專(zhuān)利名稱(chēng)：人源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子cDNA克隆和序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子cDNA克隆和序列。
自1975年LabrecgueDR首次分離到肝臟刺激因子以來(lái)，近20多年的研究中發(fā)現(xiàn)了多種有促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PHGF)、如肝臟刺激生長(zhǎng)因子(HSS)及肝再生增強(qiáng)因子(ALR)等促肝細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。我國(guó)學(xué)者蘇先獅等人從乳豬肝組織中抽提得到的肝細(xì)胞DNA合成刺激因子(HDSSF)被證實(shí)有很強(qiáng)的刺激受損肝細(xì)胞增殖作用。已經(jīng)用于治療嚴(yán)重肝炎，并在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出很好的降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、球蛋白(G)、升高血漿白蛋白(A)，改善A/G比值功效，并測(cè)出了部分氨基酸序列。為了證明該物質(zhì)的本質(zhì)及探討人源性HDSSF，根據(jù)同源克隆的原則，合成簡(jiǎn)并引物，通過(guò)cDNA文庫(kù)篩選，獲得單個(gè)克隆，完成了編碼區(qū)核苷酸全部序列。
本發(fā)明的目的就是提供人源性HDSSF cDNA克隆序列。
本發(fā)明采用從乳豬肝組織中純化的肝臟刺激物質(zhì)的部分氨基酸序列，合成簡(jiǎn)并引物，依據(jù)同源克隆的原則，利用簡(jiǎn)并PCR技術(shù)從人胎肝cDNA文庫(kù)擴(kuò)增出目的片斷，并以此為探針進(jìn)行核酸雜交篩選人胎肝cDNA文庫(kù)，從而獲得目的基因，其cDNA鏈為792bp，含有594bp的完整開(kāi)放續(xù)碼框架和5’及3’末端非編碼序列，該序列顯示HDSSF為一個(gè)含有198個(gè)氨基酸殘基。測(cè)出的序列是一種不同于其他因子的物質(zhì)AAAAGCTGTA GTGGGTTTGT AGCCAGGATG ACAGCGGTACCTTAACACAG TCCCAACAAC ATACACATCC TCTTTTGTCGGCCTAGGATA TGTTTCCCAG GAAGCATGTG GAATGTCTGGTAAATTAATA CAACTATTGG GCTCACAAGC AGGAGGAGAAGGATTCCATT TGCTATCAGC ATCACAATGA ATTACACTGCTGCCTCTGAG AACAAAACC TTTTTGGCAC TTAAACACAATAGTGTCTTT GTAATTATAG ATGGGTCCAA ATCCAGAGACCATTTCCCCA TGTGAAACAT CTGGCTTGCG ACAGGTGATTTTTTCACAGG TAGGAGGGCTT GGTCTCCAAA CGCCTATTGTTTCATTCTCC ACAGTGCAAG AAATGGAGGC ATGGCCCAAGAGTGAGAAGC GGGGGTCACA GCTGTAGGTG ACAGAAAAGCCGTATGCGTA GAAATTTTCT TCACCGCTGT GCCTTCCATTCCTGATGTCT GGAGGAGGCT TACACTTGAC AATTTCACATTGTGGGAGAG GATGACTCCA GCCAACTCCT CTATCTTGGACTTCACAACG ACTAGTGGTT GAGCCAATTA AGAAAAA


圖1為人HDSSF基因核苷酸序列圖。
人HDSSF基因核苷酸序列分析結(jié)果見(jiàn)附圖1。
本發(fā)明是通過(guò)以下方法獲得的1.質(zhì)檢、宿主菌及人胎肝cDNA文庫(kù)pGEM-T easy vector及E.coli JM109購(gòu)自Promage公司；人胎肝cDNA文庫(kù)購(gòu)自sigma公司。
2.尼龍膜購(gòu)自美國(guó)杜邦公司。
3.簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)原測(cè)定的乳豬肝抽提物HDSSF，N末端氨基酸部分序列設(shè)計(jì)上游簡(jiǎn)并引物5’-GANGANAANTCNTTNAANTGGAANGC-3’，并依據(jù)mRNA的特性，確定其下游引物。
4.HDSSF探針制備以cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)完成后以1％瓊脂糖凝膠電泳，檢查有無(wú)目的條帶。
5.探針的回收與標(biāo)記由于HDSSF的分子量為21000道爾頓，估計(jì)其讀碼框?yàn)?00bp左右，因此在凝膠上切下600bp條帶回收，按試劑盒方案以地高辛標(biāo)記探針。
6.人胎肝cDNA文庫(kù)的篩選購(gòu)買(mǎi)的cDNA文庫(kù)經(jīng)滴度測(cè)定后，取100個(gè)重組子λgt10進(jìn)行文庫(kù)初篩。挑取初篩得到的噬斑在90mm培養(yǎng)皿上種板擴(kuò)增復(fù)篩，挑取單克隆噬斑。PCR增擴(kuò)HDSSF目的基因以λgt10插入位點(diǎn)兩端序列為引物primer15’-CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTG GTTAAGT-3’；primer25’-GAGGTGGCTTATGAGTA TTTCTTC CAGGGTA-3’。獲得900bp左右條帶，這一核苷酸即λgt10文庫(kù)插入的HDSSF目的基因，它包括兩條引物至酶切位點(diǎn)EcorRI的部分λgt10序列和HDSSF全序列。
7.HDSSF核苷酸序列分析在ABI pRISMTM377XL DNA測(cè)序儀上以末端終止法進(jìn)行HDSSF核苷酸序列測(cè)定。
根據(jù)從乳豬肝組織抽提純化的生化產(chǎn)品HDSSF的生物學(xué)活性可以推測(cè)人源性HDSSF將在人體肝臟中發(fā)揮更好的肝細(xì)胞增殖作用，人源性HDSSF基因克隆成功，為下一步開(kāi)展人源性HDSSF的重組產(chǎn)品研制和生物學(xué)研究以及生產(chǎn)基因產(chǎn)品奠定了決定性的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種人源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子cDNA克隆和序列，其特征在于采用從乳豬肝組織中純化的肝臟刺激物質(zhì)HDSSF測(cè)定的部分氨基酸序列，合成簡(jiǎn)并引物，依據(jù)同源克隆的原則，利用簡(jiǎn)并PCR技術(shù)從人胎肝cDNA文庫(kù)擴(kuò)增出目的片斷，并以此為探針進(jìn)行核酸雜交篩選人胎肝cDNA文庫(kù)，從而獲得目的基因HDSSF克隆，其cDNA鏈為792bp，含有594bp的完整開(kāi)放續(xù)碼框架和5’及3’末端非編碼序列，該序列顯示HDSSF為一個(gè)含有198個(gè)氨基酸殘基的促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，HDSSF核苷酸序列在ABI PRISMTM377XL DNA測(cè)序儀上以末端終止法進(jìn)行HDSSF核苷酸序列測(cè)定，該序列為AAAAGCTGTA GTGGGTTTGT AGCCAGGATG ACAGCGGTACCTTAACACAG TCCCAACAAC ATACACATCC TCTTTTGTCGGCCTAGGATA TGTTTCCCAG GAAGCATGTG GAATGTCTGGTAAATTAATA CAACTATTGG GCTCACAAGC AGGAGGAGAAGGATTCCATT TGCTATCAGC ATCACAATGA ATTACACTGCTGCCTCTGAG AACAAAACC TTTTTGGCAC TTAAACACAATAGTGTCTTT GTAATTATAG ATGGGTCCAA ATCCAGAGACCATTTCCCCA TGTGAAACAT CTGGCTTGCG ACAGGTGATTTTTTCACAGG TAGGAGGGCTT GGTCTCCAAA CGCCTATTGTTTCATTCTCC ACAGTGCAAG AAATGGAGGC ATGGCCCAAGAGTGAGAAGC GGGGGTCACA GCTGTAGGTG ACAGAAAAGCCGTATGCGTA GAAATTTTCT TCACCGCTGT GCCTTCCATTCCTGATGTCT GGAGGAGGCT TACACTTGAC AATTTCACATTGTGGGAGAG GATGACTCCA GCCAACTCCT CTATCTTGGACTTCACAACG ACTAGTGGTT GAGCCAATTA AGAAAAA
2.一種人源性肝細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子cDNA克隆方法，其特征在于①質(zhì)檢、宿主菌及人胎肝cDNA文庫(kù)pGEM-T easy vector及E.colj JM109購(gòu)自Promage公司；人胎肝cDNA文庫(kù)購(gòu)自sigma公司。②.尼龍膜購(gòu)自美國(guó)杜邦公司。③.簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)原測(cè)定的乳豬肝抽提物HDSSFN末端氨基酸部分序列設(shè)計(jì)上游簡(jiǎn)并引物5’-GANGANAANTCNTTNAANTGGAANGC-3’，并依據(jù)mRNA的特性，確定其下游引物。④.HDSSF探針設(shè)備以cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增。反應(yīng)完成后以1％瓊脂糖凝膠電泳，檢查有無(wú)目的條帶。⑤.探針的回收與標(biāo)記由于HDSSF的分子量為21000道爾頓，估計(jì)其讀碼框?yàn)?00bp左右，因此在凝膠上切下600bp條帶回收，按試劑盒方案以地高辛標(biāo)記探針。⑥.人胎肝cDNA文庫(kù)的篩選購(gòu)買(mǎi)的cDNA文庫(kù)經(jīng)滴度測(cè)定后，取100個(gè)重組子λgt10進(jìn)行文庫(kù)初篩。挑取初篩得到的噬斑在900mm培養(yǎng)皿上種板擴(kuò)增復(fù)篩，挑取單克隆噬斑。PCR增擴(kuò)HDSSF目的基因以λgt10插入位點(diǎn)兩端序列為引物primer15’-CTTTTGAGCAAGTTCAGCCTG GTTAAGT-3’；primer25’-GAGGTGGCTTATGAGTA TTTCTTC CAGGGTA-3’。獲得900bp左右條帶，這一核苷酸即λgt10文庫(kù)插入的HDSSF目的基因，它包括兩條引物至酶切位點(diǎn)EcorRI的部分λgt10序列和HDSSF全序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了利用簡(jiǎn)并PCR技術(shù)從人胎肝cDNA文庫(kù)擴(kuò)增出目的片斷,并以此為探針進(jìn)行核苷酸雜交篩選人胎肝cDNA文庫(kù),成功獲得目的基因HDSSF克隆,其cDNA鏈為792bp,含有594bp的完整開(kāi)放續(xù)碼框架和5’及3’末端非編碼區(qū)序列。本發(fā)展為下一步開(kāi)展人源性HDSSF的重組產(chǎn)品研制和生產(chǎn)該基因產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1386857SQ01114478
公開(kāi)日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2001年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月23日
發(fā)明者蘇先獅, 唐世剛 申請(qǐng)人:蘇先獅