專利名稱：適用于豬品種分類的豬微衛(wèi)星dna標記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于豬的分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬的微衛(wèi)星DNA標記技術(shù)領(lǐng)域。
微衛(wèi)星DNA是一類以1-6個堿基為核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)順序。其中尤以二核苷酸重復(fù)單位構(gòu)成的為最多。微衛(wèi)星DNA的主要特點是(1)數(shù)目多。據(jù)估計在真核生物基因組中每6Kb就會有1個微衛(wèi)星位點(Beckmann等，《Gennomics》，1992，12卷，281-288頁)，豬基因組中僅ACTG重復(fù)的微衛(wèi)星就有65000-100000個；(2)分布廣且均勻。微衛(wèi)星DNA在基因組中是均勻分布的。Winter等(1992)的研究表明，除著絲粒及端粒的少數(shù)區(qū)域外，染色體的其他區(qū)域均廣泛分布有微衛(wèi)星位點；(3)多態(tài)信息含量豐富。即各位點等位基因一般較多；(4)易于進行自動化和半自動化檢測。因此，微衛(wèi)星DNA標記是目前用于畜禽QTL定位，遺傳多樣性評估的首選分子標記。如豬的遺傳圖譜的絕大多數(shù)標記為微衛(wèi)星標記，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和國際動物遺傳研究會推薦的用于國際上豬遺傳多樣性評估的27個標記是微衛(wèi)星標記，第一個用于家禽育種的分子標記專利也是微衛(wèi)星標記(柳松，《國外畜牧獸醫(yī)科技》1996，2期，24頁)。
豬的微衛(wèi)星DNA研究起步于90年代初期，但進展十分迅速。至今在豬基因組中已找到的近2000個標記中，絕大多數(shù)為微衛(wèi)星標記，與此同時，豬微衛(wèi)星DNA在QTL定位和遺傳多樣性評估中的應(yīng)用研究也迅速鋪開，有關(guān)豬微衛(wèi)星標記的專利爭奪正逐步展開。但是，我國豬微衛(wèi)星的研究仍十分有限，僅極少數(shù)實驗室開始了有關(guān)工作，且研究工作很不系統(tǒng)。鑒于豬微衛(wèi)星數(shù)目多，還有大量的未被發(fā)現(xiàn)，且它們具有重要的理論和應(yīng)用價值，特別是我國大量的優(yōu)良地方豬種中還可能存在特有的微衛(wèi)星位點和大量的微衛(wèi)星等位基因。因此，在我國開展豬的微衛(wèi)星的分離克隆、鑒定和應(yīng)用研究，開發(fā)具有我國知識產(chǎn)權(quán)的微衛(wèi)星標記顯得十分迫切和必要。
本發(fā)明的目的在于分離、鑒定新的適用于豬品種分類的豬的微衛(wèi)星標記，建立豬的微衛(wèi)星DNA的分離、鑒定及篩選適用于豬品種分類的分子標記的方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)一種適用于豬品種分類的豬的微衛(wèi)星標記方法，其步驟包括，構(gòu)建豬的基因組文庫，豬微衛(wèi)星文庫篩選，微衛(wèi)星順序測定，微衛(wèi)星克隆和豬的品種分類，其特征在于，所述的三個微衛(wèi)星標記的編號分別為HUA01，HUA02，HUA03，其DNA的順序分別是HUA01TAATGTGGAGGAGTCAGTCTCTGAAAATTTCTTCCAGTGCATAACTATAAGTACCTGGGACTTGTAGTATGCTTCATAAATGAACAGGCTTACCTCGATTTCATATTATTTTAAATGAATGTCCGTCTGCATGAGTCATACTCTGTGTATGTGTGTGTATGTGTGTGTGGTGGGTTTCTGTTCAGTTGTTAAGTGCAGGATATTTAGTCGGTGGAAAAGTTGCTGGTAATGGTCAAAAGGGTACCCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGGTCATAGCTGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCGCTCACAATTCACACAACATACGAGCCCGGAGATAAAGTGTAAAGCCTGGGTGCCTAATGGGTAGCTAACTCACATTAATTGCGTGCGTTCACTGCCCGTTTCCAGTCGGGAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCACGTGCGGGGAGAGGCGGTTTCGTATTGGCGCCATGGTGGTTTTCTTTTACCATTTGCGGGCACACTGATTTCCTTACCGCTGGCCTTGGTGTTCAGAAGTGTCCCGTGGTTTCCCACAGTTGAATCCTTTTTTGGGTCCGAACGGAHAU02GAGGATCCCCCTGGTGATACCCAGGTACCCCTGGTTCCTCAGGTCTGTGGGGTACAGGAAGTTGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAACTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGAGAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCATATCAGTTGCTATTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATTTTCCCTTGTCTCTCTGGACCTGTAATATATTTCTAGCGCAGGATTCTTACTCAGGTHAU03AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCTGGTGATGCCCAGGTCCCCCTGGATCCCCAGGACTGTGGGGTACAGGAAGTGGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAAGCTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGACAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTTGTGTGTGTGTGTTGTTGTGTAATTTCCCCTGGTCTCCCTGGAACCTGTTATATATTCCTACGCCAGAATCCTACTCCAGGTTAATTTGTTCTTGAATAAATTTTGGGCCACCCCTTGAATCCTTCAAAATTATGTTCCCTTAGGGGTT根據(jù)上述的三個豬微衛(wèi)星標記HUA01，HUA02，HUA03設(shè)計了三個位點的引物，該引物的順序為PL-015’-GAATGTCCGTCTGCATGAGTC-3’PR-015’-TCACACAGGAACAGCTATGACC-3’PL-025’-CCACCTTCCTAGCATATCAGTTG-3’PR-025’-CCTGAGTAAGAATCCTGCGCTAG-3’PL-035’-CCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTT-3’PR-035’-GGAGTAGGATTCTGGCGTAGGAAT-3’本發(fā)明的具體步驟是(1)豬基因組文庫的構(gòu)建實驗所用血樣均采自江蘇國營常熟畜禽良種場的二花臉豬(太湖豬的一個類群)，先后構(gòu)建了兩個適用于微衛(wèi)星篩選的豬部分基因組文庫。即豬基因組部分小插入片段M13mp18文庫和pBluescriptKS+文庫。
(2)(2)豬微衛(wèi)星的文庫篩選將鋪有重組噬菌體的轉(zhuǎn)染平板真空轉(zhuǎn)膜至尼龍膜上(M13mp18文庫篩選)或重組菌在尼龍膜上原位裂解(pBluscriptKS+文庫篩選)，采用[r-32p]ATP標記寡聚核苷酸探針(TG)10的5’末端，與制備好的尼龍膜在50℃雜交過夜。放射自顯影后，X光片燈上觀察記錄結(jié)果。
(3)豬微衛(wèi)星的順序測定克隆的微衛(wèi)星的順序測定，確定了編號為HUA01，HUA02，HUA03豬微衛(wèi)星標記，其DNA順序如上所述。
(4)新克隆微衛(wèi)星的特性分析1)根據(jù)順序測定結(jié)果設(shè)計引物，引物順序如上所論述。2)利用本室構(gòu)建的豬參考家系信息，通過PCR擴增檢測豬上下代個體的基因型，判斷等位基因的遺傳方式。3)用染色體上的熒光原位雜交技術(shù)(FISH)和雜種細胞克隆板對新克隆的位點進行染色體定位。(1)將新克隆的微衛(wèi)星用于豬的品種分類1)血樣采集。采集了六個豬品種的共85個不相關(guān)個體的血樣，血樣分別采自湖北省的黃陂外貿(mào)種豬場(杜洛克)，湖北省農(nóng)科院綜合試驗場種豬場(大白)，湖北省農(nóng)科院畜牧所豬場(湖北白、大白)，湖北省通城畜禽良種場(通城)，河南省汝南外貿(mào)種豬場(長白、大白、杜洛克)，河南省唐河外貿(mào)種豬場(杜洛克)，河南省農(nóng)科院豬場(長白)，江蘇省國營常熟畜禽良種場(二花臉、長白，江蘇省無錫市錫山種豬場(二花臉)，宜興種豬場(二花臉)，江陰畜禽良種場(二花臉)及南京農(nóng)大江浦畜牧實驗站豬場(二花臉)。(2)基因頻率統(tǒng)計及多態(tài)信息含量(PIC)計算。(3)遺傳距離計算和類平均法聚類分析UPGMA。
實施例1鑒定了3個適用于豬品種分類的新微衛(wèi)星標記HAU01、HAU02、HAU03，構(gòu)建了適用于微衛(wèi)星篩選的豬部分基因組文庫。即豬基因組部分小插入片段，采用[r-32p]ATP標記寡聚核苷酸探針(TG)10，采用放射自顯影從中篩選豬的微衛(wèi)星DNA。并通過順序測定，基因數(shù)據(jù)庫中比較，結(jié)合在家系中遺傳規(guī)律研究和基因定位對其進行鑒定。這三個微衛(wèi)星的DNA順序分別為HAU01TAATGTGGAGGAGTCAGTCTCTGAAAATTTCTTCCAGTGCATAACTATAAGTACCTGGGACTTGTAGTATGCTTCATAAATGAACAGGCTTACCTCGATTTCATATTATTTTAAATGAATGTCCGTCTGCATGAGTCATACTCTGTGTATGTGTGTGTATGTGTGTGTGGTGGGTTTCTGTTCAGTTGTTAAGTGCAGGATATTTAGTCGGTGGAAAAGTTGCTGGTAATGGTCAAAAGGGTACCCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGGTCATAGCTGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCGCTCACAATTCACACAACATACGAGCCCGGAGATAAAGTGTAAAGCCTGGGTGCCTAATGGGTAGCTAACTCACATTAATTGCGTGCGTTCACTGCCCGTTTCCAGTCGGGAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCACGTGCGGGGAGAGGCGGTTTCGTATTGGCGCCATGGTGGTTTTCTTTTACCATTTGCGGGCACACTGATTTCCTTACCGCTGGCCTTGGTGTTCAGAAGTGTCCCGTGGTTTCCCACAGTTGAATCCTTTTTTGGGTCCGAACGGAHAU02GAGGATCCCCCTGGTGATACCCAGGTACCCCTGGTTCCTCAGGTCTGTGGGGTACAGGAAGTTGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAACTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGAGAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCATATCAGTTGCTATTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATTTTCCCTTGTCTCTCTGGACCTGTAATATATTTCTAGCGCAGGATTCTTACTCAGGTHAU03AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCTGGTGATGCCCAGGTCCCCCTGGATCCCCAGGACTGTGGGGTACAGGAAGTGGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAAGCTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGACAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTTGTGTGTGTGTGTTGTTGTGTAATTTCCCCTGGTCTCCCTGGAACCTGTTATATATTCCTACGCCAGAATCCTACTCCAGGTTAATTTGTTCTTGAATAAATTTTGGGCCACCCCTTGAATCCTTCAAAATTATGTTCCCTTAGGGGTT在家系中遺傳規(guī)律研實施例2建立了一套切實可行的從豬基因組中克隆微衛(wèi)星標記的方法。采用兩種便于直接分離模板測序的載體M13mp18噬菌體和pBluescriptKS+噬菌體作為載體構(gòu)建了兩種適用于微衛(wèi)星篩選的豬基因組部分小插入片段(250-600bp)文庫，通過篩選，共得到了23個含(TG)n微衛(wèi)星的陽性克隆。
實施例3將上述微衛(wèi)星標記用于六個豬品種(其中包括中國地方豬種、歐美商用豬種和雜交育成豬種)的品種分類，確定了3個適用豬品種分類的微衛(wèi)星標記HAU01、HAU02、HAU03。六個豬品種85個血統(tǒng)不相關(guān)個體的群體中三個新克隆位點HAU01、HAU02、HAU03的基因頻率、多態(tài)信息含量及相互間的遺傳距離和聚類分析結(jié)果顯示，研究克隆的這三個微衛(wèi)星標記能很好地用于豬遺傳關(guān)系和遺傳多樣性評估。
本發(fā)明的積極效果(1)分離克隆并鑒定了三個豬的微衛(wèi)星標記，經(jīng)在國際基因數(shù)據(jù)庫中檢索，證明為新的微衛(wèi)星DNA標記。
(2)經(jīng)將上述微衛(wèi)星標記用于豬品種的群體遺傳變異檢測，證明這三個微衛(wèi)星標記適用于豬的品種分類和遺傳多樣性評估，在六個豬品種85個血統(tǒng)不相關(guān)個體的群體中三個新克隆位點的基因頻率、多態(tài)信息含量及相互間的遺傳距離和聚類分析結(jié)果如表1，表2，表3和表4所示。
(3)實驗方法有重要的改進一是采用了一種特殊的平端連接方式，利用限制酶阻止載體自連，使平端連接時重組率低的問題得到改善，外源片段與載體間的重組率達60％左右，明顯高于對載體作去磷酸化處理及不處理載體進行的連接(分別為36.96％和10.1％)，且操作簡便，成本低；二是在重組載體轉(zhuǎn)染其宿主菌的條件確定時引入試驗設(shè)計的思想，通過正交設(shè)計較快、較準確的得到了較高轉(zhuǎn)染效率的轉(zhuǎn)染因子組合；c)嘗試使用了多重PCR檢測豬的微衛(wèi)星，提高了檢測效率，降低了檢測成本。
本發(fā)明的實施效果參見表1-表4和


圖1所示表1.HAU01位點的等位基因頻率及多態(tài)信息含量品種 個體 等位基因大小(bp)PIC數(shù) 167171173長白 12 0.417 0.500 0.083 0.476大白 14 0.536 0.393 0.071 0.460杜洛克16 0.344 0.438 0.219 0.567湖北白80.313 0.625 0.063 0.427二花臉19 0.316 0.105 0.579 0.477通城 16 0.375 0.125 0.500 0.511表2.HAU02位點的等位基因頻率及多態(tài)信息含量品種個體 等位基因大小(bp) PIC數(shù) 106108112114長白 12 0.125 0.667 0.167 0.042 0.469大白 14 0.107 0.429 0.357 0.107 0.604杜洛克 16 0.250 0.250 0.406 0.094 0.647湖北白 8 0.063 0.500 0.313 0.125 0.570二花臉 19 0.000 0.500 0.395 0.105 0.496通城 16 0.000 0.625 0.250 0.125 0.468表3.HAU03位點的等位基因頻率及多態(tài)信息含量品種個體等位基因大小(bp)PIC數(shù) 101 103長白 12 0.417 0.583 0.368大白 14 0.321 0.679 0.341杜洛克 16 0.438 0.563 0.370湖北白 8 0.375 0.625 0.359二花臉 19 0.684 0.316 0.339通城 16 0.719 0.281 0.363表4六品種豬相之間的遺傳距離測定
附圖及其說明
圖1，是本發(fā)明涉及的六品種豬的UPGMA聚類圖由上述附圖及表1-4可以看出，由本發(fā)明的三個微衛(wèi)星信息所得到的遺傳距離和聚類分析結(jié)果均能很好地反映這六品種豬的實際狀況。這六個豬品種中，長白豬和大白豬為歐洲豬種，湖北白豬為我國自主育成的新品種，其中含有長白豬的血緣。杜洛克豬為美國豬種，二花臉豬和通城豬為中國地方豬種。由
圖1可見，長白豬與湖北白豬首先聚在一起，再與大白豬聚在一起，然后與杜洛克豬相聚。而二花臉豬與通城豬首先聚在一起，再與上述四品種豬相聚，形成明顯的二個分枝。由此可見，本發(fā)明克隆的這三個微衛(wèi)星標記能很好地用于豬的品種分類。
權(quán)利要求
1.一種適用于豬品種分類的豬微衛(wèi)星標記方法，其步驟包括，構(gòu)建豬的基因組文庫，豬微衛(wèi)星文庫篩選，微衛(wèi)星順序測定，微衛(wèi)星克隆和豬的品種分類，其特征在于，所述的三個微衛(wèi)星標記的編號分別為HUA01，HUA02，HUA03，其DNA的順序分別是HUA01TAATGTGGAGGAGTCAGTCTCTGAAAATTTCTTCCAGTGCATAACTATAAGTACCTGGGACTTGTAGTATGCTTCATAAATGAACAGGCTTACCTCGATTTCATATTATTTTAAATGAATGTCCGTCTGCATGAGTCATACTCTGTGTATGTGTGTGTATGTGTGTGTGGTGGGTTTCTGTTCAGTTGTTAAGTGCAGGATATTTAGTCGGTGGAAAAGTTGCTGGTAATGGTCAAAAGGGTACCCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGGTCATAGCTGTTCCTGTGTGAAATTGTTATCGCTCACAATTCACACAACATACGAGCCCGGAGATAAAGTGTAAAGCCTGGGTGCCTAATGGGTAGCTAACTCACATTAATTGCGTGCGTTCACTGCCCGTTTCCAGTCGGGAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCACGTGCGGGGAGAGGCGGTTTCGTATTGGCGCCATGGTGGTTTTCTTTTACCATTTGCGGGCACACTGATTTCCTTACCGCTGGCCTTGGTGTTCAGAAGTGTCCCGTGGTTTCCCACAGTTGAATCCTTTTTTGGGTCCGAACGGAHAU02GAGGATCCCCCTGGTGATACCCAGGTACCCCTGGTTCCTCAGGTCTGTGGGGTACAGGAAGTTGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAACTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGAGAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCATATCAGTTGCTATTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATTTTCCCTTGTCTCTCTGGACCTGTAATATATTTCTAGCGCAGGATTCTTACTCAGGTHAU03AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCCTGGTGATGCCCAGGTCCCCCTGGATCCCCAGGACTGTGGGGTACAGGAAGTGGCTGGGGCTCTGGAGAGTAGAGGGGGCACAACCCAGAAGCTGGACTGATTTCTGCGAGAATTATGTCCTAGACAATTCATAAGAACAGACAACCCCAATGGCAGTTGCTTCTCCATTTACGTGCCCCCACCTTCCTAGCCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTTGTGTGTGTGTGTTGTTGTGTAATTTCCCCTGGTCTCCCTGGAACCTGTTATATATTCCTACGCCAGAATCCTACTCCAGGTTAATTTGTTCTTGAATAAATTTTGGGCCACCCCTTGAATCCTTCAAAATTATGTTCCCTTAGGGGTT
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種適用于豬品種分類的豬微衛(wèi)星標記方法，其特征在于HUA01，HUA02，HUA03三個位點的引物順序為PL-015’-GAATGTCCGTCTGCATGAGTC-3’PR-015’-TCACACAGGAACAGCTATGACC-3’PL-025’-CCACCTTCCTAGCATATCAGTTG-3 ’PR-025’-CCTGAGTAAGAATCCTGCGCTAG-3 ’PL-035’-CCTATCAGTGGCTATGGTGTAGTT-3 ’PR-035’-GGAGTAGGATTCTGGCGTAGGAAT-全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及豬的微衛(wèi)星DNA標記技術(shù)。一種適用于豬品種分類的豬微衛(wèi)星標記方法,其步驟包括,構(gòu)建豬的基因組文庫,微衛(wèi)星文庫篩選,微衛(wèi)星順序測定,微衛(wèi)星克隆和豬的品種分類。本發(fā)明的特征是,構(gòu)建部分小插入片段基因組文庫,分離鑒定豬新微衛(wèi)星標記,篩選其中適用于豬品種分類的豬微衛(wèi)星標記HAU01、HAU02、HAU03,確定了該三個微衛(wèi)星標記DNA順序,設(shè)計了三個位點的引物。本發(fā)明為豬的品種分類、親緣鑒定和標記輔助育種提供新的分子標記。
文檔編號C12N15/12GK1370834SQ0110647
公開日2002年9月25日 申請日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月15日
發(fā)明者李奎, 彭中鎮(zhèn), 龔炎長, 趙書紅, 劉榜, 余梅, 熊統(tǒng)安 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)