專利名稱：用基因工程方法生產增強其生物活性的紅細胞生長因子二聯體/三聯體融合蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用基因工程方法制備紅細胞生長因子，特別是涉及用基因工程方法生產增強其生物活性的紅細胞生長因子二聯體/三聯體融合蛋白。
紅細胞生長因子是紅細胞生長分化的重要刺激因子，其功能為調節(jié)和促進幼稚紅細胞的生長分化，對晚期BFU-E(Burst Forming Units-Erythrocytes)及CFU-E(Colony Forming Units-Erythrocytes)有促進分化作用，并使其合成的血紅蛋白變成成熟紅細胞。它也能促進網質紅細胞的提前釋放，并能刺激骨髓巨核細胞。
臨床已廣泛使用紅細胞生長因子治療腎臟疾病引起的貧血，腫瘤病人化療后引起的貧血，以及外傷引起的大出血，即可以刺激患者自身的造血功能，彌補各種原因造成的紅細胞減少。因紅細胞生長因子只是造血因子的一種，另有其它造血因子能刺激血細胞的生長發(fā)育(如粒細胞和淋巴細胞等)，因此，世界上已有幾種構建復合性刺激因子的例子，如IL3-EPO,EPO-IL3,IL3-GCSF(WO 92/06116，專利)。實驗證明，IL3-EPO和EPO-IL3具有刺激BFU-E和CFU-E的作用。復合因子的構建是根據其自身功能，同時又具有雙重協同作用。最新一例證明是生產紅細胞生長因子/粒細胞集落因子(EPO/GM-CSF)(Antonio Met al,US Patent5916773)。
根據紅細胞生長因子的生長和代謝過程，其二聯體及三聯體(二聯體以下簡稱EPO--EPO，三聯體以下簡稱EPO-EPO-EPO)也能夠促進其生物活性。紅細胞生長因子產生于腎臟，作用于骨髓，然而它的分子量較低，由腎臟產生進入血液循環(huán)后，可很快由腎臟經尿液排出，而且尿液排出后的紅細胞生長因子經提純仍具有生物活性。盡管利用生物工程技術生產的紅細胞生長因子已廣泛應用，但仍有同樣問題。針對其應用與不足，為提高紅細胞生長因子的半衰期，增長其在血液中的停留時間以發(fā)揮更長功效，研究人員進行了各方面的實驗，如用多聚乙二醇連接蛋白，用化學方法將蛋白連接成二聚及多聚體等，其結果均為增大分子量，增長其體內循環(huán)時間。在以前的研究中，有的獲得成功，有的沒有成功。在這里我們利用基因工程的方法制造出二/三聯體的蛋白，經過初步實驗證明，其合成藥物具有和天然單體一樣的生物功效，而且延長了蛋白的生物活性，進而減少了用藥次數。
本發(fā)明的目的在于克服已有的用化學方法將蛋白連接成二聚及多聚體，其結果均為大分子量的混合物，且活性低的缺點，為了提高紅細胞生長因子的半衰期，增長其在血液中的停留時間以發(fā)揮更長功效，而且延長了蛋白的生物活性，進而減少了用藥次數；從而提供一種用基因工程方法生產增強其生物活性的紅細胞生長因子二聯體/三聯體融合蛋白。
本發(fā)明的目的是這樣實現的本發(fā)明提供的一種用基因工程方法生產增強其生物活性的紅細胞生長因子二聯體/三聯體融合蛋白，包括在兩單體中間有一段連接片段，或在其三單體中間有兩段連接片段；所述的融合蛋白具有紅細胞生長因子的蛋白自然順序，并具有其生物活性，EPO-EPO融合蛋白的生物活性為135,000IU/mg；EPO-EPO-EPO的生物活性為150,000IU/mg；具有延長生物半衰期和高于原蛋白的生物功效，二聯體融合蛋白具有如圖5所示的序列，三聯體融合蛋白具有如圖6所示的序列。
所述的融合蛋白其結構如下包括每一紅細胞生長因子的頭與另一紅細胞生長因子的尾連接，即紅細胞生長因子的C端--紅細胞生長因子的N端連接；所述的連接片段是連接肽，其連接肽順序的一級結構(如圖5所示的一種序列)，即連接二聯體/三聯體的蛋白順序，是10-20個氨基酸連接順序，具有這些連接順序的氨基酸都可以是連接肽，圖5所示的一種序列是最佳的。
其中在兩單體中間有一段連接片段為二聯體融合蛋白其結構如下紅細胞生長因子--連接片段--紅細胞生長因子EPO--Linker--EPO其中在兩單體中間有兩段連接片段為三聯體融合蛋白其結構如下紅細胞生長因子--連接片段--紅細胞生長因子--連接片段--紅細胞生長因子EPO--Linker--EPO--Linker--EPO其中二聯體/三聯體紅細胞生長因子的質粒構建，在構建中使用合成的引物寡聚脫氧核苷酸P1,P2,P3,P4,P5,P6,它們的核苷酸序列是P1:5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P2:5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’
P3:5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P4:5’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCACCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’P5:5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGAGCCCCACCACGCCTCATC 3’P6:5’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCA6 3’本發(fā)明提供的一種用基因工程方法生產增強其生物活性的紅細胞生長因子二聯體/三聯體融合蛋白的制備方法，包括如下步驟1，獲得EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合基因質粒，首先從細胞中提取信使核糖核酸(mRNA)，利用逆轉錄酶-DNA聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法制備單鏈和雙鏈互補脫氧核糖核酸(cDNA)，經過分離純化，將EPO cDNA克隆到載體上，以此為基礎進行融合蛋白的構建(重組質粒的構建如


圖1所示的)；2，利用聚合酶鏈反應(PCR)對EPO cDNA進行了亞克隆和未端改造，然后在末端改造的兩/叁個蛋白之間增加了一/兩小段連接片段(連接肽Linker,L見圖2A,2B,2C)；3，通過限制性內切酶，構建成了能夠表達如圖3所示的EPO-EPO及如圖4所示的EPO-EPO-EPO的融合蛋白質粒，并將其質粒轉化進入細胞株如CHO或COS細胞株。轉化后的細胞能分泌EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白。以下詳細描述制備方法所使用的材料包括一．細胞株包括CHO細胞株，COS細胞株。
菌株包括菌株DH5α，菌株HB101，質粒包括TopoTA連接質粒(3.9Kb,Ampr),pBR322,pUC18。
真核細胞表達質粒包括pBS1(4.6Kb,DHFRr),pMCM(5.6Kb,Ampr)。
二．酶類DNA聚合酶(Clonetech)；限制性內切酶(Promega,Biolab)；T4 DNA連接酶(Life Technologies)；mRNA純化Kit(Invitrogen)；cDNA合成Kit(Strategen)。三．主要生化試劑和材料EPO標準品(Amgen)；dNTP(Perkin Elmer)；瓊脂糖(BRL)；氨卞青霉素(Sigma)；蛋白分子量標準(Bio-Rad)；DNA分子量標準(Life Technologies)；EPO ELISA Kit(R&D)。以上所需的材料均是市場上可以買到的。
四．質粒的制備1，質粒篩選將含有目的質粒的細菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對數晚期(OD600約0.6)，將含有相應抗生素的LB培養(yǎng)液(預溫到37℃)放入燒瓶內，加入對數晚期培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時，所得培養(yǎng)物的OD600值約0.4，于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清；將細菌沉淀重懸于用冰預冷的STE溶液中(STE溶液0.1mol/L NaCl,10mmol/L Tris·Cl,pH8.0,1mmol/L EDTA,pH8.0)，離心收集細菌細胞。將收集細菌的細胞重懸于用冰預冷的含10％蔗糖，50mmol/L Tris·Cl,pH8.0的溶液中，加溶菌酶溶液，混勻，在冰上放10分鐘，加10％十二烷基硫酸鈉(SDS)，混勻，立刻加5mol/L NaCl(終濃度為1mol/L)混勻，在冰上放1小時，離心，將上清用酚氯仿和氯仿各提一次，將水相于室溫加入2倍體積乙醇混勻，于室溫放1-2小時，離心，回收質粒。
2．DNA片段的放大用PCR方法將EPOcDNA(以及其它DNA片段)放大，放置PCR儀中進行擴增94℃,45秒，55℃,45秒，72℃,1-2分鐘，循環(huán)35次后，72℃,7-10分鐘。(詳見實施例)。
3，DNA片段的連接用相同限制性內切酶切質粒和EPOcDNA(以及其它DNA片段)，37℃,30-60分鐘，經瓊脂糖電泳純化后，用T4 DNA連接酶連接，形成重組質粒的構造。(詳見實施例)。
4限制性內切酶分析用限制性內切酶切重組質粒，經瓊脂糖電泳純化后，得到EPOcDNA(以及其它DNA片段)，由此證明連接的正確性。
5，DNA序列分析用Sanger雙脫氧鏈終止法，將dNTP,DNA模板，Klenow,等量加在4個管中，55℃,30分鐘，分別加入ddA,ddG,ddT,ddC，保存于室溫15-20分鐘，按常規(guī)方法處理，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測序。
6，SDS-PAGE電泳等常規(guī)方法均參照下述文獻(Sambrook J et al,ALaboratory Methods-Molecular Cloning,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,2nd Edition,1989；Current Protocol of Molecular Biology,John Wiley & Sons)進行電泳檢測。
五、細胞培養(yǎng)從液氮中取出冷凍細胞，置37℃水浴中迅速融化，將細胞懸液移入離心管內，加入培養(yǎng)基，離心10分鐘，用含10％小牛血清(LifeTechnologies)的α-MEM(α-Dullbecco’s Modified Eagle Medium,LifeTechnologies)培養(yǎng)基重懸細胞，然后移入培養(yǎng)瓶內，接種量為3×104cells/cm2，將細胞置于CO2培養(yǎng)箱內，37℃,5％CO2，活細胞比例＞85％(48-72小時)。
六、樣品蛋白含量測定1，染色液的配制100mg考馬斯亮蘭G-250溶于50ml 95％乙醇中，然后與100ml 85％(w/v)磷酸混合，用水稀釋至1000ml；2，測定方法若蛋白量為＞0.2mg/ml，取0.1ml樣品與5ml染色液均勻混合，靜置10-30分鐘后測定A600nm；若蛋白量為5-100μg/ml，取0.8ml樣品與0.2ml染色液均勻混合后進行測定；以BSA測得曲線為標準曲線。
本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明為一種利用基因工程技術生產紅細胞生長因子(簡稱EPO)二聯體/三聯體融合蛋白的亞克隆和末端改造及用聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法，把兩個/三個相同的能表達紅細胞生長因子的基因通過一段/兩段多肽連接起來，并接入哺乳動物細胞表達質粒，將其轉入哺乳動物細胞后得到了表達。融合蛋白不僅具有紅細胞生長因子的生理活性，而且延長了蛋白在生物體內的儲留時間，進而增強其生物功效。該方法簡單，并且得到的二聯體/三聯體融合蛋白具有天然的紅細胞生長因子的生物活性，而且，EPO-EPO具有生物活性為135,000IU/mg，三聯體EPO-EPO-EPO具有生物活性為150,000IU/mg；本發(fā)明的EPO-EPO/EPO-EPO-EPO通過增強生物效應，延長體內半衰期，減少用藥次數，極大地提高了紅細胞刺激因子的臨床實用價值。
下面結合附圖和實施例詳細說明本發(fā)明
圖1是EPO cDNA的合成及重組質粒的構建圖2A,2B,2C是中間連接片段的設計，構造以及通過PCR方法修飾和構建的EPO質粒。cDNA序列的兩端都得到了修飾，即末端改造。
圖3是構建pTrm-EPO-Linker-EPO質粒的流程4是pMNAD EPO-Linker-EPO-Linker-EPO質粒的構建流程5是Linkers氨基酸序列圖例圖6A是二聯體融合蛋白的序列，和圖6B是三聯體融合蛋白的序列圖7A是構建后二聯體融合蛋白的示意圖，和圖7B是三聯體融合蛋白的示意8是融合蛋白的純化圖(SDS-PAGE)實施例1本實施例中所用的連接片段是連接肽，其連接肽順序的一級結構，即連接二聯體/三聯體的蛋白順序，是10-20個氨基酸連接順序，具有這些連接順序的氨基酸都可以用，圖5所示的一種序列是最佳的。
引物寡聚脫氧核糖核酸的設計與制備P1:5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P1是從EPO基因起始因子開始，包括信號肽鏈。
P2:5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’P2是互補于3’末端的寡聚脫氧核糖核酸，與P1一起，通過PCR，放大并克隆全長(蛋白編碼)EPO cDNA。以后的亞克隆及二聯/三聯體的構建均用該質粒為基礎。
P3:5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P3的后部分與EPO的起始密碼之后的脫氧核糖核酸序列一致。在起始密碼之前，我們加了一個BamHⅠ位點。
P4:5’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCACCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’P4是與EPO cDNA終止密碼之前的序列互補(不包括終止密碼)，并額外加了一段連接肽的核苷酸序列，其中含有一個SacⅡ位點。在SacⅡ位點之后又加了一個EcoRⅠ位點。P4與P3一起，通過PCR方法，將EPO基因的3’末端的終止密碼去掉，并加上一段連接片段(Linker)。
P5:5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGAGCCCCACCACGCCTCATC 3’P5是與EPO成熟蛋白的5’脫氧核糖核酸的起始序列一致(在信號肽下游不包括信號肽)，在上游加了一段連接肽的核苷酸序列，其中包括了SacⅡ位點，同時在SacⅡ位點前插入了一個EcoRⅠ位點。P4和P5一起，通過PCR方法，將EPO基因的起始因子和終止因子去掉，并將EPO基因兩端各加上一段連接片段(Linker)。
P6:5’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’P6與EPO cDNA的末端互補(包括終止密碼)，并帶有一個Hind Ⅲ位點。P5和P6一起，通過PCR方法，將EPO基因的5’末端的起始因子去掉，并加上一段連接片段(Linker)。
實施例2 EPO,EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合基因全長核苷酸序列的測定為了獲得EPO基因，EPO-EPO以及EPO-EPO-EPO融合基因，對cDNA及改造后序列進行了亞克隆和末端改造，并利用常規(guī)方法對每一cDNA及改造后的融合基因進行了核苷酸序列測定(詳見實施例1，圖2，圖3，圖4)。
實施例3 EPO cDNA的制備用1μg mRNA為起始物，將mRNA溶于20μl去離子的水中，加熱65℃,10-20分鐘，置于冰浴中備用；然后加入cDNA合成緩沖混合液和AMV逆轉錄酶，其中含有1μg mRNA,50mM Tris·HCl(pH8.3),40mM KCl,6mM MgCl2,4mM DTT,0.5mM dNTP,0.1mMpoly(dT)12-18,0.1mg/ml BSA。在37℃反應一小時。從上面的反應液中，取5μl，放入DNA聚合酶鏈反應(PCR)的試管中，依次加入100pmolP1和P2的上下游引物，(見實施例1)，5μl PCR緩沖液(10X),2.5mmol/L的dNTP和5單位的DNA聚合酶(Taq DNAPolymerase)，最終體積為50μl；放置PCR儀中進行擴增94℃,45秒，55℃,45秒，72℃,1-2分鐘，循環(huán)35次后，72℃,7-10分鐘；反應完成后立刻取出，放置冰浴中待用。
實施例4 EPO重組質粒的構建按照
圖1，PCR反應完成后，從試管中取5μl反應液，加入另一試管中，其中含有Topo載體以及T4 DNA連接酶，形成EPO的基本構造，成為以后基因改造的基礎。本發(fā)明對所有質粒均進行了限制性內切酶的分析以保證序列的正確性。
實施例5 EPO-EPO重組質粒的構建參考圖3，經過改建和亞克隆后形成EPO-EPO重組質粒。經過對其最后表達質粒的限制性內酶的分析和序列測定后，證明其結構與所設計的結構一致。
實施例6 EPO-EPO-EPO重組質粒的構建參考圖4，經過改建和亞克隆后形成EPO-EPO重組質粒。經過對其最后表達質粒的限制性內酶的分析和序列測定后，證明其結構與所設計的結構一致。
實施例7 EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合基因在真核細胞中的高效表達用于表達EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白真核細胞株為CHO-dhfr-(CHO,DUKXB1)(Urlaub G,et al,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.77,1216)。利用Lipofectin(Life Technologies)將EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合基因進行轉化；轉化克隆生長于含有氨甲蝶蛉(Methotrexate,Sigma)的細胞培養(yǎng)液中，其中含有α-MEM+10％小牛血清，在含5％CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)；逐漸增加氨甲蝶蛉濃度以選擇出高效表達細胞株。本發(fā)明用EPO ELISA Kit(R&D)對融合蛋白的活性進行了測定。
實施例8 EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白的分離純化經克隆后的細胞株，在無血清細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)(CHO-S-SFM Ⅱ,LifeTechnologies)，待細胞長到80％充滿時(約48-72小時)，收集細胞培養(yǎng)液，將其濃縮，然后進行透析(20mMTris·HCl,pH 6.050mM NaCl,1mM EDTA,1mMDTT),4℃,24小時。將透析后的溶液上樣于已平衡后的DEAE Sepharose柱(柱為5×20cm；用20mMTris·HCl,pH6.0,50mM NaCl緩沖液平衡5-10倍柱體積)。用梯度洗脫方法(0.05-1M NaCl)洗脫融合蛋白。分管收集各洗脫峰，經活性測定后，收集有活性部分，將其濃縮后，用HPLC分離純化，得到純化的融合蛋白。
實施例9 EPO,EPO-EPO和EPO-EPO-EPO融合蛋白生物活性的測定1．用R & D EPO免疫試劑盒為工具，其中的標準品為標準，進行體外活性測量。對每一個樣品用統(tǒng)一的稀釋液稀釋。稀釋液含有細胞培養(yǎng)液α-MEM,5％小牛血清，1％的β-Mercaptoethanol，和抗菌素(青霉素，鏈霉素及Fungizone)(其結果見表1)。
2．表2中所示的體內活性測量由8-10周的小鼠被麻醉后，從眼眶抽血，測其血沉計數，然后按照小鼠體重，根據表1中所測表達蛋白的活性，以300IU/Kg體重給予一次皮下注射。每三只小鼠為一組，共四組(單體、二聯體、三聯體、對照組)，在第九天麻醉小鼠，重新從眼眶抽血，測其血沉，其結果如表2所示。
表1 體外活性測量
EPO分子量按36Kd-45Kd計算表2體內活性測量
根據表1中結果
權利要求
1，一種用基因工程方法生產的增強其生物活性的二聯體/三聯體融合蛋白，其特征在于該結構包括在兩單體中間有一段連接片段為二聯體融合蛋白，或在其三單體中間有兩段連接片段為三聯體融合蛋白；并具有紅細胞生長因子的蛋白自然順序，其二聯體融合蛋白的生物活性為135,000IU/mg；三聯體融合蛋白的生物活性為150,000IU/mg；二聯體融合蛋白具有如下所示的序列EPO-L-EPOMGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRLGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGACRTGDRGGSGGGSAAGGSGGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR三聯體融合蛋白具有如下所示的序列EPO-L-EPO-L-EPOMGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRGGSGGGSAAGGSGGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRGGSGGGSAAGGSGGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR
2．按權利要求1所述的一種用基因工程方法生產的增強其生物活性的二聯體/三聯體融合蛋白，其特征在于所述的在兩單體中間有一段連接片段，其連接片段是將一紅細胞生長因子的尾與另一紅細胞生長因子的頭連接。
3．按權利要求1所述的一種用基因工程方法生產的增強其生物活性的二聯體/三聯體融合蛋白，其特征在于所述的在三單體中間有二段連接片段。
4．按權利要求3所述的一種用基因工程方法生產的增強其生物活性的二聯體/三聯體融合蛋白，其特征在于所述的在三單體中間有二段連接片段是一紅細胞生長因子的尾通過連接片段與第二個紅細胞生長因子的頭連接，再通過第二個連接片段把第二個紅細胞生長因子的尾與第三個紅細胞生長因子頭連接。
5．按權利要求1-3中任意一項權利要求所述的一種用基因工程方法生產的增強其生物活性的二聯體/三聯體融合蛋白，其特征在于所述的連接片段為連接肽，該連接肽是具有10-20個相同的或不相同的氨基酸連接順序。
6．按權利要求5所述的一種用基因工程方法生產的增強其生物活性的二聯體/三聯體融合蛋白，其特征在于所述的連接肽為如下序列Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly
7．按權利要求1中任意一項所述的一種用基因工程方法生產的增強其生物活性的二聯體/三聯體融合蛋白，其特征在于所述的二聯體/三聯體紅細胞生長因子的質粒構建，在構建中使用設計合成的引物寡聚脫氧核苷酸P1,P2,P3,P4,P5,P6，它們的核苷酸序列是P1:5’TGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P2:5’TCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGG 3’P3:5’AAGCTAGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTGC 3’P4:5’AGCTAGAATCCACCCGCGGATCCACCTCCTGATCCACCTCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’P5:5’AGCTAGAATCCGGATCCGCGGGTGGTGGATCTGGCGGAGCCCCACCACGCCTCATC 3’P6:5’AGCTAAAGCTTTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAG 3’
8．一種制備權利要求1所述的一種用基因工程方法生產的增強其生物活性的EPO-EPO二聯體/EPO-EPO-EPO三聯體融合蛋白的方法，包括如下步驟(1)獲得EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合基因質粒，首先從細胞中提取信息核糖核酸mRNA，利用逆轉錄酶-DNA聚合酶鏈反應RT-PCR方法制備單鏈和雙鏈互補脫氧核糖核酸cDNA，經過分離純化，將EPO cDNA克隆到載體上，以此為基礎進行融合蛋白的構建；(2)利用聚合酶鏈反應PCR，對EPO cDNA進行了亞克隆和末端改造，在蛋白之間增加了一小段連接片段；(3)通過限制性內切酶，構建成了能夠表達EPO-EPO及EPO-EPO-EPO的融合蛋白質粒，并將其質粒轉化進入CHO或COS細胞株，轉化后的細胞株能分泌EPO-EPO及EPO-EPO-EPO融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用基因工程方法生產增強其生物活性的紅細胞生長因子二聯體/三聯體融合蛋白。該方法把兩個/三個相同的能表達紅細胞生長因子的基因通過一段/兩段多肽連接起來,并接入哺乳動物細胞表達質粒,將其轉入哺乳動物細胞后得到了表達。融合蛋白不僅具有紅細胞生長因子的生理活性,而且延長了蛋白在生物體內的儲留時間,進而增強其生物功效,延長體內半衰期,減少用藥次數,極大地提高了紅細胞刺激因子的臨床實用價值。
文檔編號C12P21/02GK1305003SQ0110426
公開日2001年7月25日 申請日期2001年2月27日 優(yōu)先權日2001年2月27日
發(fā)明者李洪興 申請人:李欣越