專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法及該方法所用的菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種用糖蜜作為原料來發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法，以及該方法所用的菌株。
背景技術(shù)：
檸檬酸通常是用淀粉作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)制得的。由于我國有發(fā)達(dá)的制糖工業(yè)，作為制糖工業(yè)副產(chǎn)物的糖蜜來源相當(dāng)豐富，因此也有人嘗試用糖蜜作為碳源來發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。然而，由于糖蜜中含有成分非常復(fù)雜的各種有機(jī)物質(zhì)和無機(jī)物質(zhì)，因此在現(xiàn)有技術(shù)中用糖蜜作為原料來直接發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸還存在很大的困難。針對(duì)這一問題，有人用經(jīng)過預(yù)處理的糖蜜作為發(fā)酵原料，但是這種方法還需對(duì)糖蜜進(jìn)行附加的預(yù)處理步驟，而且發(fā)酵水平都不高，產(chǎn)酸、轉(zhuǎn)化率等各項(xiàng)指標(biāo)都無法與水解糖為原料的工藝以及我國的以淀粉為原料的工藝相比。目前還沒有關(guān)于用未經(jīng)預(yù)處理的糖蜜來直接發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是用糖蜜作為原料來發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種用于發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的新的黑曲霉菌株。
本發(fā)明一方面涉及一種生產(chǎn)檸檬酸的方法，該方法是在培養(yǎng)基中利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有糖蜜，所述微生物是黑曲霉(Aspergillusniger)SNGB313 CGMCC No.0568。
在該方法中，發(fā)酵溫度為33-37℃，較佳的為34-36℃，更佳的為35℃。發(fā)酵罐的壓力可以在0.5-1.5千克/平方厘米之間，較佳的為1千克/平方厘米。通氣量宜為400-550立方米/小時(shí)，較佳的可采用三級(jí)通氣，例如在發(fā)酵0-35小時(shí)之間為430立方米/小時(shí)，35-66小時(shí)之間為480立方米/小時(shí)，67小時(shí)以后為540立方米/小時(shí)。發(fā)酵初pH是培養(yǎng)基的自然pH。在發(fā)酵過程，無需對(duì)pH進(jìn)行控制，但pH通常可在2-8之間。這些參數(shù)的控制和選擇對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說均是顯而易見的。
發(fā)酵后，產(chǎn)物檸檬酸可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法如鈣鹽法來提取精制，例如參見中國輕工業(yè)出版社2000年10月出版的《發(fā)酵工業(yè)有機(jī)酸生產(chǎn)與應(yīng)用手冊(cè)》。
在本發(fā)明的發(fā)酵方法中，作為原料的糖蜜可以從商業(yè)途徑購得。而且，經(jīng)過試驗(yàn)性生產(chǎn)證實(shí)，本發(fā)明的黑曲霉變種SNGB313對(duì)從各種商業(yè)途徑購得的糖蜜均可達(dá)到相近的發(fā)酵水平。購得的糖蜜無需經(jīng)過任何預(yù)處理即可直接用于發(fā)酵。本文所述的“無需預(yù)處理直接用于發(fā)酵”是指無需通過分離、過濾等手段來進(jìn)行純化或改變糖蜜的有效組成和含量，就可直接進(jìn)行滅菌、稀釋來配制培養(yǎng)基。由于糖蜜中還含有未被除去的微生物生長所需的其它成分，因此，本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中可以不加入常規(guī)的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基所需的其它物質(zhì)，如其它碳源、氮源、無機(jī)鹽和金屬鹽。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可通過試驗(yàn)來進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成，例如培養(yǎng)基中可含有硫酸銨。因此，糖蜜的濃度以及加入其它物質(zhì)的選擇對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。由于各批糖蜜的還原糖含量稍有差別，因此宜用還原糖濃度來表示。在本發(fā)明的實(shí)踐中，培養(yǎng)基中的還原糖濃度可以在4-20％之間，較佳的為6-15％，更佳的是為12-15％。該還原糖濃度可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)手段(如菲林定糖法)來測(cè)定。
本發(fā)明方法中所用的黑曲霉變種SNGB313可通過直接接種或中罐培養(yǎng)等常規(guī)方式加入發(fā)酵培養(yǎng)基中。該黑曲霉變種SNGB313是從浙江奉化果園土壤中分離獲得的野生型黑曲霉經(jīng)紫外線處理、Co60-γ射線照射以及硫酸二乙酯反復(fù)誘變處理篩選獲得的。該菌株已經(jīng)于2001年4月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(中國，北京)，保藏號(hào)為CGMCC No.0568。
中國微生物保藏中心華東分站對(duì)該菌種的形態(tài)和性質(zhì)所作描述如下菌落形態(tài)在糖蜜平板培養(yǎng)基上生長非?？?，35℃培養(yǎng)4天，菌落直徑為4-5厘米，中央絮絨狀，邊緣平坦，菌絲白色，分生孢子著生致密，呈黑褐色。
顯微結(jié)構(gòu)在斜面培養(yǎng)基中營養(yǎng)菌絲有橫隔，呈無色，直徑為5-10μ。分生孢子梗白色基質(zhì)生出，表面光滑，在頂囊下不溢縮，長度為2-3毫米，直徑為10-18微米。頂囊球形，直徑一般為40-50微米。小梗單層，?；鶡o色，長度為10-12微米，寬3微米。分生孢子球形，呈黑褐色，表面粗糙生刺，直徑4-7微米，以串珠式排列。
碳源利用糖蜜。
本發(fā)明另一方面涉及一種霉菌，其特征在于，它是黑曲霉菌SNGB313 CGMCCNo.0568。
通過上文描述以及下文實(shí)施例可以看出，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)。第一，糖蜜可作為原料來直接用于發(fā)酵生產(chǎn)，無需進(jìn)行預(yù)處理，因此縮短了整個(gè)生產(chǎn)周期。第二，由于未經(jīng)預(yù)處理的糖蜜中還含有微生物生長所需的其它成分，因此，糖蜜可作為本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組分或直接作為發(fā)酵培養(yǎng)基(即其中不加入其它物質(zhì))，從而大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式
為了便于理解本發(fā)明，下面將結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例只是起說明的作用，而本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。在下文實(shí)施例中，除非另有特指，所有百分?jǐn)?shù)均指每100毫升培養(yǎng)基所含克數(shù)。應(yīng)注意，在所有培養(yǎng)基中，糖蜜的濃度均以還原糖濃度來表示。
實(shí)施例a)培養(yǎng)基的組成斜面培養(yǎng)基含糖6％(對(duì)于含還原糖50％的糖蜜(購自四川犍為糖廠)而言，含糖蜜12％)；2.5％瓊脂。
平板培養(yǎng)基含糖6％(含糖蜜12％)；2.5％瓊脂。
酸性培養(yǎng)基含糖6％(含糖蜜12％)；2％檸檬酸；3.0％瓊脂。
發(fā)酵培養(yǎng)基含糖15％(含糖蜜30％)；0.3％硫酸銨。
b)黑曲霉SNGB313的誘變和篩選首先，從浙江奉化果園土壤中分離出野生型黑曲霉(Aspergillus .niger)(命名為13-1)。隨后，進(jìn)行紫外線處理。具體方法如下取其斜面一支，用無菌水洗刮，洗下孢子置于含有玻璃珠三角瓶內(nèi)震蕩5分鐘，清液稀釋至一定濃度。取孢子懸浮液2毫升于培養(yǎng)皿中，于40W紫外燈下，距離9厘米，震蕩15～20分鐘。適當(dāng)稀釋后涂布在酸性培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)5天。挑出單菌落在斜面培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)5～7天。
隨后如下進(jìn)行Co60-γ射線照射誘變?nèi)⌒泵嬉恢?，同法制得孢子懸浮液，取?shù)毫升在鈷源(Co60-γ射線)下輻射，劑量為10萬倫琴，時(shí)間為1小時(shí)。將處理的孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后涂布在酸性培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)5天。挑出單菌落在斜面培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)5～7天。
分離出單菌，如下進(jìn)行NTG處理。取斜面一支，同法制得孢子懸浮液，加入亞硝基胍(NTG)劑量為400μg/ml，30℃處理40分鐘。將經(jīng)反復(fù)洗滌的處理孢子用以檸檬酸為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，清液適當(dāng)稀釋后涂布在酸性培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)5天。挑出單菌落在斜面培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)5～7天。
對(duì)上述所得菌落反復(fù)硫酸二乙酯和Co60-γ射線照射處理數(shù)次。硫酸二乙酯處理的具體方法如下取斜面一支，用50毫升含1滴土溫60的磷酸緩沖液洗刮，用玻璃珠分散后取數(shù)毫升加入到磷酸緩沖液內(nèi)，搖勻后加入一定量無水酒精，再加入數(shù)毫升硫酸二乙酯，在30℃搖床震蕩10分鐘，加入硫代硫酸鈉10毫升解毒10分鐘，將處理的孢子懸浮液適當(dāng)稀釋后涂布在酸性培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)5天。挑出單菌落在斜面培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)5～7天。
最后通過搖瓶培養(yǎng)并測(cè)定各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)，篩選得到一株黑曲霉，命名為SNGB313。該菌株的形態(tài)描述如下所述菌落形態(tài)在糖蜜平板培養(yǎng)基上生長非?？欤?5℃培養(yǎng)4天，菌落直徑為4-5厘米，中央絮絨狀，邊緣平坦，菌絲白色，分生孢子著生致密，呈黑褐色。
顯微結(jié)構(gòu)在斜面培養(yǎng)基中營養(yǎng)菌絲有橫隔，呈無色，直徑為5-10μ。分生孢子梗白色基質(zhì)生出，表面光滑，在頂囊下不溢縮，長度為2-3毫米，直徑為10-18微米。頂囊球形，直徑一般為40-50微米。小梗單層，梗基無色，長度為10-12微米，寬3微米。分生孢子球形，呈黑褐色，表面粗糙生刺，直徑4-7微米，以串珠式排列。
碳源利用糖蜜。
c)用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸將發(fā)酵培養(yǎng)基在250ml三角瓶中分裝50ml，用絨布封口，121℃滅菌20分鐘，冷卻后接斜面孢子或菌絲，置于35℃的290rpm旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)上發(fā)酵五天。
在50立方米不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)罐中，裝入發(fā)酵培養(yǎng)基45立方米(含4.5立方米種子培養(yǎng)液)，115℃消毒10分鐘，采用菌絲二級(jí)接種，接種量10％?？刂茥l件為罐壓1千克/平方厘米；罐溫35℃±1℃；攪拌速度90rpm。通氣采用三級(jí)生風(fēng)，其中0-35小時(shí)為430立方米/小時(shí)；36-66小時(shí)為480立方米/小時(shí)；67-結(jié)束為540立方米/小時(shí)。
表1報(bào)道了用野生型黑曲霉13-1和本發(fā)明的黑曲霉SNGB313的搖瓶比較結(jié)果。表2報(bào)道了本發(fā)明的黑曲霉菌株SNGB313在50立方米生產(chǎn)試驗(yàn)中的結(jié)果。
表1野生型黑曲霉13-1和本發(fā)明的黑曲霉SNGB313的搖瓶結(jié)果

表2黑曲霉菌株SNGB313 50立方米生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果

從表1可以看出，經(jīng)改良的黑曲霉菌株SNGB313在產(chǎn)酸、轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵周期等工藝參數(shù)上比野生型13-1均有明顯改進(jìn)。表2的數(shù)據(jù)表明，利用糖蜜作為原料可獲得與淀粉質(zhì)作為原料的常規(guī)發(fā)酵工藝相接近的發(fā)酵水平。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)檸檬酸的方法，該方法是在培養(yǎng)基中利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，其特征在于，所述培養(yǎng)基含有糖蜜，所述微生物是黑曲霉(Aspergillus niger)SNGB313CGMCC No.0568。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖蜜是未經(jīng)預(yù)處理的糖蜜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中的還原糖濃度為4-20％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵溫度為33-37℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通氣量在400-550立方米/小時(shí)之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在發(fā)酵過程中采用0-35小時(shí)之間為430立方米/小時(shí)，35-66小時(shí)之間為480立方米/小時(shí)，67小時(shí)以后為540立方米/小時(shí)的三級(jí)通氣。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還任選地包括在發(fā)酵后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，該純化方法是鈣鹽法。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基中還可含有硫酸銨。
10.一種霉菌，其特征在于，它是黑曲霉菌SNGB313 CGMCC No.0568。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法，所述檸檬酸是用糖蜜作為原料通過黑曲霉SNGB313發(fā)酵制得的。該發(fā)酵方法無需對(duì)糖蜜原料進(jìn)行預(yù)處理，且發(fā)酵培養(yǎng)基中無需加入其它物質(zhì)。本發(fā)明還提供了用于該發(fā)酵方法的黑曲霉SNGB313菌株。
文檔編號(hào)C12P7/48GK1393564SQ01113239
公開日2003年1月29日 申請(qǐng)日期2001年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月4日
發(fā)明者朱寶娣, 胡軍, 錢志良 申請(qǐng)人:上海新立工業(yè)微生物科技有限公司