專利名稱：家蠶基因工程植酸酶工業(yè)化感染控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因物質(zhì)，尤其是畜禽用轉(zhuǎn)基因酶制劑制造領(lǐng)域。
中國專利CN99103564公開了一種應(yīng)用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)植酸酶的基因工程方法，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，并使其處于多角體蛋白基因啟動(dòng)子的控制下，再將此重組質(zhì)粒與野生型BmNPV-DNA共轉(zhuǎn)染于家蠶細(xì)胞，通過體內(nèi)同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)植酸酶基因，并將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內(nèi)繁殖產(chǎn)生目標(biāo)物植酸酶蛋白。但如何將家蠶基因工程植酸酶生產(chǎn)在較大的工業(yè)化程度上實(shí)現(xiàn)，或者更具體地說在畜禽用轉(zhuǎn)基因酶制劑工業(yè)中高產(chǎn)量、低成本的生產(chǎn)出具有商業(yè)競爭力的產(chǎn)品仍是需要解決的問題。
本發(fā)明的目的是，研究一種家蠶基因工程植酸酶工業(yè)化感染控制方法，使之能改善現(xiàn)有技術(shù)的不足，使蠶體取得較高且穩(wěn)定的目標(biāo)植酸酶表達(dá)量。為低成本、批量化生產(chǎn)畜禽飼料用基因工程植酸酶商品化制劑創(chuàng)立有利條件。
本發(fā)明的目的使通過如下的方法實(shí)現(xiàn)的。
家蠶基因工程植酸酶工業(yè)化感染控制方法，應(yīng)用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)植酸酶，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，并使其處于多角體蛋白基因啟動(dòng)子的控制下，再將此重組質(zhì)粒與野生型BmNPV-DNA共轉(zhuǎn)染于家蠶細(xì)胞，通過體內(nèi)同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)植酸酶基因，并將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內(nèi)繁殖產(chǎn)生目標(biāo)物植酸酶蛋白，以以下的手段實(shí)現(xiàn)病毒的工業(yè)化感染及生長控制，A)擴(kuò)增的重組BmNPV滴度標(biāo)定達(dá)106PFU；注射接種深度為皮下2mm；B)蛹體用乙醇浸泡，蠶幼蟲用70％乙醇棉球體表消毒；接種后蠶體噴灑氯霉素；C)接種后嚴(yán)格控制溫度在25±1℃；一般收蠶時(shí)間病蠶接種后4-5天；病蛹接種后5-6天。
采用本發(fā)明的方法，與常規(guī)方法相比，在較小的生產(chǎn)成本下可保證較大批量的蛹(蠶)獲得平均較高的酶活量，從而使基因工程植酸酶制劑能在較大的工業(yè)化程度上實(shí)現(xiàn)商品化。
權(quán)利要求
1.家蠶基因工程植酸酶工業(yè)化感染控制方法，應(yīng)用重組BmNPV載體-家蠶宿主表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)植酸酶，用植酸酶基因替換家蠶核型多角體病毒基因組中的多角體蛋白基因，并使其處于多角體蛋白基因啟動(dòng)子的控制下，再將此重組質(zhì)粒與野生型BmNPV-DNA共轉(zhuǎn)染于家蠶細(xì)胞，通過體內(nèi)同源重組得到帶有外源植酸酶基因的重組病毒，再利用多角體蛋白基因的啟動(dòng)子啟動(dòng)植酸酶基因，并將此重組家蠶核型多角體感染家蠶，在蠶體內(nèi)繁殖產(chǎn)生目標(biāo)物植酸酶蛋白，其特征在于，以以下的手段實(shí)現(xiàn)病毒的工業(yè)化感染及生長控制，A)擴(kuò)增的重組BmNPV滴度標(biāo)定達(dá)106PFU；注射接種深度為皮下2mm；B)蛹體用乙醇浸泡，蠶幼蟲用70％乙醇棉球體表消毒；接種后蠶體噴灑氯霉素；C)接種后嚴(yán)格控制溫度在25±1℃；一般收蠶時(shí)間病蠶接種后4-5天；病蛹接種后5-6天為宜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶工業(yè)化感染控制方法，其特征在于，所述擴(kuò)增的重組BmNPV滴度預(yù)實(shí)驗(yàn)表達(dá)量蛹≥300U/克，蠶幼蟲≥200U/克。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶工業(yè)化感染控制方法，其特征在于，所述接種注射量蛹2-3μl，蠶幼蟲3-5μl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述之家蠶基因工程植酸酶工業(yè)化感染控制方法，其特征在于，蛹體用70％的乙醇浸泡30秒；蠶幼蟲用70％乙醇棉球體表消毒，氯霉素溶液濃度為600-800U/ml，每48小時(shí)噴灑一次。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種家蠶基因工程植酸酶工業(yè)化感染控制方法,應(yīng)用重組BMNPV載體－家蠶宿主表達(dá)系統(tǒng),在蠶體內(nèi)繁殖產(chǎn)生目標(biāo)物植酸酶蛋白,以以下的手段實(shí)現(xiàn)病毒的工業(yè)化感染及生長控制:A)擴(kuò)增的重組BmNPV滴度標(biāo)定達(dá)10
文檔編號(hào)C12N15/866GK1384191SQ0110739
公開日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2001年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月30日
發(fā)明者秦儉, 陳英, 楊忠生 申請(qǐng)人:四川華神集團(tuán)股份有限公司