專利名稱：通用模板核酸檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種通過(guò)使用通用模板檢測(cè)和/或定量核酸的方法。
近來(lái)，為了滿足快速準(zhǔn)確地檢測(cè)和/或定量感染物(如病毒、細(xì)菌、真菌)中，以及正常和不正?；蛑械奶禺愋院怂嵝蛄?，已有開發(fā)了大量技術(shù)。這些技術(shù)在檢測(cè)和定量食品、環(huán)境樣品、種畜和其他類型物質(zhì)中微生物方面有著廣闊的用途，在這些場(chǎng)合下需要監(jiān)測(cè)某種推定微生物是否存在。其他應(yīng)用包括用于法醫(yī)學(xué)、分子病理學(xué)、人類學(xué)、考古學(xué)和生物學(xué)等方面。
實(shí)現(xiàn)這類任務(wù)的一種常見(jiàn)做法是核酸雜交。該方法基于兩條核酸鏈在合適條件下形成雙鏈結(jié)構(gòu)的能力，其中這兩條核酸鏈含有互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的序列從而能夠特異性地結(jié)合。為了檢測(cè)和/或定量特定的核酸序列(稱為“靶序列”)，需制備標(biāo)記的寡核苷酸(“探針”)，該探針含有與靶序列互補(bǔ)的序列。為了靈敏地檢測(cè)和/或定量微量的遺傳物質(zhì)，已經(jīng)開發(fā)了許多更成熟的技術(shù)，它們通常涉及在測(cè)試樣品中擴(kuò)增靶核酸(DNA或RNA)并隨后進(jìn)行檢測(cè)，其中包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(transcriptionmediated amplication，TMA)和自動(dòng)維持合成反應(yīng)(3SR)。
盡管所有這些技術(shù)都是檢測(cè)和鑒別樣品中微量靶核酸的有利工具，但是它們有各種不同的問(wèn)題，這些問(wèn)題限制了它們?cè)谂R床實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下用于常規(guī)操作時(shí)的應(yīng)用性。最困難的問(wèn)題之一是，在每種測(cè)試中擴(kuò)增靶核酸以便隨后進(jìn)行檢測(cè)和定量分析的條件是不同的。換言之，沒(méi)有利于測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)化的恒定條件。
目前靶序列擴(kuò)增方法另一種常見(jiàn)問(wèn)題是擴(kuò)增子的污染。
此外，對(duì)于目前的基于靶序列擴(kuò)增的核酸檢測(cè)和/或定量方法而言，不偏不倚地檢測(cè)和/或定量具有不同基因型或突變(如導(dǎo)致抗藥性的突變)的病原體一直是眾所周知的挑戰(zhàn)。
分支DNA(bDNA)法是一種新興的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)，它可提供高重復(fù)性和準(zhǔn)確度。然而，該方法本身的靈敏度有限，且難以為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室所廣泛采用。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)易用、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)和/或定量樣品中病原體和基因表達(dá)的分析技術(shù)。
本發(fā)明的目的就是提供一種可用于檢測(cè)和/或定量樣品中病原體和基因表達(dá)的易用、靈敏、準(zhǔn)確的分析技術(shù)。本發(fā)明的新技術(shù)可以克服現(xiàn)有技術(shù)中的許多局限。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種核酸檢測(cè)方法，它包括步驟(1)在含有報(bào)告分子的PCR反應(yīng)體系中，用通用模板引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中所述引物對(duì)包括特異性結(jié)合于模板并引發(fā)的二個(gè)引物，且至少一個(gè)引物是通用模板引物，該通用模板引物包括(a)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于通用模板引物3＇端，用于與編碼特異性結(jié)合；(b)通用區(qū)，該通用區(qū)位于通用模板引物的5＇端并且具有報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，報(bào)告分子可特異性結(jié)合于該報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，且所述的報(bào)告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)(i)結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，和(ii)報(bào)告分子被切斷，并且所述報(bào)告分子的數(shù)量大于或等于通用模板引物的數(shù)量；檢測(cè)報(bào)告分子所產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)。
在本發(fā)明的一實(shí)例中，使用兩種或兩種以上不同的通用模板引物對(duì)，這些通用模板引物對(duì)分別特異性地結(jié)合于不同病原體的靶序列、同一病原體的不同靶序列、同一病原體的相同靶序列的不同區(qū)域、或其組合，并且這些通用模板引物對(duì)的報(bào)告分子結(jié)合區(qū)分別與相同或不同的報(bào)告分子發(fā)生特異性結(jié)合。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種通用模板引物對(duì)，所述引物對(duì)包括特異性結(jié)合于模板并引發(fā)PCR的二個(gè)引物，其中至少一個(gè)引物是通用模板引物，該通用模板引物包括(a)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于通用模板引物3＇端，用于與編碼特異性結(jié)合；(b)通用區(qū)，該通用區(qū)位于通用模板引物的5＇端并且具有報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，報(bào)告分子可特異性結(jié)合于該報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，且所述的報(bào)告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)(i)結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，和(ii)報(bào)告分子被切斷。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，所述的報(bào)告分子包括Taqman探針。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種核酸檢測(cè)試劑盒，它含有本發(fā)明所述的通用模板引物對(duì)。


圖1顯示了本發(fā)明的通用模板引物的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2顯示了本發(fā)明通用模板引物對(duì)的各種組合形式。
圖3是本發(fā)明一種核酸檢測(cè)方法的示意圖，其中使用的通用模板引物對(duì)含有一個(gè)通用模板引物。
圖4是本發(fā)明一種核酸檢測(cè)方法的示意圖，其中使用的通用模板引物對(duì)含有二個(gè)通用模板引物。
如本文所用，下列詞語(yǔ)/術(shù)語(yǔ)具有下列含義，除非另外說(shuō)明。
“核酸”核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、RNA或DNA的多核苷酸類似物、RNA或DNA的寡核苷酸類似物。
“靶”待直接或間接檢測(cè)的分析物，主要的靶是核酸等遺傳物質(zhì)。
“模板”能夠被核酸聚合酶擴(kuò)增的核酸分子的全長(zhǎng)或部分序列。模板抗原是RNA或DNA、或其類似物，并且可以是單鏈、雙鏈或部分雙鏈的。
“通用模板(UT)引物”通用模板引物是合成的寡核苷酸序列。其3＇端有特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)互補(bǔ)于靶序列并作為引物在擴(kuò)增反應(yīng)中延伸。此外，通用模板引物還含有通用區(qū)(也稱為通用模板區(qū)或UT區(qū))，該通用區(qū)位于通用模板引物的5＇端并且具有報(bào)告分子結(jié)合區(qū)。報(bào)告分子可特異性結(jié)合于該報(bào)告分子結(jié)合區(qū)。通用模板引物可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法合成(圖1)。
“報(bào)告分子”是一種用于產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的分子。所述的報(bào)告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)(i)結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，和(ii)報(bào)告分子被切斷。合適的報(bào)告分子例子包括(但并不限于)Taqman探針、含稀土金屬的寡核苷酸鏈等。
“Taqman探針”是一種在其5＇端帶有報(bào)告基團(tuán)并且在3＇端帶有猝滅基團(tuán)的寡核苷酸，所述的猝滅基團(tuán)會(huì)抑制報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)(例如熒光)。Taqman探針設(shè)計(jì)是現(xiàn)有技術(shù)，并且可以從公開途徑獲得有關(guān)信息(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，Williams PM；Real Time Quantitaive PCR，Genome Res.1996Oct.；6(10)986-94)。
“通用模板”指在本發(fā)明的PCR過(guò)程中，擴(kuò)增出的摻入了通用模板引物的核酸序列，或其反義核酸序列。這些通用模板既具有對(duì)應(yīng)于靶序列的核苷酸序列，又具有對(duì)應(yīng)于通用模板引物通用區(qū)(含報(bào)告分子結(jié)合區(qū))的核苷酸序列。在隨后的PCR擴(kuò)增循環(huán)中，這些通用模板作為模板起作用。
本發(fā)明所公開的方法原則上歸為信號(hào)擴(kuò)增法。其關(guān)鍵是使用了通用適應(yīng)的核酸序列作為信號(hào)擴(kuò)增的模板(在此稱為“通用模板”)，因此相應(yīng)的方法被稱為“通用模板介導(dǎo)的擴(kuò)增分析”(UT分析)。UT分析可靈敏、準(zhǔn)確和標(biāo)準(zhǔn)化地檢測(cè)和/或定量靶核酸分子。
在本發(fā)明中，對(duì)于待測(cè)樣品沒(méi)有限制，只要其中含有遺傳物質(zhì)即可。代表性的待測(cè)樣品包括(但并不限于)DNA樣品、RNA樣品、和從RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品，以及其他形式的修飾過(guò)的多聚核苷酸。
在本發(fā)明的通用模板引物中，對(duì)所述的特異結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，通常其長(zhǎng)度為8-30bp，較佳地為15-25bp。對(duì)于所述通用區(qū)的也沒(méi)有特別限制，通常其長(zhǎng)度為15-100bp，較佳地為20-40bp，更佳地約為25-35bp。
通用模板引物中含有的核苷酸通常選自A、T、C、G。然而，在所述的通用模板引物中含有其他一些核苷酸以增加與模板的結(jié)合，例如選自下組的核苷酸isoG、isoC、2＇-O-甲基-G、2＇-O-甲基-C、及其組合。
在本發(fā)明的反應(yīng)體系中，報(bào)告分子與通用模板引物的數(shù)量關(guān)系沒(méi)有特別限制。然而，較佳地，所述報(bào)告分子的數(shù)量大于或等于通用模板引物的數(shù)量，通常報(bào)告分子與通用模板引物之比大于1∶1-10∶1，更佳地為1.5∶1-5∶1。這樣，在反應(yīng)體系中，通用模板引物便基本上都處于與報(bào)告分子結(jié)合的狀態(tài)。
當(dāng)報(bào)告分子是Taqman探針時(shí)，Taqman探針與通用模板引物報(bào)告分子結(jié)合區(qū)的Tm，宜高于通用模板引物特異結(jié)合區(qū)與模板的Tm。通常，高出2-15℃，較佳地高出5-12℃。
在本發(fā)明中，如圖2所示，通用模板引物對(duì)有3種組合形式(1)上游為通用模板引物，下游為常規(guī)引物；(2)上游為通用模板引物，下游為通用模板引物；(3)上游為常規(guī)引物，下游為通用模板引物。
此外，對(duì)于與通用模板引物結(jié)合的報(bào)告分子，不同的通用模板可結(jié)合相同的報(bào)告分子，也可結(jié)合不同的報(bào)告分子(例如帶有發(fā)不同熒光的報(bào)告基團(tuán)和相應(yīng)猝滅基團(tuán)的報(bào)告分子)。
對(duì)于通用模板引物對(duì)擴(kuò)增出的通用模板的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制。按通用模板引物對(duì)的兩個(gè)引物的特異結(jié)合區(qū)的3＇端在模板上相距的距離表示，通常為1bp-10kb，較佳地為1-2kb，更佳地為1-500b，最佳地為1-100bp。尤其是是當(dāng)間距小于100bp時(shí)，可設(shè)計(jì)針對(duì)例如病原體高保守區(qū)的引物對(duì)，從而降低假陰性率。此外，間距越短，越可發(fā)揮通用模板的通用性。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
一、使用含通用模板引物和常規(guī)引物的引物對(duì)進(jìn)行UT分析現(xiàn)參見(jiàn)圖3。在該例子中，使用一對(duì)通用模板引物對(duì)，該引物對(duì)由一個(gè)通用模板引物1和一個(gè)常規(guī)引物2構(gòu)成。在該例子中，待檢測(cè)的樣品是RNA或DNA。
步驟1將引物對(duì)和待測(cè)樣品置于反應(yīng)體系中，然后，在合適的條件下，發(fā)生退火(或雜交)，即通用模板引物1的3＇端的特異結(jié)合區(qū)結(jié)合于靶RNA或DNA序列。
步驟2在逆向轉(zhuǎn)錄酶(對(duì)于RNA靶序列)或DNA聚合酶(對(duì)于DNA靶序列)，通用模板引物的3＇端向靶序列5＇端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA雙鏈。
步驟3形成的雙鏈核酸在合適的條件下變性，形成單鏈靶序列和新合成的DNA序列(即通用模板)。或者用RNase水解RNA鏈，形成新合成的DNA序列(即通用模板)。
步驟4(任選的)必要時(shí)，在合適的條件下重復(fù)步驟1，2，和3。
步驟5在合適條件下，常規(guī)引物2結(jié)合于新合成的DNA序列的互補(bǔ)區(qū)域。
步驟6在DNA聚合酶存在下，常規(guī)引物2的3＇端向通用模板序列5＇端延伸，雙鏈DNA(該雙鏈中新合成的DNA序列也是通用模板)。當(dāng)常規(guī)引物2的3＇端延伸到結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)的報(bào)告分子處時(shí)，會(huì)發(fā)生以下3種情況
(1)延伸停止；(2)繼續(xù)延伸，將報(bào)告分子從通用模板上置換下來(lái)；(3)繼續(xù)延伸，并切斷或破壞報(bào)告分子。
在第一和第二種情況下，報(bào)告分子仍是完整的，因此不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。而在第三種情況下，由于報(bào)告分子(如Taqman探針)5＇端上的猝滅基團(tuán)被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5＇核酸酶活性所水解，因此在Taqman探針3＇端處的報(bào)告基團(tuán)就不再被猝滅，從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)(如熒光信號(hào))。
步驟7在下一循環(huán)中，通用模板引物1結(jié)合于含常規(guī)引物2序列的新合成的DNA序列。同時(shí)，常規(guī)引物2也結(jié)合含通用引物1序列的通用模板。
步驟8通用模板引物1向靶序列5＇端延伸，形成DNA雙鏈。這些DNA雙鏈就是新的通用模板。同時(shí)，與步驟6中相同，當(dāng)常規(guī)引物2的3＇端延伸到結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)的報(bào)告分子處時(shí)，會(huì)發(fā)生以下3種情況(1)延伸停止；(2)繼續(xù)延伸，將報(bào)告分子從通用模板上置換下來(lái)；(3)繼續(xù)延伸，并切斷或破壞報(bào)告分子。
在第一和第二種情況下，報(bào)告分子仍是完整的，因此不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。而在第三種情況下，由于報(bào)告分子(如Taqman探針)5＇端上的猝滅基團(tuán)被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5＇核酸酶活性所水解，因此在Taqman探針3＇端處的報(bào)告基團(tuán)就不再被猝滅，從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)(如熒光信號(hào))。
步驟9重復(fù)步驟7和8。
在經(jīng)過(guò)若干循環(huán)后，與PCR原理相同，因報(bào)告分子被切斷而產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)也是成指數(shù)級(jí)(或近似于指數(shù)關(guān)系)增加的。在可檢測(cè)信號(hào)是熒光的情況下，這些信號(hào)可用熒光閱讀儀，如Roche＇s LightCycler，或著ABI GeneAmp 5700進(jìn)行測(cè)定。
二、使用含二個(gè)通用模板引物的引物對(duì)進(jìn)行UT分析現(xiàn)參見(jiàn)圖4。在該例子中，使用一對(duì)通用模板引物對(duì)，該引物對(duì)由二個(gè)通用模板引物1和2構(gòu)成，通用模板引物2的3＇端延伸到結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)的報(bào)告分子處時(shí)。在該例子中，待檢測(cè)的樣品是DNA或RNA。
步驟1將引物對(duì)和待測(cè)樣品置于反應(yīng)體系中，然后，在合適的條件下，發(fā)生退火(或雜交)，即通用模板引物1的3＇端的特異結(jié)合區(qū)結(jié)合于靶RNA或DNA序列。
步驟2在逆向轉(zhuǎn)錄酶(對(duì)于RNA靶序列)或DNA聚合酶(對(duì)于DNA靶序列)，通用模板引物的3＇端向靶序列5＇端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA雙鏈。
步驟3形成的雙鏈核酸在合適的條件下變性，形成單鏈靶序列和新合成的DNA序列(即通用模板)。或者用RNase水解RNA鏈，形成新合成的DNA序列(即通用模板)。
步驟4(任選的)必要時(shí)，在合適的條件下重復(fù)步驟1，2，和3。
步驟5在合適條件下，通用模板引物2結(jié)合于新合成的DNA序列的互補(bǔ)區(qū)域。
步驟6在DNA聚合酶存在下，通用模板引物2的3＇端向通用模板序列5＇端延伸，雙鏈DNA(該雙鏈中新合成的DNA序列也是通用模板)。當(dāng)通用模板引物2的3＇端延伸到結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)的報(bào)告分子處時(shí)，會(huì)發(fā)生以下3種情況(1)延伸停止；(2)繼續(xù)延伸，將報(bào)告分子從通用模板上置換下來(lái)；(3)繼續(xù)延伸，并切斷或破壞報(bào)告分子。
在第一和第二種情況下，報(bào)告分子仍是完整的，因此不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。而在第三種情況下，由于報(bào)告分子(如Taqman探針)5＇端上的猝滅基團(tuán)被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5＇核酸酶活性所水解，因此在Taqman探針3＇端處的報(bào)告基團(tuán)就不再被猝滅，從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)(如熒光信號(hào))。
步驟7在下一循環(huán)中，通用模板引物1結(jié)合于含通用模板引物2序列的新合成的DNA序列。同時(shí)，通用模板引物2也結(jié)合含通用引物1序列的通用模板。
步驟8通用模板引物1向靶序列5＇端延伸，形成DNA雙鏈。與步驟6中相同，當(dāng)通用模板引物1的3＇端延伸到結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)的報(bào)告分子處時(shí)以及通用模板引物2的3＇端延伸到結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)的報(bào)告分子處時(shí)，都會(huì)發(fā)生以下3種情況(1)延伸停止；(2)繼續(xù)延伸，將報(bào)告分子從通用模板上置換下來(lái)；
(3)繼續(xù)延伸，并切斷或破壞報(bào)告分子。
在第一和第二種情況下，報(bào)告分子仍是完整的，因此不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。而在第三種情況下，由于報(bào)告分子(如Taqman探針)5＇端上的猝滅基團(tuán)被DNA聚合酶(如Taq聚合酶)的5＇核酸酶活性所水解，因此在Taqman探針3＇端處的報(bào)告基團(tuán)就不再被猝滅，從而導(dǎo)致產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)(如熒光信號(hào))。
步驟9重復(fù)步驟7和8。
在經(jīng)過(guò)若干循環(huán)后，與PCR原理相同，因報(bào)告分子被切斷而產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)也是成指數(shù)級(jí)(或近似于指數(shù)關(guān)系)增加的。在可檢測(cè)信號(hào)是熒光的情況下，這些信號(hào)可用熒光閱讀儀，如Roche＇s LightCycler，或著ABI GeneAmp 5700進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明具有明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，其主要優(yōu)點(diǎn)包括(1)易于復(fù)合式檢測(cè)摻入該UT區(qū)序列可在新合成的DNA序列中引入不屬于靶序列的一段序列。而新合成的DNA序列可作為進(jìn)一步DNA擴(kuò)增的模板。與不同靶序列的數(shù)目無(wú)關(guān)，新合成的DNA序列是大部分是相同的-UT區(qū)序列，這使得各不同的靶序列被轉(zhuǎn)變成具有共同特性的序列。因此，可以在相同或基本相同的條件下對(duì)該DNA序列繼續(xù)處理或操作，易于實(shí)現(xiàn)例如多管同一條件、或一管多種靶序列等復(fù)合式檢測(cè)。
(2)更高的分析靈敏度通過(guò)使用一對(duì)含兩個(gè)通用模板引物的引物對(duì)，或者對(duì)單個(gè)靶序列的不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)多個(gè)通用模板引物對(duì)，可以產(chǎn)生現(xiàn)有技術(shù)中單探針模式更高水平的信噪比。
(3)高準(zhǔn)確性本發(fā)明的通用模板引物和UT核酸檢測(cè)方法，可減少由下列因素導(dǎo)致的假陰性概率(a)在靶序列的探針(或引物)結(jié)合位點(diǎn)處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)有效地影響探針(或引物)的結(jié)合；(b)在靶序列的探針(或引物)結(jié)合位點(diǎn)處序列的改變，這些變化可以是由于不同的亞型或突變引起的。例如在HCV中，由于使用了各種藥物，會(huì)導(dǎo)致HIV發(fā)生突變或變異。如用常規(guī)核酸檢測(cè)方法，常會(huì)導(dǎo)致假陰性。而在各種生物(包括病原體)的遺傳物質(zhì)中找出高保守的短區(qū)域(如100bp或更短)是很方便的。利用本發(fā)明，可以設(shè)計(jì)針對(duì)這些短的、高保守區(qū)域(如40-50bp)的通用模板引物對(duì)，從而減少假陰性。根據(jù)，本發(fā)明人用多對(duì)通用模板引物對(duì)HIV突變株的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)假陰性率減少50％。
(c)在樣品加工或處理過(guò)程中長(zhǎng)片段靶序列的斷裂，而這種斷裂發(fā)生在長(zhǎng)片段的擴(kuò)增的中間區(qū)域，會(huì)導(dǎo)致互補(bǔ)DNA序列復(fù)制的停止。
(4)簡(jiǎn)化或消除多重檢測(cè)在需要檢測(cè)多種病原體時(shí)，目前常需要對(duì)某種病原體進(jìn)行單獨(dú)的檢測(cè)。這是因?yàn)椴煌瑱z測(cè)反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件各不相同，因此，在同一反應(yīng)管中進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，各擴(kuò)增反應(yīng)的效率難以接近一致，從而難以在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多種病原體。
使用本發(fā)明的技術(shù)，因?yàn)橥ㄓ媚０宓拇蟛糠质窍嗤?，即UT區(qū)，因此便于在使檢測(cè)各病原體的PCR的反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)化，從而在一管中實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病原體的檢測(cè)。這使得本發(fā)明技術(shù)特別適用于獻(xiàn)血樣品檢驗(yàn)等場(chǎng)合。
(5)降低使用UT熒光標(biāo)記技術(shù)的多倍分析成本在現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于多個(gè)待測(cè)的靶核酸序列，需要相同數(shù)目的Taqman探針。與此相反，在本發(fā)明中，對(duì)于檢測(cè)多個(gè)靶序列僅需一種UT熒光探針，因此可大大降低成本。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1UT分析檢測(cè)HCV病毒(RNA病毒)在該實(shí)施例中，設(shè)計(jì)了包括一個(gè)通用模板引物和一個(gè)常規(guī)引物的通用模板引物對(duì)，反應(yīng)過(guò)程如圖3所示。
在PCR方案是從RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNART(50℃，20分鐘，95℃，5分鐘)；PCR50℃，2分鐘，94℃ 5分鐘；94℃ 20秒；和61℃ 40秒，共40個(gè)循環(huán)。
通用模板引物為5-AAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAG AACGCAACCCAACGCTACTC-3＇(SEQ ID NO1)常規(guī)引物5＇-GTGCCCCCGC AAGACT-3＇(SEQ ID NO2)使用的Taqman探針序列是5＇-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3＇(SEQ ID NO3)其中使用的報(bào)告基團(tuán)是6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5＇端的)，猝滅基團(tuán)是6-羧基-四甲基羅丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3＇端的)。
檢測(cè)時(shí)使用的檢測(cè)儀器為ABI GeneAmp 5700，激發(fā)光源為鹵素?zé)?，波長(zhǎng)為488nm。
用上述引物及相應(yīng)的Taqman探針在ABI5700基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果，加入不同稀釋度陽(yáng)性樣品在不同循環(huán)(Ct)出現(xiàn)熒光信號(hào)，而陰性樣品及其他非特異對(duì)照樣品(含有其他病原體的樣品)在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)(Ct＞40)時(shí)均未出現(xiàn)熒光信號(hào)。
實(shí)施例2UT分析檢測(cè)HBV病毒(DNA病毒)在該實(shí)施例中，設(shè)計(jì)了包括一個(gè)通用模板引物和一個(gè)常規(guī)引物的通用模板引物對(duì)，反應(yīng)過(guò)程如圖3所示。
在PCR方案是PCR50℃，2分鐘，94℃ 5分鐘；94℃ 20秒；和61℃ 40秒，共40個(gè)循環(huán)。
通用模板引物分別為5-AAGGAACAGG CGGCGACGAA TCAACGACAG AACCAGCGAT AGCCAGGACA-3＇(SEQ ID NO4)常規(guī)引物
5＇-CCTCCAATCA CTCACCAACC-3＇(SEQ ID NO5)使用的Taqman探針序列是5＇-TCGTCGCCGC CTGTTCCTTA-3＇(SEQ ID NO3)其中使用的報(bào)告基團(tuán)是6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5＇端的)，猝滅基團(tuán)是6-羧基-四甲基羅丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(位于3＇端的)。
檢測(cè)時(shí)使用的檢測(cè)儀器為ABI GeneAmp 5700，激發(fā)光源為鹵素?zé)?，波長(zhǎng)為488nm。
用上述引物及相應(yīng)的Taqman探針在ABI5700基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果，加入不同稀釋度陽(yáng)性樣品在不同循環(huán)(Ct)出現(xiàn)熒光信號(hào)，而陰性樣品及其他非特異對(duì)照樣品(含有其他病原體的樣品)在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時(shí)(Ct＞40)時(shí)均未出現(xiàn)熒光信號(hào)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>曹衛(wèi)<120>通用模板核酸檢測(cè)方法和試劑盒<130>012158<160>5<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>50<212>DNA<213>合成的引物<400>1aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aacgcaaccc aacgctactc50<210>2<211>16<212>DNA<213>合成的引物<400>2gtgcccccgc aagact 16<210>3<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>3tcgtcgccgc ctgttcctta 20<210>4<211>50<212>DNA<213>合成的引物<400>4aaggaacagg cggcgacgaa tcaacgacag aaccagcgat agccaggaca50<210>5<211>20<212>DNA<213>合成的引物<400>5cctccaatca ctcaccaacc 20
權(quán)利要求
1.一種通用模板引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)包括特異性結(jié)合于模板并引發(fā)聚合酶鏈反應(yīng)的二個(gè)引物，其中至少一個(gè)引物是通用模板引物，該通用模板引物包括(a)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于通用模板引物3＇端，用于與編碼特異性結(jié)合；(b)通用區(qū)，該通用區(qū)位于通用模板引物的5＇端并且具有報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，報(bào)告分子可特異性結(jié)合于該報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，且所述的報(bào)告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)(i)結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，和(ii)報(bào)告分子被切斷。
2.如權(quán)利要求1所述的通用模板引物對(duì)，其特征在于，所述的報(bào)告分子包括Taqman探針。
3.如權(quán)利要求1所述的通用模板引物對(duì)，其特征在于，所述的特異結(jié)合區(qū)長(zhǎng)度為8-30bp，所述通用區(qū)的長(zhǎng)度為15-100bp。
4.如權(quán)利要求1所述的通用模板引物對(duì)，其特征在于，所述的特異結(jié)合區(qū)長(zhǎng)度為15-25bp，所述通用區(qū)的長(zhǎng)度為20-40bp。
5.如權(quán)利要求1所述的通用模板引物對(duì)，其特征在于，在所述的通用模板引物中含有選自下組的核苷酸isoG、isoC、2＇-O-甲基-G、2＇-O-甲基-C、及其組合。
6.一種檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的通用模板引物對(duì)。
7.一種檢測(cè)核酸檢測(cè)方法，其特征在于，它包括步驟(1)在含有報(bào)告分子的PCR反應(yīng)體系中，用通用模板引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中所述引物對(duì)包括特異性結(jié)合于模板并引發(fā)的二個(gè)引物，且至少一個(gè)引物是通用模板引物，該通用模板引物包括(a)特異結(jié)合區(qū)，該特異結(jié)合區(qū)位于通用模板引物3＇端，用于與編碼特異性結(jié)合；(b)通用區(qū)，該通用區(qū)位于通用模板引物的5＇端并且具有報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，報(bào)告分子可特異性結(jié)合于該報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，且所述的報(bào)告分子在下列兩種情況下的狀態(tài)不同，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)(i)結(jié)合于報(bào)告分子結(jié)合區(qū)，和(ii)報(bào)告分子被切斷；(2)檢測(cè)報(bào)告分子所產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的報(bào)告分子包括Taqman探針。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的待測(cè)樣品選自下組DNA樣品、RNA樣品、和從RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使用兩種或兩種以上不同的通用模板引物對(duì)，這些通用模板引物對(duì)分別特異性地結(jié)合于不同病原體的靶序列、同一病原體的不同靶序列、同一病原體的相同靶序列的不同區(qū)域、或其組合，并且這些通用模板引物對(duì)的報(bào)告分子結(jié)合區(qū)分別與相同或不同的報(bào)告分子發(fā)生特異性結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種通過(guò)使用通用模板檢測(cè)和/或定量核酸的方法。本發(fā)明的通用模板引物對(duì)包括特異性結(jié)合于模板并引發(fā)聚合酶鏈反應(yīng)的二個(gè)引物,其中至少一個(gè)引物是通用模板引物,該通用模板引物包括:(a)特異結(jié)合區(qū);(b)通用區(qū),該通用區(qū)具有報(bào)告分子結(jié)合區(qū)。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的通用模板核酸檢測(cè)方法。本發(fā)明可易用、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)和/或定量樣品中病原體和基因表達(dá)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1384206SQ0111281
公開日2002年12月11日 申請(qǐng)日期2001年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月30日
發(fā)明者曹衛(wèi) 申請(qǐng)人:曹衛(wèi)