專利名稱：用家蠶培育生產(chǎn)冬蟲夏草的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用家蠶培育生產(chǎn)冬蟲夏草的方法。
冬蟲夏草是冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis)寄生于蟲草蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)等昆蟲體上后所形成的菌蟲復(fù)合物，主產(chǎn)于我國的四川、青海、西藏、云南、甘肅等海拔3500～5000米的高山灌叢和高山草甸中，與人參、鹿茸齊名為我國的三大名貴滋補(bǔ)防病中藥材。但是，由于冬蟲夏草菌的天然寄主昆蟲的蟲草蝙蝠蛾生活周期長，并且多病害多天敵，即自然繁殖的蟲源不足。再之，近幾年來環(huán)境污染，草甸沙化，人為過早過量地濫采濫挖而使未成熟的蟲草減少了感染寄主的機(jī)會等，使冬蟲夏草數(shù)量和質(zhì)量急劇下降，其自然資源逐趨枯竭，有的產(chǎn)區(qū)已挖不到冬蟲夏草，瀕臨滅絕狀態(tài)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)外市場日益增長的需求。
為了彌補(bǔ)冬蟲夏草供需之間的巨大缺口，目前采取人工培育的方法來生產(chǎn)冬蟲夏草的代用品。其人工培育的方法主要有二類1)采用人工液體培養(yǎng)方法，獲得冬蟲夏草菌的菌絲和發(fā)酵產(chǎn)物，制成“至靈膠囊”等產(chǎn)品供應(yīng)市場。但此類方法存在易雜菌混雜、有效成分易分解破壞、菌絲與發(fā)酵產(chǎn)物的藥理藥化不穩(wěn)定等問題，并且該產(chǎn)物既沒有“草”也沒有“蟲”，從本質(zhì)上講并不是冬蟲夏草，與天然的冬蟲夏草相距甚遠(yuǎn)。2)人工飼養(yǎng)蟲草蝙蝠蛾幼蟲，再人工接種冬蟲夏草菌以培育冬蟲夏草。但此類方法存在蟲草蝙蝠蛾生活世代周期長、生活制約因素多、飼養(yǎng)大多依賴于自然條件、在室內(nèi)難以很好地完成世代交替、費(fèi)用成本高、效益差等問題，至今未見有推廣應(yīng)用于生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是用家蠶(Bombyx mori L.)替代蟲草蝙蝠蛾幼蟲，對冬蟲夏草菌作理化生物學(xué)處理后，接種于家蠶體，再模擬天然環(huán)境，使冬蟲夏草菌侵染寄生家蠶體并長出子座的用家蠶培育生產(chǎn)冬蟲夏草的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方法如下一種是采集特級冬蟲夏草，用0.1～0.2％升汞液表面消毒后，切取組織塊置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離出冬蟲夏草菌；用4～8mg/mL Driselase酶液振蕩處理處于對數(shù)生長期的冬蟲夏草菌幼嫩菌絲，分離出原生質(zhì)體；將原生質(zhì)體置于相距10～30cm的15W紫外燈下照射20～60sec，獲得對家蠶具有感染寄生性的突變體；以30～40％PEG-Ca++為融合誘導(dǎo)劑，將對家蠶具有感染寄生性的冬蟲夏草菌突變體的原生質(zhì)體與原冬蟲夏草菌的原生質(zhì)體融合，以菌絲的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖含量和對家蠶的感染寄生性為指示性狀，從中培育篩選出既保持了冬蟲夏草菌原有性狀又能感染寄生家蠶體并很好地生長的冬蟲夏草菌菌株；將冬蟲夏草菌菌株在1000mL蒸餾水中含100～150g馬鈴薯、30～40g蛋白胨、30～40g葡萄糖、1g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂、10～15g牛肉膏、20～30g新鮮蠶蛹粉、17～20g瓊脂、pH5.0的培養(yǎng)基上培養(yǎng)繁殖后接種于家蠶體；在溫度10～30℃、濕度70～100％、光照6～24h/日的潔凈環(huán)境下保護(hù)，使冬蟲夏草菌菌株在蠶幼蟲體內(nèi)或蠶蛹體內(nèi)充分生長并最后長出子座。待子座長至5～7cm時收獲，在50～60℃下干燥，用于制成中成新藥。
另一種是采集特級冬蟲夏草，用0.1～0.2％升汞液表面消毒后，切取組織塊置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離出冬蟲夏草菌；用4～8mg/mL Driselase酶液振蕩處理處于對數(shù)生長期的冬蟲夏草菌幼嫩菌絲，分離出原生質(zhì)體；從白僵蠶體中分離出家蠶病原白僵菌，用4～8mg/ml Driselase酶液振蕩處理處于對數(shù)生長期的家蠶病原白僵菌幼嫩菌絲，分離出原生質(zhì)體；以30～40％PEG-Ca++為融合誘導(dǎo)劑，將家蠶病原白僵菌的原生質(zhì)體與冬蟲夏草菌的原生質(zhì)體融合，以菌絲的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖含量和對家蠶的感染寄生性為指示性狀，從中培育篩選出既保持了冬蟲夏草菌原有性狀又能感染寄生家蠶體并很好地生長的冬蟲夏草菌菌株；將冬蟲夏草菌菌株在1000mL蒸餾水中含100～150g馬鈴薯、30～40g蛋白胨、30～40g葡萄糖、1g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂、10～15g牛肉膏、20～30g新鮮蠶蛹粉、17～20g瓊脂、pH5.0的培養(yǎng)基上培養(yǎng)繁殖后接種于家蠶體；在溫度10～30℃、濕度70～100％、光照6～24h/日的潔凈環(huán)境下保護(hù)，使冬蟲夏草菌菌株在蠶幼蟲體內(nèi)或蠶蛹體內(nèi)充分生長并最后長出子座；待子座長至5～7cm時收獲，在50～60℃下干燥，用于制成中成新藥。
以上兩種方法的接種方法為取菌絲和分生孢子入滅菌水中，制成濃度為106～108/mL的菌液，噴灑于2～5齡剛蛻皮的潔凈蠶幼蟲體表面或化蛹第1～2天的潔凈蠶蛹體表面；或用接種針蘸取菌絲和分生孢子，穿破體皮直接接種于2～5齡的潔凈蠶幼蟲體內(nèi)或化蛹第1～12天的潔凈蠶蛹體內(nèi)。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)是它能充分利用我國豐富的家蠶資源，培育出既有“蟲”又有“草”并相似于天然的冬蟲夏草，來合理保護(hù)和利用冬蟲夏草這一我國稀有珍貴中藥材，滿足國內(nèi)外市場的需求，并用高附加值的冬蟲夏草來發(fā)展振興我國傳統(tǒng)的養(yǎng)蠶業(yè)；用本發(fā)明培育生產(chǎn)冬蟲夏草容易，成本低，能創(chuàng)造出巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
下面是本發(fā)明的實(shí)施例。實(shí)施例1．用6mg/mL Driselase酶液處理冬蟲夏草菌的菌絲，分離出原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體置于相距20cm的15W紫外燈下照射45sec，獲得對家蠶具有感染寄生性的突變體，以35％PEG-Ca++為融合誘導(dǎo)劑，將對家蠶具有感染寄生性的冬蟲夏草菌突變體的原生質(zhì)體與原冬蟲夏草菌的原生質(zhì)體融合，以菌絲的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖含量和對家蠶的感染寄生性為指示性狀，從中培育篩選出既保持了冬蟲夏草菌原有性狀又能感染寄生家蠶體并很好地生長的冬蟲夏草菌菌株，經(jīng)培養(yǎng)繁殖后，制成濃度為107/mL的分生孢子液，噴灑于化蛹第1天的生產(chǎn)用品種菁松的潔凈蠶蛹體表面，略干后置溫度25℃濕度100％的潔凈自然光照環(huán)境下保護(hù)，待蠶蛹體僵硬后換置溫度20℃、濕度95％、60W日光燈每日照射18h的潔凈環(huán)境下保護(hù)。結(jié)果冬蟲夏草菌菌株侵染寄生蠶蛹體，在體內(nèi)充分生長后伸出體外形成子座，其子座的色澤、形態(tài)與天然冬蟲夏草相似，長出子座并能很好生長的百分率為95.8％，接種20批次都得到相同的結(jié)果。
權(quán)利要求
1．用家蠶培育生產(chǎn)冬蟲夏草的方法，其特征在于1)采集特級冬蟲夏草，用0.1～0.2％升汞液表面消毒后，切取組織塊置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離出冬蟲夏草菌；用4～8mg/mL Driselase酶液振蕩處理處于對數(shù)生長期的冬蟲夏草菌幼嫩菌絲，分離出原生質(zhì)體；將原生質(zhì)體置于相距10～30cm的15W紫外燈下照射20～60sec，獲得對家蠶具有感染寄生性的突變體；以30～40％PEG-Ca++為融合誘導(dǎo)劑，將對家蠶具有感染寄生性的冬蟲夏草菌突變體的原生質(zhì)體與原冬蟲夏草菌的原生質(zhì)體融合，以菌絲的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖含量和對家蠶的感染寄生性為指示性狀，從中培育篩選出既保持了冬蟲夏草菌原有性狀又能感染寄生家蠶體并很好地生長的冬蟲夏草菌菌株；將冬蟲夏草菌菌株在1000mL蒸餾水中含100～150g馬鈴薯、30～40g蛋白胨、30～40g葡萄糖、1g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂、10～15g牛肉膏、20～30g新鮮蠶蛹粉、17～20g瓊脂、pH5.0的培養(yǎng)基上培養(yǎng)繁殖后接種于家蠶體2)在溫度10～30℃、濕度70～100％、光照6～24 h/日的潔凈環(huán)境下保護(hù)，使冬蟲夏草菌菌株在蠶幼蟲體內(nèi)或蠶蛹體內(nèi)充分生長并最后長出子座；3)待子座長至5～7cm時收獲，在50～60℃下干燥，用于制成中成新藥。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的用家蠶培育生產(chǎn)冬蟲夏草的方法，其特征在于接種方法為取菌絲和分生孢子入滅菌水中，制成濃度為106～108/mL的菌液，噴灑于2～5齡剛蛻皮的潔凈蠶幼蟲體表面或化蛹第1～2天的潔凈蠶蛹體表面；或用接種針蘸取菌絲和分生孢子，穿破體皮直接接種于2～5齡的潔凈蠶幼蟲體內(nèi)或化蛹第1～12天的潔凈蠶蛹體內(nèi)。
3．用家蠶培育生產(chǎn)冬蟲夏草的方法，其特征在于1)采集特級冬蟲夏草，用0.1～0.2％升汞液表面消毒后，切取組織塊置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離出冬蟲夏草菌；用4～8mg/mL Driselase酶液振蕩處理處于對數(shù)生長期的冬蟲夏草菌幼嫩菌絲，分離出原生質(zhì)體；從白僵蠶體中分離出家蠶病原白僵菌，用4～8mg/mL Driselase酶液振蕩處理處于對數(shù)生長期的家蠶病原白僵菌幼嫩菌絲，分離出原生質(zhì)體；以30～40％ PEG-Ca++為融合誘導(dǎo)劑，將家蠶病原白僵菌的原生質(zhì)體與冬蟲夏草菌的原生質(zhì)體融合，以菌絲的蟲草素、蟲草酸、蟲草多糖含量和對家蠶的感染寄生性為指示性狀，從中培育篩選出既保持了冬蟲夏草菌原有性狀又能感染寄生家蠶體并很好地生長的冬蟲夏草菌菌株；將冬蟲夏草菌菌株在1000mL蒸餾水中含100～150g馬鈴薯、30～40g蛋白胨、30～40g葡萄糖、1g磷酸氫二鉀、0.5g硫酸鎂、10～15g牛肉膏、20～30g新鮮蠶蛹粉、17～20g瓊脂、pH5.0的培養(yǎng)基上培養(yǎng)繁殖后接種于家蠶體；2)在溫度10～30℃、濕度70～100％、光照6～24h/日的潔凈環(huán)境下保護(hù)，使冬蟲夏草菌菌株在蠶幼蟲體內(nèi)或蠶蛹體內(nèi)充分生長并最后長出子座；3)待子座長至5～7cm時收獲，在50～60℃下干燥，用于制成中成新藥。
4．根據(jù)權(quán)利要求3所述的用家蠶培育生產(chǎn)冬蟲夏草的方法，其特征在于接種方法為取菌絲和分生孢子入滅菌水中，制成濃度為106～108/mL的菌液，噴灑于2～5齡剛蛻皮的潔凈蠶幼蟲體表面或化蛹第1～2天的潔凈蠶蛹體表面；或用接種針蘸取菌絲和分生孢子，穿破體皮直接接種于2～5齡的潔凈蠶幼蟲體內(nèi)或化蛹第1～12天的潔凈蠶蛹體內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開的是用家蠶(Bombyx mori L.)培育生產(chǎn)冬蟲夏草的方法,利用我國豐富的家蠶資源,對冬蟲夏草菌作理化生物學(xué)處理后,接種于家蠶體,再模擬天然環(huán)境,使冬蟲夏草菌侵染寄生家蠶體并最后長出子座,培育出相似于天然的冬蟲夏草。本發(fā)明培育生產(chǎn)冬蟲夏草容易、成本低,不僅有利于合理保護(hù)和利用冬蟲夏草這一我國稀有珍貴資源,滿足國內(nèi)外市場需求,而且能創(chuàng)造出巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12N1/14GK1304995SQ0110327
公開日2001年7月25日 申請日期2001年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者時連根, 鐘伯雄 申請人:浙江大學(xué)