專利名稱：基因多態(tài)性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及以引物延伸反應(yīng)為基礎(chǔ)，可用于一個或多個位點(diǎn)變異的基因多態(tài)性檢測、基因順序和基因表達(dá)高低的一種分析測定方法。
基因多態(tài)性分析檢測，具有廣泛的理論和實(shí)用價值，包括發(fā)育學(xué)研究，生物進(jìn)化研究，疾病病因分析，藥物研制和新藥開發(fā)，農(nóng)業(yè)育種等等。在醫(yī)藥衛(wèi)生中意義尤為重大。有些遺傳病直接與基因多態(tài)性，基因表達(dá)高低相關(guān)，某些疾病則與基因表達(dá)和環(huán)境因素相互作用有關(guān)。理論認(rèn)為，類似的疾病可能具有類似的基因背景或類似的基因多態(tài)性。
基因多態(tài)性中，有單堿基多態(tài)性、基因插入、基因缺失或短重復(fù)序列數(shù)目的差異。以單堿基多態(tài)性最常見。生物品種數(shù)量繁多，各品種的特性由基因所決定。在化學(xué)本質(zhì)上，基因由一系列不同排列的堿基序列構(gòu)成，這些堿基為A,T或U,C,G。在同一物種的不同個體中，基因結(jié)構(gòu)平均每一千個堿基就有一個堿基可能不同。單個堿基的不同，稱單堿基多態(tài)性。其頻率在不同基因又有不同，假基因中大約為0.11％，內(nèi)含子中約為0.1％，外顯子中則低于0.1％。
通過多學(xué)科的合作，已有多種方法可分析檢測單堿基多態(tài)性。
目前分析檢測單堿基多態(tài)性的方法均遵循下述原理之一。
一是利用單個堿基的不同引起的電泳速度不同。具體方法是毛細(xì)管電泳與光譜分析相結(jié)合。較可靠，但十分費(fèi)時、昂貴，且只能一次分析一個位點(diǎn)的單堿基多態(tài)性。
二是利用單個堿基的不同引起的堿基配對互補(bǔ)性不同。有三種方法實(shí)現(xiàn)。單堿基延長反應(yīng)法，進(jìn)行兩次不同的引物延伸反應(yīng)；檢測過程在沒有放大效果的第二次引物延伸反應(yīng)中進(jìn)行，無法避免假陰性，特別是當(dāng)待測基因的堿基位點(diǎn)與引物3′末端相同時，單堿基延伸反應(yīng)可導(dǎo)致極高的假陽性，此法無實(shí)用價值。最為常見的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(引物延伸反應(yīng)的一種)加上凝膠電泳法，先設(shè)計堿基多態(tài)性位點(diǎn)的引物時，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行引物延伸；完全互補(bǔ)的引物能延伸而不互補(bǔ)的引物不能延伸，延伸的引物通過凝膠電泳辯認(rèn)；既可靠又敏感，它是基于對單個位點(diǎn)的分析、不能進(jìn)行單堿基多態(tài)性多位點(diǎn)分析。近期，一種高密度寡核苷酸生物芯片已用于單堿基多態(tài)性多位點(diǎn)分析，它先對待測樣品進(jìn)行雙向引物延伸反應(yīng)，將待測樣品放大擴(kuò)增，然后進(jìn)行延伸產(chǎn)物與生物芯片間的雜交利用完全互補(bǔ)與部分互補(bǔ)的雜交所產(chǎn)生的信號強(qiáng)度差來識別堿基的變異；此法檢測快速、可用于大規(guī)模工業(yè)化流水作業(yè)，但敏感性和可靠性差，有20％的假陽性、10％的假陰性，高誤差限制了應(yīng)用范圍。
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，而提供一種高效、敏感、可靠，且適于大規(guī)模工業(yè)流水操作的基因多態(tài)性檢測方法。
可采取以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)目的?；蚨鄳B(tài)性檢測方法，以引物延伸反應(yīng)為基礎(chǔ)；包括以下步驟a、制備待測目標(biāo)基因的堿基特異性引物集合；b、進(jìn)行引物集合的延伸反應(yīng)；c、區(qū)分大量引物延伸產(chǎn)物與其他成分，其它成分包括未延伸的引物和用于引物延伸反應(yīng)的dNTP混合物。用于基因多態(tài)性檢測的物質(zhì)包括DNA和RNA。通過酶反應(yīng)延長目的基因特異性引物，再區(qū)分引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物與其他反應(yīng)成分。
可用于一個或多個位點(diǎn)變異的基因多態(tài)性分析檢測。用基因多態(tài)性堿基位點(diǎn)的特異性引物集合進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，再利用單鏈特異性核酸酶的消化反應(yīng)或基于分子量大小的簡單機(jī)械分離對大量引物延伸產(chǎn)物進(jìn)行快速分離，因此檢測到的引物延伸產(chǎn)物可準(zhǔn)確反映基因多態(tài)性的位點(diǎn)信息。
本技術(shù)方案相對現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果一、適用范圍寬，可篩選單一標(biāo)本中一個或多個基因多態(tài)性位點(diǎn)，篩選多個樣品中一個或多個基因位點(diǎn)，以及測定基因多態(tài)性位點(diǎn)表達(dá)高低，還可通過對已知基因的順序測定來尋找新的基因多態(tài)性位點(diǎn)。
二、以高度專一的多聚酶引物延伸反應(yīng)為基本出發(fā)點(diǎn)對基因多態(tài)性測定方法改進(jìn)，包括堿基特異性引物集合的設(shè)計，引物集合的3′末端標(biāo)記，特異性引物集合與不同配對引物的聯(lián)合使用，單方向與雙方向引物延伸反應(yīng)的選定，固相引物延伸反應(yīng)和瀑布引物延伸反應(yīng)的創(chuàng)造，大量引物延伸產(chǎn)物的快速高效分離等，從而使基因多態(tài)性測定的可靠性、高效性及適于大規(guī)模流水作業(yè)諸方面，達(dá)到較好統(tǒng)一；對整個基因的單位點(diǎn)基因多態(tài)性檢測能在數(shù)小時內(nèi)完成。
結(jié)合附圖對本技術(shù)方案的內(nèi)容作進(jìn)一步詳述。


圖1是使用預(yù)先標(biāo)記引物檢測基因多態(tài)性步驟示意圖。X,Y代表互補(bǔ)的堿基(A,T或U,C,G；其互補(bǔ)關(guān)系A(chǔ)對映T或U；C對映G)，下劃線(-)代表該堿基被標(biāo)記。基因多態(tài)性的特異堿基的位點(diǎn)決定特異性引物延伸反應(yīng)是否可以進(jìn)行。模板堿基序列中，倒數(shù)第七位堿基(斜黑體)代表多態(tài)性堿基位點(diǎn)。引物1和2為檢測該多態(tài)性位點(diǎn)的引物亞集合1為互補(bǔ)引物，2為不互補(bǔ)引物。經(jīng)引物延伸反應(yīng)，引物1與模板完全互補(bǔ)得以延伸、有延伸產(chǎn)物。未延伸引物2的3′末端的標(biāo)記信號與模板不互補(bǔ)處于單鏈狀態(tài)，被3′→5′外切酶或/和單鏈特異性酶消化切除。通過機(jī)械分離，去掉未延伸小分子引物、dNTPs、保留大分子引物延伸產(chǎn)物。
圖2是使用未標(biāo)記引物檢測基因多態(tài)性步驟示意圖。斜黑體代表多態(tài)性堿基位點(diǎn)。1為互補(bǔ)引物，2為不互補(bǔ)引物。使用未標(biāo)記的引物檢測基因多態(tài)性的標(biāo)記過程在引物延伸反應(yīng)時進(jìn)行。引物延伸反應(yīng)中單堿基反應(yīng)物含有預(yù)先標(biāo)記的堿基。含標(biāo)記堿基的引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物通過凝膠電泳或嚴(yán)格條件洗滌，與單堿基底物和未延伸的引物區(qū)分開來。X代表在dNTPs中標(biāo)記的單堿基。
相關(guān)術(shù)語描述PCR指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
引物指與特異模板中一段堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸，長度一般在10～50個堿基之間。
聚合酶指具有合成核酸分子能力的酶，其反應(yīng)溫度可以是37℃，也可以高于37℃。
凝膠電泳指在電場下對生物大分子進(jìn)行分離的方法，凝膠可以是變性的也可以是非變性的。
標(biāo)記在這里指在核酸分子中摻入可測定的基團(tuán)。標(biāo)記物可以是放射性的也可以是非放射性的，比如熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記。
目標(biāo)基因指用來作為基因多態(tài)性分析的材料，可以是DNA也可以是RNA。
核酸包括脫氧核糖核酸和核糖核酸。
DNA指脫氧核糖核酸。
cDNA是信使RNA的互補(bǔ)DNA。
染色體DNA是主要的遺傳物質(zhì)。其與cDNA的主要區(qū)別在于后者僅僅含有外顯子。
RNA指核糖核酸，包括信使核糖核酸(mRNA，轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸(tRNA，核糖體核糖核酸(rRNA)。
mRNA指信使RNA。信使RNA是合成蛋白質(zhì)的模板。同時信使RNA也常用來制備cDNA。
反義鏈指與信使RNA互補(bǔ)的堿基順序。
體外轉(zhuǎn)錄指在試管中進(jìn)行的從DNA到RNA的合成過程。
3′→5′外切酶指含有對雙鏈DNA分子中3′末端具有外切活性的酶，包括DNA聚合酶Ⅰ的大分子片段，DNA外切酶Ⅲ，等。
基因多態(tài)性檢測方法的具體步驟1、引物集合的設(shè)計，即待測目標(biāo)基因的堿基特異性引物集合的制備。
堿基特異性引物集合包括不同引物的亞集合、每一亞集合中的引物都含有類似的堿基序列、至少有一個相應(yīng)的不互補(bǔ)堿基、分別是A或C或G或T。其中不互補(bǔ)堿基位于引物3′末端或靠近3′末端處。
當(dāng)一個單堿基基因多態(tài)性位點(diǎn)位于另外兩個堿基多態(tài)性位點(diǎn)之間，且這三個多態(tài)性位點(diǎn)互相間隔不超過20個堿基數(shù)目時，退步性引物亞集合是必要的。
引物長度在18～30個堿基之間。堿基特異性引物集合為未標(biāo)記的引物；或3′未端標(biāo)記的引物，或多于一個堿基標(biāo)記的引物。標(biāo)記方法可采用放射性或非放射性。
當(dāng)使用3′末端標(biāo)記的引物或多于一個堿基標(biāo)記的引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)時只使用未標(biāo)記的dNTPs；當(dāng)使用未標(biāo)記的引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)時使用未標(biāo)記的dNTPs與標(biāo)記的堿基混合物。
引物集合為配對引物集合，或未配對引物集合；配對引物集合包括堿基特異性引物集合和與其配時的引物，未配對引物集合只包含堿基特異性引物集合。用以配對的引物可以是與待測基因互補(bǔ)的的一段序列，也可以是非特異性的普遍性引物。
未配對引物集合適用于單方向引物延伸反應(yīng)，配對引物集合適用于雙方向引物延伸，具有放大效果。
雙方向引物延伸反應(yīng)的堿基設(shè)計還需要考慮隨后使用的反應(yīng)體系和相應(yīng)的檢測方法。就固相瀑布引物延伸反應(yīng)體系和多孔板液相延伸反應(yīng)與機(jī)械分離相結(jié)合的體系中，配對引物可采用非特異的普遍性引物，也可采用多頭配對的非特異性引物，即一個非特異性引物與不多于500組，最好是不多于300組堿基特異性亞集團(tuán)配對。但是當(dāng)液相引物延伸反應(yīng)與凝膠電泳相結(jié)合時，非特異性配對引物設(shè)計則需要考慮引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物的長度。原則是一、堿基特異性引物的亞集合中各引物可采用不同標(biāo)記方法，若不標(biāo)記或采用同一種標(biāo)記方法，則不同引物長度的差別應(yīng)不小于一個堿基數(shù)目，最好是大于10個堿基數(shù)目；二、同一反應(yīng)體系中各引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物的長度應(yīng)不小于5個堿基，最好是大于十個堿基。
2、引物的延伸反應(yīng)，即進(jìn)行待測目標(biāo)基因特異性引物集合延伸反應(yīng)。
引物延伸反應(yīng)的反應(yīng)物在種類上與常規(guī)引物延伸反應(yīng)相似，包括反應(yīng)模板、引物、dNTP混合物，但這些反應(yīng)物在性質(zhì)上各有不同的要求。
模板物質(zhì)可以是直接從生物體制備的DNA或RNA，也可以是通過體外轉(zhuǎn)錄的cDNA或者是體外擴(kuò)增的基因片段產(chǎn)物。當(dāng)染色體DNA直接用于引物延伸反應(yīng)時，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶如EcoRⅠ進(jìn)行不完全消化或使用超聲波降解，使DNA達(dá)到分子量在1～20kb之間，增加引物延伸反應(yīng)的效率。
引物延伸反應(yīng)，使用DNA聚合酶包括DNA依賴性DNA聚合酶和RNA依賴性DNA聚合酶；在37℃或37℃以上進(jìn)行。
單方向和雙方向引物延伸反應(yīng)均可用于基因多態(tài)性分析。單方向引物延伸反應(yīng)只需堿基特異性引物，雙方向引物延伸反應(yīng)則要求配對引物。引物延伸反應(yīng)聚合酶的選擇和反應(yīng)詳細(xì)條件的確定已公知，視反應(yīng)目的而定。雙向引物延伸反應(yīng)的主要控制條件包括模板失活，引物與模板退火反應(yīng)，引物延伸。增加反應(yīng)循環(huán)次數(shù)是提高反應(yīng)效率的常用方法。液相引物延伸反應(yīng)時，循環(huán)次數(shù)可控制在20～40次之間。固相引物延伸循環(huán)次數(shù)可控制在30～50次之間。
退火溫度在引物延伸反應(yīng)中起著十分關(guān)鍵作用。退火溫度過高反應(yīng)不能進(jìn)行，過低則引物延伸反應(yīng)的特異性和可靠性下降。退火溫度計算以熔化溫度Tm為參考Tm=4X(G+C)+2X(A+T)。例一個含有十個A,T和十個G,C的二十個堿基引物，其熔化溫度Tm=4X(10)+2X(10)=60℃。
引物延伸反應(yīng)時，先將堿基特異性引物集合固定在特定的固相上進(jìn)行固相引物延伸反應(yīng)，或?qū)A基特異性引物集合直接加入液相中進(jìn)行液相引物延伸反應(yīng)。固相引物延伸反應(yīng)以液相引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物作為引物延伸反應(yīng)模板。用于共價固定的方法包括紫外線照射，熱烘烤，和化學(xué)反應(yīng)連接。可用于固相引物延伸的堿基特異性引物包括未標(biāo)記引物或3′末端標(biāo)記引物。
上述退火溫度的計算基于液相引物延伸反應(yīng)，不適于固相引物延伸反應(yīng)。當(dāng)堿基特異性引物共價固定于固相之后，引物與固相的結(jié)合是牢固的，而堿基特異性引物與引物延伸反應(yīng)模板之間的氫鍵結(jié)合，僅僅能夠承受堿基特異性引物隨著模板在液相中以單一分子形式做隨機(jī)熱運(yùn)動。按照液相延伸反應(yīng)計算的退火溫度下的隨機(jī)熱運(yùn)動足以破壞固定的堿基特異性引物與模板之間微弱的氫鍵結(jié)合。理論上，降低退火溫度是一種解決方案，另種方案是增加堿基特異性引物的長度，但降低退火溫度和增加堿基特異性引物長度所允許的空間十分有限。為此，可采用本發(fā)明的引物延伸反應(yīng)方法-瀑布引物延伸反應(yīng)法。
瀑布引物延伸反應(yīng)的體系使用與液相雙向引物延伸反應(yīng)相同的引物對集合。因這種引物集合在固相引物延伸反應(yīng)的效率較低，使用預(yù)先共價固定于固相的堿基特異性引物外，在反應(yīng)體系中同時加入1％～1‰低濃度的堿基特異性引物，在液相反應(yīng)體系中，先進(jìn)行高效率的液相引物延伸反應(yīng)。即能使引物延伸模板大量擴(kuò)增，又縮短了模板的長度。增加引物延伸反應(yīng)的模板是增加固相引物延伸反應(yīng)效率的有效方式之一。制約固相引物延伸反應(yīng)的另一因素是退火溫度，如何在同一反應(yīng)體系中同時或前后不久進(jìn)行液相與固相兩種引物延伸反應(yīng)中找到一個合理的退火溫度。瀑布引物反應(yīng)解決了這一難題。首先、用于瀑布引物反應(yīng)的引物對，以其反應(yīng)產(chǎn)物不長于300堿基對，最好是不長于100堿基對為原則，使固定于固相的引物與短模板間形成的微弱氫鍵結(jié)合能在相應(yīng)的退火溫度下處于較穩(wěn)定的狀態(tài)。其次、瀑布引物延伸反應(yīng)簡化了反應(yīng)過程，常規(guī)測定方法中先進(jìn)行液相引物延伸反應(yīng)，再進(jìn)行第二次液相引物延伸反應(yīng)或雜交反應(yīng)；瀑布引物延伸反應(yīng)，液相引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物作為固相引物延伸反應(yīng)的模板，后者是對基因多態(tài)性分析的重要步驟。無論是液相引物延伸反應(yīng)還是固相引物延伸反應(yīng)，目前已有多種商品化的PCR儀器可利用。
3．有用信號與無用信號的分離，即區(qū)分大量引物延伸產(chǎn)物與其他成分，其它成分包括未延伸的引物和用于引物延伸反應(yīng)的dNTP混合物。
高背景噪音是現(xiàn)有生物芯片有待解決的問題。本技術(shù)去除了標(biāo)記物與固相非特異性的結(jié)合及常規(guī)分析方法中探針與目標(biāo)基因之間的非特異性結(jié)合。本技術(shù)中唯一可能存在的噪音來自于未完全洗滌干凈的標(biāo)記物，可能引起背景噪音的標(biāo)記物為單堿基分子，來源，一是直接添加于反應(yīng)體系之中含有標(biāo)記信號的dNTPs混合物，另一是整合于標(biāo)記引物上的標(biāo)記物，后者在單鏈特異性酶消化后，標(biāo)記物仍以單堿基形式存在。
采用嚴(yán)格的洗滌條件，如0.5X的SSC每次洗滌5分鐘，重復(fù)三次洗滌足以去除反應(yīng)體系殘存的單堿基標(biāo)記物。這種單堿基標(biāo)記物造成的背景信號，只對固相引物延伸反應(yīng)有影響，對液相引物延伸反應(yīng)的影響全無或甚微。
含有標(biāo)記堿基的引物延伸產(chǎn)物以單鏈特異性核酸酶，或3′→5′外切酶消化方式與未延伸引物分離。
共價結(jié)合于特定固相上的標(biāo)記引物在固相引物延伸反應(yīng)后有兩種結(jié)果。堿基特異性引物與模板完全互補(bǔ)時，部分堿基特異性引物得到延伸，延伸的長短由配對引物控制；而延伸的堿基特異性引物的比例，則取決于固相引物延伸反應(yīng)的效率。堿基特異性引物在3′末端與模板有不完全互補(bǔ)堿基存在時，引物延伸反應(yīng)不能進(jìn)行。固相引物延伸反應(yīng)完成后反應(yīng)體系逐步降溫至20℃左右，使反應(yīng)體系中互補(bǔ)的核酸分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。這一復(fù)性過程可持續(xù)20～40分鐘。完全復(fù)性后，使用50-200單位/毫升的S1酶處理反應(yīng)系統(tǒng)。S1酶消化反應(yīng)控制在30～35℃，消化時間5～25分鐘，不宜長于1小時避免雙鏈分子被消化。另一選擇是DNA外切酶Ⅲ在37度消化10分鐘。消化之后可使用0.5倍濃度的SSC洗滌三次，每次5分鐘。
含有標(biāo)記堿基的引物延伸產(chǎn)物以不同大小分子量截留的分子篩離心方式與沒有延伸的引物和dNTPs混合物分離。
對液相引物延長反應(yīng)，機(jī)械分離可十分有效的分離已延伸產(chǎn)物與單堿基標(biāo)記物或標(biāo)記引物。根據(jù)延伸產(chǎn)物分子量遠(yuǎn)大于未延伸引物和dNTP的特點(diǎn)，利用不同截留大小的分子篩，能使這一分離過程簡單、快速和高效。在機(jī)械分離之前采S1或3′→5′外切酶消化并與嚴(yán)格洗滌相結(jié)合，對增加信號/噪聲比值有所幫助。
引物延伸產(chǎn)物通過凝膠電泳與未延伸引物和dNTPs混合物分離。
當(dāng)液相引物延伸反應(yīng)的結(jié)果分析采用單純光學(xué)掃描裝置時，機(jī)械分離為主要手段，而當(dāng)液相引物延伸反應(yīng)與凝膠電泳相結(jié)合時，機(jī)械分離和嚴(yán)格條件下的洗滌，不是必須的，盡管其能在一定程度上增加信號/噪聲比值。凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物的方法已眾所周知，分離產(chǎn)物的檢測包括溴化錠顯色，熒光掃描，放射自顯影，以及其他酶化學(xué)反應(yīng)等多種顯像手段。
常規(guī)凝膠電泳技術(shù)，其分辨率無法分析含有大量基因多態(tài)性位點(diǎn)的結(jié)果，如1000個甚至10000個多態(tài)性位點(diǎn)。本發(fā)明適用不同波長熒光標(biāo)記的引物與不同長度引物延伸產(chǎn)物相結(jié)合的設(shè)計，大大增強(qiáng)凝膠電泳的分析能力。如使用十種不同波長的熒光標(biāo)記引物，每種熒光用于標(biāo)記20～50對，可得到不同長度產(chǎn)物的不同引物。這種設(shè)計與96孔板結(jié)合，一次聚丙烯凝膠電泳就能分析至少9600種單位點(diǎn)基因多態(tài)性。
考慮到熒光標(biāo)記與檢測的儀器依賴性，使用未標(biāo)記的引物，本發(fā)明仍能通過引物延伸反應(yīng)與凝膠電泳相結(jié)合，一次分析上百種或多于1000種單位點(diǎn)基因多態(tài)性。
4、顯像與檢測對熒光標(biāo)記的引物延伸反應(yīng)，不需要額外的顯象過程，直接掃描即可得到標(biāo)記信號。對放射標(biāo)記的引物延伸反應(yīng)，可通過放射自顯影，或放射活性測定儀測定；對化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，可用化學(xué)發(fā)光儀檢測?；瘜W(xué)發(fā)光法常需要先進(jìn)行相關(guān)顯像化學(xué)反應(yīng)。檢測到的信號視信息量大小決定其處理方法，小量信息可用手工處理，大量信息則需計算機(jī)輔助分析。可用客戶自編程序、商業(yè)化的相關(guān)程序或用戶專用程序。
權(quán)利要求
1.一種基因多態(tài)性檢測方法，以引物延伸反應(yīng)為基礎(chǔ)，其特征在于，包括以下步驟a、制備待測目標(biāo)基因的堿基特異性引物集合；b、進(jìn)行引物集合的延伸反應(yīng)；c、區(qū)分大量引物延伸產(chǎn)物與其他成分，其它成分包括來延伸的引物和用于引物延伸反應(yīng)的dNTP混合物。
2.如權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于堿基特異性引物集合包括不同引物的亞集合、每一亞集合中的引物都含有類似的堿基序列、至少有一個相應(yīng)的不互補(bǔ)堿基、分別是A或C或G或T。
3.如權(quán)利要求1,2所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于引物集合為配對引物集合，或未配對引物集合；配對引物集合包括堿基特異性引物集合和與其配對的引物，未配對引物集合只包含堿基特異性引物集合。
4.如權(quán)利要求3所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于堿基特異性引物集合為未標(biāo)記的引物，或3′末端標(biāo)記的引物，或多于一個堿基標(biāo)記的引物。
5.如權(quán)利要求4所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于當(dāng)使用3′未端標(biāo)記的引物或多于一個堿基標(biāo)記的引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)時只使用未標(biāo)記的dNTPs；當(dāng)使用未標(biāo)記的引物進(jìn)行引物延伸反應(yīng)時使用未標(biāo)記的dNTPs與標(biāo)記的堿基混合物。
6.如權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于引物延伸反應(yīng)時，先將堿基特異性引物集合固定在特定的固相上進(jìn)行固相引物延伸反應(yīng)，或?qū)A基特異性引物集合直接加入液相中進(jìn)行液相引物延伸反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求6所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于固相引物延伸反應(yīng)以液相引物延伸反應(yīng)的產(chǎn)物作為引物延伸反應(yīng)模板。
8.如權(quán)利要求6所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于引物延伸反應(yīng)使用DNA聚合酶包括DNA依賴性DNA聚合酶和RNA依賴性DNA聚合酶，在37℃或37℃以上進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求1,5所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于含有標(biāo)記堿基的引物延伸產(chǎn)物以單鏈特異性核酸酶，或3′→5′外切酶消化方式與未延伸引物分離。
10.如權(quán)利要求1,5所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于含有標(biāo)記堿基的引物延伸產(chǎn)物以不同大小分子量截留的分子篩離心方式與沒有延伸的引物和dNTPs混合物分離。
11.如權(quán)利要求1,5所述的基因多態(tài)性檢測方法，其特征在于引物延伸產(chǎn)物通過凝膠電泳與未延伸引物和dNTPs混合物分離。
全文摘要
本發(fā)明是涉及以引物延伸反應(yīng)為基礎(chǔ),可用于一個或多個位點(diǎn)變異的基因多態(tài)性、基因順序和基因表達(dá)高低的一種分析測定方法。以引物延伸反應(yīng)為基礎(chǔ);包括以下步驟:a、制備待測目標(biāo)基因的堿基特異性引物集合;b、進(jìn)行引物集合的延伸反應(yīng);c、區(qū)分大量引物延伸產(chǎn)物與其他成分,其它成分包括未延伸的引物和用于引物延伸反應(yīng)的dNTP混合物。使基因多態(tài)性測定的可靠性、高效性及適于大規(guī)模流水作業(yè)諸方面,達(dá)到較好統(tǒng)一。
文檔編號C12Q1/68GK1312386SQ0110415
公開日2001年9月12日 申請日期2001年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月22日
發(fā)明者張佳, 李凱 申請人:張旭