專利名稱:脂肪酶基因序列及其在酵母中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種能在酵母(尤其是在畢赤巴斯德酵母)中表達(dá)的基因序列和可供其克隆的載體及可供其表達(dá)的酵母菌,以及酵母菌的篩選方法和從酵母基因工程菌中得到的基因工程脂肪酶。
脂肪酶(甘油酯水解酶,Lipase)是能夠水解非水溶性酯類物質(zhì),如長(zhǎng)鏈三甘油酯triglycerides(脂肪),的酯酶。它在水脂介面上特異性地將脂肪水解為脂肪酸和甘油,并在非水介質(zhì)中催化逆反應(yīng)。脂肪酶水解發(fā)生部位為油脂的酯鍵,其催化反應(yīng)如下 上述反應(yīng)還可以進(jìn)行到單酸甘油酯,直至水解成甘油。(Ghosh & Saxena,79(Pt 2)119-571996;Sober & Palmeros,Crit Rev Microbiol,20(2)95-105 1994)。脂肪酶在非水介質(zhì)中還能催化酯化反應(yīng)或改變酯鍵,在酯化反應(yīng)和轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中具有很高的專一性和相互選擇性。脂肪酶廣泛存在于動(dòng)植物各種器官組織和微生物中。微生物脂肪酶種類很多,它們的生化特性和底物特異性與產(chǎn)生菌有關(guān)。對(duì)脂肪酶結(jié)構(gòu)功能的研究主要集中于皺落假絲酵母Candida rugosa(又稱柱狀假絲酵母Candida cylindracea)。Candida rugosa脂肪酶是一種在脂肪酸的誘導(dǎo)下分泌產(chǎn)生的,由幾種具有不同催化活性的異構(gòu)酶組成的胞外脂肪酶。脂肪酶基因家族編碼序列組成高度同源而底物作用區(qū)域結(jié)構(gòu)各異的多種酶蛋白。Lip1基因所表達(dá)的酶蛋白是其中主要的一種。通過點(diǎn)突變合成的該基因在釀酒酵母和畢赤酵母中都得到了表達(dá),在畢赤酵母中經(jīng)過208小時(shí)發(fā)酵的表達(dá)量為150U/mL。(Lotti & Monticelli,Chem Phys Lipids,93(1-2)143-8 1998 Jun;Grochulski & Bouthillier,Biochemistry,33(12)3494-500 1994 Mar 29;Norin & Haeffner,Protein Sci,3(9)1493-503 1994 Sep;Brocca & Schmidt-Dannert,Protein Sci,7(6)1415-22 1998 Jun;Mileto & Brocca,Chem Phys Lipids,93(1-2)47-55 1998 Jun;Longhi &Fusetti,Biochim Biophys Acta,1131(2)227-32 1992 Jun 15)脂肪酶具有多種催化活性和寬廣的底物作用特異性,在有機(jī)物中穩(wěn)定性好,這些特性使它在有機(jī)工業(yè)系統(tǒng)中,如石油工業(yè)、食品加工、造紙業(yè)、新藥開發(fā)、生物活化劑、洗滌劑、脫脂、增香、飼料添加劑、臨床醫(yī)學(xué)、皮革、皮毛、紡織和明膠工業(yè)中的去脂等,具有非常廣泛的應(yīng)用。目前,產(chǎn)自德氏根酶、柱狀假絲酵母、曲霉、毛酶、粘質(zhì)色桿菌等的脂肪酶制劑已供應(yīng)市場(chǎng)。其中來(lái)自皺落假絲酵母Candida rugosa的脂肪酶(CRL)倍受市場(chǎng)青睞。(Lotti & Tramontano,Protein Eng,7(4)531-51994 Apr;Benjamin & Pandey,Yeast,14(12)1069-87 1998 Sep 15;Vaysse & Dubreucq,JBiotechnol,53(1)41-6 1997 Feb 28;Gray & Narang,Enzyme Microb Technol,12(10)800-71990 Oct;Holmquist,Chem Phys Lipids,93(1-2)57-66 1998 Jun。)
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能在酵母中有效表達(dá)的脂肪酶基因序列。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供供上述基因序列克隆的載體。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供能將脂肪酶分泌表達(dá)到酵母細(xì)胞外的上述載體之重組質(zhì)粒。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供具有上述基因序列的酵母菌。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供上述酵母基因工程菌的篩選方法。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種能在酵母中有效表達(dá)的脂肪酶基因序列,其特征在于根據(jù)脂肪酶氨基酸序列,設(shè)計(jì)出具有在酵母中使用頻率較高的密碼子的基因序列,在該基因序列的5’端連接與目的酵母相配合的基因片段,在3’端連接限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。為了從Lip1(Candida rugosa.脂肪酶的一種)氨基酸序列(見
圖1)出發(fā),設(shè)計(jì)出能轉(zhuǎn)入酵母中表達(dá)的DNA序列,必須采用在目的酵母中使用頻率較高的密碼子設(shè)計(jì)與脂肪酶的氨基酸相對(duì)應(yīng)的DNA序列。在此基礎(chǔ)上,還必須在其5’端連接一段與目的酵母相配合的基因片段,如CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT;為了能將序列克隆到相應(yīng)的載體上,必須在其3’端連接限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),這樣才能有效地,甚至高效地實(shí)現(xiàn)上述基因在酵母中的表達(dá)。
本發(fā)明的上述方案可作如下的完善①根據(jù)在畢赤酵母中的密碼子偏愛性設(shè)計(jì)與Lip1氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的DNA序列。②為了能在畢赤巴斯德酵母中實(shí)現(xiàn)表達(dá),本發(fā)明可以將基因片段GAATTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT連接在5’端。③在該序列的3’端連接限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)TCTAGA,是由于基因中沒有該位點(diǎn),在克隆時(shí)不會(huì)造成誤切。④把該序列的第144位和第1461位設(shè)計(jì)為C,避免BamHI位點(diǎn)。本發(fā)明經(jīng)以上處理之后可以形成下面具體的基因序列(Tsp)CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GCT CCA ACT GCT ACT TTG GCT AACGGT GAT ACT ATT ACT GGT TTG AAC GCT ATT ATT AAC GAA GCT TTT TTG GGTATT CCA TTT GCT GAA CCA CCA GTT GGT AAC TTG AGA TTT AAG GAC CCA GTTCCA TAC TCT GGT TCT TTG GAT GGT CAA AAG TTT ACT TCT TAC GGT CCA TCTTGT ATG CAA CAA AAC CCA GAA GGT ACT TAC GAA GAA AAC TTG CCA AAG GCTGCT TTG GAT TTG GTT ATG CAA TCT AAG GTT TTT GAA GCT GTT TCT CCA TCTTCT GAA GAT TGT TTG ACT ATT AAC GTT GTT AGA CCA CCA GGT ACT AAG GCTGGT GCT AAC TTG CCA GTT ATG TTG TGG ATT TTT GGT GGT GGT TTT GAA GTTGGT GGT ACT TCT ACT TTT CCA CCA GCT CAA ATG ATT ACT AAG TCT ATT GCTATG GGT AAG CCA ATT ATT CAT GTT TCT GTT AAC TAC AGA GTT TCT TCT TGGGGT TTT TTG GCT GGT GAT GAA ATT AAG GCT GAA GGT TCT GCT AAC GCT GGTTTG AAG GAT CAA AGA TTG GGT ATG CAA TGG GTT GCT GAT AAC ATT GCT GCTTTT GGT GGT GAT CCA ACT AAG GTT ACT ATT TTT GGT GAA TCT GCT GGT TCTATG TCT GTT ATG TGT CAT ATT TTG TGG AAC GAT GGT GAT AAC ACT TAC AAGGGT AAG CCA TTG TTT AGA GCT GGT ATT ATG CAA TCT GGT GCT ATG GTT CCATCT GAT GCT GTT GAT GGT ATT TAC GGT AAC GAA ATT TTT GAT TTG TTG GCT TCTAAC GCT GGT TGT GGT TCT GCT TCT GAT AAG TTG GCT TGT TTG AGA GGT GTTTCT TCT GAT ACT TTG GAA GAT GCT ACT AAC AAC ACT CCA GGT TTT TTG GCTTAC TCT TCT TTG AGA TTG TCT TAC TTG CCA AGA CCA GAT GGT GTT AAC ATTACT GAT GAT ATG TAC GCT TTG GTT AGA GAA GGT AAG TAC GCT AAC ATT CCAGTT ATT ATT GGT GAT CAA AAC GAT GAA GGT ACT TTT TTT GGT ACT TCT TCTTTG AAC GTT ACT ACT GAT GCT CAA GCT AGA GAA TAC TTT AAG CAA TCT TTTGTT CAT GCT TCT GAT GCT GAA ATT GAT ACT TTG ATG ACT GCT TAC CCA GGTGAT ATT ACT CAA GGT TCT CCA TTT GAT ACT GGT ATT TTG AAC GCT TTG ACTCCA CAA TTT AAG AGA ATT TCT GCT GTT TTG GGT GAT TTG GGT TTT ACT TTGGCT AGA AGA TAC TTT TTG AAC CAT TAC ACT GGT GGT ACT AAG TAC TCT TTTTTG TCT AAG CAA TTG TCT GGT TTG CCA GTT TTG GGT ACT TTT CAT TCT AACGAT ATT GTT TTT CAA GAT TAC TTG TTG GGT TCT GGT TCT TTG ATT TAC AAC AACGCT TTT ATT GCT TTT GCT ACT GAT TTG GAC CCA AAC ACT GCT GGT TTG TTGGTT AAG TGG CCA GAA TAC ACT TCT TCT TCT CAA TCT GGT AAC AAC TTG ATGATG ATT AAC GCT TTG GGT TTG TAC ACT GGT AAG GAT AAC TTT AGA ACT GCTGGT TAC GAT GCT TTG TTT TCT AAC CCA CCA TCT TTT TTT GTT TAATCTAGA本發(fā)明所設(shè)計(jì)的脂肪酶基因序列可以通過PCR合成的方法來(lái)獲(見圖2);首先根據(jù)脂肪酶基因設(shè)計(jì)27條引物,其中CAG93 F1~F14為正向引物,CAG93 R1~R13為反向引物(見圖3)。合成27條引物后,再將不同引物通過DNA聚合酶反應(yīng)(鏈延伸反應(yīng)和PCR反應(yīng))、酶切和連接反應(yīng)等最終合成為全長(zhǎng)脂肪酶基因序列(見圖2~8)。
本發(fā)明中引物的合成、PCR法合成全長(zhǎng)脂肪酶基因等工作可以通過專門的生物技術(shù)公司或機(jī)構(gòu)來(lái)完成。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的上述脂肪酶基因可以組成以下的重組質(zhì)粒通過在5’端和3’端的限制性酶切位點(diǎn)將脂肪酶基因功能序列連接入酵母表達(dá)載體。由于在基因設(shè)計(jì)時(shí)加入了限制性酶切位點(diǎn),合成的脂肪酶基因可以通過在其5’端和3’端的限制性酶切位點(diǎn)將功能序列連接入載體。為使脂肪酶基因能在酵母中高效表達(dá),選用帶有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)或者乙醇氧化酶(AOX)基因啟動(dòng)子的畢赤巴斯德酵母表達(dá)載體(pGAPZαA或者pPICZαA,美國(guó)Invitrogen公司),利用合成脂肪酶基因序列5’端的XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和3’端的XbaI限制性酶切位點(diǎn),將該脂肪酶合成基因(Tsp)克隆入載體pGAPZαA(見圖9)。由于在脂肪酶基因序列前加入了部分α信號(hào)肽編碼序列,該序列與載體pGAPZαA中的部分α信號(hào)肽編碼序列發(fā)生融合,從而構(gòu)成完整的α信號(hào)肽編碼序列,并形成了正確的讀碼框,為脂肪酶基因在酵母中的正確分泌表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。如果將Tsp序列的5’端進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷模涂梢栽趐GAPZαB,C或者pPICZαB,C中表達(dá)。畢赤巴斯德酵母表達(dá)載體以pGAPZαA為最佳選擇。
為了將上述脂肪酶基因克隆到載體上形成重組質(zhì)粒,本發(fā)明的載體必須具有XhoI和XbaI兩個(gè)位點(diǎn),具體的載體可以是pBluescript II SK(+)、pGAPZαA或pGAPZαB或pGAPZαC、pPICZαA或pPICZαB或pPICZαC。pBluescript II SK(+)等載體用于克隆脂肪酶基因片段。該重組載體可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌,由于重組質(zhì)粒含有Amp抗性基因,通過篩選Amp陽(yáng)性克隆即可獲得含重組質(zhì)粒的大腸桿菌,從而得到大量的脂肪酶基因,使該基因片段在大腸桿菌中得以保存和繁殖(見
圖10)。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將基因序列克隆入載體,再將克隆后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)。本發(fā)明優(yōu)選的畢赤酵母(P.pastoris)表達(dá)系統(tǒng)與Van Gorcom等的專利(US Pat5436156,1995;US Pat5863533,1999)所采用的宿主菌霉菌相比,畢赤巴斯德酵母具有很多方面的優(yōu)勢(shì)。第一,霉菌的生長(zhǎng)繁殖周期比畢赤酵母長(zhǎng)很多;第二,霉菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)是通過菌絲體尖端的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)的,這種生長(zhǎng)特性尤其適合固體培養(yǎng),而并不適合現(xiàn)代發(fā)酵工藝所常用的液態(tài)發(fā)酵,一般而言固體發(fā)酵工效低,周期長(zhǎng),成本高,由此使獲得大量發(fā)酵產(chǎn)品的成本比之液態(tài)發(fā)酵要增加很多。相比之下,畢赤巴斯德酵母是通過裂殖來(lái)增加營(yíng)養(yǎng)體的,這種繁殖特性十分適合液態(tài)發(fā)酵;第三,霉菌營(yíng)養(yǎng)體在生長(zhǎng)發(fā)育期間需要提供足夠的、較復(fù)雜的碳氮有機(jī)養(yǎng)分,這也會(huì)增加發(fā)酵成本,畢赤巴斯德酵母營(yíng)養(yǎng)體的生長(zhǎng)發(fā)育主要利用廉價(jià)的簡(jiǎn)單養(yǎng)分,如甲醇、葡萄糖和氨水等。獲得同等量的營(yíng)養(yǎng)體畢赤巴斯德酵母比霉菌消耗的養(yǎng)分要便宜得多。酵母的高細(xì)胞密度、低成本發(fā)酵方法已經(jīng)建立(Siegel R.S.,Biotechnol.Bioeng,34403-404,1989),發(fā)酵培養(yǎng)基中所使用的碳源、氮源、鹽、微量元素和生物素等都很便宜;第四,霉菌特有的霉味會(huì)降低適口性,而畢赤巴斯德酵母發(fā)酵產(chǎn)生的一種醬香味具有良好的誘食作用;第五,畢赤巴斯德酵母含有多種大量的促進(jìn)生長(zhǎng)的有機(jī)化合物,如低聚糖、核苷酸、各種氨基酸、短肽等,這些優(yōu)勢(shì)都是霉菌比不上的或所不具有的;第六,在真核生物表達(dá)系統(tǒng)中,酵母,包括畢赤巴斯德酵母在內(nèi),無(wú)疑是研究得最為詳盡的,在進(jìn)行分子生物學(xué)操作時(shí)酵母比霉菌更為容易、方便和有效。酵母作為一種良好的真核表達(dá)系統(tǒng)已成功地高效表達(dá)出許多具有生物活性的外源基因產(chǎn)物。第七、畢赤巴斯德酵母本身具有很好的安全性,曾作為單細(xì)胞蛋白廣泛應(yīng)用,酵母培養(yǎng)基中不含有毒物質(zhì)和致熱源,所以重組酵母表達(dá)的脂肪酶就可以不用分離純化而能直接以酵母培養(yǎng)物的形式直接利用,可降低脂肪酶的生產(chǎn)成本;第八、表達(dá)的脂肪酶在信號(hào)肽的引導(dǎo)下會(huì)分泌到培養(yǎng)基中,這使脂肪酶直接暴露出來(lái)而無(wú)需破碎酵母菌體,也為把包含脂肪酶的酵母培養(yǎng)物直接利用到工業(yè)生產(chǎn)中提供了可能,它為利用重組酵母工業(yè)化大規(guī)模、低成本發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明采用的含脂肪酶合成基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA或pGAPZαB或pGAPZαC,pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC可以轉(zhuǎn)化酵母,用于實(shí)現(xiàn)將脂肪酶基因片段整合到酵母染色體上,達(dá)到有效或高效分泌表達(dá)外源基因的目的(見
圖11)。
上述經(jīng)克隆后的載體重組質(zhì)粒不具備將脂肪酶表達(dá)、分泌到酵母細(xì)胞之外的功能,為解決這個(gè)問題,本發(fā)明采用將上述基因序列5’端的序列設(shè)計(jì)為pGAPZαA、pGAPZαB、pGAPZαC或pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC載體上相應(yīng)的片段的辦法達(dá)到這個(gè)目的。其原因在于由于含合成基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA上有畢赤巴斯德酵母GAP基因的部分序列,當(dāng)重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入酵母細(xì)胞后,通過體內(nèi)同源重組,pGAPZαA可以定向整合到畢赤巴斯德酵母基因組DNA上,并且GAP啟動(dòng)子無(wú)需外源誘導(dǎo)物甲醇存在即可啟動(dòng)脂肪酶合成基因的表達(dá)。同時(shí),信號(hào)肽可以指導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入酵母的分泌途徑,正確切割,將具有生物活性的外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物——脂肪酶最終分泌至胞外。
含脂肪酶合成基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA轉(zhuǎn)化畢赤巴斯德酵母前,需將環(huán)狀的重組表達(dá)質(zhì)粒用內(nèi)切酶酶切,使之線性化。不同的表達(dá)質(zhì)粒、不同的內(nèi)切酶位點(diǎn),可選擇不同的內(nèi)切酶。本發(fā)明用內(nèi)切酶BspHI消化重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA,電泳檢測(cè)酶切是否定全,純化回收完全線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA,-20℃保存?zhèn)溆?見圖9)。
畢赤巴斯德酵母的轉(zhuǎn)化常采用電激法或化學(xué)轉(zhuǎn)化法,準(zhǔn)備受體菌(P.Pastoris蛋白酶A缺陷型菌株SMD1168H),將50~80μl受體菌和5~90μg線性化重組質(zhì)粒pGAPZαA DNA混勻,電激(電壓1500V;電容25μF;電阻;200Ω)處理,然后篩選重組子(見
圖10)。
上述發(fā)明中含脂肪酶合成基因的重組質(zhì)粒pBluescript II SK(+)或pGAPZαA需用的工具酶及載體、表達(dá)系統(tǒng)等,均有專門的生物技術(shù)公司提供(如美國(guó)Promega公司、日本TaKaRa公司、美國(guó)Invitrogen公司等)。構(gòu)建方法、詳細(xì)步驟也有專門的說明書介紹。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的在表型抗性篩選的基礎(chǔ)上,通過酶活力測(cè)定進(jìn)行蛋白質(zhì)功能篩選。本發(fā)明具有表達(dá)脂肪酶的畢赤巴斯德酵母是通過將上述基因序列克隆入載體,再將克隆后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤巴斯德酵母來(lái)實(shí)現(xiàn)的。表達(dá)載體pGAPZαA上原本就帶有Zeocin抗性基因和GAP啟動(dòng)子序列,當(dāng)含有脂肪酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤巴斯德酵母并重組至染色體上后,該轉(zhuǎn)基因工程菌即獲得對(duì)Zeocin的抗性。在所獲得的菌群中其酶活力有很大的差別,因此,為了證實(shí)合成的脂肪酶基因整合并表達(dá),本發(fā)明采用了在抗性篩選(Zeocin+)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過PH值測(cè)定、溫度測(cè)定和耐熱性測(cè)定等方法對(duì)具有抗性的酵母重組子進(jìn)行酶活力測(cè)定?,F(xiàn)在保藏于武漢市武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號(hào)為No.M201002,保藏日期為2000年 月 日的菌株是上述方法篩選出的優(yōu)良菌種。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的將酵母細(xì)胞YPD液體培養(yǎng)92小時(shí),離心去除菌體后獲得上清液。經(jīng)過酶活力測(cè)定,該上清波在PH為7.2,溫度介乎30~40℃時(shí)的酶活力為120-160U/mL。
經(jīng)測(cè)定,本發(fā)明中畢赤巴斯德酵母工程菌的脂肪酶表達(dá)量在發(fā)酵培養(yǎng)92小時(shí),PH為7.2,溫度介乎30~40℃時(shí)的酶活力達(dá)到120-160U/mL。據(jù)國(guó)外報(bào)道,經(jīng)高密度發(fā)酵280小時(shí)后得到的發(fā)酵液酶活力為150U/mL。證明我們對(duì)脂肪酶基因的改造是成功的。
本發(fā)明提供的重組脂肪酶基因工程菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng),編碼脂肪酶基因表達(dá)并將脂肪酶分泌到發(fā)酵液中??梢栽趽u床上用成分簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基,經(jīng)發(fā)酵、誘導(dǎo)產(chǎn)生脂肪酶。具體方法為(1)種子活化將斜面保存的重組脂肪酶基因工程菌株接種于YPD平板,30℃靜置培養(yǎng)48小時(shí)。
(2)一級(jí)種子活化菌種接種于5ml YPD液體培養(yǎng)基中,30℃,230rpm水浴震蕩培養(yǎng)18小時(shí)。
(3)二級(jí)種子0.1ml菌液接種于50mLYPD液體培養(yǎng)基中,30℃,260rpm水浴震蕩培養(yǎng)72小時(shí)。
本發(fā)明的脂肪酶基因序列表達(dá)產(chǎn)生的脂肪酶進(jìn)行各種改造,如用各種化學(xué)修飾基團(tuán)進(jìn)行修飾,如糖基化、磷酸化、N端氨基化、蛋白內(nèi)切割等;也可為改善其表達(dá)后的轉(zhuǎn)運(yùn)而在添加信號(hào)肽及在其前或后加上融合肽等,而不改變蛋白基因序列的基本功能。這些通稱為本發(fā)明基因序列的功能生物。
綜上所述本發(fā)明中根據(jù)Candida rugosa.中Lip1的蛋白氨基酸結(jié)構(gòu),通過對(duì)脂肪酶全長(zhǎng)基因序列進(jìn)行體外設(shè)計(jì),使其適于在畢赤巴斯德酵母中表達(dá);通過基因合成、重組表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及表達(dá)篩選,即可獲得高效表達(dá)脂肪酶的畢赤巴斯德酵母基因工程菌,為工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶提供基礎(chǔ)。
(1)本發(fā)明根據(jù)所選擇的表達(dá)宿主——畢赤巴斯德酵母對(duì)遺傳密碼的偏愛程度,對(duì)脂肪酶基因進(jìn)行了密碼子選擇,用在畢赤巴斯德酵母中使用頻率較高的密碼子設(shè)計(jì)DNA序列,使得到的基因序列能夠在畢赤巴斯德酵母中正確且高效表達(dá)。
(2)在上述基礎(chǔ)上,對(duì)脂肪酶基因進(jìn)行基因的人工改造,增加了酵母分泌表達(dá)的部分信號(hào)肽序列和限制性內(nèi)切酶位點(diǎn);改造后的脂肪酶基因序列能夠在酵母中正確轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)脂肪酶并分泌至發(fā)酵液中。同時(shí),根據(jù)表達(dá)宿主——畢赤巴斯德酵母的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了能使脂肪酶基因分泌到胞外的部分信號(hào)肽序列,在構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒時(shí)能與表達(dá)載體形成正確的讀碼框,使脂肪酶基因能夠正確分泌至胞外;經(jīng)上述改造,產(chǎn)生了一個(gè)能夠在畢赤巴斯德酵母中正確、高效表達(dá)并分泌到胞外的脂肪酶基因序列。
(3)通過PCR合成出該脂肪酶基因序列,采用表達(dá)載體pGAPZαA,進(jìn)一步構(gòu)建出含有該合成基因,并能在畢赤巴斯德酵母中整合、表達(dá)的重組表達(dá)質(zhì)粒。
(4)將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤巴斯德酵母,得到一系列表達(dá)脂肪酶的畢赤巴斯德酵母基因工程菌。
(5)通過對(duì)上述工程菌株的篩選,獲得一株高效表達(dá)脂肪酶合成基因的工程菌株。
本發(fā)明由于選擇了具有良好活性的脂肪酶及合適的酵母系統(tǒng),尤其是畢赤巴斯德酵母,作為DNA設(shè)計(jì)的基礎(chǔ),因此,已實(shí)現(xiàn)了活性脂肪酶的有效表達(dá),又獲得了簡(jiǎn)化而有效的工業(yè)化、規(guī)模化的基因工程脂肪酶的生產(chǎn)方法。本發(fā)明由于采用將基因序列5’端序列設(shè)計(jì)為載體上相應(yīng)片段的辦法,實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的酵母體外表達(dá)和體外分泌。
圖1Candida rugosa(皺落假絲酵母)脂肪酶Lip1成熟蛋白氨基酸序列圖2Tsp基因序列的合成示意圖(“←”正向引物;“→”反和引物)圖3引物的堿基序列(F表示正向引物,R表示反向引物)圖4合成的CAG93-44F、CAG93(Fhc01)、CAG93-44 CAG93F1、CAG93-44 CAG93F2和CAG93-44R片段堿基序列圖5合成的脂肪酶基因(CAG93-44F片段)全自動(dòng)測(cè)序6合成的脂肪酶基因(CAG93-44 CAG93F1片段)全自動(dòng)測(cè)序7合成的脂肪酶基因(CAG93-44 CAG93F2片段)全自動(dòng)測(cè)序8合成的脂肪酶基因(CAG93-44R片段)全自動(dòng)測(cè)序9重組載體構(gòu)建示意10含合成脂肪酶基因Tsp的重組質(zhì)粒pBluescript II SK(+)電泳圖說明第一泳道為marker(來(lái)源于大連寶生物工程公司DL2000,DL15000)第二泳道為 Pbluescript II SK(+)的Xba I+Xho I雙酶切結(jié)果第二泳道為Pbluescript II SK(+)+Tsp的Xba I+Xho I雙酶切結(jié)果
圖11含合成脂肪酶基因Tsp的重組質(zhì)粒pGAZαA電泳圖說明第一泳道為pGAZαA+Tsp的Xba I+Xho I雙酶切結(jié)果第二泳道為pGAZαA的Xba I+Xho I雙酶切結(jié)果第三泳道為marker(來(lái)源于DL2000,DL15000)實(shí)施例1編碼脂肪酶的基因序列設(shè)計(jì)及人工合成本發(fā)明在Candida rugosa.脂肪酶Lip1氨基酸序列(見
圖1)的基礎(chǔ)上,采用偏愛性高的密碼子,設(shè)計(jì)出具有在酵母中使用頻率較高的密碼子的基因序列,將基因片段GAATTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT連接在5’端;在該序列的3’端連接限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)TCTAGA;將脂肪酶基因序列中在目的酵母中使用頻率低的密碼子,替換為使用頻率高的密碼子,可以形成以下具體的基因序列TspCTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GCT CCA ACT GCT ACT TTG GCT AACGGT GAT ACT ATT ACT GGT TTG AAC GCT ATT ATT AAC GAA GCT TTT TTG GGTATT CCA TTT GCT GAA CCA CCA GTT GGT AAC TTG AGA TTT AAG GAC CCA GTTCCA TAC TCT GGT TCT TTG GAT GGT CAA AAG TTT ACT TCT TAC GGT CCA TCTTGT ATG CAA CAA AAC CCA GAA GGT ACT TAC GAA GAA AAC TTG CCA AAG GCTGCT TTG GAT TTG GTT ATG CAA TCT AAG GTT TTT GAA GCT GTT TCT CCA TCTTCT GAA GAT TGT TTG ACT ATT AAC GTT GTT AGA CCA CCA GGT ACT AAG GCTGGT GCT AAC TTG CCA GTT ATG TTG TGG ATT TTT GGT GGT GGT TTT GAA GTTGGT GGT ACT TCT ACT TTT CCA CCA GCT CAA ATG ATT ACT AAG TCT ATT GCTATG GGT AAG CCA ATT ATT CAT GTT TCT GTT AAC TAC AGA GTT TCT TCT TGGGGT TTT TTG GCT GGT GAT GAA ATT AAG GCT GAA GGT TCT GCT AAC GCT GGTTTG AAG GAT CAA AGA TTG GGT ATG CAA TGG GTT GCT GAT AAC ATT GCT GCTTTT GGT GGT GAT CCA ACT AAG GTT ACT ATT TTT GGT GAA TCT GCT GGT TCTATG TCT GTT ATG TGT CAT ATT TTG TGG AAC GAT GGT GAT AAC ACT TAC AAGGGT AAG CCA TTG TTT AGA GCT GGT ATT ATG CAA TCT GGT GCT ATG GTT CCATCT GAT GCT GTT GAT GGT ATT TAC GGT AAC GAA ATT TTT GAT TTG TTG GCT TCTAAC GCT GGT TGT GGT TCT GCT TCT GAT AAG TTG GCT TGT TTG AGA GGT GTTTCT TCT GAT ACT TTG GAA GAT GCT ACT AAC AAC ACT CCA GGT TTT TTG GCTTAC TCT TCT TTG AGA TTG TCT TAC TTG CCA AGA CCA GAT GGT GTT AAC ATTACT GAT GAT ATG TAC GCT TTG GTT AGA GAA GGT AAG TAC GCT AAC ATT CCAGTT ATT ATT GGT GAT CAA AAC GAT GAA GGT ACT TTT TTT GGT ACT TCT TCTTTG AAC GTT ACT ACT GAT GCT CAA GCT AGA GAA TAC TTT AAG CAA TCT TTTGTT CAT GCT TCT GAT GCT GAA ATT GAT ACT TTG ATG ACT GCT TAC CCA GGTGAT ATT ACT CAA GGT TCT CCA TTT GAT ACT GGT ATT TTG AAC GCT TTG ACTCCA CAA TTT AAG AGA ATT TCT GCT GTT TTG GGT GAT TTG GGT TTT ACT TTGGCT AGA AGA TAC TTT TTG AAC CAT TAC ACT GGT GGT ACT AAG TAC TCT TTTTTG TCT AAG CAA TTG TCT GGT TTG CCA GTT TTG GGT ACT TTT CAT TCT AACGAT ATT GTT TTT CAA GAT TAC TTG TTG GGT TCT GGT TCT TTG ATT TAC AAC AACGCT TTT ATT GCT TTT GCT ACT GAT TTG GAC CCA AAC ACT GCT GGT TTG TTGGTT AAG TGG CCA GAA TAC ACT TCT TCT TCT CAA TCT GGT AAC AAC TTG ATGATG ATT AAC GCT TTG GGT TTG TAC ACT GGT AAG GAT AAC TTT AGA ACT GCTGGT TAC GAT GCT TTG TTT TCT AAC CCA CCA TCT TTT TTT GTT TAATCTAGA。
本發(fā)明新設(shè)計(jì)的基因可以通過PCR人工合成(見圖2),步驟如下根據(jù)新設(shè)計(jì)的基因序列設(shè)計(jì)并合成27條引物(見圖3),其中包括14條正向引物CAG93F1~F14,以及13條反向引物CAG93 R1~R13。每條引物平均長(zhǎng)為80nt,其中F1/F2、F2/F3、F3/R13、R13/R12、R12/R11、R11/F4、F4/F5、F5/F6、F6/R10、R10/R9、R9/R8、R8/F7、FT/F8、F8/F9、F9/R7、RT/R6、R6/R5、R5/F10、F10/F11、F11/F12、F12/R4、R4/R3、R3/F13、F13/F14、F14/R2和R2/R1每對(duì)引物之間各有平均20nt的重復(fù)序列;CAG93 F1的5’端加有Xho I位點(diǎn),CAG93 R1引物5’端加有Xba I位點(diǎn)。
PCR合成新設(shè)計(jì)的脂肪酶基因時(shí),先以合成5個(gè)片段為目標(biāo),然后加入新的引物,通過PCR延長(zhǎng)小片段,再用PCR反應(yīng)所得小片段PCR擴(kuò)增大片段,最后將得到的5個(gè)大片斷合成一條長(zhǎng)鏈,步驟如下首先由F3/R13、F6/R10、F9/R7、F12/R4、F14/R2五對(duì)引物進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng),反應(yīng)體系包括引物F3或F6、F9、F12、F14(0.01OD/μl)5μl、引物R13或R10、R7、R4、R2(0.01OD/μl)5μl、10xTaKaRa LA Buffer 10μl、dNTP 16μl、H2O 63μl;于94℃保溫5min后,在10min內(nèi)冷卻至55℃,加入TaKaRa LA Taq酶1μl,保溫5min,再于72℃保溫5min,得到DNA延伸液。
第二步以第一步所得的DNA延伸液為模板,分別以F2/R12、F5/R9、F8/R6、F11/R3、F13/R1為引物對(duì)進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增得到較長(zhǎng)的片段。反應(yīng)體系為引物F2或F5、F8、F11、F13(0.01OD/μl)1μl、引物R12或R9、R6、R3、R1(0.01OD/μl)1μl、DNA延伸液1μl、dNTP 10μl、10xTaKKaRa LA Buffer 10μl、TaKaRa Ex Taq酶1μl、H2O 76μl。在94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s的PCR反應(yīng)條件下,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);獲得的PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀后溶解于100μl TE中,得到DNA片段A1、B1、C1、D1和F1。
第三步以第二步所得的DNA片段A1、B1、C1、D1和F1為模板,分別以F1/R11、F4/R8、F7/R5、F10/R3、F13/R1為引物擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段,反應(yīng)體系包括引物F1或F4、F7、F11、F13(0.01OD/μl)5μl、引物R11或R8、R5、R3、R1(0.01OD/μl)5μl、10xTaKaRa LABuffer10μl、dNTP 16μl、H2O 63μl;于94℃保溫5min后,在10min內(nèi)冷卻至55℃,加入TaKaRaLA Taq酶1μl,保溫5min,再于72℃保溫5min,得到新的DNA延伸液,延伸液中包含DNA片段CAG93-44F、CAG93(Fhc01)、CAG93-44CAG93F1、CAG93-44CAG93F2和CAG93-44R。(見圖4)第四步以第三步所得的DNA延伸液為模板,分別以F1/R1為引物進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增全長(zhǎng)的DNA鏈。反應(yīng)體系為引物F1(0.01OD/μl)1μl、引物R1(0.01OD/μl)1μl、DNA延伸液1μl、dNTP 10μl、10xTaKaRa LA Buffer 10μl、TaKaRa Ex Taq酶1μl、H2O 76μl。在94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s的PCR反應(yīng)條件下,共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);獲得的PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀后溶解于100μl TE中。
CAG93-44F、CAG93-44 CAG93F1、CAG93-44 CAG93F2和CAG93-44R片斷通過DNA全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序,結(jié)果與設(shè)計(jì)序列相同(見圖5~8)。
基因的改造可利用已知的PCR技術(shù)、定點(diǎn)突變技術(shù)、基因設(shè)計(jì)后化學(xué)合成等技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明除了基因設(shè)計(jì)和引物設(shè)計(jì)外,引物合成、新設(shè)計(jì)基因的PCR合成及測(cè)序等均可以通過專業(yè)生物技術(shù)公司(大連寶生物工程公司)完成。實(shí)施例2含合成脂肪酶基因的重組質(zhì)粒pBluescript II SK(+)-Tsp的構(gòu)建在實(shí)施例1中得到的合成脂肪酶基因必須克隆到適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)粒上,以便保存利用。本發(fā)明選擇大腸桿菌載體質(zhì)粒pBluescript II SK(+),構(gòu)建出含合成脂肪酶基因的重組質(zhì)粒pBluescript II SK(+)-Tsp。具體步驟如下
1、菌株與載體大腸桿菌菌株JM109,質(zhì)粒pBluescript II SK(+)等購(gòu)自Promega公司。
2、酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶、各類修飾酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。
3、生化試劑IPTG、X-Gal均為Sigma公司產(chǎn)品。
4、培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基5、將合成好后的Tsp基因序列用XhoI和XbaI雙酶切,與同樣經(jīng)XhoI和XbaI雙酶切的載體pBluescript II SK(+)于16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,涂板后挑選陽(yáng)性重組子,得到重組質(zhì)粒pBluescript II SK(+)-Tsp。通過DNA測(cè)序分析,證實(shí)得到了改造的脂肪酶基因完整序列。
6、甘油保存陽(yáng)性重組子,需用時(shí)擴(kuò)增陽(yáng)性重組子,提取重組質(zhì)粒,用XhoI和Xba I雙酶切重組質(zhì)粒即可得到大量脂肪酶基因(Tsp)。實(shí)施例3含合成脂肪酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-Tsp的構(gòu)建本發(fā)明實(shí)施例1中合成的脂肪酶基因Tsp需要在真核表達(dá)系統(tǒng)中才能正確表達(dá)。由于畢赤巴斯德酵母是目前較為成功的表達(dá)系統(tǒng),為此,需要構(gòu)建出含合成脂肪酶基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA-Tsp,以便在畢赤巴斯德酵母中表達(dá)脂肪酶。具體步驟如下1、菌株與載體酵母菌株P(guān)ichia pastoris SMD1168H、質(zhì)粒pGAPZαA購(gòu)自Invitrogen公司。
2、酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶、各類修飾酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。
3、生化試劑IPTG、X-Gal、SDS、過硫酸氨、丙烯酰及甲叉雙丙烯酰(所用系列化試劑應(yīng)該有所變化)均為Sigma公司產(chǎn)品,其它為國(guó)產(chǎn)分析純。
4、將重組質(zhì)粒pBluescript II SK(+)-Tsp用XhoI和Xba I酶切,電泳回收約1.65kb的DNA片段。同時(shí)用XhoI和Xba I雙酶切載體質(zhì)粒pGAPZαA,電泳回收3.1kb大片段。再將1.65kb小片段與3.1kb大片段相連,得到了一個(gè)用于酵母轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體pGAPZαA-Tsp。帶有部分分泌信號(hào)序列的目的基因插入到上述表達(dá)載體的信號(hào)肽序列下游,與信號(hào)肽形成正確的閱讀框架,構(gòu)建出能通過載體上的P.pastrois GAP部分基因序列與染色體基因組之間的同源重組穩(wěn)定整合到酵母染色體上的重組表達(dá)載體。實(shí)施例4畢赤巴斯德酵母的轉(zhuǎn)化與基因工程菌(武漢市武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心、保藏號(hào)No.M201002)的篩選在實(shí)施例3中得到的含有脂肪酶基因的重組表達(dá)載體pGAPZαA-Tsp,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化P.pastoris,通過抗性篩選和酶活力測(cè)定,篩選出高效表達(dá)脂肪酶基因的基因工程菌。具體步驟如下(參考文獻(xiàn);《分子克隆實(shí)驗(yàn)摜第二版》,科學(xué)出版社,北京,1998年)1、菌株與載體酵母菌株P(guān)ichia pastoris SMD1168H、質(zhì)粒pGAPZαA購(gòu)自Invitrogen公司,含有脂肪酶合成基因的重組表達(dá)載體pGAPZαA-Tsp來(lái)自實(shí)施例3。
2、酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶、各類修飾酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。
3、生化試劑Zeocin為法國(guó)公司產(chǎn)品,其它為國(guó)產(chǎn)。
4、培養(yǎng)基酵母完全培養(yǎng)基為YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖);酵母轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為RDB(18.6%山梨醇、2%葡萄糖、1.34%Yeast);5、重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為YPD。
6、重組酵母表達(dá)載體首先用內(nèi)切酶BspHI消化(經(jīng)PEG法純化),電泳檢測(cè)酶切是否完全,使之線性化,電泳檢測(cè)酶切是否完全;線性化的pGAPZαA用酚抽提,乙醇沉淀,70%乙醇洗兩次,冷凍干燥,無(wú)菌水溶解,-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
7、將5ml SMD1168H菌液接種于50ml YPD液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)的菌液0.1~0.5ml接種于500ml新鮮YPD液體培養(yǎng)基,再30℃過夜培養(yǎng)至OD600=1.3~1.5。在+4℃,1500Xg離心5分鐘,用500ml 0℃無(wú)菌水重懸菌體。離心同上,再重懸于250ml0℃無(wú)菌水。離心同上,重懸于20ml 0℃ 1M山梨醇溶液。離心同上,再重懸于1ml 0℃ 1M山梨醇溶液,置于冰上(當(dāng)天使用)。
8、將上述制備的細(xì)胞80μl和5~90μg線性化DNA注入0℃電擊池(電擊還是電激),混勻,置冰上5分鐘。據(jù)酵母脈沖參數(shù)脈沖細(xì)胞。(電壓1500V;電容;25μF;電阻200Ω)。迅速加1ml 0℃ 1M山梨醇溶液到電擊池內(nèi),混勻。再將池內(nèi)液體轉(zhuǎn)置1.5ml EP管,30℃培養(yǎng)1~2小時(shí)。取150μl涂布含Zeocin 1000μg/ml的YPDS固體培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)2~3天。
9、用無(wú)菌牙簽從轉(zhuǎn)化平板上挑取Zeo+重組子,再在含1000μg/ml Zeocin的YPD固體培養(yǎng)基上劃線,分離單克隆。
10、將上述9制備的Zeocin+表型的重組子約26株進(jìn)一步作脂肪酶的酶活力測(cè)定。并篩選出一株在PH為7.2,溫度介乎30~40℃時(shí)酶活力為120-160U/mL的菌株。
權(quán)利要求
1.一種能在酵母中有效表達(dá)的脂肪酶基因序列,其特征在于根據(jù)脂肪酶氨基酸序列,設(shè)計(jì)出具有在酵母中使用頻率較高的密碼子的基因序列,在該基因序列的5’端連接與目的酵母相配合的基因片段,在3’端連接限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述序列,其特征在于連接5’端的基因片段為CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的序列,其特征在于連接3’端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)是TCTAGA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的序列,其特征在于CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GCT CCA ACT GCT ACT TTG GCT AACGGT GAT ACT ATT ACT GGT TTG AAC GCT ATT ATT AAC GAA GCT TTT TTG GGTATT CCA TTT GCT GAA CCA CCA GTT GGT AAC TTG AGA TTT AAG GAC CCA GTTCCA TAC TCT GGT TCT TTG GAT GGT CAA AAG TTT ACT TCT TAC GGT CCA TCTTGT ATG CAA CAA AAC CCA GAA GGT ACT TAC GAA GAA AAC TTG CCA AAG GCTGCT TTG GAT TTG GTT ATG CAA TCT AAG GTT TTT GAA GCT GTT TCT CCA TCTTCT GAA GAT TGT TTG ACT ATT AAC GTT GTT AGA CCA CCA GGT ACT AAG GCTGGT GCT AAC TTG CCA GTT ATG TTG TGG ATT TTT GGT GGT GGT TTT GAA GTTGGT GGT ACT TCT ACT TTT CCA CCA GCT CAA ATG ATT ACT AAG TCT ATT GCTATG GGT AAG CCA ATT ATT CAT GTT TCT GTT AAC TAC AGA GTT TCT TCT TGGGGT TTT TTG GCT GGT GAT GAA ATT AAG GCT GAA GGT TCT GCT AAC GCT GGTTTG AAG GAT CAA AGA TTG GGT ATG CAA TGG GTT GCT GAT AAC ATT GCT GCTTTT GGT GGT GAT CCA ACT AAG GTT ACT ATT TTT GGT GAA TCT GCT GGT TCTATG TCT GTT ATG TGT CAT ATT TTG TGG AAC GAT GGT GAT AAC ACT TAC AAGGGT AAG CCA TTG TTT AGA GCT GGT ATT ATG CAA TCT GGT GCT ATG GTT CCATCT GAT GCT GTT GAT GGT ATT TAC GGT AAC GAA ATT TTT GAT TTG TTG GCT TCTAAC GCT GGT TGT GGT TCT GCT TCT GAT AAG TTG GCT TGT TTG AGA GGT GTTTCT TCT GAT ACT TTG GAA GAT GCT ACT AAC AAC ACT CCA GGT TTT TTG GCTTAC TCT TCT TTG AGA TTG TCT TAC TTG CCA AGA CCA GAT GGT GTT AAC ATTACT GAT GAT ATG TAC GCT TTG GTT AGA GAA GGT AAG TAC GCT AAC ATT CCAGTT ATT ATT GGT GAT CAA AAC GAT GAA GGT ACT TTT TTT GGT ACT TCT TCTTTG AAC GTT ACT ACT GAT GCT CAA GCT AGA GAA TAC TTT AAG CAA TCT TTTGTT CAT GCT TCT GAT GCT GAA ATT GAT ACT TTG ATG ACT GCT TAC CCA GGTGAT ATT ACT CAA GGT TCT CCA TTT GAT ACT GGT ATT TTG AAC GCT TTG ACTCCA CAA TTT AAG AGA ATT TCT GCT GTT TTG GGT GAT TTG GGT TTT ACT TTGGCT AGA AGA TAC TTT TTG AAC CAT TAC ACT GGT GGT ACT AAG TAC TCT TTTTTG TCT AAG CAA TTG TCT GGT TTG CCA GTT TTG GGT ACT TTT CAT TCT AACGAT ATT GTT TTT CAA GAT TAC TTG TTG GGT TCT GGT TCT TTG ATT TAC AAC AACGCT TTT ATT GCT TTT GCT ACT GAT TTG GAC CCA AAC ACT GCT GGT TTG TTGGTT AAG TGG CCA GAA TAC ACT TCT TCT TCT CAA TCT GGT AAC AAC TTG ATGATG ATT AAC GCT TTG GGT TTG TAC ACT GGT AAG GAT AAC TTT AGA ACT GCTGGT TAC GAT GCT TTG TTT TCT AAC CCA CCA TCT TTT TTT GTT TAATCTAGA
5.一種權(quán)利要求1-4所述的任一種基因序列的載體,其特征在于在多克隆位點(diǎn)具有XhoI和XbaI位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體,其特征在于復(fù)制載體為pBluescript II SK(+)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體,其特征在于表達(dá)載體為pGAPZαA或pGAPZαB或pGAPZαC,pPICZαA或pPICZαB或pPICZαC。
8.一種具有權(quán)利要求5所述的載體的酵母菌,其特征為將基因序列克隆入載體,再將克隆后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤巴斯德酵母。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的酵母菌,其特征在于在表型抗性篩選的基礎(chǔ)上,通過酶活力測(cè)定進(jìn)行蛋白質(zhì)功能篩選。
10.一種從權(quán)力要求9所述的基因工程菌中得到的基因工程脂肪酶,其特征在于工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng),編碼脂肪酶基因表達(dá)并將脂肪酶分泌到發(fā)酵液中。
11.一種具有權(quán)利要求7所述的載體的酵母菌,其特征為將基因序列克隆入載體,再將克隆后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤巴斯德酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能在酵母中有效表達(dá)的脂肪酶基因序列及具有該基因序列的酵母菌。其主要特征在于:根據(jù)脂肪酶氨基酸序列,設(shè)計(jì)出具有在酵母中使用頻率較高的密碼子的基因序列,在該基因序列的5’端連接與目的酵母相配合的基因片段,在3’端連接限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。本發(fā)明的酵母菌能有效分泌脂肪酶蛋白,能廣泛用于石油工業(yè)、造紙業(yè)、生物制藥、化工等領(lǐng)域,起去脂、增香、洗滌等功用。
文檔編號(hào)C12N15/55GK1366056SQ0110744
公開日2002年8月28日 申請(qǐng)日期2001年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月15日
發(fā)明者貝錦龍, 楊林, 蔡小鈿, 王珣章 申請(qǐng)人:廣州市綠巨人生物環(huán)保技術(shù)有限公司