專(zhuān)利名稱(chēng)：人6－磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶、其編碼序列及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的編碼人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶(glucosamine-6-phosphate isomerase 2，簡(jiǎn)稱(chēng)為“GNPI2”)多肽的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。本發(fā)明還涉及GNPI2的酶學(xué)活性。具體地說(shuō)，本發(fā)明的多肽是一種新的與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、及炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)蛋白。
酶是人體細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)具有催化活性和特殊空間構(gòu)象的生物大分子物質(zhì)，對(duì)維持正常的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能發(fā)揮著重要的作用。研究酶的分離純化、酶的生物學(xué)活性、酶的空間構(gòu)象與酶學(xué)活性之間的關(guān)系一直是傳統(tǒng)生物化學(xué)的一個(gè)重要組成部分。近年來(lái)，隨著人類(lèi)基因組作圖和測(cè)序即將完成，尋找和發(fā)現(xiàn)新的酶分子、探討其基因表達(dá)與調(diào)控、研究酶學(xué)活性改變與疾病發(fā)生的關(guān)系，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物化學(xué)研究的最熱門(mén)的課題。
人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶(glucosamine-6-phosphate isomerase，GNPI)(EC5.3.1.10)催化6-磷酸葡萄糖胺與6-磷酸果糖之間的相互轉(zhuǎn)化，主要是6-磷酸葡萄糖胺經(jīng)醛/酮結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變及脫胺，生成果糖，進(jìn)而進(jìn)入三羧酸循環(huán)。GNPI所催化的反應(yīng)是N-乙酰-6-磷酸葡萄糖胺代謝途徑的最后一步，對(duì)調(diào)節(jié)糖胺多糖、糖脂及蛋白多糖在細(xì)胞內(nèi)的代謝以及再利用有著重要作用。糖胺多糖、糖脂及蛋白多糖多位于細(xì)胞膜內(nèi)或細(xì)胞表面，參與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成、細(xì)胞間的相互識(shí)別以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是一類(lèi)重要的生物大分子，其代謝的異常常導(dǎo)致重要細(xì)胞功能的失調(diào)，如感染、免疫功能失調(diào)、腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移等。糖胺多糖、糖脂及蛋白多糖與疾病發(fā)生的關(guān)系一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。因此，調(diào)節(jié)其代謝的酶也顯得異常重要。
GNPI最初是從大腸桿菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)并純化出來(lái)的，在人體內(nèi)只有腦組織及紅細(xì)胞內(nèi)的GNPI活性曾經(jīng)被研究及報(bào)道。近年來(lái)Nature雜志發(fā)表的一篇研究報(bào)道使GNPI再次成為關(guān)注的焦點(diǎn)。該研究報(bào)道從中國(guó)倉(cāng)鼠精子內(nèi)純化出一種蛋白質(zhì)(Oscillin)，并發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)能啟動(dòng)小鼠卵細(xì)胞鈣離子的內(nèi)流，進(jìn)而激活卵細(xì)胞的發(fā)育。而這種蛋白質(zhì)與大腸桿菌的GNPI有著高度的同源性。此后的大量研究認(rèn)為GNPI與受精過(guò)程密切相關(guān)。人們從人的精子中克隆分離出GNPI，發(fā)現(xiàn)它主要分布于精子的頂體部位，并認(rèn)為它可能通過(guò)氧化供能為受精過(guò)程提供能量而激活卵細(xì)胞的發(fā)育。這些研究表明GNPI在發(fā)育的過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。
研究表明，鑒于GNPI可能在感染、腫瘤、炎癥等病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并可能在治療生殖無(wú)能、抗感染、抗炎癥反應(yīng)、抗腫瘤以及免疫功能調(diào)節(jié)等多個(gè)領(lǐng)域具有重要的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。因此，為治療目的研究和開(kāi)發(fā)新的人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶有重要意義。然而，在本發(fā)明之前，還沒(méi)有公開(kāi)過(guò)其他類(lèi)型的人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶。
本發(fā)明的目的是提供一種新的人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2蛋白以及其片段、類(lèi)似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。本發(fā)明的GNPI2蛋白是一種GNPI同源分子。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供GNPI2的酶學(xué)活性。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的GNPI2多肽，該多肽是人源的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述人GNPI的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中158-988位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1939位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備具有人GNPI2蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)人GNPI2蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人GNPI2蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的人GNPI2多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測(cè)的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的10-3032個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進(jìn)、拮抗人GNPI2多肽活性的化合物，以及抑制人GNPI2多肽的表達(dá)的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是人GNPI2多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測(cè)樣品中是否存在GNPI2蛋白的方法，它包括將樣品與GNPI2蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在GNPI2蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測(cè)與人GNPI2多肽異常表達(dá)相關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測(cè)編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發(fā)明的第九方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進(jìn)人GNPI2多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制人GNPI2多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的人GNPI2蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的人GNPI2多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體。這些藥物組合物可治療腫瘤、炎癥、感染及生殖無(wú)能等病癥。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。


圖1是本發(fā)明的人GNPI2的cDNA序列，其中非編碼序列用黑體字母表示，編碼序列用大寫(xiě)常規(guī)字母表示。
圖2是本發(fā)明的人GNPI2蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列。其中下劃線的序列為6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶的催化功能域。
圖3是本發(fā)明的人GNPI2 Northern印跡雜交所顯示的分布。左圖和中圖為GNPI2的正常組織分布；右圖為GNPI2在多種細(xì)胞系內(nèi)的分布。1-16泳道分別為脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、PBL、心臟、腦、胎盤(pán)、肺、肝、骨骼肌、腎和胰臟。泳道17-24分別為以下細(xì)胞株HL-60、Hela、K562、Raji、SW480、A549和G361。PBL代表人外周血白細(xì)胞。結(jié)果提示GNPI2是一種廣泛分布的6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶分子。
圖4是Western印記結(jié)果。1空載體陰性對(duì)照；2洗脫液；3GNPI2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞粗提物；4純化的GNPI2蛋白。
圖5是本發(fā)明的人GNPI2在細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)后其胞內(nèi)蛋白的6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶活性與對(duì)照組的比較。1空載體陰性對(duì)照；2GNPI2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞粗提物；3純化的GNPI2蛋白。
圖6是本發(fā)明的經(jīng)純化的GNPI2表達(dá)產(chǎn)物的酶動(dòng)力學(xué)活性曲線。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“GNPI2蛋白”、“GNPI2多肽”或“人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2”可互換使用，都指具有人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的GNPI2蛋白或多肽”是指GNPI2多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類(lèi)、糖類(lèi)或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化GNPI2蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。GNPI2的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人GNPI2蛋白的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人GNPI2蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類(lèi)似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人GNPI2多肽”指具有人GNPI2蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人GNPI2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人GNPI2蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人GNPI2 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人GNPI2多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人GNPI2多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人GNPI2多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人GNPI2多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人GNPI2蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然人GNPI2多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人GNPI2蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類(lèi)似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼GNPI2蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人GNPI2核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫(kù)中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或GNPI2蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的GNPI2多肽。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人GNPI2多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人GNPI2多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體和在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人GNPI2編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門(mén)氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人GNPI2蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療GNPI2蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進(jìn)或?qū)笹NPI2蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達(dá)的重組人GNPI2蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有治療價(jià)值的能抑制或刺激人GNPI2蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人GNPI2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人GNPI2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人GNPI2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人GNPI2蛋白的分子，也包括那些并不影響人GNPI2蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人GNPI2基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專(zhuān)利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人GNPI2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人GNPI2蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類(lèi)單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見(jiàn)Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoelonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人GNPI2蛋白功能的抗體以及不影響人GNPI2蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類(lèi)抗體可以利用人GNPI2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人GNPI2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
抗人GNPI2蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人GNPI2蛋白。此外，與人GNPI2蛋白結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標(biāo)記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。這種放射性標(biāo)記的抗體可作為一種非創(chuàng)傷性診斷方法用于腫瘤細(xì)胞的定位和判斷是否有轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人GNPI2蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人GNPI2蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計(jì)成針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人GNPI2蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過(guò)二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人GNPI2蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞(例如淋巴結(jié)細(xì)胞等)。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人GNPI2蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與GNPI2蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于腫瘤、炎癥、感染、生殖無(wú)能病方面的治療。在使用本發(fā)明GNPI2蛋白時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療劑，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明GNPI2多肽或其激動(dòng)劑、拮抗劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的GNPI2蛋白或其拮抗劑、激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人GNPI2蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于GNPI2蛋白的無(wú)表達(dá)或異常/無(wú)活性的GNPI2蛋白的表達(dá)所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設(shè)計(jì)成表達(dá)變異的GNPI2蛋白，以抑制內(nèi)源性的GNPI2蛋白活性。來(lái)源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒等可用于將GNPI2基因轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶GNPI2基因的重組病毒載體的方法可見(jiàn)于已有文獻(xiàn)(Sambrook，et al.)。另外重組人GNPI2基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
抑制人GNPI2 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機(jī)制是核酶分子與互補(bǔ)的靶RNA特異性雜交后進(jìn)行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學(xué)合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應(yīng)用。反義RNA分子可通過(guò)編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動(dòng)子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對(duì)其進(jìn)行修飾，如增加兩側(cè)的序列長(zhǎng)度，核糖核苷之間的連接應(yīng)用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過(guò)載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
能與人GNPI2蛋白結(jié)合的多肽分子可通過(guò)篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫(kù)而獲得。篩選時(shí)，必須對(duì)人GNPI2蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人GNPI2蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人GNPI2蛋白水平，可以用作解釋人GNPI2蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷GNPI2蛋白起作用的疾病。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在GNPI2蛋白的方法是利用GNPI2蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與GNPI2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在GNPI2蛋白。
GNPI2蛋白的多聚核苷酸可用于GNPI2蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，GNPI2蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)GNPI2蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下GNPI2蛋白的異常表達(dá)。如GNPI2 DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷GNPI2蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開(kāi)的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱(chēng)為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用GNPI2蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)GNPI2蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)GNPI2基因的突變也可用于診斷GNPI2蛋白相關(guān)的疾病。GNPI2蛋白突變的形式包括與正常野生型GNPI2 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)本發(fā)明GNPI2蛋白的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見(jiàn)于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過(guò)與Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過(guò)連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從人樹(shù)突狀細(xì)胞cDNA文庫(kù)中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長(zhǎng)為1939個(gè)堿基，其開(kāi)放讀框位于158-988位，編碼全長(zhǎng)為276個(gè)氨基酸的人GNPI2蛋白(SEQ ID NO2)。該GNPI2蛋白屬于酶分子，與GNPI氨基酸序列高度同源，一致性可高達(dá)87％，相似性則可達(dá)94％。
此外，GNPI2蛋白也包含GNPI保守的催化基序(125-143殘基)。Northern印跡分析表明在組織中廣泛表達(dá)。已進(jìn)行的研究提示，GNPI2可能為新的人6-磷酸異構(gòu)酶，具潛在的抗腫瘤，抗炎癥，治療生殖無(wú)能等疾病的作用。因此，GNPI2蛋白或其相關(guān)的拮抗劑、激動(dòng)劑等可為治療腫瘤、炎癥、免疫功能失調(diào)及生殖無(wú)能等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人GNPI2 cDNA的克隆用Trizol(Gibco公司)提取人樹(shù)突狀細(xì)胞總RNA。然后，從總RNA中分離poly(A)mRNA。將poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA后，用SuperScriptII克隆試劑盒(購(gòu)自Gibco)將cDNA片段定向插入到載體的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌形成cDNA質(zhì)粒文庫(kù)。用雙脫氧法測(cè)定隨機(jī)挑選克隆的5’末端的序列。將測(cè)定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一個(gè)cDNA克隆的DNA序列為新的全長(zhǎng)cDNA。通過(guò)合成一系列引物對(duì)新克隆所含的DNA序列進(jìn)行雙向測(cè)定。計(jì)算機(jī)分析表明，克隆所含的全長(zhǎng)cDNA是一個(gè)新的cDNA序列(如SEQ ID NO1和
圖1所示)，編碼一個(gè)新的蛋白質(zhì)(如SEQ ID NO2和圖2所示)。此蛋白質(zhì)被命名為人樹(shù)突狀細(xì)胞衍生的6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶或人GNPI2，其編碼基因命名為人GNPI2基因。
序列SEQ ID NO1全長(zhǎng)為1939bp，包括157bp的5’端非編碼區(qū)和951bp的3’端非編碼區(qū)，編碼含276個(gè)氨基酸的多肽。理論上計(jì)算未糖基化的成熟分子的分子量約為31kD。
BLAST分析表明其與已知基因不同，與人GNPI氨基酸序列高度同源，一致性達(dá)87％，相似性達(dá)94％屬于酶分子。此外，在GNPI2蛋白中也包含一個(gè)GNPI蛋白的保守催化基序(125-143殘基)(圖2)，這也進(jìn)一步提示它可能是新的人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶。實(shí)施例2 用RT-PCR方法克隆人GNPI2的編碼序列用Trizol(Gibco公司)提取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞總RNA，取6mg細(xì)胞總RNA與0.5μg Oligo-dT12-18混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，反應(yīng)結(jié)束后加80μl ddH2O進(jìn)行稀釋。PCR擴(kuò)增所用的引物如下有義引物5’-GGAATTCCGCCATCATGAGGCTTGTAATTCTTGATAAC-3′(SEQ ID NO3)，反義引物5’-GGGGTACCGTTTCCATCTTTCATACTGAATAG-3′(SEQ IDNO4)。PCR反應(yīng)體積為50μl，其中含反轉(zhuǎn)錄模板10μl、0.4mM引物、0.2mM dNTP和1U ExTaq DNA聚合酶(Takara Inc.)，擴(kuò)增參數(shù)為94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒，25個(gè)循環(huán)后PCR產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳初步確認(rèn)。DNA序列分析結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物的編碼DNA序列與SEQ ID NO1所示的158-986完全相同。
實(shí)施例3 GNPI2的Northern印跡分析按如下常規(guī)方法進(jìn)行Northern印跡待檢濾膜置于10ml經(jīng)68℃預(yù)熱的雜交液，在雜交爐(Bellco)中于68℃預(yù)雜交30分鐘；將標(biāo)記好的cDNA探針于95～100℃變性2～5分鐘，置冰上迅速冷卻后加入雜交液(cDNA探針終濃度為2～10ng/ml或1～2×106cpm/ml)，充分混勻，于68℃雜交2小時(shí)。雜交結(jié)束后，濾膜用2×SSC、0.05％SDS室溫淋洗數(shù)次，繼振蕩沖洗30～40分鐘，其間更換洗液數(shù)次。隨后用0.1×SSC、0.1％SDS于50℃振蕩沖洗20～40分鐘。最后濾膜用塑料保鮮膜包裹，于-70℃曝光X線膠片24～48小時(shí)。
Northern印跡雜交結(jié)果顯示在肝、心臟、骨骼肌、胎盤(pán)等許多正常組織中以及Molt-4、Raji等多種細(xì)胞系中均有表達(dá)(4.5kb)，這表明GNPI2蛋白是一種廣泛表達(dá)的蛋白(圖3)。實(shí)施例4 人GNPI2重組表達(dá)在該實(shí)施例中，以實(shí)施例2中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用序列如下的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人GNPI2 DNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′端寡核苷酸引物序列為5’-GGAATTCCGCCATCATGAGGCTTGTAATTCTTGATAAC-3′(SEQ IDNO3)該引物含有EcoRI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開(kāi)始的部分編碼序列；3′端引物序列為5’-GGGGTACCGTTTCCATCTTTCATACTGAATAG-3′(SEQ ID NO4)該引物含有Kpn I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人GNPI2的部分編碼序列。
將獲得的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)EcoRI/Kpn I酶切再與質(zhì)粒pGEM-3ZF按常規(guī)方法重組并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆鑒定后純化并測(cè)序(ABI公司的377型測(cè)序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。將正確序列的人GNPI2 cDNA EcoRI/Kpn I酶切片段克隆至表達(dá)載體pcDNA3.1(Pharmacia公司)，形成形成載體pcDNA3.1-GNPI2，然后轉(zhuǎn)化人DH5α。陽(yáng)性克隆用EcoRI/Kpn I酶切鑒定，酶切產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)測(cè)序證實(shí)，已插入了完整的GNPI2編碼序列。
將真核表達(dá)載體pcDNA3.1-GNPI2用脂質(zhì)體導(dǎo)入人COS7細(xì)胞內(nèi)，72小時(shí)后收取細(xì)胞，用冰冷的裂解液(含20mM Tris，PH7.5；150mM Nacl；1mM EDTA；1％Triton；2.5mM焦磷酸鈉；1mMβ磷酸甘油；1mM NaVO3和1mM PMSF)裂解細(xì)胞，然后用超聲破碎30次，13,000rpm離心10分鐘，取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。部分上清用HiTrap Chelating columns(Pharmacia Biotech)親和層析法純化，得到人GNPI2蛋白。
用Edams水解法進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端10個(gè)氨基酸與SEQ IDNO2所示的N-端10個(gè)氨基酸殘基完全相同。
實(shí)施例5抗人GNPI2抗體的產(chǎn)生將實(shí)施例4中獲得的重組蛋白人GNPI2用來(lái)免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人GNPI2基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明GNPI2蛋白發(fā)生結(jié)合。
實(shí)施例6GNPI2的酶學(xué)活性將實(shí)施例4中所獲得的含GNPI2全長(zhǎng)編碼序列的重組pGEM-3ZF載體中正確序列的人GNPI2 cDNA EcoRI/KpnI酶切片段克隆至pcDNA3.1真核表達(dá)載體，然后用脂質(zhì)體導(dǎo)入人COS7細(xì)胞內(nèi)，72小時(shí)后收取細(xì)胞，用冰冷的裂解液(含20mMTris，PH7.5；150mM Nacl；1mM EDTA；1％ Triton；2.5mM焦磷酸鈉；1mM β磷酸甘油；1mM NaVO3和1mM PMSF)裂解細(xì)胞，然后用超聲破碎30次，13,000rpm離心10分鐘，取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。部分上清用HiTrap Chelating columns(Pharmacia Biotech)親和層析法純化，純化蛋白及細(xì)胞粗提物均用BCA蛋白定量試劑(Pierce)定量。純化蛋白及細(xì)胞粗提物經(jīng)Western電泳并用熒光標(biāo)記的抗myc抗體結(jié)合，證實(shí)其中有分子量吻合的GNPI2蛋白存在(圖4)。
酶學(xué)活性的檢測(cè)在30℃條件下進(jìn)行，以產(chǎn)物中果糖含量的增加表示酶的活性。反應(yīng)體系中含200μl的75mM Tris-HCl(pH7.7)，0.85mM N-乙酰6-磷酸葡萄糖胺(活化劑)，20mM 6-磷酸葡萄糖胺(底物)以及20μl酶蛋白，包括純化蛋白、洗脫液、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞粗提物及pcDNA3.1空載體所作的陰性對(duì)照。反應(yīng)分別進(jìn)行15、30、45、60分鐘后，加入1.8ml 11.6N的鹽酸及0.05％的雷鎖辛，77℃加熱8分鐘，產(chǎn)物用分光光度記檢測(cè)420nm處的吸光率。酶反應(yīng)產(chǎn)物中的果糖經(jīng)鹽酸和雷鎖辛作用后，在420nm處有特異的吸收峰。結(jié)果表明，GNPI2在COS7細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)的產(chǎn)物具有催化6-磷酸葡萄糖胺轉(zhuǎn)化為果糖的活性(圖5和6)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所<120>人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶、其編碼序列及用途<130>011997<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1939<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(158)..(988)<400>1cgcctttatc tgcatccggg tccgtgggat tcgcgctcca ctggtcagct ggggtcgctc 60tcgggtggtt gggtgttgct tgttcccgct gttccagcgt cgaagaacca ttgggtctgc120cggtttgaac ttgttctgga agctgtgcgt caccgta atg agg ctt gta att ctt 175Met Arg Leu Val Ile Leu1 5gat aac tat gac ttg gct agt gaa tgg gca gcc aaa tac atc tgt aat 223Asp Asn Tyr Asp Leu Ala Ser Glu Trp Ala Ala Lys Tyr Ile Cys Asn10 15 20cgc atc att cag ttc aaa cct gga cag gac aga tat ttt aca ctg ggt 271Arg Ile Ile Gln Phe Lys Pro Gly Gln Asp Arg Tyr Phe Thr Leu Gly25 30 35tta cca aca ggg agt aca cct tta gga tgc tat aaa aaa cta ata gaa 319Leu Pro Thr Gly Ser Thr Pro Leu Gly Cys Tyr Lys Lys Leu Ile Glu40 45 50tat cat aag aat gga cac ctt tct ttt aaa tat gtg aag acc ttt aat 367Tyr His Lys Asn Gly His Leu Ser Phe Lys Tyr Val Lys Thr Phe Asn55 60 65 70atg gat gaa tat gta gga ctt cca aga aat cat cct gaa agc tac cat 415Met Asp Glu Tyr Val Gly Leu Pro Arg Asn His Pro Glu Ser Tyr His75 80 85tct tat atg tgg aat aat ttt ttt aag cat atc gat ata gat cct aat 463Ser Tyr Met Trp Asn Asn Phe Phe Lys His Ile Asp Ile Asp Pro Asn90 95 100aat gca cat atc ctt gac ggg aat gct gca gat tta caa gca gaa tgt 511Asn Ala His Ile Leu Asp Gly Asn Ala Ala Asp Leu Gln Ala Glu Cys105 110 115gat gct ttt gaa aac aaa ata aaa gaa gct gga gga ata gat ctt ttt 559Asp Ala Phe Glu Asn Lys Ile Lys Glu Ala Gly Gly Ile Asp Leu Phe120 125 130gtt gga gga att ggt cca gat ggt cat atc gct ttc aat gag cct gga 607Val Gly Gly Ile Gly Pro Asp Gly His Ile Ala Phe Asn Glu Pro Gly135 140 145 150tcc agt tta gtg tca agg aca aga tta aag act cta gca atg gat acc 655Ser Ser Leu Val Ser Arg Thr Arg Leu Lys Thr Leu Ala Met Asp Thr155 160 165atc ttg gca aat gcc aaa tat ttt gat gga gat tta tca aaa gtg cca 703Ile Leu Ala Asn Ala Lys Tyr Phe Asp Gly Asp Leu Ser Lys Val Pro170 175 180act atg gct cta act gtt ggt gtg ggg aca gtg atg gat gct aga gaa 751Thr Met Ala Leu Thr Val Gly Val Gly Thr Val Met Asp Ala Arg Glu185 190 195gta atg atc ctt ata aca ggg gca cac aag gca ttt gcc ctg tac aaa 799Val Met Ile Leu Ile Thr Gly Ala His Lys Ala Phe Ala Leu Tyr Lys200 205 210gca ata gaa gaa gga gtc aat cac atg tgg act gtt tcc gct ttc cag 847Ala Ile Glu Glu Gly Val Asn His Met Trp Thr Val Ser Ala Phe Gln215 220 225 230cag cat ccc cgg act att ttt gta tgc gat gaa gat gct act tta gaa 895Gln His Pro Arg Thr Ile Phe Val Cys Asp Glu Asp Ala Thr Leu Glu235 240 245tta aga gtt aaa act gtg aaa tac ttt aaa ggt cta atg cat gtg cac 943Leu Arg Val Lys Thr Val Lys Tyr Phe Lys Gly Leu Met His Val His250 255 260aat aaa ctt gtg gat cca cta ttc agt atg aaa gat gga aac tga 988Asn Lys Leu Val Asp Pro Leu Phe Ser Met Lys Asp Gly Asn265 270 275aggagactgg agcaaaattc agcttgaatg aacagagcac tttttactaa gtagtagatg 1048aattttcagc tatgcaatat gacaaaacat ggggaatttt gaagattgtc attttttcat 1108tcgagtctct atgttaaaca ttccatattt tgaatattta tatcttgtac ttgggtttaa 1168gagaagtagc tggctctcaa gattgactgg ctatttatta taaagtactg aagtcacata 1228gccacctata aaacagcata gaaatgtctg cctgtttaaa aagtcatttt aaaggtagag 1288tgtccacatc aggcaccatt tgtgatatga ctccagtggc atatatttca ttttttaatg 1348acaagacact ccaaacettt cagataacaa actatcattg cagaccttca cttttggaat 1408gcaatcttta tattttctgt gcatcacaca catgcttttc tgcacgtggt tgccttagtc 1468atcttcctac agcaccatct agacatcaaa aattgtgcta tatatcattg gtaaaggaaa 1528tttgaagaga tgacagtgcc taaaagtaca gtttacatcc ttttggaaag tatgtgtaag 1588tgcatgtttt ttgtgcacct tcttctatag cactttttta caaatatctt atttttattt 1648aacgacttgg gttcatgtcc ctaatataag tatcttgaca attatgagct ttatacctag 1708caagccactt caggaaattc ttttggagaa tattttctga ttattgttaa acttaatata 1768caattagctt tattccttat aaaatgtcta aaagaataat acgaagtata tataaaagga 1828attactgtaa actacattgc catagcaatt tacataaaag tatattgttt tctatcttta 1888actcaaataa agcgtgtaat aaataagtta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a1939<210>2<211>276<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Arg Leu Val Ile Leu Asp Asn Tyr Asp Leu Ala Ser Glu Trp Ala1 5 10 15Ala Lys Tyr Ile Cys Asn Arg Ile Ile Gln Phe Lys Pro Gly Gln Asp20 25 30Arg Tyr Phe Thr Leu Gly Leu Pro Thr Gly Ser Thr Pro Leu Gly Cys35 40 45Tyr Lys Lys Leu Ile Glu Tyr His Lys Asn Gly His Leu Ser Phe Lys50 55 60Tyr Val Lys Thr Phe Asn Met Asp Glu Tyr Val Gly Leu Pro Arg Asn65 70 75 80His Pro Glu Ser Tyr His Ser Tyr Met Trp Asn Asn Phe Phe Lys His85 90 95Ile Asp Ile Asp Pro Asn Asn Ala His Ile Leu Asp Gly Asn Ala Ala
100 105 110Asp Leu Gln Ala Glu Cys Asp Ala Phe Glu Asn Lys Ile Lys Glu Ala115 120 125Gly Gly Ile Asp Leu Phe Val Gly Gly Ile Gly Pro Asp Gly His Ile130 135 140Ala Phe Asn Glu Pro Gly Ser Ser Leu Val Ser Arg Thr Arg Leu Lys145 150 155 160Thr Leu Ala Met Asp Thr Ile Leu Ala Asn Ala Lys Tyr Phe Asp Gly165 170 175Asp Leu Ser Lys Val Pro Thr Met Ala Leu Thr Val Gly Val Gly Thr180 185 190Val Met Asp Ala Arg Glu Val Met Ile Leu Ile Thr Gly Ala His Lys195 200 205Ala Phe Ala Leu Tyr Lys Ala Ile Glu Glu Gly Val Asn His Met Trp210 215 220Thr Val Ser Ala Phe Gln Gln His Pro Arg Thr Ile Phe Val Cys Asp225 230 235 240Glu Asp Ala Thr Leu Glu Leu Arg Val Lys Thr Val Lys Tyr Phe Lys245 250 255Gly Leu Met His Val His Asn Lys Leu Val Asp Pro Leu Phe Ser Met260 265 270Lys Asp Gly Asn275<210>3<211>38<212>DNA<213>合成引物<400>3ggaattccgc catcatgagg cttgtaattc ttgataac 38<210>4<211>32<212>DNA<213>合成引物<400>4ggggtaccgt ttccatcttt catactgaat ag 3權(quán)利要求
1.一種分離的人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2多肽，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中158-988位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-3032位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種具有人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2多肽活性的多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2多肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2多肽活性的多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2多肽特異性結(jié)合的抗體。
10.一種檢測(cè)樣品中是否存在6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2多肽的方法，其特征在于，包括將樣品與權(quán)利要求9所述的抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2多肽。
11.如權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于篩選促進(jìn)人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2多肽活性的激動(dòng)劑，或者篩選抑制人6-磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶GNPI2多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。
12.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種新型人,6－磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶(GNPI2)。本發(fā)明提供編碼此蛋白分子的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這種蛋白分子的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了編碼這種新型6－磷酸葡萄糖胺異構(gòu)酶的多核苷酸的用途。本發(fā)明還證實(shí)了GNPI2的酶學(xué)活性。本發(fā)明還公開(kāi)了抗此蛋白分子用于疾病的診斷及治療的策略,特別是可用于腫瘤、炎癥、免疫失調(diào)、生殖異常等疾病的診斷和治療。
文檔編號(hào)C12N9/90GK1380413SQ0110596
公開(kāi)日2002年11月20日 申請(qǐng)日期2001年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月12日
發(fā)明者張嘉, 章衛(wèi)平, 李楠, 曹雪濤 申請(qǐng)人:第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所