專利名稱：一種建立植物基因標(biāo)簽系統(tǒng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立植物基因標(biāo)簽系統(tǒng)的方法。
遺傳學(xué)是對自然群體或誘變?nèi)后w變異規(guī)律進行研究的一門科學(xué)。通過對作圖群體中變異規(guī)律的遺傳分析從而對引起變異的遺傳因子(基因)及其在在染色體上的相關(guān)位置加以確認(rèn)。這種變異可以是分離的，如大多數(shù)點突變；也可以是連續(xù)的，如一些復(fù)雜性狀(特別是一些重要的農(nóng)藝性狀，如產(chǎn)量和植株高度)，這些性狀大多是由多基因控制的。
近年來，植物基因組研究進展迅速，擬南芥基因組序列已在2000年底全部被測定，水稻的基因組序列測定也即將于今年完成。隨著植物基因組測序計劃的迅速推進，Genebank中積累了大量功能未知的植物DNA序列，如何闡明其生物學(xué)意義即鑒定出基因組全部基因的功能已成為植物基因組研究的重點和熱點。突變體途徑是目前對植物基因組中基因進行功能分析的最廣泛的應(yīng)用手段，并在植物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究中取得了很大成功。經(jīng)典的化學(xué)(EMS)或物理(等離子、γ射線)誘變法允許我們在相對容易的情況下以極高的頻率獲得整個基因組基因飽和突變，即每一基因均發(fā)生一次突變，然后用圖位克隆程序?qū)ν蛔兓蜻M行克隆。在模式植物如擬南芥中由于高密基因圖譜和一系列重疊基因組DNA的酵母人工染色體(YAC)或細菌人工染色體(BAC)的存在，這一程序可相對較快進行。而且，隨著基因組序列的完成，圖位克隆策略也將大大加速。但是，對分子標(biāo)記飽和度低的大多數(shù)植物來說，圖位克隆無疑將是一個極為漫長的過程。
可以隨機插入植物染色體的DNA元件如轉(zhuǎn)座子或農(nóng)桿菌T-DNA也可用作誘變劑誘導(dǎo)植物功能缺失突變體的發(fā)生。隨著植物基因組序列的逐漸被破譯，T-DNA和轉(zhuǎn)座子插入突變等方法在基因功能研究中應(yīng)用越來越廣泛。由于插入元件的序列是已知的，通過Inverse PCR或Tail PCR法可在很短的時間內(nèi)獲得插入片段的側(cè)翼(Souer et al.，1995；Liu et al.，1995)，并進行測序，因此被插入的基因序列可以再通過PCR的方法很容易的克隆出來，并可建立T-DNA或Ds側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫。因此，插入突變法的運用為我們提供了一種迅速有效的克隆突變基因的方法。
農(nóng)桿菌T-DNA標(biāo)簽技術(shù)即通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)將T-DNA隨機插入到植物基因組中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的改進和完善，使利用T-DNA標(biāo)簽對植物全基因組進行突變進而研究基因組所有基因的功能成為可能。T-DNA一旦插入就幾乎不再移動，因此，所再生的突變體相當(dāng)穩(wěn)定，較易保存。但是，T-DNA標(biāo)簽僅適用于可以用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的植物。而且，要建立在基因組中每一個基因至少含一個突變標(biāo)簽的飽和突變體庫，需得到的轉(zhuǎn)化突變體數(shù)量極大。
1951年Mclintock發(fā)現(xiàn)在玉米基因組中存在一段可移動的DNA序列，它可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置，后來命名為轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子(transposon)。后來，除玉米以外，人們在金魚草，矮牽牛，水稻等植物中也發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)座子存在。
轉(zhuǎn)座子大體可以分為兩大類以DNA-DNA方式轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)。第一類轉(zhuǎn)座子可以通過DNA復(fù)制或直接切除兩種方式獲得可移片段，重新插入基因組DNA中。根據(jù)轉(zhuǎn)座的自主性，這類元件又可以分為自主轉(zhuǎn)座元件和非自主轉(zhuǎn)座元件，前者本身能夠編碼轉(zhuǎn)座酶而進行轉(zhuǎn)座，后者則需在自主元件存在時方可轉(zhuǎn)座，如在玉米的Ac/Ds系統(tǒng)中，Ac(Activator)屬于自主元件，Ds(Dissociation)則是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能轉(zhuǎn)座(Girel and Saedler，1992)。第二類轉(zhuǎn)座子又稱為返座元(retroposon)(Hirochika，1997)，是近年新發(fā)現(xiàn)的由RNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座元件，在結(jié)構(gòu)和復(fù)制上與反轉(zhuǎn)錄病毒(retrovims)類似，只是沒有病毒感染必須的env基因，它通過轉(zhuǎn)錄合成mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄合成新的元件整合到基因組中完成轉(zhuǎn)座，每轉(zhuǎn)座1次拷貝數(shù)就會增加1份，因此它是目前所知高等植物中數(shù)量最大的一類可活動遺傳成分。目前共發(fā)現(xiàn)了3種類型反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tyl-copia類，Ty3-gypsy類和LINE(long interspersed nuclear elements)類轉(zhuǎn)座子，前兩類是具有長末端重復(fù)的轉(zhuǎn)座子，LINE類轉(zhuǎn)座子沒有長末端重復(fù)。高等植物中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子主要屬于Tyl-copia類，分布十分廣泛，幾乎覆蓋了所有高等植物種類(Hirochika et al.，1996)。目前在基因庫中登陸的植物轉(zhuǎn)座子約156種，最常用的是來源于玉米的Ac/Ds系統(tǒng)。
轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)不僅解釋了生物遺傳進化上分子作用引起的一些現(xiàn)象，也為基因工程和分子生物學(xué)研究提供了強有力的工具，使人們可以在不了解基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和表達模式的情況下，分離克隆植物基因，即轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽(transposon tagging)。其原理是利用轉(zhuǎn)座子的插入造成基因突變，以轉(zhuǎn)座子序列為基礎(chǔ)，從突變株的基因文庫中篩選出帶有此轉(zhuǎn)座子的克隆，它必定含有與轉(zhuǎn)座子序列相鄰的突變基因的部分序列，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因(Girel and Saedler，1992)。
1984年，用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法首先在玉米中分離了bronze基因，該基因編碼了玉米花色素合成途徑的關(guān)鍵酶——UDP-葡萄糖類黃3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Fedoroff et al.，1984)。Baker等人首先證明了玉米的Ac/Ds轉(zhuǎn)座元件在轉(zhuǎn)基因煙草中有作用，此后又發(fā)現(xiàn)Ac/Ds在其他許多物種中如擬南芥、蕃茄、矮牽牛、亞麻、馬鈴薯、黃豆和水稻中都有活性(Baker et al.，1986；Hirochika et al.，1996；Hirochika，1997)。1993年用Ac元件從矮牽牛中成功地克隆了一個花色素苷合成基因，開創(chuàng)了用外源轉(zhuǎn)座子在異源宿主中克隆基因的先河(Chuck et al.，1993)。此后利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)分離了許多植物基因。
目前植物基因工程常用的轉(zhuǎn)座元件體系分為天然和人工改造兩大類，前者包括自主元件單因子體系和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座元件體系，后者主要是人工改造的雙因子體系。
自主轉(zhuǎn)座元件單因子體系利用了轉(zhuǎn)座活性較高的自主轉(zhuǎn)座子如玉米的Mu轉(zhuǎn)座子、Ac轉(zhuǎn)座子和矮牽牛的dTpH1轉(zhuǎn)座子，已經(jīng)克隆了擬南芥白化病基因(albino)、雄性育性基因、蕃茄的抗病基因Cf-9等基因(Knappet al.，1994a)。這一轉(zhuǎn)座體系具有兩大優(yōu)點一是在植物中插入拷貝數(shù)高，如Mu元件每個基因組平均拷貝數(shù)可達100以上，因此可以在大田自然培養(yǎng)條件下獲得大量突變個體；二是只需篩選相對較少量的植株就能標(biāo)記所有基因。然而，這一體系也存在一些問題自主轉(zhuǎn)座元件高頻率的轉(zhuǎn)座有可能切除轉(zhuǎn)座酶而留下一些序列導(dǎo)致永久突變；自主轉(zhuǎn)座在體細胞內(nèi)可能造成基因功能自動恢復(fù)；自主元件切除留下一些片段使轉(zhuǎn)座元件不能與突變表型共分離，這些都增加了篩選克隆的困難，阻礙了轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽的推廣(Lucas et al.，1995)。
雖然反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子作為一個整體，在整個植物基因組中拷貝數(shù)很多甚至是最多的一類成分，但它包括了許多亞群，有的亞群僅由一個或幾個拷貝組成，這些以單拷貝或低拷貝方式存在的成分比較容易識別，同時實驗證明反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活動在組織培養(yǎng)中能被激活，因此它們是一類很有潛力的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽體系。1996年Hirchick等人就利用水稻反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tos17建立了水稻基因敲除體系(gene knock-out system)，Tos17可以在組織培養(yǎng)過程中被激活，插入水稻基因組中，使基因失效(Hirochika，1997)。1999年Sato等利用這一體系分離了6個水稻kn1-型同源異型框基因，發(fā)現(xiàn)了引起水稻植株矮化的突變基因OSH15(Sato et al.，1999)。
最近Lucas等將煙草中的有活性的Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入擬南芥(Lucas et al.，1995)，發(fā)現(xiàn)它在后者中可進行轉(zhuǎn)座，從而將新的拷貝插入到其它基因的可讀框中。之后又相繼將它導(dǎo)入蕃茄和水稻中，在新的宿主中進行了表達，而且宿主的內(nèi)源反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不影響新導(dǎo)入轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座，說明反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子并不受植物種類差異的影響。雙子葉植物中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不僅可在異源雙子葉植物中轉(zhuǎn)座，也可以在單子葉植物中表達，這為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子用于轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽提供了更廣闊的前景。
雙因子轉(zhuǎn)座子體系是一經(jīng)人工改造過的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)。它由一個非自主轉(zhuǎn)座元件和一個改造過后自身不能轉(zhuǎn)座的自主轉(zhuǎn)座元件組成，后者編碼轉(zhuǎn)座酶引起前者的轉(zhuǎn)座。分別構(gòu)建含兩個元件的植物表達載體(

圖1)，分別轉(zhuǎn)化植物培育分別含有非自主性轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的株系，后代純化，再通過轉(zhuǎn)基因植株雜交，在F2代就能獲得大量由轉(zhuǎn)座子引起的突變體。通過異源轉(zhuǎn)座子(主要是玉米轉(zhuǎn)座子如Ac/Ds，En/Spm，或Mu)，人們已經(jīng)在擬南芥、矮牽牛、金魚草、西紅柿、玉米等幾種植物(Knappet al.，1994b；Lucas et al.，1995；Sato et al.，1999；Izawa et al.，1997)中，獲得各種突變植株群體，Shimamoto等利用雙元載體系統(tǒng)，分別培育含Ds轉(zhuǎn)座元件和含Ac轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)座酶(AcTPase)基因的水稻株系，通過雜交篩選得到了大量矮化、花期改變的突變體(Izawa et al.，1997)。
雙因子轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)Ac/Ds的轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽系統(tǒng)雖然只需要幾百個起始獨立Ds轉(zhuǎn)化體，通過與表達Ac轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因植株雜交即可獲得新突變體群體。大大減少了轉(zhuǎn)化工作量。但后期田間所需的純化、雜交工作量很大。而轉(zhuǎn)基因植物在田間必須經(jīng)幾代篩選才可獲得純系。雜交后代又需經(jīng)過幾代擴繁使Ac轉(zhuǎn)座酶和Ds插入元件分離，才能使突變體得以穩(wěn)定，工作量極大。
T-DNA標(biāo)簽技術(shù)雖可取得較好的單位點整合效果，并具有插入穩(wěn)定，容易保持等優(yōu)點，但其需要相當(dāng)大轉(zhuǎn)化群體。要建立飽和突變體庫，即基因組的每一基因至少有一個插入標(biāo)簽，即便是基因組最小的植物擬南芥要獲得95％飽和度的插入約需12.5萬個獨立轉(zhuǎn)基因植株，水稻則高達45萬以上。前期轉(zhuǎn)化工作量極大。因此，傳統(tǒng)的方法在大多數(shù)植物突變體庫的建立中均難以進行。
本發(fā)明的目的是提供一種建立植物基因標(biāo)簽系統(tǒng)的方法。
我們利用可誘導(dǎo)系統(tǒng)控制Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的轉(zhuǎn)座酶基因，并與Ds一起轉(zhuǎn)入植株。在未誘導(dǎo)情況下，Ac轉(zhuǎn)座酶基因處于沉默狀態(tài)，不具激活Ds轉(zhuǎn)座能力。通過瞬間的誘導(dǎo)Ac轉(zhuǎn)座酶表達，激活Ds轉(zhuǎn)座并隨機插入植物基因組中從而獲得突變體。由于Ds的轉(zhuǎn)座是用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)Ac轉(zhuǎn)座酶而發(fā)生，不需要通過與含Ac轉(zhuǎn)座酶的植株雜交來實現(xiàn)，從而省卻了繁重的田間雜交工作。且任何一個插入突變體均可作為一個突變源來產(chǎn)生新的突變體。這樣，就可從有限的起始材料，通過控制瞬間誘導(dǎo)次數(shù)，在短時間內(nèi)獲得植物飽和突變?nèi)后w。另一方面，在未誘導(dǎo)情況下由于無Ac轉(zhuǎn)座酶存在，突變體可保持穩(wěn)定并遺傳，從而省卻了傳統(tǒng)方法中通過田間多次擴繁來分離轉(zhuǎn)座酶和Ds插入元件，以使插入突變體穩(wěn)定的步驟和程序，節(jié)省了大量時間、人力、物力和財力。
由于通過重復(fù)誘導(dǎo)，插入元件Ds可重新轉(zhuǎn)座，因此可以利用有限的起始材料通過反復(fù)誘導(dǎo)的方法使插入快速達到飽和狀態(tài)。在擬南芥中僅需要100-300株左右起始材料。在水稻中也僅需要500-1000左右的起始轉(zhuǎn)基因材料。這是傳統(tǒng)方法工作量的五千到一萬分之一。大大縮短了獲得飽和突變體群體所需要的時間，節(jié)省了財力、物力。尤為重要的是這一方法的建立使那些難以轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化系統(tǒng)不完善的植物突變體庫的建立成為可能。
本發(fā)明提供了一種建立植物基因標(biāo)簽系統(tǒng)的方法，包括以下步驟(a)構(gòu)建一種第一DNA片段，使其包含一種由誘導(dǎo)系統(tǒng)或愈傷組織特異性表達啟動子控制的編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和一種植物篩選標(biāo)記基因，和一種第二DNA片段，使其包含一種依賴于轉(zhuǎn)座酶的非自主性插入元件和一種植物篩選標(biāo)記基因；或者，構(gòu)建一種第三DNA片段，使其包含一種由誘導(dǎo)系統(tǒng)或愈傷組織特異性表達啟動子控制的編碼轉(zhuǎn)座酶的基因、一種依賴于轉(zhuǎn)座酶的非自主性插入元件和一種植物篩選標(biāo)記基因；(b)用所構(gòu)建的第一DNA片段和第二DNA片段或者含有這些DNA片段的質(zhì)粒，或者用所構(gòu)建的第三DNA片段或者含有該DNA片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞；(c)篩選出被轉(zhuǎn)化的植物細胞；(d)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶表達；(e)使被轉(zhuǎn)化的植物細胞再生出完整植株。
在本發(fā)明的方法中，所述的DNA片段指含有由誘導(dǎo)系統(tǒng)(或愈傷組織特異性表達啟動子)控制的轉(zhuǎn)座酶的DNA分子；可以是人工合成的DNA片段，也可在包括在用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體質(zhì)粒如pBin 19，pCambia，pBI 101等和可在原核生物中繁殖的其他質(zhì)粒如pUC，pBluescript，PCR載體質(zhì)粒中。這些質(zhì)粒以及使用這些質(zhì)粒的構(gòu)建方法可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進行。
所述的轉(zhuǎn)座酶可以是來源于不同生物(包括植物或非植物)，在植物中具有自主或非自主性轉(zhuǎn)座能力的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，如玉米來源的Ac/Ds，En/Spm，Mu，金魚草中的Tam，矮牽牛中的dTph1，水稻中的Tos17等。
所述的轉(zhuǎn)座酶基因是編碼自主性轉(zhuǎn)座酶和非自主性轉(zhuǎn)座酶基因，如玉米來源的Ac轉(zhuǎn)座酶基因或其他植物來源的轉(zhuǎn)座酶基因。
所述的依賴于轉(zhuǎn)座酶的非自主性轉(zhuǎn)座插入元件，如Ds元件等。非自主性轉(zhuǎn)座插入元件其末端反向重復(fù)序列(TIR)之間可根據(jù)建立突變體庫的目的(1)不含有其他DNA片段；或(2)含有選擇標(biāo)記基因；或(3)包含無啟動子或僅具核心啟動子(minimal promoter)-報告基因片段，以用于增強子和啟動子誘捕或基因誘捕；或(4)含有啟動子用于基因激活等。
所述的植物篩選標(biāo)記基因可以是抗生素篩選標(biāo)記基因，如抗卡那霉素篩選標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)，抗潮霉素篩選標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)；或非抗生素篩選標(biāo)記基因如木糖異構(gòu)酶等(Haldrup etal.，1998)。
所述的控制轉(zhuǎn)座酶的誘導(dǎo)系統(tǒng)可以是酒精可誘導(dǎo)系統(tǒng)(alc)，糖甾醇可誘導(dǎo)系統(tǒng)，四環(huán)素可誘導(dǎo)系統(tǒng)(tet)，乳糖可誘導(dǎo)系統(tǒng)(lac)，銅離子可誘導(dǎo)系統(tǒng)，及植物內(nèi)源誘導(dǎo)系統(tǒng)如熱激(heat shock)，除草劑(safener)，損傷誘導(dǎo)系統(tǒng)等及愈傷組織特異性表達啟動子。
本發(fā)明的方法中，所述的植物細胞指來源于如擬南芥、煙草、馬鈴薯、水稻、小麥、玉米、油菜、棉花、大豆等所有植物的細胞、組織或植株。細胞或植物的轉(zhuǎn)化指通過原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+，PEG)，基因槍介導(dǎo)法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，電激法，花粉管導(dǎo)入，微注射等任何一種方法或幾種方法的組合。
本發(fā)明的方法中，所述的轉(zhuǎn)化細胞(或植物愈傷組織，植株)的篩選指利用抗生素或其他篩選標(biāo)記基因，如含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因的細胞或愈傷組織可由卡那霉素或其替衍生代物如G 418等進行篩選；含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的細胞或愈傷組織可由潮霉素進行篩選等。在獲得抗性愈傷組織細胞后可采用Southern或PCR法，點雜交等分子檢測手段對其進行檢測，以確定其含有Ac轉(zhuǎn)座酶基因。
本發(fā)明的方法中，轉(zhuǎn)座酶的誘導(dǎo)表達可通過物理方法如熱激誘導(dǎo)，損傷誘導(dǎo)或針對不同誘導(dǎo)系統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)，如酒精誘導(dǎo)系統(tǒng)用酒精，四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)用四環(huán)素，糖甾醇誘導(dǎo)系統(tǒng)用的地塞米松，lac誘導(dǎo)系統(tǒng)用葡萄糖等實現(xiàn)，也可由其相應(yīng)的替代物或衍生物實現(xiàn)。誘導(dǎo)表達可在植物的任何時期如愈傷組織階段，植物營養(yǎng)生長階段，生殖生長階段，種子發(fā)生及種子萌發(fā)階段等，但以愈傷組織階段為最好。轉(zhuǎn)座酶還可由愈傷組織特異性表達啟動子控制其在植物愈傷組織階段特異性表達用以代替可誘導(dǎo)系統(tǒng)。用Northern或Western篩選在誘導(dǎo)時具有Ac轉(zhuǎn)座酶高表達而在未誘導(dǎo)時不表達的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的方法中，使被轉(zhuǎn)化的植物細胞再生出完整植株主要指通過離體由包含有上述DNA元件的轉(zhuǎn)化細胞再生的植株，也包括非離體的其他營養(yǎng)繁殖方法再生的植株。
A.編碼轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座因子。Ac元件的轉(zhuǎn)座酶由花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子控制。載體上同時含有抗生素篩選標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)，由胭脂堿合成酶基因(NOS)啟動子控制。
B.缺失Ac元件的部分片段獲得非自主性轉(zhuǎn)座子Ds元件，載體上同時含有抗生素篩選標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPT)，由CaMV 35S啟動子控制。Tocs，章魚堿合成酶基因(OCS)終止子。Tcamv，花椰菜花葉病毒終止子。
圖2可誘導(dǎo)啟動子-Ac轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒和Ds質(zhì)粒的構(gòu)建。
pCC-Ac01，誘導(dǎo)啟動子控制下的Ac轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒?？敲顾乜剐曰蛴蒛biquitin啟動子調(diào)控，Ubiquitin啟動子包含有其第一內(nèi)含子，以增強抗性基因表達。酒精可誘導(dǎo)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子alcR由水稻actin 1啟動子控制，Ac轉(zhuǎn)座酶基因由酒精可誘導(dǎo)系統(tǒng)alcA控制，在無誘導(dǎo)劑存在的情況下，轉(zhuǎn)座酶基因不表達。當(dāng)加入誘導(dǎo)劑酒精后酒精與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子alcR結(jié)合改變其構(gòu)象，然后與alcA結(jié)合，Ac轉(zhuǎn)座酶基因得以轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶。
pCC-Ds02，依賴轉(zhuǎn)座酶的非自主性Ds元件質(zhì)粒。質(zhì)粒含有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子調(diào)控的潮霉素抗性基因和依賴轉(zhuǎn)座酶的非自主性轉(zhuǎn)座Ds元件，包括有兩個末端重復(fù)序列(TIR)用于轉(zhuǎn)座的識別序列。在兩個末端重復(fù)序列(TIR)之間加有含不完全內(nèi)含子的大腸桿菌葡萄糖苷酸酶報告基因(GUS)以用于啟動子誘捕。LB，農(nóng)桿菌T-DNA左邊界；RB，農(nóng)桿菌T-DNA右邊界。
圖3 alcgus轉(zhuǎn)基因水稻植株的鑒定。M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.陽性對照；2.陰性對照植株；3-15，為獨立擬轉(zhuǎn)基因植株。
圖4 alcgus轉(zhuǎn)基因水稻誘導(dǎo)活性的鑒定。
用100mL 1％的酒精以根部澆灌的方式誘導(dǎo)alcgus轉(zhuǎn)基因水稻，初次誘導(dǎo)48h后重復(fù)誘導(dǎo)一次，120h后進行GUS活性檢測。1為非轉(zhuǎn)基因水稻對照，2-9分別為轉(zhuǎn)基因株系ta56、8a15、8a31、ta3、ta4、ta80、8a1、8a2。
圖5以不同酒精濃度澆灌水稻對alc系統(tǒng)誘導(dǎo)活性的影響。
用100mL不同濃度(v/v)的酒精以根部澆灌方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因水稻，初次誘導(dǎo)48h時重復(fù)誘導(dǎo)一次，120h時檢測GUS活性。CK，非轉(zhuǎn)基因水稻。A，轉(zhuǎn)基因株系8a2；B，轉(zhuǎn)基因株系ta4。
圖6酒精劑量對alc系統(tǒng)誘導(dǎo)活性的影響。
用100mL不同濃度(v/v)的酒精通過溶液培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因水稻ta4，持續(xù)誘導(dǎo)96h后收集葉片檢測GUS活性。CK，非轉(zhuǎn)基因水稻。
圖7酒精誘導(dǎo)時間對alc系統(tǒng)的作用。
用100mL的酒精以根部澆灌的方式誘導(dǎo)alc轉(zhuǎn)基因水稻，初次誘導(dǎo)48h后重復(fù)誘導(dǎo)一次(兩次誘導(dǎo)如圖中箭頭所示)，初次誘導(dǎo)后每隔24h采集一次葉片，用于GUS活性測定。CK為非轉(zhuǎn)基因水稻。A，轉(zhuǎn)基因株系ta4；B，轉(zhuǎn)基因株系ta56。
圖8酒精誘導(dǎo)時間對alc系統(tǒng)的作用。
用100mL的酒精以溶液培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)alc轉(zhuǎn)基因株系ta4，誘導(dǎo)后每隔24h采集一次葉片，用于GUS活性測定。CK為非轉(zhuǎn)基因水稻。
圖9 alc系統(tǒng)在不同器官誘導(dǎo)活性的比較。
用100mL 2％的酒精以根部澆灌的方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因株系ta4，48h時重復(fù)誘導(dǎo)一次，96h后采集根、莖、葉，檢測其GUS活性。
圖10 GUS在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中的組織化學(xué)定位.用100mL 2％的酒精以根部澆灌的方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因株系ta4，48h時重復(fù)誘導(dǎo)一次，96h后葉片經(jīng)徒手切片，用X-Gluc檢測其活性。A.誘導(dǎo)前，B.誘導(dǎo)96小時后。
pCC-Ds02質(zhì)粒含有花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子調(diào)控的潮霉素抗性基因和依賴轉(zhuǎn)座酶的非自主性轉(zhuǎn)座Ds元件，包括有兩個末端重復(fù)序列(TIR)用于轉(zhuǎn)座的識別序列。在兩個末端重復(fù)序列(TIR)之間加有含不含5’端的不完全內(nèi)含子的大腸桿菌葡萄糖苷酸酶報告基因(GUS)以用于啟動子誘捕(見圖2)。
按照Hiei等(1994)的方法通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將雙元載體pBin19alcgus導(dǎo)入到水稻中。挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于20ml YEB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素50mg/mL)中，28℃(150rpm)2-3天。于4℃下5000rpm離心3分鐘，去上清，重懸于AAM培養(yǎng)基(含0.1mmol/L乙酰丁香酮)中，28℃避光搖動1-2小時，至OD600＝0.6-0.9。選生長狀態(tài)良好、顆粒狀愈傷組織浸入農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中搖動20分鐘后，靜置30分鐘，取出用無菌濾紙吸干多余菌液，將愈傷組織接種于共培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2-3天后，待農(nóng)桿菌生長至可見愈傷下的菌斑但未長滿愈傷時，將愈傷組織放入廣口瓶中，用無菌水沖洗3-5次，每次搖動數(shù)次，直到水中不見絲狀菌體；然后在含500mg/L羧芐青霉素的無菌水中浸泡30-60分鐘，最后再沖洗一遍，置于無菌濾紙上涼干，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(含150mg/L G418和500mg/L羧芐青霉素)篩選。
當(dāng)采用根部澆灌的方式時，初次誘導(dǎo)48h后重復(fù)誘導(dǎo)一次，120h后采集葉片，測定其GUS活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系8a2在取樣時間內(nèi)，0.1％的酒精即可誘導(dǎo)其GUS基因的表達；GUS活性在0.5％和1％的酒精誘導(dǎo)情況下可提高14至21倍；2％的酒精誘導(dǎo)效率最高，GUS活性可提高大約40倍；而5％的酒精誘導(dǎo)效率有所降低(圖5)。
用不同濃度酒精以溶液培養(yǎng)方式誘導(dǎo)株系ta4。持續(xù)誘導(dǎo)96h后，采集葉片進行GUS熒光活性測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1％的酒精即可誘導(dǎo)GUS活性提高16倍，1％的酒精可使alcgus的表達活性提高160倍。而5％的酒精僅使GUS活性增加20倍左右(圖6)。
因而采用根部澆灌或溶液培養(yǎng)的誘導(dǎo)方式，在一定的酒精濃度范圍內(nèi)，alc系統(tǒng)的誘導(dǎo)活性依賴于酒精的濃度。根部澆灌方式誘導(dǎo)alc系統(tǒng)時，2％的酒精誘導(dǎo)效果最佳；而采用溶液培養(yǎng)方式誘導(dǎo)時，1％的酒精最有效。可能由于較高濃度的酒精會對水稻產(chǎn)生脅迫，影響基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，因而較高濃度的酒精誘導(dǎo)效率反而降低(如根部澆灌方式中的5％的酒精及溶液培養(yǎng)方式中2％和5％濃度的酒精)。因此在進一步實驗中根部澆灌方式誘導(dǎo)時采用2％的酒精作為誘導(dǎo)物，而溶液培養(yǎng)方式則以1％的酒精作為誘導(dǎo)物。B.酒精誘導(dǎo)時間對alc系統(tǒng)的作用我們采用根部澆灌和溶液培養(yǎng)兩種方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因水稻，研究了酒精誘導(dǎo)時間對alc系統(tǒng)的作用。
采用根部澆灌的方式時，以2％的酒精誘導(dǎo)兩個轉(zhuǎn)基因株系ta4、ta56，誘導(dǎo)方式如前所述。初次誘導(dǎo)后每隔24h采集一次葉片，直到誘導(dǎo)120h后，檢測GUS活性。結(jié)果顯示株系ta4在初次誘導(dǎo)48h時，GUS活性提高18倍；72h后GUS活性升高至66倍；96h時GUS活性最強，約是增加144倍；之后GUS活性開始降低，120h時約是誘導(dǎo)前的118倍(圖7) 。
以溶液培養(yǎng)方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因株系ta4時，用1％的酒精溶液持續(xù)誘導(dǎo)96h，每隔24h采集一次葉片，檢測GUS活性。結(jié)果顯示，GUS活性持續(xù)增加，初次誘導(dǎo)48h后GUS活性提高7倍左右，96h后GUS活性可增加160倍(圖8)。
此結(jié)果說明酒精可以快速誘導(dǎo)alc系統(tǒng)。由于蛋白質(zhì)的翻譯要落后于mRNA的轉(zhuǎn)錄，可以推測實際上alc系統(tǒng)對酒精的響應(yīng)要更快一些。C.alc系統(tǒng)在不同器官誘導(dǎo)活性的比較為研究alc系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因水稻不同器官中的誘導(dǎo)能力，我們用2％的酒精通過根部澆灌的方式誘導(dǎo)株系ta4，誘導(dǎo)方式如前所述。初次誘導(dǎo)后96h，分別采集其根、莖、葉，進行GUS熒光活性測定。結(jié)果顯示，在葉中GUS活性最強，約是誘導(dǎo)前的160倍，而莖根中GUS活性相對較弱約是誘導(dǎo)前的7到12倍(圖9)。對誘導(dǎo)前后葉片做徒手切片，然后進行組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前，葉片中GUS在所有細胞中均無表達，但誘導(dǎo)96小時后GUS在包括葉肉細胞、維管組織中均有很強的表達活性(圖10)。
利用如前所述農(nóng)桿菌水稻轉(zhuǎn)化，篩選方法將pCC-Ac01質(zhì)粒轉(zhuǎn)入水稻，通過卡那霉素篩選獲得抗性植株。以Ac轉(zhuǎn)座酶基因片段為探針進行分子檢測。并利用成熟的誘導(dǎo)程序?qū)﹃栃灾仓赀M行誘導(dǎo)。通過Northern檢測誘導(dǎo)前后Ac轉(zhuǎn)座酶mRNA的表達量，選取誘導(dǎo)前無表達，而誘導(dǎo)后高表達Ac轉(zhuǎn)座酶的植株。
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權(quán)利要求
1.一種建立植物基因標(biāo)簽系統(tǒng)的方法，包括以下步驟(a)構(gòu)建一種第一DNA片段，使其包含一種由誘導(dǎo)系統(tǒng)或愈傷組織特異性表達啟動子控制的編碼轉(zhuǎn)座酶的基因和一種植物篩選標(biāo)記基因，和一種第二DNA片段，使其包含一種依賴于轉(zhuǎn)座酶的非自主性插入元件和一種植物篩選標(biāo)記基因；或者，構(gòu)建一種第三DNA片段，使其包含一種由誘導(dǎo)系統(tǒng)或愈傷組織特異性表達啟動子控制的編碼轉(zhuǎn)座酶的基因、一種依賴于轉(zhuǎn)座酶的非自主性插入元件和一種植物篩選標(biāo)記基因；(b)用所構(gòu)建的第一DNA片段和第二DNA片段或者含有這些DNA片段的質(zhì)粒，或者用所構(gòu)建的第三DNA片段或者含有該DNA片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞；(c)篩選出被轉(zhuǎn)化的植物細胞；(d)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶表達；(e)使被轉(zhuǎn)化的植物細胞再生出完整植株。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的含有這些DNA片段的質(zhì)粒是用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體質(zhì)粒。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的質(zhì)粒是pBin 19，pCambia，或pBI 101。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的含有這些DNA片段的質(zhì)粒是可在原核生物中繁殖的質(zhì)粒。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的質(zhì)粒是pUC，pBluescript，或者PCR載體質(zhì)粒。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的轉(zhuǎn)座酶是植物中具有自主或非自主性轉(zhuǎn)座能力的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述的轉(zhuǎn)座酶是玉米來源的Ac/Ds，En/Spm，Mu，金魚草中的Tam，矮牽牛中的dTph1，或者水稻中的Tos17。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的依賴于轉(zhuǎn)座酶的非自主性轉(zhuǎn)座插入元件是Ds元件。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的植物篩選標(biāo)記基因是抗卡那霉素篩選標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(MPTII)，抗潮霉素篩選標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)；或木糖異構(gòu)酶。
10.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的控制轉(zhuǎn)座酶的誘導(dǎo)系統(tǒng)是酒精可誘導(dǎo)系統(tǒng)(alc)，糖甾醇可誘導(dǎo)系統(tǒng)，四環(huán)素可誘導(dǎo)系統(tǒng)(tet)，乳糖可誘導(dǎo)系統(tǒng)(lac)，銅離子可誘導(dǎo)系統(tǒng)，或者熱激，除草劑，損傷誘導(dǎo)系統(tǒng)。
11.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的植物細胞指來源于擬南芥、煙草、馬鈴薯、水稻、小麥、玉米、油菜、棉花、大豆的細胞。
12.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，轉(zhuǎn)化植物細胞指通過原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+，PEG)，基因槍介導(dǎo)法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，電激法，花粉管導(dǎo)入，微注射或這些方法的組合來進行的。
13.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶表達是在植物的愈傷組織階段，植物營養(yǎng)生長階段，生殖生長階段，種子發(fā)生或種子萌發(fā)階段進行的。
14.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，轉(zhuǎn)座酶表達是由愈傷組織特異性表達啟動子控制下進行的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種建立植物基因標(biāo)簽系統(tǒng)的方法,包括:構(gòu)建一種DNA片段,使其包含一種由誘導(dǎo)系統(tǒng)或愈傷組織特異性表達啟動子控制的編碼轉(zhuǎn)座酶的基因、一種依賴于轉(zhuǎn)座酶的非自主性插入元件和一種植物篩選標(biāo)記基因;用所構(gòu)建的DNA片段或含有上述片段DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞;篩選出被轉(zhuǎn)化的植物細胞;誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶表達;使被轉(zhuǎn)化的植物細胞再生出完整植株。該方法大大簡化了傳統(tǒng)方法所需的大量田間純化和雜交程序,縮短了所需要的時間。
文檔編號C12N15/11GK1386860SQ0111809
公開日2002年12月25日 申請日期2001年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月21日
發(fā)明者儲成才, 陳帥, 阿爾拜托·馬提尼 申請人:中國科學(xué)院遺傳研究所