專利名稱：人工合成的人干細(xì)胞因子編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工合成的DNA序列及其表達(dá)方法，特別是人工合成的人干細(xì)胞因子編碼基因及其表達(dá)方法。
干細(xì)胞因子(Stem Cell Factor,SCF)是來(lái)源于多種組織細(xì)胞的一類早期造血調(diào)控因子，在小鼠中，由10#染色體上的Steel座位編碼，是原癌基因c-kit產(chǎn)物的一個(gè)胞外配體。由于其刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、結(jié)合受體的特性，又被稱作肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Mast Cell Growth Factor,MGF)、Steel因子(Steel Factor/SteelLocus Fact,SF/SLF)、KIT配體(Kit Ligand,KL)等(Williams,DE et al,1990,Cell 63(2):167-174；Zsebo,KM et al,1990,Cell 63(2):195-201；Martin,FM etal,1990,Cell,63(2):203-211；Zsebo,KM et al,1990,Cell,63(2):213-224；Huang,Eet al,1990,Cell,63(2):225-233；Anderson,DM et al,1990,Cell,63(2):235-243；Williams,DE et al,1991,Pro Growth Factor Res,3(3):235-242)。
自1990年以Williams DE,Zesbo KM,Huang EW為首的三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)小組分別報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)了SCF并發(fā)表了其cDNA的序列以來(lái)，SCF的各個(gè)方面的研究，都取得了很大進(jìn)展。hSCF基因位于染色體的12q22-24區(qū)，全基因編碼一個(gè)跨膜蛋白，通過(guò)mRNA的不同拼接以及蛋白酶在Ala164/Ala165位的酶促降解，也可以產(chǎn)生可溶的活性形式(Martin,FM et al,1990,Cell,63(2):203-211；Zsebo,KM et al,1990,Cell,63(2):213-224；Andsern,DM et al,1991,CellGrowth & Differentiation,2(4):373-378)這里的可溶形式是指由膜結(jié)合型經(jīng)蛋白酶酶促降解而來(lái)的一種活性形式，而不是指表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌中的存在狀態(tài)。膜型、可溶形式的SCF都具有重要而又各不相同的生物學(xué)作用，膜型SCF主要在胚胎發(fā)育的早期起作用，而可溶形式的SCF則具有更為廣泛的作用。
在體內(nèi)，SCF的活性形式是非共價(jià)二聚體，并且是高度糖基化的，但糖基化對(duì)其生物學(xué)作用影響不大(Zsebo,KM et al,1990,Cell 63(2):195-201；Zsebo,KM et al,1990,Cell 63(2):195-201)。天然基因在E.coli中重組表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)復(fù)性以后，具有生物活性。而結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系方面，通過(guò)缺失突變揭示出，羧基端一部分氨基酸，對(duì)其生物活性的維持并不是必須的，但若缺失破壞了兩個(gè)二硫鍵的完整性，則活性喪失，這說(shuō)明二硫鍵對(duì)于維持正確的高級(jí)構(gòu)象以及生物學(xué)活性是至關(guān)重要的。將其與載體進(jìn)行融合表達(dá)則發(fā)現(xiàn)融合在氨基端、羧基端的不相關(guān)短肽，對(duì)其活性影響不大(Nishikawa,Met al,1992,Biochem Biophys Res Commun,188(1):292-297)。
人們對(duì)干細(xì)胞因子的生物學(xué)作用也進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)它具有多種生物學(xué)作用，參與多種生理過(guò)程。對(duì)造血系統(tǒng)，SCF是一個(gè)多譜系調(diào)控因子，既可作用于早期造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞，又可作用于晚期較成熟血細(xì)胞；既可單獨(dú)作用，又可協(xié)同其它因子起放大性作用；既可在局部起作用，引起成熟細(xì)胞聚集，又可作為一種血清因子，影響祖細(xì)胞的發(fā)育。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，SCF在胚胎發(fā)育早期原始生殖細(xì)胞、黑色素細(xì)胞的遷移與定位中也起重要作用，臨床許多疾病的發(fā)生都與之或其配體缺陷有關(guān)(Aye,MT et al,1992,ExpHematol,20(4):523-527)。由于SCF具有多種生物學(xué)功能，臨床上，SCF在許多方面都具有較好的應(yīng)用前景。初步的動(dòng)物、人體實(shí)驗(yàn)表明其在一些疾病如多種貧血、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)及相關(guān)疾病的治療與預(yù)防，放療、化療的保護(hù)，體外造血以及基因治療等方面都具有很好的效果(Zsebo,KM etal,1992,Proc Natl Acad Sci USA,89(23):9464-9468；Luskey,BD et al,1992,Blood,80(2):396-402)。
在生理狀態(tài)下，SCF含量極微，僅靠生化手段從細(xì)胞培養(yǎng)、體內(nèi)組織中分離與純化來(lái)供科研、臨床應(yīng)用是非常困難的。雖然通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得的天然hSCF基因在E.coli可以進(jìn)行表達(dá)，但表達(dá)水平不是很高，一般占合成蛋白總量的13％左右(Martin,FM et al,1990,Cell,63(2):203-211；Langley,KE etal,1992,Arch Biochem Biophys,295(1):21-28)，要想在E.coli中高效表達(dá)，有一定的困難。
本發(fā)明的目的是提供一種可以在大腸桿菌中高效表達(dá)、人工合成的人干細(xì)胞因子編碼基因。
本發(fā)明人工合成的人干細(xì)胞因子編碼基因，其核苷酸序列如下5＇GGAATTCAATGG AAGGTATCTG CCGTAACCGT GTTACTAACA ATGTTAAAGA CGTTACTAAA 623＇GTTACC TTCCATAGAC GGCATTGGCA CAATGATTGT TACAATTTCT GCAATGATTTCTGGTAGCTA ACCTGCCGAA AGACTACATG ATCACCCTGA AATACGTTCC GGGTATGGAC 122GACCATCGAT TGGACGGCTT TCTGATGTAC TAGTGGGACT TTATGCAAGG CCCATACCTGGTTCTGCCGA GCCACTGCTG GATCAGCGAA ATGGTTGTAC AGCTGTCTGA CTCTCTGACT 182CAAGACGGCT CGGTGACGAC CTAGTCGCTT TACCTTCATG TCGACAGACT GAGAGACTGA
GATCTGCTGG ACAAATTCTC TAACATCTCT GAGGGCCTGT CTAACTACTC TATCATCGAC 242CTAGACGACC TGTTTAAGAG ATTGTAGAGA CTCCCGGACA GATTGATGAG ATAGTAGCTGAAACTGGTAA ACATCGTTGA CGACCTGGTT GAATGCGTTA AAGAAAACTC TTCTAAAGAC 302TTTGACCATT TGTAGCAACT GCTGGACCAA CTTACGCAAT TTCTTTTGAG AAGATTTCTGCTGAAAAAAT CTTTCAAAAG CCCGGAACCG CGTCTGTTCA CTCCGGAAGA GTTCTTCCGT 362GTCTTTTTTA GAAAGTTTTC GGGCCTTGGC GCAGACAAGT GAGGCCTTCT CAAGAAGGCAATCTTCAACC GTTCTATCGA CGCTTTCAAG GACTTCGTAG TTGCATCTGA AACTAGCGAC 422TAGAAGAAGG CAAGATAGCT GCGAAAGTTC CTGAAGCATC AACGTAGACT TTGATCGCTGTGCGTTGTTT CTTCTACCCT GTCTCCGGAA AAAGACTCTC GTGTTTCTGT TACCAAACCG 482ACGCAACAAA GAAGATGGGA CAGAGGCCTT TTTCTGAGAG CACAAAGACA ATGGTTTGGCTTCATGCTGC CGCCGGTTGC TTAAG 3＇ 512AAGTACGACG GCGGCCAACG AATTCAGCTG GCA5＇本發(fā)明在設(shè)計(jì)SCF的合成基因時(shí)，參考Climie,S et al,1990,Proc Natl AcadSci USA,87(2):633-637；Barry,A et al,1987,Proc Natl Acad SciUSA,84(22):8961-8965的工作，采用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行了多方面的輔助分析，并考慮以下幾點(diǎn)1)、密碼子的選擇密碼子的使用與表達(dá)效率的高低存在明顯的關(guān)系，為了實(shí)現(xiàn)hSCF基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)，選擇了E.coli偏愛(ài)的密碼子。考慮以后在其它宿主(如，酵母)中進(jìn)行表達(dá)，直接得到活性產(chǎn)物的可能，在密碼子的選擇上，盡量選擇了兩者共同的偏愛(ài)密碼。
2)、寡核苷酸片段長(zhǎng)度的選擇寡核苷酸片段的長(zhǎng)度，決定合成SCF全基因所需寡核苷酸片段的數(shù)目。長(zhǎng)度太短，則所需寡核苷酸片段數(shù)目會(huì)增加，相應(yīng)地合成、純化的工作量以及基因組裝的困難也會(huì)增加；長(zhǎng)度太長(zhǎng)，又會(huì)使合成中出現(xiàn)錯(cuò)誤的幾率增加。既要充分利用現(xiàn)有DNA合成儀的合成能力，又要將合成、克隆中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤降低到最小，依據(jù)國(guó)外報(bào)導(dǎo)，50-70個(gè)核苷酸較好(Climie,S et al,1990,ProcNatl Acad Sci USA,87(2):633-637)，本發(fā)明選擇了60個(gè)寡核苷酸的長(zhǎng)度。
3)、對(duì)應(yīng)寡核苷酸片段互補(bǔ)序列長(zhǎng)短的選擇為了能全部混合退火，連接，實(shí)現(xiàn)基因的一次性組裝，對(duì)應(yīng)片段之間必需有較大的互補(bǔ)性，本發(fā)明選擇了50％的互補(bǔ)性。
4)、酶切位點(diǎn)的添加與去除為了基因的克隆、表達(dá)以及以后進(jìn)行基因融合等工作操作方便，首先通過(guò)同義密碼的選擇，除去了基因內(nèi)部大部分的常用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，并且在相當(dāng)于SCF的N-端前面，添加了起始密碼ATG、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ位點(diǎn)及相應(yīng)的保護(hù)性堿基，在SCF的C-端后面，添加了終止密碼TAA和SalⅠ位點(diǎn)。
5)、避免復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成如在合成的基因中存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)如重復(fù)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、大段的回紋結(jié)構(gòu)等，勢(shì)必會(huì)增加基因組裝的困難，影響基因表達(dá)的效率。翻譯起始區(qū)復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在，還會(huì)直接影響翻譯起始效率甚至阻止翻譯的進(jìn)行，因此，以pBV220為表達(dá)載體，通過(guò)翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，借助同義密碼、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)及保護(hù)性堿基的選擇，盡量去除合成基因中，尤其是起始密碼子前后的復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)。
根據(jù)以上設(shè)計(jì)的合成策略，本發(fā)明分成18個(gè)片段，合成了SCF的全基因，其序列如

圖1、圖2所示。根據(jù)設(shè)計(jì)原則，在不改變氨基酸序列的前提下，通過(guò)密碼子的替換，對(duì)可溶形式的hSCF基因進(jìn)行了較大改動(dòng)在核苷酸水平上變化約23％(114/492)，在密碼子水平上，變化約63％(103/164)，并且去除了天然基因內(nèi)部原先存在的EcoRⅠ、XmaⅠ、SmaⅠ、PstⅠ等位點(diǎn)，在兩端引進(jìn)了EcoRⅠ、SalⅠ位點(diǎn)，中間引進(jìn)了HincⅡ、PvuⅡ位點(diǎn)。由于PvuⅡ位點(diǎn)剛好位于hSCF蛋白預(yù)測(cè)的高級(jí)結(jié)構(gòu)中兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的連接處附近，為hSCF的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究以及以hSCF為材料進(jìn)行蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)提供了便利。而合成的hSCF基因插入pBV220以后，預(yù)測(cè)的翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)表明SD序列位于一個(gè)較大的開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)中，起始密碼ATG前后也都沒(méi)有較復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，應(yīng)有利于合成的hSCF基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)。
應(yīng)用本發(fā)明的人干細(xì)胞因子編碼基因，在大腸桿菌中得到的目的蛋白占菌體總蛋白的40％以上，表達(dá)量得到了顯著提高。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1為合成的可溶形式的hSCF基因的核苷酸序列圖2為合成、天然hSCF基因核苷酸序列的比較圖3為PCR產(chǎn)物分析圖4為菌落原位雜交圖5為pUC19/SCF的限制性酶切分析圖6為合成的可溶形式的hSCF基因的核苷酸序列測(cè)定圖7為pBV220/SCF的限制性酶切分析圖8為42℃誘導(dǎo)后，工程菌不同時(shí)期的總蛋白電泳圖譜圖9為工程菌發(fā)酵時(shí)相的控制在下面的實(shí)施例中，所涉及到的材料如下1、菌種及質(zhì)粒E.coli JM109(recAlsupE44endAlhsdR17gyrA96relAlthiΔ(lac-proAB)F＇[traD36proAB+lacIqlacZΔM15])E.coli DH5α(supE44ΔlacU169(φ80lacΔM15)hsdR17recAlendAlgyrA96thi-lrelAl)質(zhì)粒pUC19質(zhì)粒pBV2202、培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基在900ml的水中，加入蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，攪拌直至完全溶解，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加水至1000ml,15磅高壓蒸氣滅菌20分鐘。
LB固體培養(yǎng)基上述LB液體培養(yǎng)基加1.5％(W/V)瓊脂粉。
M9培養(yǎng)基在900ml的水中，加入6gNa2HPO4,3gKH2PO4,0.5gNaCl,1g NH4Cl，攪拌直至完全溶解，最后用水補(bǔ)足總體積至1000ml，高壓滅菌，使用前加分開(kāi)滅菌的20％的葡萄糖溶液20ml,1M MgSO42ml,1M CaCl20.1ml。
M9 CA培養(yǎng)基上述M9培養(yǎng)基內(nèi)加入0.1-0.2％的酪蛋白水解物。
3、工具酶及其緩沖液限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ,T4噬菌體DNA連接酶，T4噬菌體多核苷酸激酶，Taq聚合酶以及DNA Marker等為Biolab、Promeg、華美等公司產(chǎn)品。
限制性內(nèi)切酶高鹽緩沖液(10×):500mM Tris-HCl(pH7.5),1M NaCl,0.1M MgCl2,10mM DTT。
T4噬菌體DNA連接酶緩沖液(10×):200mM Tris-HCl(pH7.6),50mMMgCl2,50mM DTT,0.5mg/ml小牛血清白蛋白(BSA)T4噬菌體多核苷酸激酶緩沖液(10×):0.5M Tris-HCl(pH7.6),50mMDTT,0.1M MgCl2,1mM鹽酸亞精胺，1mM EDTA(pH8.0)PCR緩沖液(10×):500mM KCl,00mM Tris-HCl(pH8.3),15mM MgCl24、實(shí)驗(yàn)中所用溶液4.1、SDS-PAGE分離蛋白所用試劑Tris-甘氨酸電泳緩沖液250mM甘氨酸，25mM Tris-HCl(pH8.3)，0.1％SDS分離膠緩沖液375mM Tris-HCl(pH8.8),0.1％SDS濃縮膠緩沖液125mM Tris-HCl(pH6.8),0.1％SDS30％丙烯酰胺貯液29％丙烯酰胺，1％亞甲基雙丙烯酰胺樣品緩沖液50mM Tris-HCl(pH6.8),2％SDS,100mM DTT(現(xiàn)用現(xiàn)加)，0.1％溴酚蘭，10％甘油考馬斯亮蘭R250染色液0.25％(W/V)考馬斯亮蘭R250,45％甲醇，10％冰乙酸脫色液45％甲醇，10％冰乙酸蛋白Marker:Promega公司產(chǎn)品4.2、菌落原位雜交所用溶液SSC液(20×):3M氯化鈉，0.3M檸檬酸鈉，氫氧化鈉調(diào)pH7.0Denhardt試劑(50×):1％聚蔗糖(Ficoll,400型；Pharmacia),1％聚乙烯咯烷酮，1％牛血清白蛋白(組分V；Sigma)鮭魚精DNA將鮭魚精DNA溶于水至10mg/ml的終濃度，調(diào)節(jié)NaCl的濃度至0.1M，用酚、酚氯仿各抽提一次，回收水相，超聲剪切DNA，乙醇沉淀，回收DNA，適量水溶解，測(cè)定溶液OD260，調(diào)節(jié)DNA終濃度至10mg/ml，煮沸10分鐘，20℃保存。臨用前沸水浴5分鐘，冰浴驟冷。
變性液0.5M NaOH,1.5M NaCl中和液0.5M Tris-HCl,1.5M NaCl預(yù)洗液5×SSC,0.5％SDS,1mM EDTA(pH8.0)預(yù)雜交液6×SSC,5×Denhart＇s,0.1％SDS,50％甲酰胺，100μg/ml經(jīng)變性并被打斷的鮭魚精DNA。
雜交液預(yù)雜交液中加入標(biāo)記好探針即為雜交液4.3、電轉(zhuǎn)移緩沖液39mM Gly,48mM Tris堿，0.037％SDS,20％甲醇4.4、TE緩沖液10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA4.5、TBE緩沖液89mM Tris-硼酸，2mM EDTA(pH8.0)4.6、PBS緩沖液10mM NaH2PO4-Na2HPO4(pH7.0),0.15M NaCl5、其它材料IPTG、X-gal為德國(guó)Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品，酵母提取物、蛋白胨、RPMI-1640、3％瓊脂粉為日本制藥株式會(huì)社產(chǎn)品，酸水解酪蛋白(CasaminoAcids)為Difco公司產(chǎn)品，低熔點(diǎn)瓊脂糖、超純瓊脂糖、考馬斯亮蘭R250為英國(guó)Serva公司產(chǎn)品，聚丙烯酰胺、二硫蘇糖醇DTT為Sigema公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜為Millipore公司產(chǎn)品，T7 Sequencing Kit為Parmacia公司產(chǎn)品，同位素為福瑞公司產(chǎn)品，氨芐青霉素、鏈霉素、溶菌酶為上海第三制藥廠產(chǎn)品，馬血清購(gòu)自豐臺(tái)軍馬所。
在下面的實(shí)施例中，所涉及到的方法如下1、質(zhì)粒DNA的制備與純化質(zhì)粒DNA的快速抽提、大量制備，都是采用堿變性法，參照文獻(xiàn)Sambrook,J et al,1989,Molecular Cloning,2nd ed.,CSHL Press,New York．進(jìn)行。獲得高純度的質(zhì)粒采用Sephorose 2B柱層析法以去除RNA。用TE-NaCl緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)，收集A260第一個(gè)峰(如體積太大可用正丁醇先濃縮)，加1/10體積的3MNaAC(pH5.2)及兩倍體積的無(wú)水乙醇，置于液氮?dú)庀嘀?5-20分鐘或-20℃過(guò)夜，4℃ 12,000g離心15分鐘，沉淀用70％乙醇洗兩次，真空抽干，TE溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、限制性內(nèi)切酶酶切按不同的限制性內(nèi)切酶的具體要求進(jìn)行。一般取待酶切DNA 1μg，加限制性內(nèi)切酶3-5個(gè)單位，反應(yīng)體積15-20μl，適當(dāng)溫度水浴1-2個(gè)小時(shí)，取少量樣品電泳檢測(cè)酶切效果。
3、DNA片段的回收DNA酶切片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，采用凍融法或低熔點(diǎn)瓊脂糖法進(jìn)行回收。
凍融法在長(zhǎng)波紫外燈下將待回收片段從瓊脂糖凝膠上切下，盡量去掉不含DNA的部分，將膠條放在1.5ml的離心管內(nèi)，置于液氮?dú)庀嘀?分鐘，使膠條冰凍，取出室溫融化，12,000g離心5分鐘，取上清，反復(fù)兩次，將上清液合并，用等體積酚抽提一次，取上清，再用酚氯仿、氯仿各抽提一次。取上清，用乙醇沉淀回收DNA。
低熔點(diǎn)瓊脂糖法待凝膠冷卻凝固后，于4℃進(jìn)行電泳以保證凝膠不會(huì)熔化。當(dāng)目的DNA條帶電泳到適當(dāng)位置時(shí)，切下含該DNA的凝膠，加入5倍體積的20mMTrisHCl(pH8.0),1mM EDTA的緩沖液，65℃水浴5-10分鐘，使低熔點(diǎn)瓊脂糖熔化，冷卻至室溫后，用等體積酚抽提一次，取上清，再用酚氯仿、氯仿各抽提一次。取上清，用乙醇沉淀回收DNA。
4、DNA片段的連接與轉(zhuǎn)化在DNA的粘性末端連接反應(yīng)中，控制載體與目的DNA片段的克分子比為1∶1-1∶1.5，12℃連接12-16小時(shí)，取連接反應(yīng)物約20-30ng，加入0.2ml感受態(tài)細(xì)菌，冰浴40分鐘，42℃水浴中保溫1-2分鐘，加0.8mlLB培養(yǎng)基，37℃或30℃靜置培養(yǎng)45分鐘。取適當(dāng)稀釋的培養(yǎng)物0.1ml，涂布于含氨芐青霉素的平板中，37℃或30℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，4℃保存。
5、單鏈DNA探針的制備用T4噬菌體多核苷酸激酶(T4 PNK)進(jìn)行5＇-末端標(biāo)記。取純化好的寡核苷酸片段約10pmol，加入3μl[γ-32p]ATP(10μCi/μl),2μl 10倍的T4噬菌體多核苷酸激酶緩沖液，8-10個(gè)單位的T4PNK以及去離子水至總體積20μl，混勻，37℃反應(yīng)45-60分鐘，68℃加熱15分鐘以滅活激酶。此法制備的探針可直接用于雜交，不必進(jìn)一步純化(Sambrook,J et al,1989,MolecularCloning,2nd ed.,CSHL Press,New York.)。
6、菌落原位雜交用無(wú)菌牙簽將轉(zhuǎn)化后待篩選菌落點(diǎn)種于硝酸纖維素膜上，同時(shí)復(fù)制一套對(duì)照平皿，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，4℃保存對(duì)照平皿。用平頭鑷子揭下濾膜，菌落面朝上置于用10％SDS浸過(guò)的濾紙上，以固定菌落。3分鐘后，將濾膜轉(zhuǎn)移到用變性液飽和的濾紙上堿變性7分鐘，然后再將濾膜轉(zhuǎn)移至用中和液飽和的濾紙上，中和5分鐘，重復(fù)3次。同樣操作，用2×SSC液處理5分鐘，固定DNA。使菌落面朝上，于室溫自然干燥至少30分鐘以后，80℃烘烤1-2小時(shí)。取出濾膜，用2×SSC液浸泡5分鐘，移至大體積預(yù)洗液中平緩搖動(dòng)，50℃溫浴30分鐘，然后移到預(yù)雜交液中，55℃保溫4-6小時(shí)，再于雜交液中55℃保溫過(guò)夜。取出濾膜，用2×SSC/0.1％SDS液于56℃洗滌濾膜3-4次，每次15分鐘。待濾膜自然干燥后，-70℃下壓片，放射自顯影(Sambrook,J et al,1989,Molecular Cloning,2nd ed.,C SHL Press,New York.)。
7、DNA序列的測(cè)定參照Sanger的雙脫氧末端終止法進(jìn)行測(cè)定，使用Pharmacia公司T7Sequnencing Kit。直接用質(zhì)粒作模板，正反引物從兩個(gè)方向進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)在美國(guó)Applied Biosystem公司373A型DNA自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行。
實(shí)施例1、基因片段的合成與克隆，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體1、寡核苷酸片段的化學(xué)合成在美國(guó)Applied Biosystem公司381A型DNA合成儀上采用固相亞磷酸胺法合成。
2、合成片段的后處理及純化用29％的濃氨水于室溫反應(yīng)3小時(shí)，從固相支持物上將寡核苷酸水解下來(lái)。水解液轉(zhuǎn)移至60℃水浴中，溫浴8-16小時(shí)，再用16％的聚丙烯酰胺/6M尿素變性膠分離，含有產(chǎn)物條帶的凝膠用0.5M NaCl的水溶液于37℃浸泡過(guò)夜，浸出液通過(guò)C18反相層析柱得以純化。純化產(chǎn)物測(cè)定OD260，按10D260=34μg單鏈DNA計(jì)算濃度，真空干燥，備用。
3、基因片段的5’-端的磷酸化，退火連接將已純化的各寡核苷酸片段用去離子水溶解，各取100pmol，在含有1×T4PNK buffer,10mmol ATP,5個(gè)單位的PNK的40μl的反應(yīng)體系中，37℃溫浴30-45分鐘，68℃溫浴20分鐘，以滅活PNK，終止反應(yīng)。
取20μl上述反應(yīng)物，95℃煮沸5分鐘，緩慢降至58℃，維持30℃經(jīng)1-2小時(shí)冷卻以后，在含有1mM ATP、10mM DTT、1×連接酶緩沖液、10個(gè)單位的T4DNA連接酶的反應(yīng)體系中，于12℃連接過(guò)夜。
4、PCR擴(kuò)增將連接反應(yīng)物1∶10稀釋，取20μl作為模板，以A1、B1(如圖1所示)為引物，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增基因。PCR反應(yīng)總體積為50μl，其中含有引物各1μM，四種脫氧核苷酸各0.2mM,Taq聚合酶4個(gè)單位。反應(yīng)條件為95℃變性1分鐘，58℃退火30秒，70℃延伸45秒，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，完成基因的一次性組裝，其PCR結(jié)果如圖3所示(其中帶1為DNA標(biāo)記pBR322+HinfⅠ，帶2為PCR擴(kuò)增結(jié)果，帶3為pUC19+EcoRⅠ+SalⅠ；帶4為pUC19)，經(jīng)擴(kuò)增確證得到了0.5Kb的DNA片段。
5、合成hSCF基因的克??；構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體；轉(zhuǎn)化大腸桿菌；篩選轉(zhuǎn)化菌落回收PCR擴(kuò)增的基因片段，經(jīng)EcoRⅠ、SalⅠ酶切以后，與用同樣限制性內(nèi)切酶酶切過(guò)的pUC19連接，重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂布于含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的平板上，培養(yǎng)過(guò)夜，挑取白色菌落，以合成的寡核苷酸片段A3(如圖1所示)為探針，以B7、B8(如圖1所示)為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行菌落原位雜交，結(jié)果如圖4所示(菌斑1為陽(yáng)性對(duì)照，菌斑2為陰性對(duì)照)。隨機(jī)挑選一個(gè)陽(yáng)性克隆，接種培養(yǎng)，抽提DNA進(jìn)行質(zhì)粒大小、酶切鑒定。結(jié)果表明重組質(zhì)粒的大小為3.2Kb，用EcoRⅠ、SalⅠ酶切，顯示單一切點(diǎn)；進(jìn)行雙酶切，能切出一條0.5Kb大小的片段，如圖5所示(帶1為DNA標(biāo)記pBR322+HinfⅠ，帶2為pUC19/SCF+EcoRⅠ+SalⅠ；帶3為pUC19/SCF+EcoRⅠ；帶4為pUC19/SCF+SalⅠ；帶5為pUC19，電泳結(jié)果與設(shè)計(jì)完全一致，證明確實(shí)含有全長(zhǎng)可溶形式的hSCF基因。
6、基因的全序列測(cè)定為進(jìn)一步證實(shí)合成基因的完全正確性，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了序列分析。以雙鏈為模板，用正反兩種引物，通過(guò)Sanger雙脫氧鏈終止法同時(shí)從兩個(gè)方向進(jìn)行全序列測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了多個(gè)陽(yáng)性克隆，同一克隆重復(fù)測(cè)定兩次，其中一個(gè)克隆的SCF合成基因的序列與設(shè)計(jì)的完全一致，此重組質(zhì)粒命名為pUC19/SCF。又對(duì)該克隆進(jìn)行了全自動(dòng)測(cè)序，結(jié)果如圖6所示，與手工測(cè)定結(jié)果完全一致。
實(shí)施例2、工程菌的構(gòu)建用EcoRⅠ、SalⅠ同時(shí)酶切pUC-19/SCF質(zhì)粒，以低熔點(diǎn)瓊脂法回收大小約0.5kb的SCF片段，與用同樣限制性內(nèi)切酶處理的pBV220進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。連接的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含氨芐青霉素的平板，30℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子接種培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒電泳，進(jìn)行質(zhì)粒大小和EcoRⅠ、SalⅠ酶切鑒定，如圖7所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期的一致，證實(shí)此即表達(dá)質(zhì)粒pBV220/SCF，含有此質(zhì)粒的菌株即為可用于發(fā)酵表達(dá)的工程菌株。
實(shí)施例3、工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)從含有可溶形式的hSCF基因的工程菌LB斜面挑選單菌落，接種至LB培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期(OD600約0.65)，5％接種于M9CA培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)過(guò)夜，再將過(guò)夜培養(yǎng)物以2％的比例接種于M9CA培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)，OD600上升到0.5左右，進(jìn)行42℃水浴熱誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)，適當(dāng)時(shí)間收獲。
實(shí)施例4、工程菌的搖瓶培養(yǎng)將工程菌在30℃培養(yǎng)，以擴(kuò)增質(zhì)粒拷貝數(shù)，然后轉(zhuǎn)到42℃培養(yǎng)。由于30℃培養(yǎng)時(shí)，積累了大量的質(zhì)粒拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)到42℃時(shí)，使CⅠ阻抑物失活，啟動(dòng)SCF基因的大量表達(dá)。工程菌的裂解物的電泳行為表明，在分子量約為19KD的地方，新增了一條明顯蛋白帶，相當(dāng)于可溶形式的hSCF蛋白的大小。應(yīng)用Pharmacia LKB Ultro ScanXL激光掃描儀對(duì)膠進(jìn)行密度掃描(633nm)，結(jié)果該蛋白帶占菌體總蛋白的40％左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)外報(bào)導(dǎo)(Langley,KE etal,1992,Arch Biochem Biophys,295(1):21-28)，說(shuō)明獲得了高效表達(dá)可溶形式的hSCF基因工程菌株。
也可以采用聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE法(Laemmli,UK et al,1970,Nature,227:680-685)對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。其做法是，樣品事先用樣品溶解緩沖液煮沸4-5分鐘后，取10-15μl進(jìn)行電泳。電泳時(shí)，濃縮膠的濃度為5％，分離膠為12％-15％，電泳板10mm×7mm×1mm,20mA恒流，電泳時(shí)間1.5-2小時(shí)。電泳畢，用考馬斯亮蘭R250染色4小時(shí)以上，脫色液脫色，至背景清亮為止。然后經(jīng)激光密度掃描儀掃描，測(cè)定目的蛋白的含量。
實(shí)施例5、工程菌發(fā)酵時(shí)相的控制為了確定搖瓶培養(yǎng)時(shí)，工程菌在30℃生長(zhǎng)到什么程度進(jìn)行誘導(dǎo)，以及42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)多長(zhǎng)時(shí)間收獲，能獲得最大收獲量，發(fā)明人首先觀察了細(xì)菌在30℃培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線，如圖9所示(曲線1為30℃下的生長(zhǎng)曲線；曲線2為42℃誘導(dǎo)后的生長(zhǎng)曲線；曲線3為不同時(shí)段下hSCF的合成；曲線4為相對(duì)收獲產(chǎn)量)2％接種，在300ml培養(yǎng)量/3000ml搖瓶中，培養(yǎng)4-5小時(shí)，其OD600可達(dá)到0.5左右，細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，分裂旺盛，因此選擇此時(shí)進(jìn)行42℃熱誘導(dǎo)。在42℃誘導(dǎo)后，每隔1小時(shí)取樣，測(cè)定其OD600值并進(jìn)行SDS-PAGE分析，觀察其表達(dá)情況，結(jié)果如圖8所示(凝膠上的數(shù)字是42℃處理后的時(shí)數(shù)，凝膠下的數(shù)字是rhSCF占總蛋白的百分比)，42℃誘導(dǎo)以后，比生長(zhǎng)率有一個(gè)明顯的升高，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其OD600值逐漸上升，持續(xù)6-7個(gè)小時(shí)，才趨于穩(wěn)定；SCF的表達(dá)量，也在6-7小時(shí)以后，達(dá)到最高，因此其相對(duì)收獲量(OD600與表達(dá)量的乘積)也最高，所以選擇42℃誘導(dǎo)6-7小時(shí)進(jìn)行收獲。
實(shí)施例6、SCF表達(dá)產(chǎn)物的純化及物化測(cè)定1、包涵體的制備發(fā)酵液經(jīng)4℃離心(3,000rpm,15分鐘)，收集菌體。菌體用適當(dāng)體積PBS洗滌兩次，然后每1g左右的濕菌體加10ml的2mg/ml溶菌酶/溶液W(50mMTris-HCl pH8.0/10mM EDTA)重懸，室溫輕微振蕩30分鐘，然后再用超聲發(fā)生器冰浴超聲破菌，4℃離心(14,000g,20分鐘)，棄上清，沉淀即為包涵體。
2、包涵體的洗滌沉淀先用3％Triton X-100/0.2％脫氧膽酸鈉/溶液W洗兩次，再用2.0M尿素/溶液W洗一次。所有洗滌過(guò)程都在室溫進(jìn)行，輕微攪拌30-45分鐘，4℃離心(14,000g,15分鐘)。保留沉淀，取少量上清電泳，觀察洗滌效果。
3、包涵體的溶解沉淀用8M尿素/溶液S(50mMTris-HCl pH8.0/1mM EDTA/0.03％疊氮化鈉)溶解。室溫輕微攪拌，至大部分沉淀溶解，4℃離心(17,000g,30分鐘)，除去不溶雜質(zhì)，上清用于電泳鑒定、折疊復(fù)性以及進(jìn)一步純化。溶解過(guò)程中，控制SCF的總濃度在3-4mg/ml左右。
4、rhSCF的復(fù)性向包涵體溶解液中加入2％的鏈霉素，4℃放置20-30分鐘，4℃離心(12,000g,15分鐘)，除去絮狀沉淀保留上清。再向上清中加入DTT至終濃度為10mM,30℃保溫30分鐘，用溶液S稀釋，至SCF終濃度約0.3mg/ml左右，移入透析袋內(nèi)，4℃用10-20倍體積的2M尿素/溶液S透析72小時(shí)，輕微攪拌，中間更換透析液一次。
透析液4℃離心(17,000g,30分鐘)，保留上清，沉淀再用少量8M尿素/10mMDTT/溶液S重新溶解、透析。合并兩次透析液，再對(duì)大體積溶液S透析，最終除去尿素。此即復(fù)性好的rhSCF粗提物。
5、rhSCF的進(jìn)一步純化(1)酸沉淀粗提物用10％的HAC調(diào)節(jié)pH至4.0，用50mM NaAC-HAC(pH4.0)透析30分鐘，出現(xiàn)絮狀沉淀，4℃離心(17,000g,30分鐘)除去沉淀，保留上清。
(2)離子交換層析取酸沉淀上清進(jìn)行陽(yáng)離子交換。
離子交換柱Pharmacia C16/20(2×16cm)介 質(zhì)Pharmacia Sp-Sepharose Fast Flow平 衡 液50mM NaAC-HAC(pH4.0)洗 脫 液0-0.3M NaCl/50mM NaAC-HAC(pH4.0)流 速120ml/hr
操 作用平衡液充分平衡柱體，直至pH值、電導(dǎo)值恒定。上樣，用平衡液充分沖洗，然后上NaCl梯度，上行液流洗脫分步收集，各層析峰進(jìn)行電泳檢測(cè)和活性測(cè)定。
(3)凝膠過(guò)濾層析凝膠過(guò)濾柱Pharmacia CK 26/100(5×100cm)介 質(zhì)Pharmacia Sephacryl S-200(HR)平 衡 液PBS洗 脫 液PBS流 速60ml/hr操 作用至少2倍床體積的平衡液充分平衡柱體以后，以5％的柱體積上樣，上行液流洗脫，分步收集，各層析峰進(jìn)行電泳檢測(cè)和活性測(cè)定。
實(shí)施例7、N-末端氨基酸序列分析約10μg純化樣品SDS-PAGE進(jìn)一步分離以后，經(jīng)10mA恒流45-60分鐘電轉(zhuǎn)印至事先用甲醇浸泡過(guò)30分鐘的PVDF膜上，用去離子水漂洗PVDF膜2-3次，再用0.1％考馬斯亮蘭、10％冰醋酸、50％甲醇對(duì)膜染色1-2分鐘，用10％冰醋酸、50％甲醇脫色，去離子水沖洗，剪下相應(yīng)于目的帶的部分，直接用于N-端氨基酸的序列分析。
實(shí)施例8、rhSCF的生物活性的測(cè)定根據(jù)rhSCF對(duì)人骨髓細(xì)胞粒、巨核系集落形成的影響，確定其生物學(xué)活性。
1、正常人骨髓單細(xì)胞懸液的制備取自301醫(yī)院胸外科手術(shù)病人的肋骨，無(wú)菌操作取出骨髓以RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，然后用淋巴細(xì)胞分層液制成單個(gè)細(xì)胞懸液。
2、CFU-GM半固體培養(yǎng)依次加入1640培養(yǎng)液；2×105/ml細(xì)胞懸液；終濃度30％的馬血清；HMCM(終濃度10％、5％)；SCF(終濃度10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml)37℃保溫15分鐘，緩慢滴加煮沸的3％瓊脂，立即混勻，倒進(jìn)36mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿1ml，均勻鋪平，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10天、14天，觀察集落形成情況，以大于40個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)計(jì)為一個(gè)集落。rhSCF的含量通過(guò)考馬斯亮蘭R250染色結(jié)合蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確定。結(jié)果表明，本發(fā)明的rhSCF可刺激人骨髓細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致粒、巨核系集落(CFU-GM)的大小、數(shù)量的明顯增加，具有天然hSCF的生物活性。
權(quán)利要求
1.一種人工合成的人干細(xì)胞因子編碼基因，其核苷酸序列如下5＇GGAATTCAATGG AAGGTATCTG CCGTAACCGT GTTACTAACA ATGTTAAAGA CGTTACTAAA 623＇GTTACC TTCCATAGAC GGCATTGGCA CAATGATTGT TACAATTTCT GCAATGATTTCTGGTAGCTA ACCTGCCGAA AGACTACATG ATCACCCTGA AATACGTTCC GGGTATGGAC 122GACCATCGAT TGGACGGCTT TCTGATGTAC TAGTGGGACT TTATGCAAGG CCCATACCTGGTTCTGCCGA GCCACTGCTG GATCAGCGAA ATGGTTGTAC AGCTGTCTGA CTCTCTGACT 182CAAGACGGCT CGGTGACGAC CTAGTCGCTT TACCTTCATG TCGACAGACT GAGAGACTGAGATCTGCTGG ACAAATTCTC TAACATCTCT GAGGGCCTGT CTAACTACTC TATCATCGAC 242CTAGACGACC TGTTTAAGAG ATTGTAGAGA CTCCCGGACA GATTGATGAG ATAGTAGCTGAAACTGGTAA ACATCGTTGA CGACCTGGTT GAATGCGTTA AAGAAAACTC TTCTAAAGAC 302TTTGACCATT TGTAGCAACT GCTGGACCAA CTTACGCAAT TTCTTTTGAG AAGATTTCTGCTGAAAAAAT CTTTCAAAAG CCCGGAACCG CGTCTGTTCA CTCCGGAAGA GTTCTTCCGT 362GTCTTTTTTA GAAAGTTTTC GGGCCTTGGC GCAGACAAGT GAGGCCTTCT CAAGAAGGCAATCTTCAACC GTTCTATCGA CGCTTTCAAG GACTTCGTAG TTGCATCTGA AACTAGCGAC 422TAGAAGAAGG CAAGATAGCT GCGAAAGTTC CTGAAGCATC AACGTAGACT TTGATCGCTGTGCGTTGTTT CTTCTACCCT GTCTCCGGAA AAAGACTCTC GTGTTTCTGT TACCAAACCG 482ACGCAACAAA GAAGATGGGA CAGAGGCCTT TTTCTGAGAG CACAAAGACA ATGGTTTGGCTTCATGCTGC CGCCGGTTGC TTAAG 3＇ 512AAGTACGACG GCGGCCAACG AATTCAGCTG GCA5＇
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人工合成的人干細(xì)胞因子編碼基因,在不改變氨基酸序列的前提下,通過(guò)密碼子的替換,選擇大腸桿菌的偏愛(ài)密碼子,去除了天然基因內(nèi)部原先存在的EcoRⅠ、XmaⅠ、SmaⅠ、PstⅠ等位點(diǎn),在兩端引進(jìn)了EcoRⅠ、SalⅠ位點(diǎn),中間引進(jìn)了HincⅡ、PvuⅡ位點(diǎn)。由于PvuⅡ位點(diǎn)剛好位于hSCF蛋白預(yù)測(cè)的高級(jí)結(jié)構(gòu)中兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的連接處附近,為hSCF的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究以及以hSCF為材料進(jìn)行蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)提供了便利。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1314470SQ01109409
公開(kāi)日2001年9月26日 申請(qǐng)日期2001年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月8日
發(fā)明者趙志虎, 曹誠(chéng), 馬清鈞 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所