專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)方法及培養(yǎng)細(xì)胞用灌裝氣體的裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)方法，具體地說，本發(fā)明涉及動物細(xì)胞的培養(yǎng)方法和實現(xiàn)該方法所采用的細(xì)胞培養(yǎng)用灌裝氣體的裝置。
現(xiàn)階段常采用的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法是將動物細(xì)胞連同盛裝細(xì)胞和培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶，在瓶蓋微松，細(xì)胞瓶內(nèi)與瓶外的氣體能自由交換的狀態(tài)下，放入濕度為60％-100％，二氧化碳濃度為5％的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)(R.Ian Freshney.Culture ofAnimal Cells,Alan R.Liss.Inc.,New York.1990；黃培堂譯，D.L.斯佩克特著細(xì)胞實驗指南科學(xué)出版社2001)。由于培養(yǎng)箱內(nèi)的高濕度和合適的溫度(20℃-45℃)，適宜微生物特別是霉菌生長，這樣易造成處于培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生污染，尤其是反復(fù)開關(guān)培養(yǎng)箱的門時，環(huán)境中存在的微生物易進(jìn)入培養(yǎng)箱，細(xì)胞發(fā)生污染的概率加大；另外購置與經(jīng)常維修培養(yǎng)箱費(fèi)用極其昂貴。
本發(fā)明的目的是提供新的細(xì)胞培養(yǎng)的方法，此方法克服了常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法的上述問題，而且應(yīng)用此方法不需購置與維修二氧化碳培養(yǎng)箱，費(fèi)用低廉。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種細(xì)胞培養(yǎng)用灌裝氣體的裝置，使用該裝置，可使氣體在無菌狀態(tài)下進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其步驟是A 讓高壓二氧化碳?xì)怏w減壓成為低壓氣體，B 低壓氣體經(jīng)除菌灌氣管過濾除菌成無菌二氧化碳?xì)怏w，C 細(xì)胞培養(yǎng)瓶口對著除菌灌氣管的噴嘴，并置瓶口在除菌灌氣管的鐘形罩內(nèi)，D 灌裝二氧化碳?xì)怏w入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，并E 擰緊瓶蓋，置細(xì)胞培養(yǎng)瓶于溫箱中培養(yǎng)。
本發(fā)明所說的細(xì)胞培養(yǎng)瓶是指含有在細(xì)胞培養(yǎng)上認(rèn)為的適量的細(xì)胞和適宜的細(xì)胞完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，這種的細(xì)胞培養(yǎng)瓶還帶有瓶蓋或瓶塞，瓶蓋或瓶塞可以對細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行完全的氣密封，阻止瓶內(nèi)和瓶外氣體交換。這種細(xì)胞培養(yǎng)瓶可在市場上購得，如NUNCLONR牌T-25或T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
本發(fā)明所說的二氧化碳?xì)怏w是指二氧化碳與空氣的混合氣體。二氧化碳?xì)怏w體積占總氣體體積的4.5-5.5，余量為空氣。最佳配比為二氧化碳?xì)怏w體積占總氣體體積的5.0，余量為空氣。本發(fā)明所說的二氧化碳?xì)怏w在50-80公斤力/厘米2壓力下貯藏在耐壓鋼瓶中，使用時，通過減壓閥，在低壓表壓力指針為0.05-1.0公斤力/厘米2壓力下，低壓氣體經(jīng)除菌灌氣管的過濾除菌腔中的填充物過濾除菌成無菌二氧化碳?xì)怏w，再灌裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的空氣由二氧化碳?xì)怏w置換。
灌裝了二氧化碳?xì)怏w的細(xì)胞培養(yǎng)瓶經(jīng)擰緊瓶蓋，置細(xì)胞至細(xì)胞所需溫度的溫箱中培養(yǎng)，溫箱可以是普通水溶溫箱如上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠生產(chǎn)的隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱或廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的生化培養(yǎng)箱。培養(yǎng)箱的溫度調(diào)至細(xì)胞所需適宜的溫度20℃-45℃之間，如常用的28℃或37℃。灌裝二氧化碳?xì)怏w來培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法可培養(yǎng)所有的離體動物細(xì)胞如懸浮生長的細(xì)胞和貼壁生長的細(xì)胞。
正如二氧化碳培養(yǎng)箱中二氧化碳?xì)怏w在細(xì)胞培養(yǎng)中所起的作用一樣，灌裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的二氧化碳?xì)怏w起著同樣的維持細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)微環(huán)境的PH值穩(wěn)定和促進(jìn)細(xì)胞代謝中氣體交換的作用，瓶蓋的擰緊阻止瓶內(nèi)二氧化碳?xì)怏w的外溢并防止微生物侵入培養(yǎng)瓶內(nèi)。另外由于細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于普通溫箱內(nèi)，這種溫箱內(nèi)沒有潮濕的環(huán)境，不利微生物特別是霉菌在培養(yǎng)箱中的生長，這樣也減少了培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生污染的概率。
一種培養(yǎng)細(xì)胞用灌裝二氧化碳?xì)怏w的裝置，由內(nèi)盛二氧化碳?xì)怏w的耐壓鋼瓶，減壓閥，耐壓導(dǎo)管，通氣連接蓋和除菌灌氣管依次連結(jié)密封而成，其特征是除菌灌氣管11由噴嘴1，鐘形罩2，通氣管9和過濾除菌腔13組成，過濾除菌腔13內(nèi)填裝脫脂棉17，過濾除菌腔13通過通氣管9與噴嘴1相通，噴嘴1置于鐘形罩2內(nèi)；通氣連接蓋12一端塞入過濾除菌腔13內(nèi)，另一端依次連著耐壓導(dǎo)管14，減壓閥15和內(nèi)盛二氧化碳?xì)怏w的耐壓鋼瓶16。
鋼瓶內(nèi)的二氧化碳?xì)怏w在高壓壓力為50-80公斤力/厘米2狀態(tài)下貯存，隨著使用，壓力逐步降低，直至為0公斤力/厘米2。灌裝氣體時，二氧化碳?xì)怏w通過減壓閥，如氧氣減壓閥，在減壓閥低壓表指針為0.1-1.0公斤力/厘米2時，最好為0.3公斤力/厘米2壓力時，使二氧化碳?xì)怏w通過除菌灌氣管11的過濾除菌腔13內(nèi)的無菌脫脂棉17，氣體變成無菌的二氧化碳?xì)怏w，通過噴嘴1，進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置換瓶內(nèi)已存在的空氣。除菌灌氣管11在使用時，最好置于正在工作的生物安全臺或稱超凈工作臺的無菌區(qū)上。
除菌灌氣管11最好由玻璃制造，這樣可反復(fù)高壓蒸氣滅菌并易于觀察。過濾除菌腔13內(nèi)盛的脫脂棉17可隨時更換，并可隨除菌灌氣管一同高壓滅菌，成為無菌脫脂棉，在二氧化碳?xì)饬魍ㄟ^時起過濾除菌作用。
作為本發(fā)明的改進(jìn)，置于鐘形罩2內(nèi)的噴嘴1離鐘形罩2外圍有1-5厘米距離，鐘形罩2與通氣管9融為一體。鐘形罩2在灌裝二氧化碳?xì)怏w時保護(hù)噴嘴微區(qū)間和細(xì)胞培養(yǎng)瓶口的無菌環(huán)境，以免污染正在灌氣中的細(xì)胞培養(yǎng)物。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，除菌灌氣管11還帶有一個閥門8，該閥門8位于過濾除菌腔13和噴嘴1之間的通氣管9中。閥門8由錐形旋塞3和與之大小吻合，形狀相匹配的錐形活塞套5組成，旋塞3的錐頂部為螺紋10，并伸出活塞套5外，墊圈6和螺帽7將旋塞3固定在活塞套5內(nèi)，在旋塞上有導(dǎo)氣孔4，在導(dǎo)氣孔4與通氣管9水平時，導(dǎo)氣孔4與通氣管9相通?；钊?與除菌灌氣管11一樣由玻璃制造，并與通氣管9連成為一個整體；旋塞4，墊圈6，螺帽7由塑料制造，以利氣體密封。
在一個細(xì)胞培養(yǎng)瓶灌裝二氧化碳?xì)怏w完畢轉(zhuǎn)換另一細(xì)胞培養(yǎng)瓶時，將旋塞3旋轉(zhuǎn)90度，導(dǎo)氣孔4與通氣管9垂直，閥門關(guān)閉，阻止二氧化碳?xì)怏w通過導(dǎo)氣孔4，以節(jié)約二氧化碳?xì)怏w，浪費(fèi)減少。
采用灌裝氣體來培養(yǎng)細(xì)胞的方法可最大限度地避免培養(yǎng)中的細(xì)胞發(fā)生細(xì)菌、放線菌、真菌污染，特別是霉菌污染，而灌裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的二氧化碳?xì)怏w又調(diào)節(jié)著密封培養(yǎng)瓶內(nèi)微環(huán)境中PH值的恒定，即調(diào)節(jié)著細(xì)胞瓶內(nèi)培養(yǎng)液的PH值恒定，滿足培養(yǎng)中的細(xì)胞對二氧化碳的需求。
采用本發(fā)明提供的二氧化碳灌氣裝置，可提供無菌的二氧化碳?xì)怏w和無菌的灌裝氣體的微環(huán)境條件。除菌灌氣管中的過濾除菌腔內(nèi)的無菌脫脂棉，可對二氧化碳?xì)怏w過濾除菌，而鐘形罩有效地遮擋著外界的氣流可能造成的污染，保護(hù)噴嘴與培養(yǎng)瓶的無菌環(huán)境。
采用灌裝氣體方法培養(yǎng)細(xì)胞，無污染發(fā)生，細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定，且費(fèi)用減少50％。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。


圖1是本發(fā)明灌裝氣體的裝置示意2是本發(fā)明灌裝氣體的裝置中除菌灌氣管結(jié)構(gòu)的剖視圖。
圖3是本發(fā)明灌裝氣體的裝置的除菌灌氣管中閥門的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4是本發(fā)明灌裝氣體的裝置的除菌灌氣管中閥門的結(jié)構(gòu)另一示意圖。
本發(fā)明灌裝氣體的裝置如圖1所示，由內(nèi)盛二氧化碳?xì)怏w的耐壓鋼瓶16，減壓閥15，耐壓導(dǎo)管14，通氣連接蓋12和除菌灌氣管11依次連結(jié)密封而成。本發(fā)明的除菌灌氣管11結(jié)構(gòu)如圖2所示，除菌灌氣管11由噴嘴1，鐘形罩2，通氣管9和過濾除菌腔13組成，過濾除菌腔13內(nèi)填裝脫脂棉17，過濾除菌腔13通過通氣管9與噴嘴1相連，噴嘴1置于鐘形罩2內(nèi)。通氣連接蓋12一端塞入過濾除菌腔13內(nèi)，另一端依次連著耐壓導(dǎo)管14，減壓閥15和內(nèi)盛二氧化碳?xì)怏w的耐壓鋼瓶16。鋼瓶內(nèi)的二氧化碳?xì)怏w在高壓壓力為50-80公斤力/厘米2狀態(tài)下貯存，隨著使用，壓力逐步降低，直至為0公斤力/厘米2。使用時，二氧化碳?xì)怏w通過減壓閥15，如氧氣減壓閥，在減壓閥低壓表指針為0.1-1.0公斤力/厘米2時，最好為0.3公斤力/厘米2壓力時，使氣體通過除菌灌氣管11的過濾除菌腔13內(nèi)的無菌脫脂棉17，二氧化碳?xì)怏w變成無菌的二氧化碳?xì)怏w，通過噴嘴1，進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置換瓶內(nèi)已存在的空氣。除菌灌氣管11在使用時，最好置于正在工作的生物安全臺內(nèi)或超凈工作臺的無菌區(qū)間內(nèi)。
作為本發(fā)明的改進(jìn)，置于鐘形罩2內(nèi)的噴嘴1離鐘形罩2外圍有1-5厘米距離，鐘形罩2與通氣管9融為一體。鐘形罩2在灌裝二氧化碳?xì)怏w時保護(hù)噴嘴微區(qū)間和細(xì)胞培養(yǎng)瓶口的無菌環(huán)境，以免污染正在灌氣中的細(xì)胞培養(yǎng)物。
作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，除菌灌氣管11還帶有一個閥門8，閥門結(jié)構(gòu)如圖3和圖4所示，該閥門8位于過濾除菌腔11和噴嘴1之間的通氣管9中。閥門8由錐形旋塞3和與之大小吻合，形狀相匹配的錐形活塞套5組成，旋塞3的錐頂部為螺紋10，并伸出活塞套5外，墊圈6和螺帽7將旋塞3固定在活塞套5內(nèi)，在旋塞3上有導(dǎo)氣孔4，導(dǎo)氣孔4與通氣管9相通?；钊?與除菌灌氣管11一樣由玻璃制造，并與通氣管9連成為一個整體；旋塞3，墊圈6，螺帽7由塑料制造。
在一個細(xì)胞培養(yǎng)瓶灌裝二氧化碳?xì)怏w完畢轉(zhuǎn)換另一細(xì)胞培養(yǎng)瓶時，將旋塞3旋轉(zhuǎn)90℃，如圖4所示，導(dǎo)氣孔4與通氣管9方向垂直，閥門關(guān)閉，阻止二氧化碳?xì)怏w通過導(dǎo)氣孔4，以節(jié)約二氧化碳?xì)怏w，浪費(fèi)減少。
當(dāng)灌裝二氧化碳?xì)怏w時，可按如下順序操作1)打開二氧化碳鋼瓶16的高壓閥門；2)調(diào)整減壓閥15的低壓閥值為0.1-1.0公斤力/厘米2，最好為0.3公斤力/厘米2；3)在超凈工作臺無菌區(qū)打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋；
4)將細(xì)胞培養(yǎng)瓶口對著除菌灌氣管11的噴嘴1，且瓶口置于鐘形罩2內(nèi)；5)二氧化碳?xì)怏w灌入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，持續(xù)時間15-60秒；6)立即擰緊瓶蓋，常規(guī)培養(yǎng)；7)降低低壓閥值至0；8)關(guān)閉高壓閥門。
當(dāng)連續(xù)灌裝2個或多個細(xì)胞培養(yǎng)瓶時，可在上述步驟6后將旋塞3旋轉(zhuǎn)90度，關(guān)閉閥門8，以阻止二氧化碳?xì)怏w通過，再打開另一培養(yǎng)瓶瓶蓋，并將旋塞3再旋轉(zhuǎn)90度，重復(fù)上述步驟3-6，實現(xiàn)多次灌裝二氧化碳?xì)怏w又節(jié)約二氧化碳?xì)怏w的目的。
采用灌裝氣體的方法培養(yǎng)動物細(xì)胞，可有效地減少細(xì)胞發(fā)生污染的概率，保證培養(yǎng)過程中的細(xì)胞質(zhì)量。與常規(guī)方法相比，因不需購置與維修二氧化碳培養(yǎng)箱，費(fèi)用低廉。
可對本發(fā)明稍加改進(jìn)，可對工業(yè)化大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)所使用的容器如轉(zhuǎn)瓶等進(jìn)行灌裝二氧化碳?xì)怏w，并起到類似二氧化碳培養(yǎng)箱的作用。
以下結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明
權(quán)利要求
1．一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其步驟是A 讓高壓二氧化碳?xì)怏w減壓成為低壓氣體，B 低壓氣體經(jīng)除菌灌氣管過濾除菌成無菌二氧化碳?xì)怏w，C 細(xì)胞培養(yǎng)瓶口對著除菌灌氣管的噴嘴，并置瓶口在除菌灌氣管的鐘形罩內(nèi)，D 灌裝二氧化碳?xì)怏w入細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，E 擰緊瓶蓋，置細(xì)胞培養(yǎng)瓶于溫箱中培養(yǎng)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是二氧化碳?xì)怏w是二氧化碳與空氣的混合氣體，二氧化碳?xì)怏w體積占總氣體體積的4.5-5.5，余量為空氣。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是二氧化碳?xì)怏w體積占總氣體體積的5.0，余量為空氣。
4．一種培養(yǎng)細(xì)胞用灌裝二氧化碳?xì)怏w的裝置，由內(nèi)盛二氧化碳?xì)怏w的耐壓鋼瓶，減壓閥，耐壓導(dǎo)管，通氣連接蓋和除菌灌氣管依次連結(jié)密封而成，其特征是除菌灌氣管(11)由噴嘴(1)，鐘形罩(2)，通氣管(9)和過濾除菌腔(13)組成，過濾除菌腔(13)內(nèi)填裝脫脂棉(17)，過濾除菌腔(13)通過通氣管(9)與噴嘴(1)相連，噴嘴(1)置于鐘形罩(2)內(nèi)。通氣連接蓋(12)一端塞入過濾除菌腔(13)內(nèi)，另一端依次連著耐壓導(dǎo)管(14)，減壓閥(15)和內(nèi)盛二氧化碳?xì)怏w的耐壓鋼瓶(16)。
5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)細(xì)胞用灌裝二氧化碳?xì)怏w的裝置，其特征是除菌灌氣管(11)還帶有一個閥門(8)，該閥門(8)位于過濾除菌腔(13)和噴嘴(1)之間的通氣管(9)中。閥門(8)由錐形旋塞(3)和與之大小吻合，形狀相匹配的錐形活塞套(5)組成，旋塞(3)的錐頂部為螺紋(10)，并伸出活塞套(5)外，墊圈(6)和螺帽(7)將旋塞(3)固定在活塞套(5)內(nèi)，在旋塞上有導(dǎo)氣孔(4)，在導(dǎo)氣孔(4)與通氣管(9)水平時，導(dǎo)氣孔(4)與通氣管(9)相通?；钊?5)與除菌灌氣管(11)一樣由玻璃制造，并與通氣管(9)連成為一個整體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的用灌裝二氧化碳?xì)怏w來培養(yǎng)動物細(xì)胞的方法和實現(xiàn)該方法所采用的細(xì)胞培養(yǎng)用灌裝氣體的裝置。該方法是讓二氧化碳?xì)怏w減壓,除菌,灌裝入培養(yǎng)瓶,擰緊瓶蓋,置溫箱中培養(yǎng)。實現(xiàn)該方法的裝置由內(nèi)盛二氧化碳?xì)怏w的耐壓鋼瓶16,減壓閥15,耐壓導(dǎo)管14,通氣連接蓋12和除菌灌氣管11依次連結(jié)密封而成。用該方法并采用該裝置,可提供無菌的二氧化碳?xì)怏w和無菌的灌裝氣體的微環(huán)境條件,有效地減少細(xì)胞發(fā)生污染的概率,保證細(xì)胞質(zhì)量。
文檔編號C12N5/06GK1321742SQ0111425
公開日2001年11月14日 申請日期2001年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者屈三甫, 鄭從義 申請人:武漢大學(xué)