專(zhuān)利名稱(chēng)：由茶樹(shù)葉生產(chǎn)微體幼芽的一步法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由茶樹(shù)葉生產(chǎn)微體幼芽的新一步法。
茶是一種受歡迎的具有抗癌特性的含咖啡因飲料(Jankun等，為什么飲茶可以預(yù)防癌癥，《自然》(Nature)5561；1997)。雖然山茶屬有許多種，但僅C.sinensis(L.)O.Kuntze或茶及其諸如Chinary、Assamica和Cambod的不同栽培品種在商業(yè)上是很重要的(Braua D.N.“茶樹(shù)貿(mào)易”于Barua D.N.編輯，《茶葉栽培中的科學(xué)和實(shí)踐》中，加爾各答茶研究協(xié)會(huì)；53-68；1989)。
茶葉栽培不僅是重要的職業(yè)提供源、而且也是世界所有茶葉生長(zhǎng)地區(qū)掙取外匯的主要途徑(Wilson，K.C.編輯的《咖啡、可可和茶》中的“植物學(xué)和植物改良”，CABI出版，Wallingford，UK167-173；1999)。但是，茶葉的總產(chǎn)量不足以滿(mǎn)足本國(guó)和世界市場(chǎng)的需要(Kabra，G.D.，1999年茶葉統(tǒng)計(jì)資料，《茶時(shí)代》(Tea time)Vol VIII，No.3 9-11，99，30-31；1999)。由于不同的生命性的(真菌、害蟲(chóng)和病毒)和非生命的(冰凍、冰雹、寒冷、干旱、營(yíng)養(yǎng)不良等)應(yīng)力使茶葉的產(chǎn)率和質(zhì)量進(jìn)一步降低(Wilson，K.C.編輯的《咖啡、可可和茶》中的“植物學(xué)和植物改良”，CABI出版，Wallingford，UK167-173；1999)。
實(shí)際屬于木本樹(shù)種的茶樹(shù)具有較長(zhǎng)的生活周期以及高度自身不相容性和近親繁殖蕭條(Barua D.N.編輯，《茶葉栽培中的科學(xué)和實(shí)踐》中的Barua D.N.“茶樹(shù)貿(mào)易”，加爾各答茶研究協(xié)會(huì)；53-68；1989)，這通常限制了通過(guò)常規(guī)的育種方法生產(chǎn)高產(chǎn)率且優(yōu)等和抗應(yīng)力茶樹(shù)。因此，生物技術(shù)方法的應(yīng)用是一種有效且可供選擇的方法。但是，預(yù)先必備一種有效率且能繁殖的再生方法對(duì)于生物技術(shù)應(yīng)用是最重要的。
茶葉中的最嚴(yán)重問(wèn)題是水皰枯萎病，因?yàn)樗趾τ糜谥撇璧娜~子和幼芽，結(jié)果產(chǎn)率下降了50％。因此，抑制水皰枯萎病對(duì)于彌補(bǔ)這些損失是非常急需的。已確定了一些具有高產(chǎn)率和高質(zhì)量但易患水皰枯萎病的克隆，因此需要通過(guò)諸如葉外植體的同源組織的生物技術(shù)改良，因?yàn)橹T如子葉外植體的異質(zhì)組織會(huì)導(dǎo)致基因分離和所需的高產(chǎn)率和高質(zhì)量的特性的喪失。因此，現(xiàn)存的方法在于諸如子葉外植體的異質(zhì)組織不具有上述有關(guān)用途并且還需要保持優(yōu)良植物特性類(lèi)型的準(zhǔn)確。因此，急需發(fā)展采用同源組織的微體繁殖的方法。葉外植體的再生是最佳的優(yōu)選，因?yàn)?i)葉外植體是同源的；(ii)葉外植體的再生總是產(chǎn)生忠實(shí)于原始的選擇性?xún)?yōu)良特性類(lèi)型的植物；(iii)葉子含有極大量復(fù)制數(shù)的葉綠體DNA，因此在進(jìn)行任何基因操作時(shí)如轉(zhuǎn)基因或體細(xì)胞雜交的研制中使用葉子，則葉子表達(dá)可以擴(kuò)增數(shù)倍；(iv)葉子為任何基因操作技術(shù)提供了大量表面；(v)葉子是市售的成品茶的主要商業(yè)來(lái)源；(vi)葉子提供了豐富的原料供應(yīng)；(vii)采用葉子作為外植體不會(huì)防礙一般的好的特性和植物的生長(zhǎng)；倘若在再生過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)體細(xì)胞克隆變異，那么通過(guò)體細(xì)胞雜交或通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的生物技術(shù)作物改良通常需要經(jīng)愈傷組織相的再生。由于茶樹(shù)壽命長(zhǎng)，與快速生長(zhǎng)的草本植物相比，愈傷組織相中的染色體變異的可能性要低。因此，本申請(qǐng)報(bào)道了使用經(jīng)愈傷組織相的微體繁殖茶樹(shù)的有效一步法。如果使用葉外植體或如果植物為50年或更長(zhǎng)的非常老的樹(shù)，木本植物的再生能力很差。
為了產(chǎn)生經(jīng)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的植物或經(jīng)愈傷組織相的未定形幼芽形成，但要么轉(zhuǎn)化頻率低(4-6％)或要么生根很少，已將葉外植體用于山茶屬的其它觀賞植物種中，即C.japonica和C.reticulata(Sanjose，M.C.和Vieitez，A.M.成熟Camellia reticulata的體外葉子的未定形幼芽再生，《園藝科學(xué)雜志》(J.Hort.Sci.)67677-683；1992；Sanjose，M.C.和Vieitez，A.M.“通過(guò)胚胎發(fā)生和柄莖發(fā)生來(lái)源于葉外植體培養(yǎng)物的山茶屬小植株的再生”，《園藝科學(xué)》(Sci.Horti.)，54303-315；1993；Pedroso，M.C.和Pais，M.S.的C.japonica L.葉中的直接胚胎形成”，《植物細(xì)胞再配(Rep.)》12639-643；1993)。而且，這些均是觀賞植物種。但是，沒(méi)有有關(guān)通過(guò)茶即商用的山茶屬或茶樹(shù)中的愈傷組織、用于未定形幼芽形成的葉外植體的植物再生的方法的報(bào)道。至今也沒(méi)有從茶或任何其它觀賞植物種中的葉外植體再生幼芽的一步法的報(bào)道。
為了研究葉外植體的再生方法，Nakamura Y.在1984年做了首次嘗試(茶樹(shù)體外繁殖的有效方法，Proc.Internat.Symp.有關(guān)茶葉產(chǎn)量的最近發(fā)展，中國(guó)，臺(tái)灣，198463-74頁(yè))，其中愈傷組織是在補(bǔ)充有茁長(zhǎng)素2，4-二氯苯氧乙酸的Nitsch和Nitsch培養(yǎng)基(Nitsch，J.P.和Nitsch C.，來(lái)源于花粉粒的單倍體植物，《科學(xué)》(Sci.)(Washington)，16385-87；1969)和Gamborg培養(yǎng)基(Gamborg，O.L.，Miller，R.A.和Ojima，K.大豆根細(xì)胞的懸浮液培養(yǎng)物的營(yíng)養(yǎng)需要，《實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究》50151-58；1968)中獲得的。該方法的缺點(diǎn)是盡管在形態(tài)發(fā)生的不同步驟中使用了不同的培養(yǎng)基，但未能獲得形態(tài)發(fā)生或未定形幼芽形成。
在1985年，Nakamura(Nakamura，Y.外植體的起源對(duì)茶樹(shù)組織培養(yǎng)中的根的分化和其不同品種的影響，Shizuoka茶實(shí)驗(yàn)站621-8；1985)和Palni、Sood、Chand、Sharma、Rao和Jain(Palni，L.M.S.Sood，A.，Chand，G.，Sharma，M.，Rao，D.V.，Jain，N.K.茶中的組織培養(yǎng)研究，Proc.International Sym.有關(guān)茶葉科學(xué)，Shizuoka，日本，395-399，1991)又嘗試了經(jīng)愈傷組織相的葉外植體的植物再生，其中從葉愈傷組織中獲得了生根或根形成，但是缺點(diǎn)是這種生根愈傷組織沒(méi)有產(chǎn)生根并且使用了兩種不同的培養(yǎng)基。此后，直至1996年才有有關(guān)葉外植體的植物再生的報(bào)道，其中Kato(Kato，M.體外生長(zhǎng)的茶幼芽的未成熟葉的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，《植物細(xì)胞再配(Rep.)》15920-926；1996)從來(lái)源于Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige T.和Skoog F.A用于煙草組織培養(yǎng)的快速生長(zhǎng)和生物測(cè)定的改進(jìn)培養(yǎng)基，《植物生理學(xué)》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中的體外生長(zhǎng)植物的葉外植體的體細(xì)胞胚胎得到了一些植物，該培養(yǎng)基補(bǔ)充在液體中的0.5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸和0.8％瓊脂固化培養(yǎng)基中的5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸。
Kato的方法的主要缺點(diǎn)列舉如下(i)有關(guān)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的外植體應(yīng)答的百分比非常低(6％)；(ii)供體植物是導(dǎo)致子代中的基因變異的樹(shù)苗；(iii)體細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)化為植物的頻率非常低，即7.1％；(iv)將被誘導(dǎo)的胚胎控制在葉的特定區(qū)域內(nèi)、而不從所有葉表面為它們提供不適合的轉(zhuǎn)基因研究；(v)不包括用于從具有優(yōu)良特性的成熟的選擇性矮樹(shù)叢中培養(yǎng)葉外植體的系統(tǒng)，而包括從樹(shù)苗的葉外植體中的胚胎發(fā)生愈傷組織的開(kāi)發(fā)；(vi)樹(shù)苗代表異質(zhì)群體，而從選擇性成熟樹(shù)收集的外植體具有優(yōu)良特性，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^(guò)克隆或無(wú)性繁殖方式進(jìn)行繁殖；(vii)將不同的培養(yǎng)基用于諸如胚胎誘導(dǎo)、第二次胚胎發(fā)生和胚胎萌發(fā)的不同步驟過(guò)程。
本發(fā)明的主要目的是在單一步驟中從茶樹(shù)的葉外植體開(kāi)發(fā)健壯的幼芽；
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將有關(guān)的外源基因引入葉外植體并通過(guò)直接biolistic槍或間接植物肥大病菌屬來(lái)開(kāi)發(fā)大量基因修飾植物；本發(fā)明還有一個(gè)目的是開(kāi)發(fā)一種有效的微體繁殖方法，該方法是使用單一植物生長(zhǎng)激素的合算的單一步驟法；本發(fā)明還有一個(gè)目的是通過(guò)在塑料陪替氏培養(yǎng)皿(可經(jīng)高壓滅菌的)中使用僅25ml的培養(yǎng)基和通過(guò)避免傳代培養(yǎng)、開(kāi)發(fā)一種從葉外植體微體繁殖茶的合算且勞動(dòng)效率高的有效方法；本發(fā)明還有一個(gè)目的是在一旦雜交體愈傷組織形成的情況下、不需進(jìn)一步傳代培養(yǎng)而開(kāi)發(fā)一種用于來(lái)源于原生質(zhì)體的葉的微體繁殖和體細(xì)胞雜交的有效方法；本發(fā)明還有另一個(gè)目的是將有關(guān)基因引入原生質(zhì)體并研究其表達(dá)；本發(fā)明的另一個(gè)目的是在病毒的診斷程序中促進(jìn)病毒顆粒的吸收。
因此，本發(fā)明提供了在單一步驟中從茶樹(shù)的葉外植體開(kāi)發(fā)健壯幼芽的新方法。
因此，本發(fā)明提供了一種從葉外植體微體繁殖茶的新的、高效率的、簡(jiǎn)單的、合算且勞動(dòng)效率高的方法，其中幼芽可從市售的山茶屬或茶樹(shù)的任何栽培品種(即Chinary、Cambod或Assamica)的葉發(fā)育而成。將幼芽尖端的第二和第三葉置于9.0cm塑料陪替氏培養(yǎng)皿(可高壓滅菌的)中的含2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10.0mg/l)但優(yōu)選5.0mg/l的2，4-D的25ml標(biāo)準(zhǔn)基本Murashige和Skoog培養(yǎng)基中，沒(méi)有任何類(lèi)型的新鮮培養(yǎng)基中的傳代培養(yǎng)。在至少2-4周后但優(yōu)選2周后于所有葉外植體的表面觀察到愈傷組織。在至少4-6周后但優(yōu)選4周后于同樣的陪替氏培養(yǎng)皿中的同樣培養(yǎng)基中觀察到生根或根形成。最終，4-6周后但優(yōu)選4周后在同樣的陪替氏培養(yǎng)皿中的同樣培養(yǎng)基中也觀察到幼芽形成。本方法的新穎性在于(a)不需要任何后續(xù)步驟；(b)僅需要一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10.0mg/l)；(c)不需傳代培養(yǎng)；(d)整個(gè)方法僅在該方法開(kāi)始時(shí)需要25ml培養(yǎng)基；(e)在同一培養(yǎng)基(當(dāng)其漸漸減少時(shí))中可觀察到形態(tài)發(fā)生(生根和幼芽形成)的所有步驟，因此使得該方法合算且勞動(dòng)效率高。
因此，本發(fā)明提供了從茶葉外植體生產(chǎn)微體幼芽的新一步法，該方法僅包含約10-16周的單一步驟，其中(a)將任何栽培品種(即Chinary、Assamica和Cambod)的體外培養(yǎng)植物的葉外植體置于9.0cm可高壓滅菌的塑料陪替氏培養(yǎng)皿中的補(bǔ)充有維生素如維生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、維生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和煙酸(0.25-1.5mg/l)與甘氨酸(1.0-3.0mg/l)、2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10mg/l)的25ml瓊脂固化的(0.8-1.0％)標(biāo)準(zhǔn)基本Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige T.和SkoogF.A用于煙草組織培養(yǎng)的快速生長(zhǎng)和生物測(cè)定的改進(jìn)培養(yǎng)基，《植物生理學(xué)》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中；(b)2-4周后但優(yōu)選2周后在同樣的培養(yǎng)基中觀察到愈傷組織發(fā)育；(c)4-6周后在同樣但部分減少的培養(yǎng)基中的葉愈傷組織上觀察到生根或根形成；(d)最終，4-6周后在同樣但幾乎干燥且減少了的培養(yǎng)基中的生根愈傷組織上也觀察到幼芽形成；(e)將如此形成的幼芽轉(zhuǎn)移至含液體培養(yǎng)基的繁殖培養(yǎng)基中以進(jìn)行繁殖，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有5μm苯基噻二唑基脲(Sandal I.，BhattacharyaA.和Ahuja P.S.2001.用于茶樹(shù)幼芽繁殖的高效液體培養(yǎng)系統(tǒng)，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)00.1-6)；(f)用吲哚-3-丁酸處理至少3.0cm長(zhǎng)幼芽的切除末端20-30分鐘、并轉(zhuǎn)移至覆蓋有廣口瓶的無(wú)菌沙土混合物(1∶1)中至少60-75天，然后轉(zhuǎn)移至開(kāi)放的塑料罐(Sandal I.，BhattacharyaA.和Ahuja P.S.2001。用于茶樹(shù)幼芽繁殖的高效液體培養(yǎng)系統(tǒng)，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)00.1-6)中。
在一個(gè)實(shí)施方式中，將選擇性植物的三個(gè)栽培品種(Chinary、Assamica和Cambod)的新鮮的完全折疊的、半開(kāi)放的或全張開(kāi)的葉作為外植體。將此葉子在含多菌靈(0.1％)和鏈霉素(0.05％)的溶液中清洗、在吐溫20中洗滌和在含一滴液體清潔劑的0.01％(w/v)氯化汞溶液中表面滅菌、然后在無(wú)菌蒸餾水中徹底洗滌。然后將表面滅菌后的外植體按上述方法培養(yǎng)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，如上所述使用雜交栽培品種Chinary、Assamica和Cambod的體外或間接體外培養(yǎng)的選擇性植物的葉外植體i)將任何栽培品種的雜交體的體外培養(yǎng)的完全折疊的、半開(kāi)放的或全張開(kāi)的葉外植體置于9.0cm可高壓滅菌的塑料陪替氏培養(yǎng)皿中的標(biāo)準(zhǔn)的基本Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige T.和Skoog F.A用于煙草組織培養(yǎng)的快速生長(zhǎng)和生物測(cè)定的改進(jìn)培養(yǎng)基，《植物生理學(xué)》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有維生素例如維生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、維生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和煙酸(0.25-1.5mg/l)與甘氨酸(1.0-3.0mg/l)、以及最重要的2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10mg/l)，將其在同樣的培養(yǎng)皿中在冷熒光(52μmolm-2s-1)下于25±2℃培養(yǎng)10-16周，然后在同樣培養(yǎng)基中進(jìn)行生根和最終的未定形幼芽形成。
ii)10-16周后切除從上述步驟得到的幼芽，并令其在含3％蔗糖和5μM苯基噻二唑基脲的20ml靜態(tài)液體培養(yǎng)基中繁殖(SandalI.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001.用于茶樹(shù)幼芽繁殖的高效液體培養(yǎng)系統(tǒng)，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)00.1-6)。
iii)使微幼芽生根，即通過(guò)用5.0mg/l的吲哚-3-丁酸處理切除的末端，并在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下將其種在覆蓋有倒轉(zhuǎn)廣口瓶的罐中的1∶1沙∶土無(wú)菌混合物中8周，然后在室溫下將生根的幼芽轉(zhuǎn)移至塑料罐中(Sandal I.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001.用于茶樹(shù)幼芽繁殖的高效液體培養(yǎng)系統(tǒng)，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)00.1-6)。
培養(yǎng)基中存在高濃度的2，4-二氯苯氧乙酸可誘導(dǎo)活性細(xì)胞分裂和未分化生長(zhǎng)、導(dǎo)致植物組織中的愈傷組織形成。培養(yǎng)基中有特定濃度的2，4-二氯苯氧乙酸時(shí)的愈傷組織形成可能是由于細(xì)胞內(nèi)2，4-D水平吸收增加引起的。但是當(dāng)愈傷組織在培養(yǎng)基中停留延長(zhǎng)一段時(shí)期(即10-16周)，在培養(yǎng)基中和細(xì)胞內(nèi)的2，4-二氯苯氧乙酸水平有進(jìn)行性稀釋?zhuān)瑢?dǎo)致連續(xù)的愈傷組織生長(zhǎng)。這樣減少了培養(yǎng)基中和細(xì)胞內(nèi)的2，4-二氯苯氧乙酸水平以及培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)部分減少，可能導(dǎo)致應(yīng)急性情形、因而導(dǎo)致形態(tài)發(fā)生或大量根形成。而且，由于培養(yǎng)基的變干和減少而致的培養(yǎng)基中的2，4-二氯苯氧乙酸和營(yíng)養(yǎng)水平的減少可能導(dǎo)致幼芽形成和同時(shí)的愈傷組織變干。通過(guò)隨愈傷組織生長(zhǎng)或根生長(zhǎng)的任一形式的經(jīng)過(guò)時(shí)間和培養(yǎng)基的逐漸減少而進(jìn)行性消退的2，4-二氯苯氧乙酸，可能獲得形態(tài)發(fā)生每一步中的2，4-二氯苯氧乙酸水平的臨界閾值。當(dāng)在2，4-D減少的培養(yǎng)基中出現(xiàn)足夠的根生長(zhǎng)和連續(xù)愈傷組織生長(zhǎng)時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)幼芽。因此，由于培養(yǎng)基減少而至的每一步形態(tài)發(fā)生中的2，4-二氯苯氧乙酸的細(xì)胞內(nèi)閾值、其消退和應(yīng)急性情形對(duì)于通過(guò)去分化指導(dǎo)葉組織進(jìn)行再生過(guò)程可能是必需的。
避免了上述缺點(diǎn)的本方法的新特點(diǎn)如下(i)本方法包括從葉外植體生產(chǎn)茶幼芽的單一步驟；(ii)葉外植體反應(yīng)的百分比高(幾乎100％)；(iii)發(fā)現(xiàn)選自成熟的茶樹(shù)(間接體外和體外兩者)的葉外植體反應(yīng)效率高；(iv)該方法對(duì)于選擇性/優(yōu)良克隆的克隆繁殖非常有效；(v)該方法也可用于來(lái)源于樹(shù)苗的葉外植體；(vi)該方法對(duì)折疊的和未折疊的葉子均有效；(vii)該方法對(duì)任何栽培品種(Chinary、Assamica和Cambod)的葉外植體均有效；(viii)該方法涉及從所有表面發(fā)育的愈傷組織形成、而不局限于在體細(xì)胞胚胎情況下葉表面的特殊區(qū)域；(ix)本方法能產(chǎn)生10-15％以上無(wú)定形幼芽形成、而后它可生根發(fā)育成健壯植物；(x)本發(fā)明首次報(bào)道了在葉外植體上發(fā)展最高頻率的茶幼芽愈傷組織形成的“一步”法。這是與以前未能通過(guò)未定形幼芽、甚至采用許多步驟從葉外植體獲得植物的所有以前的報(bào)道相對(duì)比的結(jié)果；(xi)與Kato(1996)建議的方法相比，本方法提供了生產(chǎn)較高頻率基因轉(zhuǎn)化茶樹(shù)的潛在能力。這是因?yàn)榕c由于特定區(qū)域誘導(dǎo)而致的低頻率的基因轉(zhuǎn)化體細(xì)胞胚胎相比，該方法為單個(gè)細(xì)胞提供了可能性，即將該細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化以具有極大的繁殖機(jī)會(huì)、并產(chǎn)生成功的轉(zhuǎn)化體。


圖1表示在葉外植體上的愈傷組織的誘導(dǎo)和繁殖；圖2表示來(lái)源于葉外植體的所有愈傷組織的生根(生根表示未定形生長(zhǎng)途徑轉(zhuǎn)變至形態(tài)發(fā)生途徑的轉(zhuǎn)變點(diǎn))；圖3表示在葉愈傷組織上形成的根的未定形幼芽的形成；圖4表示從葉外植體間接發(fā)育的生根微體幼芽。
下面的實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明，因此不應(yīng)將其視為對(duì)本發(fā)明范圍的限定。
實(shí)施例1當(dāng)在25±2℃和52μmolm-2s-1冷熒光16小時(shí)光照下將其置于補(bǔ)充有維生素如維生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、維生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和煙酸(0.25-1.5mg/l)與甘氨酸(1.0-3.0mg/l)和2.5-10mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(pH 5.6±0.2)的(0.8-1.0％)瓊脂固化基本Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige T.和Skoog F.A用于煙草組織培養(yǎng)的快速生長(zhǎng)和生物測(cè)定的改進(jìn)培養(yǎng)基，《植物生理學(xué)》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中10-16周時(shí)，任何重要栽培品種(Chinary、Assamica和Cambod)的體外培養(yǎng)植物的完全折疊的、半開(kāi)放的或全張開(kāi)的葉植物的葉都是反應(yīng)性外植體。培養(yǎng)開(kāi)始后1-2周愈傷組織在補(bǔ)充有維生素如維生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、維生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和煙酸(0.25-1.5mg/l)與甘氨酸(1.0-3.0mg/l)和2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10mg/l)的基本Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige T.和Skoog F.A，用于煙草組織培養(yǎng)的快速生長(zhǎng)和生物測(cè)定的改進(jìn)培養(yǎng)基，《植物生理學(xué)》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中發(fā)育，然后在同樣但變干且減少的培養(yǎng)基中4-6周后生根、又4-6周后幼芽形成。將如此形成的幼芽轉(zhuǎn)移至含液體培養(yǎng)基的繁殖培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有5μm苯基噻二唑基脲(Sandal I.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001。用于茶樹(shù)幼芽繁殖的高效液體培養(yǎng)系統(tǒng)，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)00.1-6)，用吲哚-3-丁酸處理至少3.0cm長(zhǎng)幼芽的切除末端20-30分鐘、并轉(zhuǎn)移至覆蓋有廣口瓶的無(wú)菌沙土混合物(1∶1)中至少60-75天，然后轉(zhuǎn)移至開(kāi)放的塑料罐中。
實(shí)施例2用來(lái)自Himalayan生物資源技術(shù)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)研究所，Banuri，Palampur(36°N和78.18°E和1290m以上的海平面)的任何重要栽培品種(Chinary、Assamica和Cambod)的50年齡選擇性植物的完全折疊的、半開(kāi)放的或全張開(kāi)的葉外植體(從幼芽尖端的第二和第三葉)的葉作為外植體。用黑貂毛制成的毛刷和液體清潔劑徹底清洗該葉子，在含(0.1％)多菌靈和(0.05％)鏈霉素的吐溫20中洗滌并在含一滴液體清潔劑的0.01％氯化汞溶液中進(jìn)行表面滅菌、然后在蒸餾水中徹底清洗。將滅菌后的外植體按上面所述方法中的每個(gè)細(xì)節(jié)進(jìn)行類(lèi)似培養(yǎng)。
實(shí)施例3在25±2℃溫度下和52μmolm-2s-1冷熒光16小時(shí)光照下將其它雜交栽培品種的體外培養(yǎng)植物的完全折疊的、半開(kāi)放的或全張開(kāi)的葉外植體的葉置于補(bǔ)充有維生素如維生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、維生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和煙酸(0.25-1.5mg/l)與甘氨酸(1.0-3.0mg/l)和2.5-10mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(pH 5.6±0.2)的(0.8-1.0％)瓊脂固化基本Murashige和Skoog培養(yǎng)基(Murashige T.和Skoog F.A，用于煙草組織培養(yǎng)的快速生長(zhǎng)和生物測(cè)定的改進(jìn)培養(yǎng)基，《植物生理學(xué)》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中以發(fā)育愈傷組織，1-2周后，在同樣的培養(yǎng)基中4-6周后生根、又4-6周后幼芽形成。將如此形成的幼芽轉(zhuǎn)移至含液體培養(yǎng)基的繁殖培養(yǎng)基中繁殖，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有5μm苯基噻二唑基脲(Sandal I.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001，用于茶樹(shù)幼芽繁殖的高效液體培養(yǎng)系統(tǒng)，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)00.1-6)，為了生根，用吲哚-3-丁酸處理至少3.0cm長(zhǎng)幼芽的切除末端20-30分鐘、并轉(zhuǎn)移至覆蓋有廣口瓶的無(wú)菌沙土混合物(1∶1)中至少60-75天，然后轉(zhuǎn)移至開(kāi)放的塑料罐中(Sandal I.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001，用于茶樹(shù)幼芽繁殖的高效液體培養(yǎng)系統(tǒng)，植物細(xì)胞組織器官培養(yǎng)00.1-6)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)為(1)健壯植物可從真正同源的葉組織如葉外植體中再生；(2)本發(fā)明可用于產(chǎn)生抗水皰枯萎病植物；
(3)本方法也可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交；(4)本方法可通過(guò)直接傳遞法用于葉綠體轉(zhuǎn)化；(5)由于與沒(méi)有中間愈傷組織的葉組織的直接再生相比，愈傷組織細(xì)胞的快速繁殖期間可產(chǎn)生單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化體的快速繁殖，因此本方法是發(fā)展高頻率轉(zhuǎn)基因的最佳方法；(6)由于與以前報(bào)道中的特定區(qū)域的體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)相比，愈傷組織是從所有葉表面發(fā)育的，因此通過(guò)此方法的轉(zhuǎn)化體的頻率大大高于現(xiàn)存方法；(7)本發(fā)明可用于將有關(guān)基因引入原生質(zhì)體的發(fā)育方法和用于研究其表達(dá)；(8)本發(fā)明可用于促進(jìn)病毒顆粒的吸收；(9)本發(fā)明可用于產(chǎn)生具有諸如細(xì)胞質(zhì)雄性不育的母系遺傳特征、抗諸如莠去凈的除草劑的植物；(10)與預(yù)先存在方法中使用50-100ml培養(yǎng)基相比，在可高壓滅菌的陪替氏培養(yǎng)皿中僅使用25ml培養(yǎng)基是一種合算的方法；(11)由于整個(gè)過(guò)程中不需要傳代培養(yǎng)且僅需要25ml培養(yǎng)基，因此本發(fā)明方法是合算的；(12)由于不需要傳代培養(yǎng)本發(fā)明也是勞動(dòng)效率高的。
權(quán)利要求
1.一種從茶樹(shù)葉外植體生產(chǎn)微幼芽的新的一步方法，它包括約10-16周，其中(a)切除來(lái)源于用于愈傷組織誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的茶樹(shù)植物的外植體，該外植體在補(bǔ)充有選自維生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、維生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和煙酸(0.25-1.5mg/l)與甘氨酸(1.0-3.0mg/l)、2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10mg/l)的維生素的標(biāo)準(zhǔn)基本Murashige和Skoog培養(yǎng)基中保持2-4周，優(yōu)選2周后，(b)4-6周后將愈傷組織培養(yǎng)物保持在用于生根或根形成的同樣但部分減少了的培養(yǎng)基中，(c)4-6周后使生根愈傷組織在同樣但幾乎干燥且減少了的培養(yǎng)基中生根，(d)將用于繁殖的步驟(c)形成的幼芽轉(zhuǎn)移至含補(bǔ)充有5μM苯基噻二唑基脲的液體培養(yǎng)基的繁殖培養(yǎng)基中，(e)切斷長(zhǎng)幼芽的末端至少約3.0cm，用吲哚-3-丁酸處理幼芽末端20-30分鐘、將其轉(zhuǎn)移并保持在含沙土混合物(1∶1)的廣口瓶中至少60-75天得到小植株，(f)將小植株轉(zhuǎn)移至開(kāi)口的塑料罐中得到健壯的有活力的茶樹(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中外植體是選自Chinary、Assamica和Cambod的茶葉栽培品種。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)誘導(dǎo)葉外植體中的分生組織的活性，來(lái)源于任何茶樹(shù)栽培品種及其雜交體的葉外植體被用于間接幼芽形成。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)誘導(dǎo)葉外植體中的分生組織的活性，來(lái)源于生長(zhǎng)體內(nèi)和體外條件下的選擇性植物的任何茶樹(shù)栽培品種的葉外植體被用于間接幼芽形成。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使用的是來(lái)源于任何折疊至完全展開(kāi)的葉子的葉外植體。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中外植體是從幼芽尖端的第二和第三葉切除的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中培養(yǎng)基包括標(biāo)準(zhǔn)的基本瓊脂固化(0.8-1.0％)Murashige和Skoog培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的pH為5.8、補(bǔ)充有維生素例如維生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、維生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和煙酸(0.25-1.5mg/l)與甘氨酸(1.0-3.0mg/l)、以及最重要的2.5-10mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸，優(yōu)選10.0mg/l。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中外植體被置于步驟(i)的補(bǔ)充有2.5-10mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸的培養(yǎng)基中至少10-16周，優(yōu)選12周。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的茁長(zhǎng)素選自吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中僅一種茁長(zhǎng)素是用于葉外植體的健壯幼芽的再生。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中僅使用了可高壓滅菌的9.0cm陪替氏培養(yǎng)皿中的25ml培養(yǎng)基。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中不需要穿戴培養(yǎng)，并且本方法是簡(jiǎn)單的一步法。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在52μmolm-2s-1的冷熒光下的16小時(shí)光照期被用于所有培養(yǎng)物且培養(yǎng)基的pH為5.6-5.9。
全文摘要
本發(fā)明提供了從經(jīng)愈傷組織相的葉外植體微體繁殖茶樹(shù)的一步法,其中從愈傷組織的誘導(dǎo)階段至生根和幼芽形成的階段,將外植體在補(bǔ)充有維生素例如維生素B
文檔編號(hào)C12N5/02GK1375190SQ0110982
公開(kāi)日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2001年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月20日
發(fā)明者因德拉·桑達(dá)爾, 阿米塔·巴塔查里亞, 馬杜·夏爾馬, P·S·阿胡賈 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會(huì)