專利名稱：具有血管生成抑制作用的融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種重組蛋白產(chǎn)物，具體講是一種具有血管生成抑制作用的融合蛋白。
背景技術(shù)：
正常的血管增生只限定于特定的情況，如外傷，胚胎形成，女性的生殖周期。血管的異常增殖可導(dǎo)致一系列的疾病，如腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，糖尿病性視網(wǎng)膜增生，血管疾病如血管瘤，動(dòng)脈粥樣硬化，變態(tài)反應(yīng)性疾病如關(guān)節(jié)炎等。
1971年Folkman教授首先提出了腫瘤的生長(zhǎng)依賴血管的假設(shè)，多年來的研究結(jié)果已充分證明了這一理論。抑制血管生成，就可切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和血道轉(zhuǎn)移途徑，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。1994年，F(xiàn)olkman實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)38KD的纖溶酶原片段angiostatin能夠特異抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及新生血管形成，并能顯著抑制Lewis肺癌轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)(O′Reilly M S，Holmgren L，Shing Y，et al.Cell，1994；79315-328)。隨著研究的逐步深入，有關(guān)報(bào)導(dǎo)不斷出現(xiàn)。如，WO96/35774公開了有關(guān)angiostatin及聚體的作用和使用方法；WO98/54217公開了angiostatin片段的使用；US 5,776,704公開了檢測(cè)angiostatin的方法；US 5,801,012公開了angiostatin的產(chǎn)生方法；WO99/16889公開了angiostatin融合蛋白磁療腫瘤的作用，其前導(dǎo)肽為白介素3(IL-3)等。
人的血漿纖維蛋白溶酶原包含了Kringle 1-5。Kringle位點(diǎn)是3個(gè)環(huán)狀相連的二硫鍵結(jié)構(gòu)，每個(gè)Kringle包含約80個(gè)氨基酸，各個(gè)Kringle有50％左右的序列相同。不同Kringle結(jié)構(gòu)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的抑制能力順序?yàn)?；K5＞K1＞K3＞K2＞K4(Cao et al.J.Biol.Chem，27129461-29467，1996；Cao et al.J Biol Chem27222924-22928，1997)。如，在WO99/00420中公開了K1-5體內(nèi)調(diào)節(jié)血管生成的作用；US 5,801,146中公開了K5在抑制血管生成方面的作用；WO97/41824中公開了一種治療血管生成疾病的哺乳動(dòng)物K5片段和融合蛋白。
人體的免疫球蛋白Fc區(qū)域已成功與多種目標(biāo)蛋白融合并表達(dá)成功，包括IL2，CD26，Tat，Rev，OSF-2，β1G-H3，IgE受體，PSMA和gp120(U.S.PatentNo.5,541,087and U.S.Patent No.5,726,044)。Fc區(qū)域包括CH1，CH2，CH3，CH4和Hinge區(qū)。常用類別為IgG的CH2，CH3及Hinge區(qū)，其余類別IgA，IgD，IgE和IgM也可使用。Fc區(qū)域能夠增加融合蛋白的表達(dá)量，增強(qiáng)穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期。
上述人體內(nèi)源性的抗血管生成因子，一方面顯示出很好的應(yīng)用前景，體外顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，體內(nèi)顯著抑制了原發(fā)性和轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)，無毒副作用，反復(fù)使用體內(nèi)不產(chǎn)生抗藥性，與傳統(tǒng)的放療、化療相比，具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值；但另一方面，由于其穩(wěn)定性和用藥量的問題，又在一定程度上限制了臨床的廣泛使用性。與一般細(xì)胞因子臨床用量微克級(jí)相比，血管生成抑制因子臨床有效用量一般都在毫克級(jí)，相差千倍。另外，由于是內(nèi)源性的蛋白多肽片段，其活性也易于丟失。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上述情況，本發(fā)明將提供一種可被應(yīng)用于臨床的高表達(dá)，高活性，高穩(wěn)定性的具有血管生成抑制作用的不同結(jié)構(gòu)形式的融合蛋白。
本發(fā)明所稱的具有血管生成抑制作用的融合蛋白的核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列為S-Fc-K5形式，其中S為人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)集落胞刺激因子(hGM-CSF)前導(dǎo)肽，F(xiàn)c為人免疫球蛋白IgG Fcγ，K5為人血漿纖維蛋白溶酶原內(nèi)的片段K5。該S-Fc-K5融合蛋白的核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列為；GAA TTC ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG GCC TGC AGCGlu Phe Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys SerATC TCT CCG CTC GAG CGG GAG CCC AAA TCT TCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCGIle Ser Pro Leu Glu Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro ProTGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCCCys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys ProAAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTGLys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp ValAGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CATSer His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val HisAAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGCAsn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val SerGTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTCVal Leu Thr VaL Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys ValTCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAGSer Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lle Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GlnCCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCA CGG GAG GAG ATG ACC AAG AACPro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys AsnCAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAGGln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys GIy Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val GluTGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GACTrp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu AspTCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAGSer Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp GlnCAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACGGln GJy Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr ThrCAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC CCG GGT CCT CCC CTC GAT GTA GCA CCT CCG CCT GTTGln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Pro Pro Leu Asp Val Ala Pro Pro Pro ValGTC CTG CTT CCA GAT GTA GAG ACT CCT TCC GAA GAA GAC TGT ATG TTT GGG AAT GGGVa1 Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn GlyAAA GGA TAC CGA GGC AAG AGG GCG ACC ACT GTT ACT GGG ACG CCA TGC CAG GAC TGGLys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp TrpGCT GCC CAG GAG CCC CAT AGA CAC AGC ATT TTC ACT CCA GAG ACA AAT CCA CGG GCGAla Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg AlaGGT CTG GAA AAA AAT TAC TGC CGT AAC CCT GAT GGT GAT GTA GGT GGT CCC TGG TGCGly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp CysTAC ACG ACA AAT CCA AGA AAA CTT TAC GAC TAC TGT GAT GTC CCT CAG TGT GCG GCCTyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala AlaCCT TCA TTTPro Ser Phe。
制備上述具有血管生成抑制作用的融合蛋白的方法，可以按下述步驟方式進(jìn)行(a) 采用RT-PCR方法，克隆人S，F(xiàn)c，K5基因片段；(b)通過分子重組，將目的基因克隆到相應(yīng)載體中；(c)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞表達(dá)；(d)用親合層析和分子篩方法純化目標(biāo)蛋白。
首先，從人體器官、組織中調(diào)出相應(yīng)的目的基因。如血漿纖溶酶原K5的基因片段和IgG FCγ基因片段。采用RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因。設(shè)計(jì)引物時(shí)要根據(jù)克隆載體的不同，設(shè)計(jì)的目標(biāo)蛋白不同而引入不同的接頭。如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO，SP2中表達(dá)時(shí)，根據(jù)所用質(zhì)粒不同，如pMEl8S引入XbaI和EcoRI接頭或質(zhì)粒上已提供的其它多克隆接頭，如pdc則引入XmaI和XhoI接頭。
K5基因片段與Fc區(qū)域連接時(shí)一般用N端連接，可通過多肽直接連接，也可通過多肽鍵連接。Fc區(qū)域與信號(hào)肽S連接時(shí)也采用同樣的方式。有時(shí)S-Fc-K5之間的連接根據(jù)需要要引入適當(dāng)?shù)牡鞍姿饷盖形稽c(diǎn)，如FactorXa等。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染可采用鈣磷法，脂質(zhì)法，電轉(zhuǎn)法等，可根據(jù)需要采用目前所使用的各種有效的轉(zhuǎn)入方法和手段?？寺〉暮Y選，根據(jù)系統(tǒng)的不同，可采用Amp，G418，MTX等篩選方法。轉(zhuǎn)化物經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定后表達(dá)。
根據(jù)需要可以采用搖瓶培養(yǎng)，也可采用發(fā)酵罐培養(yǎng)。浮游細(xì)胞可直接培養(yǎng)，也可通過載體培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞用載體培養(yǎng)。發(fā)酵罐培養(yǎng)采用一次性投料或分批投料方式。
融合蛋白產(chǎn)物的提純一般采用親和層析(如金屬柱，蛋白A柱)和分子篩層析，也不排除疏水層析，離子交換層析和HPLC的使用及今后推出的新型層析材料和層析方式的使用。
融合蛋白產(chǎn)物的鑒定采用PAGE-SDS，PAGE-West blotting，酶標(biāo)檢測(cè)和細(xì)胞生物學(xué)活性鑒定。
在大腸桿菌M15中K5的表達(dá)量為40％左右，可在分子量1.4-1.5萬左右見到明顯的表達(dá)帶(參見圖1)，經(jīng)酶標(biāo)檢測(cè)具有特異性抗性。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，離心破菌分離上清過Ni柱，洗脫放散后可得到一單一蛋白帶(參見圖2)，經(jīng)分子篩純化后，純度可達(dá)98％(參見圖3)。
用上述分離提純的K5產(chǎn)物進(jìn)行了以下的研究1.細(xì)胞生物學(xué)活性測(cè)定用小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞p61和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304測(cè)定rh K5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。根據(jù)克隆產(chǎn)物的不同，半數(shù)致死量ED50范圍在nM～pM級(jí)(參見圖4)。
2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)C57B16小鼠接種Lewis肺癌第4天開始腹部皮下注射rhK5(30mg/kg/day)。注射10天后拍照，可見實(shí)驗(yàn)組小鼠腋下腫瘤壞死消失(參見圖5a)，對(duì)照組4小鼠注射等量生理鹽水，可見小鼠腋下腫瘤明顯增大(參見圖5b)。接種20天后，實(shí)驗(yàn)組小鼠和對(duì)照組小鼠均處死作解剖。實(shí)驗(yàn)組小鼠心、肝、腎、肺均未見異常，鏡檢未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞。對(duì)照組小鼠接種腫瘤的體積大小不等，最大腫瘤體積＞1000mm3。
上述結(jié)果說明，所得到的K5的純度高，活性強(qiáng)，能通過抑制腫瘤新生血管的生成非常顯著地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，是很有開發(fā)前景的一種血管生成抑制因子。
與此同時(shí)也觀察到，K5在4℃液態(tài)保存條件下的活性容易喪失，與一般細(xì)胞因子相比穩(wěn)定性較差。為此可以采用pME18s質(zhì)粒，首先將人GM-CSF前導(dǎo)肽和人IgG Fcγ基因序列連接到哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒pME18s上，然后將rhK5連接，構(gòu)建成S-Fc-K5融合蛋白(分子量約為45KD)，以增強(qiáng)目標(biāo)蛋白的體外穩(wěn)定性，以及純化的易操作性。
已有報(bào)道，目標(biāo)蛋白融合Fc區(qū)域能獲得多種優(yōu)勢(shì)表達(dá)量增加，體外穩(wěn)定性及體內(nèi)半衰期增強(qiáng)。Fc區(qū)域可促進(jìn)目標(biāo)蛋白的可溶性，促進(jìn)復(fù)性，增強(qiáng)生物活性。此外，F(xiàn)c區(qū)域與蛋白A有很好的親和性，易于目標(biāo)蛋白的分離純化。補(bǔ)體固定和受體結(jié)合功能有時(shí)需要從Fc區(qū)域刪除以適應(yīng)一定的應(yīng)用范圍。哺乳動(dòng)物細(xì)胞Fc融合蛋白的表達(dá)量范圍一般在30～100mg/L。人GM-CSF與IL-3有相似的生物學(xué)功能，其受體廣泛分布于造血和非造血細(xì)胞，其生物學(xué)功能比IL-3更為專一。
信號(hào)肽是分泌性蛋白N端的一段小肽，一般由15～30個(gè)疏水氨基酸所組成。信號(hào)肽的特點(diǎn)是它的疏水性，它的作用是使蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入高爾基體。一旦蛋白質(zhì)進(jìn)入高爾基體，信號(hào)肽就被信號(hào)肽酶水解掉。切除信號(hào)肽后，前蛋白質(zhì)就變成有生物活性的蛋白質(zhì)了。
本發(fā)明涉及的S-Fc-K5融合蛋白，可制備成多抗或單抗特異性抗血清，可作為臨床醫(yī)學(xué)的診斷試劑，用于特異性，敏感性要求高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，如放免分析，酶聯(lián)免疫，流式細(xì)胞及免疫組化技術(shù)。對(duì)體液(如血液、尿液)或組織標(biāo)本中的相關(guān)因子進(jìn)行定性、定量和定位檢測(cè)，以確定疾病的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后的相關(guān)性。
本發(fā)明涉及的S-Fc-K5系列，還可用作基因治療。以適當(dāng)?shù)妮d體將目的基因轉(zhuǎn)入人體細(xì)胞，補(bǔ)充缺失的基因，或使細(xì)胞獲得新的功能，以達(dá)到治療的目的，即是基因治療。目前使用的載體大致可分為病毒性載體和非病毒性載體。病毒性載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，皰癥病毒，痘苗病毒等。非病毒性載體包括脂質(zhì)性載體。此外蛋白-DNA復(fù)合物以受體介導(dǎo)入細(xì)胞。
本發(fā)明血管生成抑制融合蛋白S-Fc-K5可以具有以下的優(yōu)勢(shì)1.作用靶標(biāo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞，其遺傳物質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性。腫瘤細(xì)胞自身其遺傳物質(zhì)極不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生多藥耐藥性。
2.只作用于正在生長(zhǎng)繁殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞，不作用于已有的“靜止的”血管內(nèi)皮細(xì)胞，避開女性的生理周期、傷口愈合期及胎兒與兒童的生長(zhǎng)發(fā)育期用藥，無任何毒副作用；3. 由于融合了IgG Fcγ區(qū)域，克服了一般重組多肽蛋白的體外不穩(wěn)定，活性易喪失的弱點(diǎn)，延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期，有可能減少臨床用藥量；4.由于Fc區(qū)域與蛋白A親和力好，可直接采用蛋白A親和層析柱分離純化目標(biāo)蛋白，有可能降低生產(chǎn)成本；5.Fc區(qū)域能促進(jìn)目標(biāo)蛋白復(fù)性，從而有可能增強(qiáng)目標(biāo)蛋白生物活性；另一方面，F(xiàn)c區(qū)域促進(jìn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)，加之純化方案的改進(jìn)，使大量生產(chǎn)趨于可行。
以下通過具體實(shí)例的實(shí)施方式，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作詳細(xì)的說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于下述的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1是其中的K5在大腸桿菌M15中的表達(dá)圖譜。
圖2是K5用Ni柱洗脫放散SDS-PAGE電泳圖譜。
圖3是對(duì)K5用分子篩層析的圖譜。
圖4是K5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，其中a為ECV304，b為p61。
圖5是K5實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠腫瘤大小比較，其中a實(shí)驗(yàn)組；b對(duì)照組。
圖6是目標(biāo)蛋白的純化過程示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1重組人K5多肽片段的純化從中國(guó)人的肝組織中獲得目的基因，用pQE30作為表達(dá)載體，構(gòu)建后目標(biāo)蛋白在大腸桿菌M15菌中的表達(dá)量可達(dá)40％以上，如圖1所示，主要以包涵體形式存在。純化時(shí)，將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的菌體離心收集。沉淀菌體用PBS洗滌兩次，離心所得菌體懸浮于8.0M尿素裂解液中，加適量的溶菌酶用超聲波破碎菌體。包涵體溶解后經(jīng)離心收集其上清，過Ni-NTA Superflow親和柱，利用改變pH條件進(jìn)行洗滌和洗脫。洗脫的目標(biāo)蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析，染色后顯示為單一的一條帶，分子量約15,000，如圖2所示。經(jīng)分子篩層析，電腦掃描純化達(dá)98％，如圖3所示。此目標(biāo)蛋白為變性蛋白，用透析或超濾去除尿素后得到可溶性的具有生物活性的蛋白，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，如圖4所示，其中，圖中的a為ECV304；b為p61；圖中的1均為空白對(duì)照組，2～5依次分別為1μg/ml，2μg/ml，3μg/ml和4μg/ml實(shí)驗(yàn)組。
實(shí)例2重組人S-Fc-K5融合蛋白的分離純化此類融合蛋白主要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而表達(dá)產(chǎn)物多為分泌型。當(dāng)融合蛋白含有Fc片段時(shí)，分離純化采用Protein A親和層析。這是因?yàn)镻rotein A不僅對(duì)IgG分子的Fc區(qū)有很強(qiáng)的特異親和性，而且載量很高，層析后目標(biāo)蛋白純度可達(dá)95％，如需更高的純度可增加一步分子篩層析，回收率大于80％，純化過程如圖6所示。
對(duì)不含F(xiàn)c肽片段的融合蛋白，如K5，當(dāng)其末端含有6個(gè)His(組氨酸)時(shí)可用金屬螯合柱親和層析純化。
實(shí)例3對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)定使用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304、小鼠內(nèi)皮細(xì)胞p61、牛內(nèi)皮細(xì)胞BCE，測(cè)定融合蛋白S-FC-K5系統(tǒng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制活性。
使用含10％NCS(小牛血清)、P/S(+)DMEM培養(yǎng)基，將上述細(xì)胞配成2.5×104/ml密度，細(xì)胞懸液各加一塊24孔板，每孔0.5ml，37℃含5％CO2孵箱中24小時(shí)培育后，更換新鮮培養(yǎng)基，內(nèi)含5％NCS、P/S(+)，加不同濃度的樣品，孵育30分鐘，添加bFGF使終濃度為1～5ng/ml，72小時(shí)孵育后，作鏡下活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
活細(xì)胞計(jì)數(shù)取平均值標(biāo)準(zhǔn)差作圖，結(jié)果顯示樣品對(duì)不同血管內(nèi)皮細(xì)胞均有劑量依賴的抑制作用。其ED50可以達(dá)到nM～pM級(jí)(圖4)。
權(quán)利要求
1.一種具有血管生成抑制作用的融合蛋白，其核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列為S-Fc-K5形式，其中S為人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)集落胞刺激因子(hGM-CSF)前導(dǎo)肽，F(xiàn)c為人免疫球蛋白IgG Fcγ，K5為人血漿纖維蛋白溶酶原內(nèi)的片段K5，其序列為GAA TTC ATG TGG CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG GCC TGC AGCGlu Phe Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys SerATC TCT CCG CTC GAG CGG GAG CCC AAA TCT TCT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCGIle Ser Pro Leu Glu Arg Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro ProTGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCCCys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys ProAAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTGLys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp ValAGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CATSer His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val HisAAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGCAsn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val SerGTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTCVal Leu Thr VaL Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys ValTCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAGSer Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly GlnCCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCA CGG GAG GAG ATG ACC AAG AACPro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys AsnCAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAGGln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys GIy Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val GluTGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GACTrp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu AspTCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAT AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAGSer Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp GlnCAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACGGln GJy Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr ThrCAG AAG AGC CTC TCC CTG TCC CCG GGT CCT CCC CTC GAT GTA GCA CCT CCG CCT GTTGln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Pro Pro Leu Asp Val Ala Pro Pro Pro ValGTC CTG CTT CCA GAT GTA GAG ACT CCT TCC GAA GAA GAC TGT ATG TTT GGG AAT GGGVal Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn GlyAAA GGA TAC CGA GGC AAG AGG GCG ACC ACT GTT ACT GGG ACG CCA TGC CAG GAC TGGLys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp TrpGCT GCC CAG GAG CCC CAT AGA CAC AGC ATT TTC ACT CCA GAG ACA AAT CCA CGG GCGAla Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg AlaGGT CTG GAA AAA AAT TAC TGC CGT AAC CCT GAT GGT GAT GTA GGT GGT CCC TGG TGCGly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp CysTAC ACG ACA AAT CCA AGA AAA CTT TAC GAC TAC TGT GAT GTC CCT CAG TGT GCG GCCTyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala AlaCCT TCA TTTPro Ser Phe 。
2.一種制備如權(quán)利要求1所述的具有血管生成抑制作用的融合蛋白的方法，按下述方式操作(a)采用RT-PCR方法，克隆人S，F(xiàn)c，K5基因片段；(b)通過分子重組，將目的基因克隆到相應(yīng)載體中；(c)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞表達(dá)；(d)用親合層析和分子篩方法純化目標(biāo)蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所說的宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種具有血管生成抑制作用的融合蛋白,其核苷酸及相應(yīng)的氨基酸序列為S－Fc－K5形式,其中S為人粒細(xì)胞－巨噬細(xì)集落胞刺激因子(hGM－CSF)前導(dǎo)肽,Fc為人免疫球蛋白IgG Fcγ,K5為人血漿纖維蛋白溶酶原內(nèi)的片段K5。此血管生成抑制融合蛋白S－Fc－K5比天然產(chǎn)物具有更強(qiáng)的生物活性,更好的穩(wěn)定性,可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)?？梢灾瞥商貏e適用于腫瘤等相關(guān)疾病的檢測(cè)、診斷和預(yù)后。
文檔編號(hào)C12N15/85GK1338473SQ0110879
公開日2002年3月6日 申請(qǐng)日期2001年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月29日
發(fā)明者陳靜嫻, 吳緯, 宋寧, 焦麗華, 王憬惺, 簡(jiǎn)涌, 楊剛虹 申請(qǐng)人:四川楊天生物藥業(yè)股份有限公司, 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所