專利名稱：基因工程制備人白細(xì)胞介素4的方法及其表達(dá)載體和工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽藥物的領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及基因工程人白細(xì)胞介素4(Interleukin-4，IL-4)的制備方法，還涉及有關(guān)的表達(dá)載體和工程菌。
白細(xì)胞介素4是一種由輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，能作用于體內(nèi)的多種細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，能增強(qiáng)IgE介導(dǎo)的體液免疫和殺傷細(xì)胞的殺傷能力。
IL-4屬于Th2細(xì)細(xì)胞產(chǎn)生的特征性細(xì)胞因子，對多種免疫活性細(xì)胞的功能具有明顯的作用可增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫(特別是IgE反應(yīng))及特異性和非特異性的細(xì)胞免疫功能。對B細(xì)胞，IL-4是IgE的特異性誘導(dǎo)劑，IL-4還能增加B細(xì)胞表達(dá)MHC-II類分子、LFA1、LFA3和CD23(低親和力IgE受體)，并能能維持抗原活化B細(xì)胞的生長和擴(kuò)增。對T細(xì)胞，IL-4能誘導(dǎo)TCR/δ前T細(xì)胞分化。在一定條件下可維持胸腺細(xì)胞和活化T細(xì)胞生長，誘導(dǎo)活化T細(xì)胞表達(dá)CD23。IL-4還能增加抗原特異性CTL的活性。對NK細(xì)胞，IL-4能誘導(dǎo)其增殖。IL-4對造血功能也有一定影響，能增加G-CSF誘導(dǎo)的粒細(xì)胞集落，增加EPO誘導(dǎo)的紅細(xì)胞集落，增加IL-6誘導(dǎo)的紅細(xì)胞和粒/單核細(xì)胞集落，增加IL-3誘導(dǎo)的嗜堿/肥大細(xì)胞集落等。IL-4能通過增加呼吸爆發(fā)增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的吞噬功能；增加中性粒細(xì)胞表達(dá)膜結(jié)合型和可溶性IL-1RII，這種作用與IL-4的抗炎效應(yīng)有關(guān)。IL-4能增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞表達(dá)MHC-II類分子、LFA-1、CD23；減少CD14和FcγR(CD64、CD32和CD16)表達(dá)。阻斷巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的ATCC(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用)但不影響細(xì)胞吞噬。抑制單核細(xì)胞自發(fā)釋放或被誘導(dǎo)釋放細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN)的能力，但增加細(xì)胞釋放IL-1受體拮抗因子，IL-4還能誘導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡；抑制單核細(xì)胞分泌膠原酶，從而降低細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的降解作用；抑制細(xì)胞釋放超氧化離子和PGE2。這些作用說明IL-4是有效的抗炎因子。
樹突狀細(xì)胞(DC)是已知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APC)，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種能直接激活初始型T細(xì)胞的APC。DC在激活、啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答尤其是細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)中起著十分重要的作用。作為腫瘤細(xì)胞與特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞之間的“橋梁”，DC所具有的處理、加工和提呈抗原的功能在腫瘤抗原誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，尤其是T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫功能的過程中所發(fā)揮的作用極為重要。近年來，隨著對DC研究的不斷深入，尤其是DC大量擴(kuò)增技術(shù)的建立，以DC為基礎(chǔ)的腫瘤特異性免疫治療和基因治療的研究成為相當(dāng)熱門的研究課題，并顯示出良好的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用前景，有望為腫瘤的治療提供新的途徑。在該方面最引人囑目的研究工作是應(yīng)用抗原或抗原多肽在體外沖擊致敏(pulsing)DC，然后將之回輸或免疫接種至荷瘤宿主，進(jìn)行的腫瘤免疫治療，臨床試驗(yàn)已證明該療法能顯著地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性CTL，產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)并能治療腫瘤患者。目前常用的培養(yǎng)擴(kuò)增人樹突狀細(xì)胞的方法需要加入人白細(xì)胞介素4，因此基因工程人白細(xì)胞介素4在樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤的免疫治療中有著廣泛的應(yīng)用前景。
由于IL-4具有多方面生物學(xué)功能，其臨床適應(yīng)癥較廣。IL-4可發(fā)揮其抗腫瘤作用而用于某些腫瘤的治療；IL-4的抗炎作用可能在某些炎癥或自身免疫病中有治療價(jià)值，如應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎的治療；IL-4增加抗HBV特異性抗體產(chǎn)生的作用也有應(yīng)用價(jià)值；IL-4還可能成為防治糖尿病的藥物。目前國外應(yīng)用基因工程IL-4治療腫瘤已進(jìn)入I期和II期臨床試驗(yàn)。
國內(nèi)外有關(guān)IL-4的表達(dá)和純化研究工作亦有數(shù)家報(bào)道，但是目前IL-4的表達(dá)量不高，一般均在為菌體蛋白的5-10％，特別是由于IL-4的本身的生物學(xué)特性，使得從原核表達(dá)產(chǎn)物中復(fù)性較困難，復(fù)性得率較低(通常小于10％)，活性較差。制備后的IL-4的比活性一般為1.0-3×106單位/毫克，很難滿足腫瘤免疫治療的臨床研究需求。因此用何種表達(dá)載體和宿主細(xì)胞來表達(dá)IL-4，提高復(fù)性得率，一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員研究的焦點(diǎn)所在。
因此，本發(fā)明的目的就是提供一種高效地制備基因工程人白細(xì)胞介素4的方法(包括分離純化工藝)，以及有關(guān)的載體和宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種表達(dá)基因工程人白細(xì)胞介素4的表達(dá)載體，該載體為含有人白細(xì)胞介素4序列的原核pK223-3m載體，且人IL一4編碼序列位于pL和rrnBT1T2序列之間。
較佳地，該載體是pK223-3m-hIL-4，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它被本發(fā)明所述的載體所轉(zhuǎn)化。較佳地，所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，如大腸桿菌。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備人白細(xì)胞介素4的方法，該方法包括在適合表達(dá)IL-4的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求3中所述的大腸桿菌宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出IL-4；分離純化出IL-4，得到所表達(dá)的人白細(xì)胞介素4。
較佳地，分離純化包括以下步驟(a)制備包含體；(b)洗滌包含體；(c)溶解包含體，(d)復(fù)性；(e)陽離子交換；(f)凝膠過濾。
此外，在一實(shí)施例中，復(fù)性步驟如下在溶解的包含體中，加入2-4倍體積的甘油，充分混勻后，加入4-8倍體積的復(fù)性液進(jìn)行稀釋復(fù)性，并靜置0.5-24小時(shí)，其中該復(fù)性液配方含有20-250mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝8.0-10.0，0.02-0.2M NaCl，0.5-5mM GSH/0.5-5mM GSSG。
更佳地，該復(fù)性液配方如下50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.0；0.1M NaCl；2mM GSH/2mM GSSG，且靜置時(shí)間為2-5小時(shí)。
附圖包括


圖1是編碼人IL-4的核苷酸序列。
圖2是pK223-3m-hIL-4載體的構(gòu)建示意圖，其中將人IL-4 cDNA克隆入pK223-3m載體，形成表達(dá)載體pK223-3m-hIL-4。
圖3為用pK223-3m-hIL-4轉(zhuǎn)化的DH5α發(fā)酵后rhIL-4表達(dá)量的電泳照片。其中泳道M為分子量標(biāo)記；泳道1-3分別連續(xù)三批發(fā)酵后rhIL-4的表達(dá)結(jié)果。
圖4是基因工程人IL-4純化過程的陽離子交換圖譜。
圖5是基因工程人IL-4的凝膠過濾圖譜。
圖6是純化后基因工程人IL-4的SDS-PAGE電泳鑒定照片。其中泳道1-3為三批純化的rhIL-4(非還原型)；泳道M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道4-6為三批純化的rhIL-4(還原型)。泳道7為國外標(biāo)準(zhǔn)品(見圖6)。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將編碼hIL-4的核苷酸序列克隆入一種載體即pK223-3m，可十分高效地表達(dá)基因工程人IL-4。通過優(yōu)化培養(yǎng)及制備工藝，完成了本發(fā)明。
在一個(gè)較佳例子中，結(jié)合特別設(shè)計(jì)的分離純化重組IL-4過程，充分體現(xiàn)出本發(fā)明的表達(dá)載體和/或工程菌的高效性。特別是純化過程通過優(yōu)化IL-4的復(fù)性過程，使純化IL-4的得率大大提高。
表達(dá)載體pK223-3m的元件來源于pK223-3(Pharmacia公司，GenBank登錄號M77749)和pJL6這兩個(gè)載體，經(jīng)構(gòu)建后重命名為pK223-3m；其中主要包括基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子-λ噬菌體的PL啟動(dòng)子，以及控制該啟動(dòng)子的溫度敏感的阻抑蛋白cIts857，這一對元件構(gòu)成基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)元件；其它的元件則包括質(zhì)粒復(fù)制啟動(dòng)子、抗氨芐青霉素的抗性基因以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄終止的元件。插入人IL-4基因后命名為pK223-3m-hIL-4，其中人白細(xì)胞介素4的序列如
圖1所示，表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)如圖2所示。
本發(fā)明新型的表達(dá)載體是這樣構(gòu)建的采用中國人外周血單個(gè)核細(xì)胞作為人IL-4基因的來源，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法獲得編碼人IL-4 cDNA；將人IL-4 cDNA克隆到原核表達(dá)載體pK223-3m中；經(jīng)核酸測序證明，人IL-4序列正確，在該載體中，人IL-4基因的轉(zhuǎn)錄受到cIts857啟動(dòng)子的控制。該重組表達(dá)載體命名為pK223-3m-hIL-4；
采用大腸桿菌DH5α作為宿主細(xì)胞，用載體pK223-3m-hIL-4轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌，經(jīng)過反復(fù)篩選和表達(dá)分析，獲得高表達(dá)人IL-4的生產(chǎn)菌株DH5α/pK223-3m-hIL-4。
可用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞宜為原核細(xì)胞，更佳地為大腸桿菌，最佳地為大腸桿菌DH5α菌株。
表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化可采用常規(guī)的方法，如氯化鈣法、電穿孔法等。選用的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域的常規(guī)使用的培養(yǎng)基。
在本發(fā)明中，可用多種常規(guī)方法使攜帶表達(dá)載體的菌株表達(dá)IL-4。在下面的實(shí)施例4給出了一個(gè)優(yōu)選方案。在一級種子培養(yǎng)中，采用LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間一般為12-16小時(shí)，收獲時(shí)的OD600光吸收應(yīng)大于約0.6，一般為0.6-0.8。在二級種子培養(yǎng)中，采用2YT培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間一般為12-16，收獲時(shí)的OD600光吸收應(yīng)大于約2.0。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，當(dāng)收獲時(shí)的OD600光吸收大于約3.0時(shí)，可升高溫度以誘導(dǎo)IL-4在熱誘導(dǎo)調(diào)控元件下進(jìn)行表達(dá)。誘導(dǎo)時(shí)間一般為2-6小時(shí)，較佳地為2.5-4小時(shí)。收獲時(shí)OD600光吸收一般應(yīng)大于約5.0，一般為4.5-5.5。這樣，獲得的IL-4表達(dá)量一般占菌體中蛋白的20-30％。
表達(dá)蛋白后的分離純化步驟，一般包括以下步驟(a)制備包含體，(b)洗滌包含體，(c)溶解包含體，(d)復(fù)性，(e)陽離子交換柱層析和(f)凝膠過濾柱色譜。
本發(fā)明的另一改進(jìn)之處在于復(fù)性步驟。一種優(yōu)選的復(fù)性步驟如下在溶解的包含體中，加入2-4倍體積的甘油，充分混勻后，加入4-8倍體積的復(fù)性液進(jìn)行稀釋復(fù)性，并靜置0.5-24小時(shí)，其中該復(fù)性液配方含有20-250mMNa2CO3/NaHCO3，PH＝8.0-10.0，0.02-0.2M NaCl，0.5-5mM GSH/0.5-5mMGSSG。更佳地，該復(fù)性液配方如下50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.0；0.1MNaCl；2mM GSH/2mM GSSG，且靜置時(shí)間為2-5小時(shí)。
純化工藝可采用本領(lǐng)域中常規(guī)使用的純化工藝，也可采用本發(fā)明人專門設(shè)計(jì)的純化工藝，其中純化工藝包括包含體制備、洗滌包含體(任選步驟)、溶解包含體、復(fù)性、陽離子交換、凝膠過濾等步驟。一種純化方案是用工程菌DH5α/pK223-3m-hIL-4，在發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵，收集菌體通過包含體的制備，復(fù)性后轉(zhuǎn)換緩沖液，進(jìn)行CM Sepharose FF柱層析，Sephacryl S-200凝膠過濾純化制成半成品，用本發(fā)明人選擇的工藝進(jìn)行純化，最終可獲得純度大于95％基因人白細(xì)胞介素4制品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)表達(dá)量高。目前，現(xiàn)有技術(shù)中人IL-4的重組表達(dá)量占菌體總蛋白的5-10左右，本發(fā)明通過優(yōu)化表達(dá)載體并結(jié)合培養(yǎng)發(fā)酵條件，使其表達(dá)量高達(dá)30％。
(2)復(fù)性得率高采用其它方法復(fù)性得率＜10％，本發(fā)明通過對復(fù)性液的改進(jìn)，優(yōu)化復(fù)性條件，使復(fù)性得率提高至35％以上。
以下結(jié)合實(shí)施例和附圖，來進(jìn)一步詳細(xì)地闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例用于說明目的而并非用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1、hIL-4 cDNA的克隆天然成熟的人白細(xì)胞介素4由129個(gè)氨基酸組成。
本發(fā)明人通過反轉(zhuǎn)錄PCR從中國人的健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞中克隆出人白細(xì)胞介素4的cDNA。
本發(fā)明所采用的上游引物為5’-AATGCACAAGTGCGATATCACCT-3’，下游引物為5’-CGGGATCCTCAGCTCGAACACTTTGAA-3’(含BamHI酶切位點(diǎn))。
RT-PCR按常規(guī)方法進(jìn)行，得到的PCR產(chǎn)物被直接克隆至pK223-3m載體，進(jìn)行DNA測序，測序引物為5’-CTTTGGGGTGTGTGATAC-3’DNA的測序證實(shí)，本發(fā)明人所克隆的人白細(xì)胞介素4 cDNA序列是正確的(
圖1)。實(shí)施例2、表達(dá)IL-4原核載體的構(gòu)建在該實(shí)施例中所采用pK223-3m原核載體含有PL啟動(dòng)子，熱誘導(dǎo)表達(dá)調(diào)控元件cIts857等元件。
對實(shí)施例1制備的pK223-3m-hIL-4載體即可直接用于誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)酶切鑒定，pK223-3m-hIL-4載體的酶切圖譜正確，含有所插入的rhIL-4 cDNA序列(圖2)。實(shí)施例3.IL-4表達(dá)工程菌的建立及其鑒定在該實(shí)施例中，將pK223-3m-hIL-4載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，從而建立表達(dá)人IL-4的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(工程菌)DH5α/rhIL-4。
獲得的原始工程菌菌種用含15％甘油的LB培養(yǎng)基保存于-70℃，每支1.0ml。工程菌在LB軟瓊脂平板上生長呈典型的大腸桿菌菌落特征。為檢查工程菌的穩(wěn)定性，每傳20代作一次酶切圖譜分析，結(jié)果與原始菌種一致，這證明本發(fā)明中的工程菌是很穩(wěn)定的。
該工程菌于2001年4月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，中國，武漢，保藏編號為CCTCC No.M201009。實(shí)施例4.發(fā)酵(a)種子培養(yǎng)將菌種0.1ml接種入含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(一級種子培養(yǎng)基)，在搖床中30℃、200rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)，在OD600光吸收為大于0.6時(shí)(在該例子中為0.8)進(jìn)行收取。
取一級種子培養(yǎng)基中擴(kuò)增后的種子2.5ml，接種入含250ml二級種子培養(yǎng)基(同發(fā)酵培養(yǎng)基)的1L培養(yǎng)瓶中，在搖床中30℃、200rpm培養(yǎng)12～16小時(shí)，在OD600光吸收應(yīng)大于2.0時(shí)(在該例子中為2.2)。發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以M9基本培養(yǎng)為基礎(chǔ)，添加其它物質(zhì)，其配方如下酪蛋白水解氨基酸5.0g/LNa2HPO46.0g/L
KH2PO43.0g/LNaCl 3.0g/LNH4Cl 0.5g/L用NaOH調(diào)PH值至7.2，高壓滅菌。
添加以下微量元素配方FeCl3125mMMnSO420mMZnSO420mMCuSO420mMCoCl220mMH3BO320mMNa2MoO420mM上述物質(zhì)分別溶解于1N HCl中，過濾除菌。
臨用前無菌加入下述物質(zhì)1M MgSO41ml/L0.1M CaCl21ml/L1mg/ml硫胺素 1ml/L葡萄糖 5g/L微量元素 1ml/L100mg/ml氨芐青霉素 1ml/L工作體積為10L的發(fā)酵罐，接種入500ml培養(yǎng)好的二級種子培養(yǎng)液，開始發(fā)酵。發(fā)酵參數(shù)設(shè)置如下攪拌速率 200-600rpm通氣量 2.0L/分鐘罐壓 5.0PSI溶解氧 30％PH值控制 6.5溫度 32.0℃發(fā)酵中用NH4OH控制PH值；產(chǎn)生過量泡沫時(shí)，用Antifoam 204(Sigma)0.2ml消泡；溶氧控制為與攪拌速率級聯(lián)，溶氧低于30％時(shí)自動(dòng)加快攪拌速度，以滿足氧的供應(yīng)。發(fā)酵過程中測定OD600光密度值，監(jiān)測細(xì)菌的生長情況，OD600光密度值為3.0左右時(shí)，開始升溫至42℃，誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)IL-4。
誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)后，此時(shí)OD600值為5.5-6.5時(shí)收獲菌體，這相當(dāng)于菌體濕重為5～8克/升發(fā)酵終產(chǎn)物。IL-4表達(dá)量為菌體總蛋白的30％(圖3)。4℃離心收集菌體，保存于-20℃?zhèn)溆谩?shí)施例5.基因工程人IL-4的純化包含體制備取實(shí)施例4中發(fā)酵好的凍存菌體25克，加入50mM Tris 2mM EDTA pH8.3緩沖液250ml，待樣品融化后制成懸液，9000rpm離心15分鐘收集菌體。
加入含50mM Tris 2mM EDTA pH8.3緩沖液500ml，制成懸液后，靜置20分鐘。
冰浴下超聲，功率300W，占空比為50％，每個(gè)循環(huán)30秒，總時(shí)間為15分鐘，處理樣品體積為250ml，超聲粉碎的細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后，4℃、9000rpm離心20分鐘，收集沉淀。
在收集的沉淀中，加入2M尿素、50mM Tris 2mM EDTA pH8.3緩沖液200ml，制成懸液，室溫下攪拌洗滌30分鐘。4℃、7000rpm離心20分鐘收集菌體。
再加入2M尿素、50mM Tris 2mM EDTA PH8.3緩沖液200ml，制成懸液，室溫下攪拌洗滌30分鐘。4℃、7000rpm離心20分鐘收集菌體。
加入50mM Tris 2mM EDTA PH8.3緩沖液200ml，制成懸液，室溫下攪拌洗滌30分鐘。
最后按上述方法用50mM PB 1mMEDTA PH7.0攪拌洗滌菌體一次，離心收集沉淀。溶解包含體在如上制備的包含體中，加入6M鹽酸胍、10mM DTT、1mM EDTA、50mMTris/HCl，pH＝9.0的溶液(按每克包含體加入10ml)，吹打，充分?jǐn)嚢瑁敝涟w完全溶解。4℃、9000rpm離心30分鐘，取上清備用。復(fù)性取上述溶解后的包含體，加入3倍體積的甘油，充分混勻后，在室溫下靜置30分鐘。然后用5倍體積的復(fù)性液進(jìn)行稀釋復(fù)性得，室溫下靜置4小時(shí)。
復(fù)性液的成分如下50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.00.1M NaCl2mM GSH/2mM GSSG4℃、9000rpm離心30分鐘，取上清備用緩沖液轉(zhuǎn)換取上述復(fù)性后組分，超濾濃縮至原體積的1/10，然后加入10倍體積的50mM檸檬酸緩沖液，PH＝5.4，繼續(xù)超濾濃縮至1/10體積。重復(fù)一次后，所得的樣品經(jīng)4℃、9000rpm離心30分鐘，取上清備用。陽離子交換柱層析層析柱為CM-Sepharose FF 2.6×10cm，樣品為上述的包含體溶解液，緩沖液為A為50mM檸檬酸，PH＝5.0，緩沖液B為含2M NaCl的50mM檸檬酸，PH＝5.0。
上樣后采用NaCl線性梯度洗脫，收集各組分，SDS-PAGE鑒定后，合并含IL-4的組分進(jìn)行下一步純化(圖4)。凝膠過濾柱層析上述組分采用凝膠過濾柱層析進(jìn)一步純化，方法如下層析柱為SephacrylS2002.6×100cm，緩沖液為50mM PB PH7.0，流速為60ml/小時(shí)，上樣量為柱體積的1/10，收集蛋白峰。層析圖如圖5所示。凍干上述制備的基因人IL-4純品，用20mM谷氨酸，PH＝7.0，0.1M NaCl溶液稀釋到終濃度100ug/ml，加入甘露醇至終濃度2％，人血白蛋白至終濃度0.1％。分裝至西林瓶中，冷凍干燥后制成基因工程人IL-4成品。該制品可以-20℃保存2年而無明顯的活性喪失。實(shí)施例6 基因工程人IL-4的鑒定和活性測定用常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳測定純化后的IL-4進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE電泳，銀染后掃描測得IL-4為單一條帶。圖6是純化后基因工程人IL-4的SDS-PAGE電泳鑒定照片。其中泳道1-3為三批純化的rhIL-4(非還原型)；泳道M為低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道4-6為三批純化的rhIL-4(還原型)。泳道7為國外標(biāo)準(zhǔn)品(見圖6)用常規(guī)方法進(jìn)行N末端氨基酸殘基測定N端15個(gè)氨基酸鑒定結(jié)果與天然的IL-4完全一致，為MetHisLysCysAspIleThrLeuGlnGluIleIleLysThrLeu。
用常規(guī)方法進(jìn)行比活性測定即采用TF-1依賴株、MTT法測定純化的IL-4活性，測定的活性單位IL-4蛋白質(zhì)絕對含量之比為比活性(單位為國際標(biāo)準(zhǔn)單位/毫克)。結(jié)果表明，采用實(shí)施例5方法純化的IL-4終產(chǎn)品比活性為6.5×106國際標(biāo)準(zhǔn)單位/毫克。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)基因工程人白細(xì)胞介素4的表達(dá)載體，其特征在于，該載體為含有人白細(xì)胞介素4序列的原核pK223-3m載體，且人IL-4編碼序列位于pL和rrnBT1T2序列之間。
2.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，該載體是pK223-3m-hIL-4，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。
3.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它被權(quán)利要求1所述的載體所轉(zhuǎn)化。
4.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是大腸桿菌。
5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，它是大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α/pK223-3m-hIL-4，CCTCC M 201009。
6.一種制備人白細(xì)胞介素4的方法，其特征在于，該方法包括在適合表達(dá)IL-4的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求3中所述的大腸桿菌宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出IL-4；分離純化出IL-4，得到所表達(dá)的人白細(xì)胞介素4。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，分離純化包括以下步驟(a)制備包含體；(b)洗滌包含體；(c)溶解包含體，(d)復(fù)性；(e)陽離子交換；(f)凝膠過濾。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，復(fù)性步驟如下在溶解的包含體中，加入2-4倍體積的甘油，充分混勻后，加入4-8倍體積的復(fù)性液進(jìn)行稀釋復(fù)性，并靜置0.5-24小時(shí)，其中該復(fù)性液配方含有20-250mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝8.0-10.0，0.02-0.2M NaCl，0.5-5mM GSH/0.5-5mM GSSG。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，該復(fù)性液配方如下50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.00.1M NaCl2mM GSH/2mM GSSG。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，靜置時(shí)間為2-5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種表達(dá)基因工程人白細(xì)胞介素4(rhIL－4)的表達(dá)載體pK223－3m－h(huán)IL－4,還公開了用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α,以及用上述表達(dá)載體和/或宿主細(xì)胞發(fā)酵表達(dá)、純化人基因工程白細(xì)胞介素4的工藝方法。用本發(fā)明可表達(dá)載體及工程菌可高獲得IL－4的高表達(dá),并通過復(fù)性及純化獲得人IL－4純品,且獲得的基因工程IL－4比活性高。
文檔編號C12N15/03GK1380419SQ01105968
公開日2002年11月20日 申請日期2001年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月12日
發(fā)明者王建莉 申請人:上海華康生物技術(shù)有限公司