專利名稱：仔豬紅痢魏氏梭菌α－β毒素雙價(jià)基因工程菌苗及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因片段修飾，在表達(dá)載體pXCPAB2中引入α-β毒素融合基因的、預(yù)防仔豬紅痢的魏氏梭菌α-β毒素雙價(jià)基因工程菌苗及制備方法。
引起仔豬紅痢的致病菌為C型魏氏梭菌，其致病因子主要為菌體產(chǎn)生的α和β毒素。目前，市場(chǎng)上流行的菌苗為傳統(tǒng)的滅活菌，它存在著滅活苗本身的缺點(diǎn)，即有效抗原成份部分失活，免疫力低，特別是引起仔豬紅痢C型魏氏梭菌易形成芽胞，存在滅活不徹底的隱患，有時(shí)由于菌苗中含有這些未失活的菌反而會(huì)引起仔豬發(fā)病，甚至導(dǎo)致死亡。
本發(fā)明的目的是提供一種克服上述缺點(diǎn)，菌苗抗原成份能緩慢釋放、能更有效地預(yù)防仔豬紅痢的仔豬紅痢魏氏梭菌α-β毒素雙價(jià)基因工程菌苗及制備方法。
本發(fā)明的這種新型基因工程菌苗，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，從C型魏氏梭菌染色體中擴(kuò)增出α毒素保護(hù)性抗原基因，通過(guò)分離、純化、內(nèi)切酶酶切，獲得α毒素基因。用同樣方法制備了β毒素基因，然后通過(guò)連接反應(yīng)，將α毒素基因融合在β毒素基因的上游，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pXCPAB2，通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到受體菌BL21(DE3)中，構(gòu)建了含α-β毒素融合基因表達(dá)載體的基因工程菌株BL21(DE3)(pXCPAB2)，該菌株表達(dá)的有效抗原成份在菌體內(nèi)部，該基因工程菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，用0.4％甲醛滅活，并輔以氫氧化鋁膠制成基因工程滅活苗。
α-β毒素基因表達(dá)質(zhì)粒pXCPAB2的結(jié)構(gòu)式 它含有大腸桿菌復(fù)制子0RI、PT7是T7 RNA聚合酶/啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)，外源目的基因α、β毒素基因和抗性篩選基因卡那霉素(Kan)基因。α毒素保護(hù)性抗原基因是α毒素全基因的第222位至第1110位，該基因表達(dá)的α毒素蛋白已失去了α毒素本身的生物學(xué)毒性。β毒素為全基因。
本發(fā)明方法構(gòu)建并可批量生產(chǎn)的用于預(yù)防C型魏氏梭菌引起的仔豬紅痢、用于妊娠母豬的α-β毒素雙價(jià)基因工程菌苗的顯著優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建的基因工程菌株BL21(DE3)(pXCPAB2)遺傳性狀穩(wěn)定、質(zhì)粒傳代穩(wěn)定、有效抗原表達(dá)穩(wěn)定。有效抗原成份以包含體形式存在于菌體內(nèi)部，這樣的存在形式在使用時(shí)，抗原成份是緩慢連續(xù)釋放的，因而用于免疫懷孕母豬，效果甚佳，并且在制作菌苗時(shí)避免了用甲醛滅活菌體時(shí)對(duì)有效抗原的破壞和免疫力的降低。
仔豬紅痢魏氏梭菌α-β毒素雙價(jià)基因工程菌苗的構(gòu)建方法，其特征是1、采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，設(shè)計(jì)2條α毒素PCR引物，α1為5｀-CATGCCATGGCAGATAATAATTTCTCA-3｀,α2為5｀-CGCGGATCCGATTTCC TGAAATCCA-3｀，其由α1引物中含有NcoⅠ酶切位點(diǎn)，α2引物中含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)；然后從C型魏氏梭菌染色體中擴(kuò)增出α毒素保護(hù)性抗原基因，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化PCR產(chǎn)物，用內(nèi)切酶NcoⅠ和BamHⅠ酶切PCR產(chǎn)物，回收α毒素基因。再用PCR技術(shù)設(shè)計(jì)2條β毒素PCR引物，β1為5｀-CGCGGATCCCCCAATGATATAGGTAAAACT-3｀,β2為5｀-CCGGCGGGCCGCCGAATTCTTAATAGCTGT-3｀,其中β1引物中含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)，β2引物中含有NotⅠ酶切位點(diǎn)；然后從C型魏氏梭菌染色體中擴(kuò)增出β毒素基因，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化PCR產(chǎn)物，用內(nèi)切酶NotⅠ和BamHⅠ酶切PCR產(chǎn)物，回收β毒素基因PCR反應(yīng)體積為100μL，其中10μL10倍反應(yīng)緩沖液，10ng染色體DNA,200μmol/L dNTPs，引物各250ng,3U Taq DNA聚合酶，按94℃60s→42℃60s→72℃120s的溫度轉(zhuǎn)換模式，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。β毒素基因的擴(kuò)增條件同上，只是引物P1為5｀-CGCGGATCCCCCAATGAT ATAGGTAAAACT-3｀,P2為5｀-CCGGCGGGCCGCCGAATTCTTAATAGCTGT-3｀，其中P1引物中含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)，P2引物中含NotⅠ的酶切位點(diǎn)。二者PCR產(chǎn)物分別用NcoⅠ、BamHⅠ和BamHⅠ、NotⅠ酶切，然后用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收α和β毒素基因。2、將α和β毒素基因用T4 DNA連接酶連接，然后插入到用NcoⅠ和NotⅠ雙酶切載體pET-28b中，并用氯化鈣法轉(zhuǎn)化至受體菌BL21(DE3)中，涂種于含Kan的LB瓊脂平板上，過(guò)夜培養(yǎng)。挑取其中三個(gè)Kan陽(yáng)性的重組菌落，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，采用堿性裂解法快速抽提質(zhì)粒，然后進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果重組質(zhì)粒的遷移率比載體質(zhì)粒慢，表明已有外源DNA插入。把其中一個(gè)重組質(zhì)粒命名為pXCPAB2，分別用NcoⅠ、BamHⅠ和NcoⅠ、BamHⅠ雙酶切該質(zhì)粒，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒含有α和β毒素基因，且二者融合在一起，經(jīng)DNA序列分析證實(shí)，表明重組質(zhì)粒中含有α-β毒素融合基因，且閱讀框架是正確的。
仔豬紅痢魏氏梭菌α-β毒素雙價(jià)基因工程菌苗的生產(chǎn)工藝，其特征是(1)把凍干菌種BL21(DE3)(pXCPAB2)用LB培養(yǎng)基制成一級(jí)種子、二級(jí)種子和生產(chǎn)用三級(jí)種子；(2)將三級(jí)種子按2-5％的量接種于發(fā)酵罐中，進(jìn)行通氣培養(yǎng)，通氣量3-4V/min，50％滅菌葡萄糖調(diào)節(jié)pH值，調(diào)節(jié)范圍7.2-7.8,36-38℃培養(yǎng)18-24h。在培養(yǎng)過(guò)程中可以添加適量的誘導(dǎo)劑，可用0.1mmol/l異丙基-硫代-D-半乳糖苷作為本基因工程菌株的誘導(dǎo)劑，該抗原蛋白可占菌體總蛋白的10％以上。(3)收獲的菌液添加滅活劑10％甲醛溶液至終濃度0.4-0.6％,37℃滅活48h；(4)按1∶1比例加入氫氧化鋁膠和菌液，并按終濃度0.01％添加1％硫柳汞溶液，磨制2分鐘，裝入大瓶子，沉淀后棄上清或添加生理鹽水，然后裝入分裝筒，混勻，調(diào)pH6.8-7.2，制成含20％氫氧化鋁膠的佐劑疫苗，菌苗成品含BL21(DE3)(pXCPAB2)菌250億個(gè)/5ml。
生產(chǎn)培養(yǎng)基的配方為蒸餾水1000ml，胰蛋白胨8g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，用2mol/l氫氧化鈉調(diào)pH7.6-7.8，加入適量消泡劑，116℃滅菌40分鐘，保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明生產(chǎn)工藝中所用的凍干菌種按下述步驟制備1菌種1.1制造用菌種為BL21(DE3)(pXCPAB2)，代號(hào)為DD-2，暫由解放軍軍需大學(xué)細(xì)菌學(xué)研究室鑒定、保存和供應(yīng)。
1.2菌種標(biāo)準(zhǔn) 制苗用基因工程菌株DD-2應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)1.2.1染色特性 本菌株為革蘭氏陰性小桿菌。
1.2.2培養(yǎng)特性 在普通瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18-20h，菌落為圓形、邊緣整齊、閃光、濕潤(rùn)、半透明、微隆起、灰白色、中等大小的菌落；普通肉湯培養(yǎng)24h，呈均勻渾濁，能抗硫酸卡那霉素(kan)。生長(zhǎng)曲線同一般大腸桿菌。
1.2.3質(zhì)粒傳代穩(wěn)定性 重組質(zhì)粒pXCPAB2在受體菌BL21(DE3)中能穩(wěn)定傳代，經(jīng)20世代后，含質(zhì)粒率為100％，在無(wú)選擇壓力下培養(yǎng)，質(zhì)粒丟失率小于5％。
1.2.4質(zhì)粒DNA檢查 將該菌株于普通肉湯中37℃振蕩培養(yǎng)16-20h后，其培養(yǎng)物用快速堿性裂解法抽提質(zhì)粒DNA，分別用NcoⅠ、BamHⅠ和BamHⅠ、NotⅠ及NcoⅠ、NotⅠ雙酶切該質(zhì)粒，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢查，可見0.95kb的α毒素基因片段、0.93kb的β毒素基因片段和1.88kb的α-β融合基因片段。
1.2.5毒力 對(duì)普通肉湯16-18h的培養(yǎng)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。以20億活菌腹腔接種18-22g小鼠10只，觀察10天應(yīng)全部健活。
1.2.6純粹檢查 用適宜培養(yǎng)基檢查，應(yīng)無(wú)雜菌生長(zhǎng)。
1.2.7免疫原性 將制成的20％氫氧化鋁膠佐劑苗(原苗濃度為10倍稀釋后OD值=0.6)用下述方法檢查其免疫原性。取體重18-22g小鼠10只，腹腔注射0.2ml/只，間隔14天再次腹腔注射0.2ml/只，14天后，腹腔攻擊C型魏氏梭菌強(qiáng)毒菌C59-1，攻毒劑量為5億活菌/只。免疫組保護(hù)率應(yīng)在80％以上，對(duì)照組死亡率應(yīng)在80％以上。
1.3菌種保存 DD-2凍干菌種置0-4℃，保存期暫定為3年；置-65℃，保存期暫定為5年。
2疫苗生產(chǎn)操作細(xì)則2.1生產(chǎn)用種子的制備2.1.1一級(jí)種子的繁殖與鑒定 凍干菌種經(jīng)普通肉湯增殖后，劃線接種于含kan的普通瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18-24h，選取符合上述1.2.1染色特性，1.2.2培養(yǎng)特性規(guī)定的典型菌落5個(gè)，單獨(dú)接種于含相同抗生素的普通肉湯小管，經(jīng)質(zhì)粒DNA檢查符合1.2.5項(xiàng)毒力規(guī)定，接種于含相同抗生素的瓊脂斜面若干支，37℃培養(yǎng)18-24h，經(jīng)純檢合格者作為一級(jí)種子。置0-4℃保存，限一個(gè)月內(nèi)使用。
2.1.2二級(jí)種子的繁殖與鑒定 取一級(jí)種子接種于含硫酸卡那霉素的普通肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h后轉(zhuǎn)種于含同樣抗生素的大瓶普通肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h，經(jīng)純檢合格后作為生產(chǎn)用種子，此種子液置0-4℃保存，限72h內(nèi)使用。
2.1.3三級(jí)種子的繁殖和鑒定 取二級(jí)種子接種LB培養(yǎng)基(2萬(wàn)ml大瓶子)通氣培養(yǎng)，通氣量3-4V/min，用滅菌的50％葡萄糖調(diào)節(jié)pH值，調(diào)節(jié)范圍7.2-7.8,37℃培養(yǎng)12-16h，經(jīng)純檢合格后，作為三級(jí)種子。三級(jí)種子置4℃保存，可保存2天。
2.2菌液培養(yǎng)和中間監(jiān)測(cè)2.2.1制苗用培養(yǎng)基胰蛋白胨8g酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml，用2mol/l氫氧化鈉調(diào)pH值7.6-7.8，加入適量消泡劑，116℃滅菌40min保存?zhèn)溆谩?br> 2.2.2菌液培養(yǎng) 將三級(jí)種子按培養(yǎng)基總量的5％接種于改良LB培養(yǎng)基中，37℃通氣培養(yǎng)18-24h，通氣量3-4V/min，培養(yǎng)過(guò)程中添加滅菌50％葡萄糖溶液，用于補(bǔ)充碳源和調(diào)節(jié)pH值，pH值調(diào)節(jié)范圍7.2-7.6。
2.2.3中間監(jiān)測(cè) 菌液培養(yǎng)完成后，取樣適當(dāng)稀釋后接種于含適量抗生素的普通瓊脂平板，進(jìn)行活菌記數(shù)，同時(shí)按九二版《獸用生物制品規(guī)程》附錄50頁(yè)進(jìn)行純檢，應(yīng)純粹。
2.3滅活 按菌液總量的0.4％加入10％甲醛溶液，經(jīng)37℃滅活48h，然后按九二版《獸用生物制品規(guī)程》附錄50頁(yè)進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
2.4 50％氫氧化鋁生理鹽水的制備 啟動(dòng)膠體磨，加入0.85％生理鹽水2000ml，再稱量氫氧化鋁原膠2000g，分?jǐn)?shù)次加入生理鹽水中，磨制5min，并用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0以上，裝入2萬(wàn)ml大瓶子中，116℃高壓滅菌40min，4℃貯存?zhèn)溆谩⒅苽涞?0％氫氧化鋁生理鹽水制成20％氫氧化鋁生理鹽水，并調(diào)pH值6.8-7.2，然后測(cè)定其吸附力，應(yīng)符合《獸醫(yī)生物制品規(guī)程》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。
2.5混苗 膠體磨用8％甲醛溶液消毒(浸泡過(guò)夜或運(yùn)轉(zhuǎn)20min)，棄掉消毒液后啟動(dòng)，按適當(dāng)比例加入氫氧化鋁膠和菌液，并按終濃度0.01％添加1％或2％硫柳汞溶液，磨制2min，裝入大瓶子，沉淀后棄上清或添加生理鹽水，然后裝入分裝筒，混勻，調(diào)pH6.8-7.2，制成20％氫氧化鋁膠佐劑苗。
2.6半成品檢驗(yàn) 配苗后取樣按九二版《獸用生物制品規(guī)程》附錄50頁(yè)進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，應(yīng)無(wú)細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)。
2.7成品的制備 半成品檢驗(yàn)合格后，分裝、壓蓋、貼簽、裝盒、裝箱、留樣、入庫(kù)、記錄。填寫生產(chǎn)日?qǐng)?bào)表和入庫(kù)單。
2.8成品的性狀 菌苗靜置后分層，上層為棕黃色澄明液體，下層為灰白色沉淀，振搖后呈均勻混濁液。
2.9菌苗用途 預(yù)防C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的仔豬紅痢，用于妊娠母豬。
2.10菌苗用法與用量 未經(jīng)本疫苗免疫過(guò)的初產(chǎn)母豬于產(chǎn)前30-40天和15-20天，各肌肉注射5ml，經(jīng)過(guò)本疫苗免疫過(guò)的經(jīng)產(chǎn)母豬，于產(chǎn)前15-20天肌肉注射5ml。
2.11菌苗貯藏 在2-8℃保存，有效期暫定為1年。
2.12菌苗規(guī)格 5ml,10ml/瓶。
權(quán)利要求
1．一種用于預(yù)防仔豬紅痢的魏氏梭菌α-β毒素雙價(jià)基因工程菌苗，其特征是基因工程菌株BL21(DE3)(pXCPAB2)1)受體菌為大腸桿菌BL21(DE3)2)重組表達(dá)質(zhì)粒pXCPAB2 它含有大腸桿菌復(fù)制子ORI，PT7是T7 RNA聚合酶/啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)，外源目的基因α和β毒素基因，抗性篩選基因卡那霉素(Kan)基因；α毒素保護(hù)性抗原基因是α毒素全基因的第222位至第1110位，該基因表達(dá)的α毒素蛋白已失去了α毒素本身的生物學(xué)毒性，β毒素為全基因，基因工程菌株BL21(DE3)(pXCPAB2)表達(dá)的有效抗原α-β毒素融合蛋白以包含體形式存在于菌體內(nèi)部。
2．一種仔豬紅痢魏氏梭菌α-β毒素雙價(jià)基因工程菌苗的構(gòu)建方法，其特征是采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，設(shè)計(jì)2條α毒素聚合酶鏈反應(yīng)引物，α1為5｀-CATGCCATGGCAGATAATAATTTCTCA-3｀,α2為5｀-CGCGGATCCGATTTCCTGAAATCCA-3｀，其中α1引物中含有NcoⅠ酶切位點(diǎn)，α2引物中含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)，然后從C型魏氏梭菌染色體中擴(kuò)增出α毒素保護(hù)性抗原基因，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，用內(nèi)切酶NcoⅠ和BamHⅠ酶切聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，回收α毒素基因；再用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，設(shè)計(jì)2條β毒素聚合酶鏈反應(yīng)引物，β1為5｀-CGCGGATCCCCCAATGATATAGGTAAAACT-3｀,β2為5｀-CCGGCGGGCCGCCGAATTCTTAATAGCTGT-3｀，其中β1引物中含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)，β2引物中含有NotⅠ酶切位點(diǎn)，從C型魏氏梭菌染色體中擴(kuò)增出β毒素保護(hù)性抗原基因，用內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物，回收β毒素基因；二者的聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物分別用NcoⅠ、BamHⅠ和BamHⅠ、NotⅠ酶切，然后用聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物回收試劑盒回收α和β毒素基因；聚合酶鏈反應(yīng)體積為100μL，其中10μL10倍反應(yīng)緩沖液，10ng染色體DNA,200μmol/L dNTPs，引物各250ng,3U TaqDNA聚合酶，按94℃60s→42℃60s→72℃120s的溫度轉(zhuǎn)換模式，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；通過(guò)連接反應(yīng)，將α毒素保護(hù)性抗原基因融合在β毒素基因的上游，構(gòu)建了含有α-β毒素融合基因；再將α-β毒素融合基因插入到表達(dá)載體pET-28b的NcoⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pXCPAB2，通過(guò)氯化鈣轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pXCPAB2轉(zhuǎn)入到受體菌BL21(DE3)中；構(gòu)建了含α-β毒素融合基因表達(dá)載體的基因工程菌株BL21(DE3)(pXCPAB2)；用堿性裂解法從構(gòu)建的基因工程菌株中提取質(zhì)粒，然后用內(nèi)切酶酶切鑒定，用NcoⅠ和BamHⅠ可切下α毒素基因，用BamHⅠ和NotⅠ可切下β毒素基因；經(jīng)DNA序列分析證實(shí)構(gòu)建的α-β毒素融合基因序列正確，閱讀框架正確。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述構(gòu)建方法獲得的α-β毒素雙價(jià)基因工程菌苗的生產(chǎn)工藝，其特征是(1)把凍干菌株BL21(DE3)(pXCPAB2)用LB培養(yǎng)基制成一級(jí)種子、二級(jí)種子和生產(chǎn)用三級(jí)種子；(2)將三級(jí)種子按2-5％的量接種于發(fā)酵罐中，進(jìn)行通氣培養(yǎng)，通氣量3-4V/min,50％滅菌葡萄糖調(diào)節(jié)pH值，調(diào)節(jié)范圍7.2-7.8,36-38℃培養(yǎng)18-24h；在培養(yǎng)過(guò)程中可以添加適量的誘導(dǎo)劑(IPTG)0.1mmol/l；(3)收獲的菌液添加滅活劑10％甲醛溶液至終濃度0.4-0.6％,37℃滅活48h；(4)按50億活菌苗/ml比例加入氫氧化鋁膠和菌液，并按終濃度0.01％添加1-2％硫柳汞溶液，磨制2分鐘，裝入大瓶子，沉淀后棄上清或添加生理鹽水，然后裝入分裝筒，混勻，調(diào)pH6.8-7.2，制成含20％氫氧化鋁膠的佐劑疫苗，菌苗成品含BL21(DE3)(pXCPAB2)菌株數(shù)為50億個(gè)/ml；菌苗成品的性狀菌苗靜置后分層，上層為棕黃色澄明液體，下層為灰白色沉淀，振搖后呈均勻混濁液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征是基因工程菌株BL21(DE3)(pXCPAB2)，可用0.1mmo1/1異丙基-硫代-D-半乳糖苷作為本基因工程菌株的誘導(dǎo)劑，該抗原蛋白可占菌體總蛋白的10％以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其特征是生產(chǎn)培養(yǎng)基的配方為蒸溜水1000ml，胰蛋白胨8g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，用2mol/l氫氧化鈉調(diào)pH7.6-7.8，加入適量消泡劑，116℃滅菌40分鐘，保存?zhèn)溆谩?br> 全文摘要
仔豬紅痢魏氏梭菌α－β毒素雙價(jià)基因工程菌苗及制備方法,其特征是采用聚合酶鏈反應(yīng),從魏氏梭菌染色體中擴(kuò)增出α和β毒素保護(hù)性抗原基因,通過(guò)分離、純化、內(nèi)切酶酶切,獲得α毒素基因和β毒素基因,構(gòu)建了含α－β毒素融合基因表達(dá)載體的基因工程菌株BL21(DE3)(pXCPAB2),該菌株表達(dá)的有效抗原成份存在于菌體內(nèi)部,能起到緩慢連續(xù)釋放的作用,克服了傳統(tǒng)滅活苗的缺點(diǎn),從而達(dá)到更有效地預(yù)防仔豬紅痢的目的。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1311037SQ0110615
公開日2001年9月5日 申請(qǐng)日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月15日
發(fā)明者許崇波, 衛(wèi)廣森 申請(qǐng)人:衛(wèi)廣森, 許崇波