利要求4～8任一項所述的核酸，并能在宿主細胞中表達權利要求1～3任一項所述的蛋白質。
10.一種轉化體，它是用權利要求9所述的重組載體轉化，并產生權利要求1～3任一項所述的蛋白質。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有人酪氨酸激酶Hck結合活性的新型蛋白質。本發(fā)明蛋白質的代表例具有序列號1或12所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了編碼這些蛋白質的核酸。本發(fā)明的蛋白質具有結合人酪氨酸激酶Hck的性質，并具有促進腫瘤壞死因子刺激產生的細胞凋亡的功能。
文檔編號C12N15/54GK1415012SQ00818099
公開日2003年4月30日 申請日期2000年10月26日 優(yōu)先權日1999年10月29日
發(fā)明者谷山忠義, 成田雅 申請人:愛詩愛詩制藥株式會社