專利名稱：一種產紅色素的海洋細菌及利用這種細菌生產紅色素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種產紅色素的海洋細菌菌株及利用這種細菌生產紅色素的方法。本發(fā)明還涉及一種紅色素。
色素分為合成色素和天然色素，合成色素不但無營養(yǎng)價值還有不同程度的毒性，有些甚至可致癌，因此在食品和化妝品工業(yè)中使用的越來越少，取而代之的是安全性好，并具有一定營養(yǎng)價值和藥理功能的天然色素，但目前開發(fā)的天然色素種類遠不能滿足市場的需要。
現(xiàn)有的天然色素大多由植物和低等動物組織提取，由于動植物野生資源有限，栽培或養(yǎng)殖所需要的周期長，原材料的成本高和供應不足，限制了生產的規(guī)模。微生物繁殖快，能通過人工培養(yǎng)大量獲得，是一類具有較高開發(fā)潛力的生物資源，特別是海洋微生物代謝產物的獨特和新穎已得到國內外科技界的肯定。
目前國內外都有一些有關微生物發(fā)酵產生色素的報道，但在工業(yè)生產中應用的很少。陸地真菌紅曲霉，生產的色素用作食品添加劑，是目前唯一在市場上使用的用微生物生產的色素。紅曲霉培養(yǎng)需要熟稻米作為固體培養(yǎng)基，生長繁殖周期較長，而且單一的天然紅色素很難滿足市場需要，目前國內化妝品使用的紅色素大多為化學合成色素。利用海洋微生物人工培養(yǎng)提取色素，國內外均未報道。不少海洋微生物都能產生色素，但一般色素產生量較少，肉眼觀察菌落顏色淺，色素的產生極不穩(wěn)定，溫度、光照、營養(yǎng)都會影響其色素的產生，不能做為生產色素的菌株。
本發(fā)明的目的是提供一種產紅色素的海洋細菌。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種利用本發(fā)明的細菌生產紅色素的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種天然紅色素。
本發(fā)明提供了一種產紅色素的海洋細菌，菌株代號S-9801。其形態(tài)為桿狀或弧桿狀，0.5-1.2μm，無芽孢，周生鞭毛，運動型，革蘭氏染色陰性，在蛋白胨培養(yǎng)基(每1L海水含氮源0.5％、碳源0.2％)28℃培養(yǎng)24h，形成的菌落近園形，較光滑，鮮紅色，色素不溶于培養(yǎng)基。該菌株對石蕊牛奶有胨化作用；葡萄糖氧化反應陽性；氧化酶陰性；觸酶陰性。初步鑒定為黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)菌株在15℃-35℃的培養(yǎng)溫度下均能生長，25℃-28℃為最適生長溫度，在這一溫度下，菌株液體培養(yǎng)12小時開始產生色素，培養(yǎng)36小時，菌株產生的色素可達最大值。
S-9801菌株在培養(yǎng)液所含的NaCl濃度0-5.0％的范圍內均可生長，但培養(yǎng)液的NaCl濃度為0時，菌株生長很差，不能產生色素。NaCl濃度為5.0％時，菌株生長正常，產生的色素量較少。菌株在NaCl濃度1.0-3.0％的范圍內生長良好，產生的色素量大，NaCl濃度在這一范圍內變化，對菌株生長和色素產量的影響不明顯。
菌株在培養(yǎng)液的pH 3-9的范圍內均可生長，并產生紅色素。pH值為9時，菌株生長與其它處理差異不大，但產生的色素量較少，適宜生長pH 4-8。
經測定，S-9801菌株適合的人工培養(yǎng)基為蛋白胨或胰蛋白胨5-7g酵母粉1-3g，葡萄糖2-4g，NaCl 20-30g，MgCl.6H2O1.1-2.3g，KCl 0.15-0.3g，瓊脂17g，水1000ml。培養(yǎng)所需溫度25℃-28℃，pH 4-8。
S-9801菌株適合液體生長，可以通過發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，具有占用的空間小，生產規(guī)模較易控制的特點，有利于大規(guī)模生產。海洋細菌S-9801菌株，生命力強，對營養(yǎng)要求簡單，生長范圍寬，產生的紅色素，對酸、堿、熱、光的耐受能力強，經中國醫(yī)科院藥物篩選中心所做的動物毒性試驗表明，該色素毒性很低。同時菌株可通過發(fā)酵罐液體發(fā)酵大量獲取，其生長繁殖速度較已有的天然色素生物資源快。紅色素色彩鮮艷，作為化妝品使用的天然紅色素，具有很好的發(fā)展前景。
本發(fā)明的海洋細菌S-9801已于2000年12月27日在中國菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏，保藏中心地址為北京，中關村，郵政編碼100080。保藏號為CGMCC NO.0527本發(fā)明還提供了一種生產天然紅色素的方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明的海洋細菌和從培養(yǎng)物中提取紅色素。
在上述方法中，本發(fā)明的菌株的培養(yǎng)在胰蛋白胨(優(yōu)選0.7％重量)+酵母粉(優(yōu)選0.3％重量)為氮源，葡萄糖(優(yōu)選0.3％重量)為碳源，NaCl濃度為1.8％-2.1％(重量)，pH6-7，溫度28℃的條件液體培養(yǎng)，產生的色素可達1.5g/L。
從培養(yǎng)物中分離紅色素時可將發(fā)酵液pH調整至2-4，最好為3左右。這時色素沉降最徹底。在進行提取時，最好使用醇類溶劑，優(yōu)選用乙醇做溶劑，這樣可使色素更安全。
本發(fā)明還提供了一種由本發(fā)明的海洋細菌生產的紅色素。色素干燥粗品為玫瑰紅色，純品為深紅色，外界環(huán)境在pH12以下為紅色，pH值為12或12以上色調變?yōu)辄S色。色素對光、熱具有較好的穩(wěn)定性。
S-9801菌株產生的色素顏色鮮艷，色素產量大，菌株產生色素的性質較穩(wěn)定。S-9801野生菌株來自海水，海水的低營養(yǎng)環(huán)境造就其對營養(yǎng)要求不嚴格的特性。
我國是人口大國，食品和化妝品工業(yè)所需要的色素量很大，目前使用的色素大多為合成色素，天然色素用量不足10％。其中天然色素種類少，生產規(guī)模小，價格貴是主要原因。而天然色素產量低主要又因為生物資源缺乏或成本高。S-9801菌株的發(fā)現(xiàn)不但為我國天然色素增加一個新品種，更重要的是該菌株可通過液體發(fā)酵罐工業(yè)化生產，因此，該發(fā)明必將對我國的天然色素工業(yè)產生積極的推動作用，同時，這一發(fā)現(xiàn)也將為海洋生物資源的利用開辟一條新途徑。
菌株以蛋白胨培養(yǎng)液為基本培養(yǎng)液，分別在15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、條件下培養(yǎng)，觀察產生紅色素的時間，然后置適宜的溫度下培養(yǎng)，分別于12、24、36、48、60h取樣一次，用752型紫外分光光度計，測OD538值，分析菌體培養(yǎng)色素產量達最大的時間。
試驗結果表明，S-9801菌株在培養(yǎng)液所含的NaCl濃度0-5.0％的范圍內均可生長，但培養(yǎng)液的NaCl濃度為0時，菌株生長很差，不能產生色素。NaCl濃度為5.0％時，菌株生長正常，產生的色素量較少。菌株在NaCl濃度1.0-3.0％的范圍內生長良好，產生的色素量大，NaCl濃度在這一范圍內變化，對菌株生長和色素產量的影響不明顯。
S-9801菌株在培養(yǎng)液的pH 3-9的范圍內均可生長，并產生紅色素。pH值為9時，菌株生長與其它處理差異不大，但產生的色素量較少。
菌株在15℃-35℃的培養(yǎng)溫度下均能生長，25-28℃為最適生長溫度，在這一溫度下，菌株液體培養(yǎng)12小時即可達到對數(shù)生長期，并開始產生色素，培養(yǎng)36小時，菌株產生的色素可達最大值。
表1 S-9801菌株在培養(yǎng)液NaCl、pH、不同和培養(yǎng)溫度、時間不同時產生色素情況表
實施例2S-9801菌株的試驗室培養(yǎng)和色素粗品的獲得蛋白胨5g酵母粉2g，葡萄糖2g，NaCl 21g，MgCl.6H2O 1.8g，KCl0.2g，瓊脂17g，水1000ml。溫度25℃-28℃，調節(jié)培養(yǎng)液pH6-7，滅菌，倒入平皿，冷卻后接入S-9801菌株，培養(yǎng)24h的新鮮菌苔，再接入胰蛋白胨7g酵母粉3g，葡萄糖3g，NaCl 21g，MgCl.6H2O1.8g，KCl 0.2g，水1000ml。pH6-7的無菌培養(yǎng)液中，裝樣量120ml/250ml，150rpm，28℃，振蕩培養(yǎng)30分鐘左右，細菌開始繁殖，12小時菌株繁殖達指數(shù)生長期，并開始產生色素，培養(yǎng)24-36小時后取出，調節(jié)發(fā)酵液到pH3，離心(5000rpm)10分鐘，棄去上清液，沉淀物加入無水乙醇(每1000ml發(fā)酵液的沉淀物加入200ml乙醇)充分溶解后保留乙醇溶液，重復3次，合并乙醇溶液，將乙醇經旋轉蒸發(fā)蒸干，即可獲得紅色素粗提物。
表2 不同pH值對菌體的沉降效果
從表中可以看出，pH值在3～4時，菌體的沉降效果最好。
采用氯仿直接萃取法和調pH值使菌體沉降再用乙醇提取法，均可獲得色素粗品，前一種方法操作簡單，發(fā)酵液直接加入氯仿即可提取，每1000ml發(fā)酵液最高可獲得色素粗品1.3g，但氯仿用量大，同時氯仿的毒性也較大；后一種方法需要將發(fā)酵液調適當pH值使菌體沉降后離心，再用乙醇提取，操作稍復雜，但節(jié)約溶劑，乙醇毒性較小，菌體沉降后提取較完全，每1000ml發(fā)酵液最高可獲得色素粗品1.5g，因此用乙醇提取法更為合適。
紅色素粗提物經100℃濕熱處理1h，干燥處理2h，其顏色與40℃干燥處理差異不大，吸光度損失率分別為0和7.1％。粗提色素置自然光下10d，或紫外光處理不超過1h，吸光度值未見發(fā)生變化，紫外光處理超過1小時，吸光度損失率為6.7％。色素經中國醫(yī)學科學院藥物研究所急性毒性測試，腹腔注射LD50為670.04mg/kg，灌胃給藥的毒性顯著低于腹腔注射，最小致死量大于2000mg/kg，毒性很低。實施例3色素在不同溶劑中的溶解和不同pH對色素色調的影響經乙醇提取的紅色素取0.2g，分別用20ml的乙醇、甲醇、丙酮、乙醚、氯仿溶解，溶解液40℃烘干后，分別用乙醇定溶至20ml，測OD538值，觀察其溶解的難易程度。適量色素用乙醇溶解，分別用NaOH和HCl調節(jié)pH分別為3、5、9、11、12，以pH7作為對照，觀察色素色調的變化。
表3紅色素用不同溶劑溶解后的OD值與不同pH值下的色調變化
結果表明，在pH 2-11的范圍內，紅色素很穩(wěn)定。紅色素在乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、乙醚、5種溶劑中均能溶解，但溶解程度不同，根據(jù)不同溶劑溶解后的OD538測定，其溶解度從大到小的順序為甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿。
(4)重結晶，濃縮色素提取物溶于5ml甲醇中，在60℃時緩慢加入2ml水，4℃冰箱過夜，抽濾。得到色素結晶，60℃，10h真空干燥，稱重。
(5)HPLC分析C18柱，甲醇∶水(2∶1)洗脫，檢測波長534nm、254nm。流速1ml/min。以檢測樣品純度。
經紫外、紅外和核磁共振測定分析色素結構，初步認為該色素為共軛吡咯類色素。
權利要求
1.一種產紅色素的海洋細菌，其保藏號為CGMCC NO.0527。
2.一種生產天然紅色素的方法，包括培養(yǎng)權利要求1所述的海洋細菌；和從培養(yǎng)物中提取紅色素。
3.按照權利要求2所述的方法，其中，所述的海洋細菌是在胰蛋白胨為氮源，葡萄糖為碳源，NaCl濃度為1.8％-2.1％(重量)的條件下進行。
4.按照權利要求2所述的方法，其中，從培養(yǎng)物中提取紅色素是通過首先將發(fā)酵液pH調整至2-4，然后使用醇類溶劑進行提取。
5.按照權利要求2所述的方法，其中，從培養(yǎng)物中提取紅色素是通過首先將發(fā)酵液pH調整至3，然后使用乙醇為溶劑進行提取。
6.一種由權利要求1所述的海洋細菌產生的紅色素。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種產紅色素的海洋細菌,其保藏號為CGMCC NO.0527。本發(fā)明還提供了一種生產天然紅色素的方法,包括:培養(yǎng)權利要求1所述的海洋細菌;和從培養(yǎng)物中提取紅色素的步驟。本發(fā)明還提供了一種紅色素。
文檔編號C12N1/20GK1377956SQ0111027
公開日2002年11月6日 申請日期2001年4月5日 優(yōu)先權日2001年4月5日
發(fā)明者田黎, 李光友, 劉發(fā)義 申請人:國家海洋局第一海洋研究所