專利名稱：生物生產(chǎn)類胡蘿卜素的改良方法及其所用的生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備類胡蘿卜素的分子生物學(xué)和用于制備類胡蘿卜素的生物材料。
已知蝦青素分布于多種生物體中，例如動(dòng)物(如火烈鳥和朱繯等鳥類和如虹鱒魚和鮭魚等魚類)，藻類和微生物。據(jù)認(rèn)為蝦青素具有較強(qiáng)的針對(duì)活性氧類的抗氧化特性，這一特性有望應(yīng)用于藥物以保護(hù)活細(xì)胞使其免受一些疾病(如癌癥)的侵害。另外，從工業(yè)應(yīng)用的角度出發(fā)，將蝦青素用作著色劑的需求日漸增加，在養(yǎng)魚(如鮭魚)業(yè)中尤其如此，因?yàn)槲r青素使動(dòng)物變成與眾不同的桔紅色，在市場(chǎng)上更能引起消費(fèi)者的注意。
已知Phaffia rhodozyma是一種可產(chǎn)生胡蘿卜素的酵母菌株，它可以特異性地產(chǎn)生蝦青素。與其它產(chǎn)胡蘿卜素的酵母，即紅酵母屬不同的是，Phaffiarhodozyma (P.rhodozyma)可以發(fā)酵一些糖類，如D-葡萄糖。從工業(yè)應(yīng)用的角度出發(fā)，這是一個(gè)重要的特征。最近的分類學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Phaffia rhodozyma具有有性繁殖并且其有性形態(tài)(telemorphic state)被命名為Xanthophyllomycesdendrorhous(W.I.Golubev；酵母11，101-110，1995)。已進(jìn)行了一些菌株改良研究，旨在從P.rhodozyma中獲得蝦青素超級(jí)生產(chǎn)菌株，但近十年來此類研究僅局限于利用常規(guī)的誘變法和原生質(zhì)體融合。最近，Wery等人使用P.rhodozyma開發(fā)了一種宿主載體系統(tǒng)，其中多拷貝的非-復(fù)制型質(zhì)粒被整合至P.rhodozyma基因組中的核糖體DNA基因座上(Wery等，基因，184，89-97，1997)。據(jù)Verdoes等報(bào)道，他們進(jìn)一步改良了載體，得到P.rhodozyma轉(zhuǎn)化子及其3個(gè)產(chǎn)胡蘿卜素基因，所述基因編碼催化香葉基香葉基焦磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)棣?胡蘿卜素之反應(yīng)的酶(國際專利申請(qǐng)WO97/23633)。在不遠(yuǎn)的將來，基因工程方法對(duì)P.rhodozyma菌株改良研究的重要性將會(huì)增加，從而突破通過常規(guī)方法達(dá)到的生產(chǎn)能力。
很多研究人員推測(cè)蝦青素在P.rhodozyma中可能作為抗氧化劑起作用，因?yàn)樗窃谏L的呼吸期而不是發(fā)酵期經(jīng)刺激而產(chǎn)生的。通常，活性氧類趨于在呼吸期內(nèi)產(chǎn)生，這是由泛醌庫的還原速度和呼吸鏈下游電子轉(zhuǎn)移之間的電子轉(zhuǎn)移失衡所導(dǎo)致的呼吸鏈電子溢流引起的。在此推測(cè)中，蝦青素可能會(huì)與活生物體中超氧化物歧化酶所作的那樣，淬滅這些活性氧類。
據(jù)Schroeder等報(bào)道，當(dāng)刺激產(chǎn)生蝦青素時(shí)，處于生長后期的Phaffiarhodozyma呼吸鏈由KCN-敏感型呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)镵CN-抗性呼吸(生物化學(xué)雜志，270，18374-18379，1995)。KCN-敏感型呼吸鏈?zhǔn)浅Ｒ姷碾娮愚D(zhuǎn)移鏈，其中泛醌庫內(nèi)的電子經(jīng)由分布于多種生物體中的復(fù)合物III轉(zhuǎn)移至復(fù)合物IV上。已知此呼吸鏈?zhǔn)躃CN或抗霉素A的抑制。另一方面，KCN-抗性呼吸鏈分布于植物和真菌中。在此呼吸鏈中，被稱為選擇性(alternative)氧化酶(AOX)的線粒體膜蛋白在通過使用氧分子作為受體，將泛醌庫內(nèi)的電子轉(zhuǎn)移至H2O分子的過程中起著主要作用。已知正丙基沒食子酸(n-PG)或水楊基羥肟酸(SHAM)可抑制AOX活性。
在鑒定Phaffia rhodozyma中的抗霉素-敏感型蝦青素超級(jí)生產(chǎn)菌株的研究中，An等人推測(cè)這種突變體能產(chǎn)生更多的蝦青素以淬滅可能由電子轉(zhuǎn)移鏈溢流電子所產(chǎn)生的活性氧類(應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，55，116-124，1989)。
本發(fā)明是基于下列假定產(chǎn)生的，即在電子轉(zhuǎn)移鏈處于還原態(tài)的條件下，蝦青素的生物合成可能被上調(diào)。所述還原態(tài)可以通過加入特異性抑制劑來誘導(dǎo)，所述抑制劑如抗霉素A，KCN，n-PG或SHAM。所述還原態(tài)也可以通過一些能導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移失衡的突變來誘導(dǎo)。
根據(jù)本發(fā)明，得到了具有SHAM抗性的突變體。與其親代菌株相比，所述突變體的蝦青素生產(chǎn)能力增加了50％。
本發(fā)明包括克隆一種基因，所述基因編碼Phaffia rhodozyma中的選擇性(alternative)氧化酶。本發(fā)明還包括在適當(dāng)宿主生物體，如大腸桿菌或釀酒酵母中表達(dá)上述基因，然后進(jìn)行酶鑒定?？墒褂萌绱丝寺〉幕?，通過定點(diǎn)誘變啟動(dòng)子序列或使用反義法來降低適當(dāng)宿主，如P.rhodozyma中的AOX活性。通過在適當(dāng)培養(yǎng)條件下，在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)化子可證實(shí)它們對(duì)胡蘿卜素生成的影響。
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)類胡蘿卜素的新方法，所述方法包括培養(yǎng)一種生物體，其可通過在誘導(dǎo)選擇性(alternative)氧化酶活性降低的條件下處理可生產(chǎn)類胡蘿卜素的親代生物體而得到，并選擇類胡蘿卜素生產(chǎn)能力增加的生物體。本發(fā)明方法中所用的生物體可以是借助于改變對(duì)選擇性(alternative)氧化酶抑制劑的抗性而使類胡蘿卜素生產(chǎn)能力增加的突變菌株。所述生物體可以是抗選擇性(alternative)氧化酶抑制劑的突變體。根據(jù)本發(fā)明的方法可以通過使用原生生物界或真菌界的生物體來實(shí)現(xiàn)，更優(yōu)選使用聚球藍(lán)細(xì)菌屬(Synechococcus)，集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis)，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬，其中最優(yōu)選的生物體是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomyces dendrorhous的菌株。
可用于本發(fā)明的選擇性(alternative)氧化酶的抑制劑可選自正丙基沒食子酸或水楊基羥肟酸。
本發(fā)明還提供了建立突變菌株的方法，所述突變菌株相對(duì)于親代生物體而言能生產(chǎn)出水平有所增加的類胡蘿卜素，所述方法包括在降低選擇性(alternative)氧化酶活性的條件下培養(yǎng)可生產(chǎn)類胡蘿卜素的生物體，并選擇類胡蘿卜素生產(chǎn)水平比所述親代生物體高的生物體。所述的降低選擇性(alternative)氧化酶活性的條件包括選擇性(alternative)氧化酶抑制劑的存在。用于此目的的選擇性(alternative)氧化酶抑制劑可選自正丙基沒食子酸或水楊基羥肟酸。本發(fā)明的突變菌株生物體屬于原生生物界或真菌界，更優(yōu)選為聚球藍(lán)細(xì)菌屬，集胞藍(lán)細(xì)菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬，其中最優(yōu)選的生物體是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomyces dendrorhous的菌株。
另一方面，本發(fā)明還涉及可通過上述方法得到的，相對(duì)于親代生物體而言能產(chǎn)生水平有所增加的類胡蘿卜素的生物體的突變菌株。更具體地，所述突變體的特征在于它們甚至在含有0.3至0.45mg/ml SHAM的培養(yǎng)基中也能以類似于在不含SHAM的培養(yǎng)基中的生長速率生長。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了SHAM-抗性突變體，這些突變體衍生自Phaffia rhodozyma ATCC96594。已于2000年4月3日將這些SHAM-抗性突變體保藏于DSMZ(德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig，德國)，保藏號(hào)分別為DSM13429，DSM13430和DSM13431。
本發(fā)明方法中所用的生物體可以是重組生物體，與親代生物體相比，該重組生物體中的上述選擇性(alternative)氧化酶的基因表達(dá)經(jīng)改變后降低了效力。本發(fā)明還提供了相對(duì)于宿主生物體而言能產(chǎn)生水平有所增加的類胡蘿卜素的重組生物體，其特征在于與該宿主生物體相比，該重組生物體中選擇性(alternative)氧化酶的基因表達(dá)經(jīng)改變后降低了效力?？山柚谶x自反義技術(shù)，定點(diǎn)誘變，化學(xué)誘變等的技術(shù)改變這種生物體中選擇性(alternative)氧化酶的基因表達(dá)。用于此目的的生物體屬于原生生物界或真菌界，更優(yōu)選為聚球藍(lán)細(xì)菌屬，集胞藍(lán)細(xì)菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬，其中最優(yōu)選的生物體是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomyces dendrorhous的菌株，尤其是上述的保藏菌株。
本發(fā)明還提供了重組DNA序列，該序列編碼衍生自能產(chǎn)生類胡蘿卜素之生物體的選擇性(alternative)氧化酶。重組DNA可得自屬于原生生物界或真菌界的生物體，更優(yōu)選為聚球藍(lán)細(xì)菌屬，集胞藍(lán)細(xì)菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬，其中最優(yōu)選的生物體是Phaffia rhodozyma和Xanthophyllomycesdendrorhous的菌株，尤其是上述的保藏菌株。本發(fā)明的重組DNA序列可以是由SEQ ID NO2鑒定的序列，或者是與SEQ ID NO2的同一性高于55％，更優(yōu)選高于75％，最優(yōu)選高于95％的序列。
更具體地，所述重組DNA序列的特征在于(a)它編碼具有SEQ ID NO1所述氨基酸序列的所述酶，或(b)它編碼所述酶的變體，所述酶變體選自(i)等位基因變體，和(ii)具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加，插入，缺失和/或取代并具有所述酶活性的酶。上述特別說明的分離的DNA序列可衍生自Phaffiarhodozyma的基因，該DNA序列可選自(i)SEQ ID NO2所示的DNA序列，(ii)SEQ ID NO2所示DNA序列的同類編碼或等位基因變體，和(iii)SEQ IDNO2所示DNA序列的衍生物，其中添加，插入，缺失和/或取代了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，但仍編碼具有所述酶活性的多肽。
本發(fā)明還提供了所述重組DNA轉(zhuǎn)化宿主生物體的用途。重組DNA的適當(dāng)形式可以是載體。通過使用重組DNA得到的重組生物體能降低選擇性(alternative)氧化酶的酶活性。被重組DNA轉(zhuǎn)化的宿主生物體可用于改良類胡蘿卜素，尤其是蝦青素的生產(chǎn)方法。因此，本發(fā)明也提供了這種重組生物體。
另外，本發(fā)明提供了用生物學(xué)方法生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，所述方法包括將上述重組DNA導(dǎo)入適當(dāng)宿主生物體，并培養(yǎng)所得的重組生物體。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，其特征在于在有利于生產(chǎn)類胡蘿卜素的條件下培養(yǎng)上述重組生物體。該方法可用于生物生產(chǎn)蝦青素。


圖1示出了P.rhodozyma呼吸鏈的工作模型。
如上所述，很多研究人員推測(cè)蝦青素在Phaffia rhodozyma中可能作為抗氧化劑起作用，因?yàn)樗窃谏L的需氧呼吸期而不是發(fā)酵期經(jīng)刺激而產(chǎn)生的。通常，活性氧類趨于在該呼吸期內(nèi)產(chǎn)生，這是由泛醌庫的還原速度和呼吸鏈下游電子轉(zhuǎn)移之間的電子轉(zhuǎn)移失衡所導(dǎo)致的呼吸鏈電子溢流引起的(圖1)。在此推測(cè)中，蝦青素可能會(huì)與超氧化物歧化酶所作的那樣，淬滅這些活性氧類。
根據(jù)此推測(cè)，通過抑制Phaffia rhodozyma中的呼吸鏈即可過量產(chǎn)生蝦青素。實(shí)際上，An等人從Phaffia rhodozyma中分離出一些突變體，這些突變體的KCN-敏感型呼吸被阻斷，并能產(chǎn)生更多的蝦青素(應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，55，116-124，1989)。
另一方面，據(jù)Schroeder等報(bào)道，當(dāng)刺激蝦青素的生產(chǎn)時(shí)，處于生長后期的Phaffia rhodozyma的呼吸鏈由KCN-敏感型呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)镵CN-抗性呼吸(生物化學(xué)雜志，270，18374-18379，1995)。在此上下文中，由選擇性(alternative)氧化酶介導(dǎo)的KCN-抗性呼吸可能會(huì)對(duì)蝦青素生產(chǎn)期的呼吸產(chǎn)生更大的影響。抑制選擇性(alternative)氧化酶可能會(huì)導(dǎo)致蝦青素的過量產(chǎn)生。
為了檢查特異性抑制呼吸活性對(duì)Phaffia rhodozyma的蝦青素生產(chǎn)的影響，可以在生長瓊脂培養(yǎng)基中加入連續(xù)稀釋的SHAM(已知SHAM能抑制選擇性(alternative)氧化酶)。在研究過程中，出現(xiàn)了幾個(gè)自發(fā)突變體，它們甚至在含有0.3至0.45mg/ml SHAM的培養(yǎng)基中也能顯示出類似于在不含SHAM的培養(yǎng)基中的生長活性。令人驚奇的是，這種突變體生產(chǎn)出的蝦青素比其親代高50％。運(yùn)表明一些導(dǎo)致蝦青素過量產(chǎn)生的突變可能通過呼吸鏈還原態(tài)補(bǔ)償了生長抑制，所述還原態(tài)可能是由選擇性(alternative)氧化酶活性的降低引起的。
本發(fā)明提供了由此分離得到的突變體，該突變體抗0.3至0.45mg/mlSHAM(選擇性(alternative)氧化酶的特定抑制劑)。與上文類似，本領(lǐng)域技術(shù)人員也易于理解，通過在選擇性(alternative)氧化酶之任何一種或多種抑制劑的存在下培養(yǎng)相應(yīng)生物體，并篩選在所述抑制劑的存在下顯示出生長活性和比親代生物體的蝦青素生產(chǎn)能力高的生物體，即可建立能以更高生產(chǎn)能力生產(chǎn)蝦青素的突變菌株。通過按實(shí)施例2所述，從P.rhodozyma細(xì)胞中提取類胡蘿卜素并測(cè)定蝦青素水平即可測(cè)定蝦青素的生產(chǎn)能力。選擇相對(duì)于親代菌株而言能以較高水平生產(chǎn)蝦青素的突變菌株的標(biāo)準(zhǔn)可以是生產(chǎn)能力增加約10％。可在選擇性(alternative)氧化酶之抑制劑的壓力下再次培養(yǎng)和篩選所得的突變菌株，從而改善生產(chǎn)能力?？稍谶m當(dāng)培養(yǎng)基中使用所得突變菌株生產(chǎn)蝦青素。
為了降低選擇性(alternative)氧化酶的活性，基因工程所用的方法在幾個(gè)方面優(yōu)于在培養(yǎng)基中加入特定抑制劑，如SHAM的方法。一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)上的原因，加入所述抑制劑會(huì)增加生產(chǎn)成本。在培養(yǎng)基中加入所述抑制劑還有另一個(gè)缺點(diǎn)，該缺點(diǎn)體現(xiàn)在從終產(chǎn)品中除去所加抑制劑的純化步驟中。
另外，本發(fā)明提供了分離的重組DNA序列，該序列編碼Phaffiarhodozyma中的選擇性(alternative)氧化酶。
本發(fā)明的所述DNA指的是cDNA和基因組DNA，前者僅含有其5’-和3’-非翻譯區(qū)的短片段之間側(cè)接的開放閱讀框，后者含有其內(nèi)含子和參與目的基因之表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，如其啟動(dòng)子和終止子。
首先，我們使用簡(jiǎn)并PCR法克隆了含有部分AOX基因的部分基因片段。所述簡(jiǎn)并PCR是克隆目的基因的方法，其中目的基因的氨基酸序列與得自其它物種的功能相同或相似的已知酶具有較高同源性。通過將氨基酸序列逆翻譯成相應(yīng)的核苷酸(“簡(jiǎn)并的核苷酸”)來設(shè)計(jì)在簡(jiǎn)并PCR中被用作引物的簡(jiǎn)并引物。在此簡(jiǎn)并引物中，通常使用的是由A，C，G或T中的任一種組成的混合引物，或在多義密碼子處含有肌苷的引物。在本發(fā)明中，混合引物被用作簡(jiǎn)并引物以克隆上述基因。如下文所述，所用PCR條件根據(jù)引物和欲克隆的基因的不同而改變。
將經(jīng)上述簡(jiǎn)并PCR得到的部分DNA片段標(biāo)記后用作探針，篩選構(gòu)建于適當(dāng)宿主中的噬菌體載體或質(zhì)粒載體上的基因組文庫，從而可從染色體中克隆完整的基因，該基因含有其編碼區(qū)，其內(nèi)含子以及其調(diào)節(jié)區(qū)，如啟動(dòng)子或終止子。通常，在文庫構(gòu)建及后續(xù)基因操作，如測(cè)序，限制性消化，連接等過程中，經(jīng)常使用大腸桿菌作為宿主菌株，并使用大腸桿菌載體，噬菌體載體，如λ噬菌體載體，或質(zhì)粒載體，如pUC載體。在本發(fā)明中，在λ載體的衍生物λgt11中構(gòu)建P.rhodozyma的EcoRI基因組文庫。在構(gòu)建文庫之前，通過Southern印跡雜交測(cè)定插入物大小，即必須克隆多長的插入物。在本發(fā)明中，根據(jù)供應(yīng)商(Boehringer-Mannheim，Mannheim，德國)提供的方法，用一種類固醇半抗原，即地高辛配基(DIG)替代常規(guī)的32P標(biāo)記來標(biāo)記用作探針的DNA。通過將經(jīng)DIG-標(biāo)記的含有目的基因的一部分的DNA片段用作探針，來篩選構(gòu)建自P.rhodozyma染色體的基因組文庫。挑選雜交噬斑用于進(jìn)一步研究。分離出陽性噬斑之后，將插入片段亞克隆至適用于測(cè)序的適當(dāng)質(zhì)粒載體中。在本發(fā)明中，將陽性噬菌體載體中的插入片段亞克隆至pOCUS-2載體，該載體可用于構(gòu)建插入了轉(zhuǎn)座子的測(cè)序衍生物(Locus Pocus System，Novagene，Madison，美國)。
在本發(fā)明中，使用自動(dòng)化的熒光DNA測(cè)序儀，即ALFred系統(tǒng)(Pharmacia，Uppsala，瑞典)和自動(dòng)循環(huán)測(cè)序方法，其中在大多數(shù)的測(cè)序過程中使用的是Taq DNA聚合酶。
測(cè)定基因組序列之后，使用編碼區(qū)的序列克隆相應(yīng)基因的cDNA。也利用PCR法來克隆cDNA片段。合成PCR引物，其序列等同于開放閱讀框(ORF)的5’-和3’-末端序列，其中還添加了一種適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)，使用這些PCR引物進(jìn)行PCR。在本發(fā)明中，在PCR克隆cDNA時(shí)將cDNA庫用作模板。所述cDNA庫由通過使用病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq聚合酶(Clontech制備的CapFinder試劑盒，Palo Alto，美國)，將得自P.rhodozyma的mRNA用作模板而在體外合成的多種cDNA組成。由其序列進(jìn)一步證實(shí)所得的所需cDNA。另外，將所得cDNA片段克隆至在大腸桿菌或釀酒酵母中起作用的表達(dá)載體，使其受適當(dāng)啟動(dòng)子的控制之后，可使用該cDNA證實(shí)其酶活性。
為了表達(dá)衍生自真核生物的基因，經(jīng)常使用將cDNA克隆至大腸桿菌或釀酒酵母中的表達(dá)載體的方法。這是因?yàn)樯矬w的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特異性各有不同，不能識(shí)別其它物種的內(nèi)含子序列。實(shí)際上，原核生物在其自身的遺傳背景中不含內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。甚至在酵母中，釀酒酵母所屬的子囊菌綱與P.rhodozyma所屬的擔(dān)子菌綱的遺傳背景都有所不同。Wery等證實(shí)P.rhodozyma的肌動(dòng)蛋白基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)不能被子囊菌綱的釀酒酵母識(shí)別和剪接(酵母，12，641-651，1996)。
據(jù)一些其它的研究人員報(bào)道，某些類型的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)參與其基因表達(dá)的調(diào)節(jié)(Dabeva，M.D等，美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，83，5854，1986)?；蛟S，重要的是當(dāng)目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)參與其自身基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，則在目的基因自我克隆時(shí)使用具有其內(nèi)含子的基因組片段。
為了使用基因工程方法進(jìn)行菌株改良研究，必須研究其在諸如轉(zhuǎn)錄和翻譯的事件中的遺傳機(jī)制。為了研究遺傳機(jī)制，重要的是測(cè)定其上游激活序列(UAS)，即啟動(dòng)子，內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和終止子的基因序列，而不是僅測(cè)定其外顯子的基因序列。
根據(jù)本發(fā)明，從P.rhodozyma的基因組DNA中克隆出編碼選擇性(alternative)氧化酶的基因，測(cè)定其基因組序列，該序列含有選擇性(alternative)氧化酶(AOX)基因，其中包括其5’-和3’-鄰接區(qū)以及其內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
證實(shí)酶活性之后，可進(jìn)行降低選擇性(alternative)氧化酶活性的基因修飾研究。
在本發(fā)明中，所述多肽序列包括SEQ ID NO2、其具有AOX活性的片段、及在嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與SEQ ID NO2雜交的多肽序列，所述嚴(yán)謹(jǐn)度足以鑒定針對(duì)SEQ ID NO2之特異性結(jié)合，且這類雜交體可編碼具有選擇性(alternative)氧化酶功能的多肽。例如，可應(yīng)用以下雜交條件和洗滌條件的任意組合來獲得所需特異性結(jié)合高嚴(yán)謹(jǐn)度雜交6X SSC0.5％ SDS100μg/ml變性鮭精DNA50％甲酰胺于42℃輕柔搖動(dòng)著保溫過夜高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌室溫2X SSC，0.5％SDS中洗滌15分鐘1次，然后于室溫0.1X SSC，0.5％SDS中洗滌15分鐘1次。
低嚴(yán)謹(jǐn)度雜交6X SSC0.5％ SDS100μg/ml變性鮭精DNA50％甲酰胺于37℃輕柔搖動(dòng)著保溫過夜低嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌室溫0.1X SSC，0.5％SDS中洗滌15分鐘1次。
中嚴(yán)謹(jǐn)度條件可通過改變上述雜交反應(yīng)和/或洗滌條件的溫度來獲得。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用高嚴(yán)謹(jǐn)度雜交條件和洗滌條件。
為了用遺傳學(xué)方法降低基因表達(dá)，可使用某些方法。一種方法是反義法。反義法是通過導(dǎo)入人工基因片段來降低目的基因之表達(dá)的方法，所述人工基因片段的序列與目的基因的序列互補(bǔ)。這種反義基因片段可以在體內(nèi)與目的基因的成熟mRNA片段形成復(fù)合物，結(jié)果可抑制mRNA的有效翻譯。為了構(gòu)建AOX基因的反義RNA，可使用PCR法克隆AOX基因的互補(bǔ)cDNA鏈。
另一種方法是突變啟動(dòng)子區(qū)域。通常，基因由具有各自不同功能的幾個(gè)部分組成。在真核生物中，與編碼核糖體RNA(rRNA)，核內(nèi)小RNA(snRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)的基因不同的是，編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的基因被轉(zhuǎn)錄成前信使RNA(pre-mRNA)。盡管RNA聚合酶II(PolII)在此轉(zhuǎn)錄事件中起主要作用，但PolII不能缺乏順式元件和反式-作用的蛋白質(zhì)因子而單獨(dú)起始轉(zhuǎn)錄，所述順式元件覆蓋含啟動(dòng)子和UAS的上游區(qū)域。首先，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物識(shí)別待表達(dá)基因之5’-鄰接區(qū)中的啟動(dòng)子序列，所述復(fù)合物由幾個(gè)蛋白質(zhì)基本成分組成。在此事件中，當(dāng)在一些特定調(diào)節(jié)(如熱休克反應(yīng)，或?qū)I養(yǎng)饑餓的適應(yīng)等)下表達(dá)基因時(shí)，還需要一些其它的參與者。此時(shí)，啟動(dòng)子序列附近的5’-上游非翻譯區(qū)域中需要存在UAS，一些正或負(fù)調(diào)節(jié)蛋白識(shí)別并結(jié)合該UAS。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物與啟動(dòng)子序列結(jié)合的強(qiáng)度受啟動(dòng)子附近反式-作用因子結(jié)合的影響，這樣就能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。
通過磷酸化激活轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物之后，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物啟動(dòng)由轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的某些部分作為延伸復(fù)合物從啟動(dòng)子區(qū)域沿該基因3’-方向脫附(該步驟被稱為啟動(dòng)子清除事件)，延伸復(fù)合物繼續(xù)轉(zhuǎn)錄直至其到達(dá)鄰接該基因3’-下游區(qū)域的終止序列。
為了降低目的基因的表達(dá)，經(jīng)常使用常規(guī)化學(xué)誘變或基因定點(diǎn)誘變來突變含UAS序列的上述目的基因啟動(dòng)子區(qū)域。在此方法中，誘變基因盒，然后將其導(dǎo)入P.rhodozyma，所述基因盒的5’末端含有與目的基因的啟動(dòng)子區(qū)域融合的一個(gè)報(bào)道基因，其3’末端含有目的基因的終止區(qū)域。通過檢測(cè)報(bào)道基因活性的差異，可以篩選出有效的突變。通過用具有已突變的啟動(dòng)子區(qū)域的重組DNA轉(zhuǎn)化宿主菌株可以得到目的酶的表達(dá)有所降低的突變菌株。
可將含有反義AOX基因或AOX基因之突變型啟動(dòng)子的構(gòu)建體作為載體轉(zhuǎn)移至適當(dāng)宿主菌株。當(dāng)使用Phaffia rhodozyma作為宿主菌株時(shí)，通過將這類構(gòu)建體克隆至適當(dāng)載體即可實(shí)現(xiàn)此目的，其中所述載體上含有可在P.rhodozyma中起作用的選擇標(biāo)記。經(jīng)常將藥物抗性基因用作選擇標(biāo)記，所述抗性基因編碼的酶能使宿主在存在毒性抗生素時(shí)存活。藥物抗性基因的一個(gè)例子是pGB-Ph9上攜帶的G418抗性基因(Wery等，基因，184，89-97，1997)。所述質(zhì)粒可以通過染色體和質(zhì)粒之間的同源重組整合至Phaffia rhodozyma的染色體上。
至于轉(zhuǎn)化方法，可使用LiAc法和電穿孔法(Wery等，基因，184，89-97，1997)轉(zhuǎn)化P.rhodozyma。
可在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)基因工程改造的P.rhodozyma并評(píng)價(jià)其生產(chǎn)蝦青素的能力。
下述實(shí)施例將參照附圖進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
實(shí)施例下述實(shí)施例中使用的是下列材料和方法菌株P(guān).rhodozyma ATCC96594 (根據(jù)布達(dá)佩斯條約于1998年4月8日重新保藏，保藏號(hào)為ATCC 74438)E.coli Y1090r-araD139，hsdR(rK-，mK+)，mcrB+，rpsL，supF，trpC12∷Tn10，ΔlacU169，Δlon，F(xiàn)-，λ-，(pMC9)(Clontech)E.coli DH5αF-，φ80d，lacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，hsd(rK-，mK+)，recA1，endA1，deoR，thi-1，gyrA96，relA1(Toyobo，Osaka，日本)E.coliγδ供體Δ(gpt-proA)62，leu，44，ara14，galK2，lacY1，Δ(mcrC-mrr)，(rB-，mB-)，xyl-5，mtl-1，recA13，[F+∷Tn1000(tets)](Novagene)E.coli γδ受體F-，araD139，Δ(ara-leu)7696，galE15，galK16，Δ(lac)X74，(Strr)，hsdR2(rK12-，mK12+)，mcrA，mcrB1∷Tn5(kanr)(Novagene)
E.coli TOP10F-，mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)，φ80，M15，ΔlacX74，recA1，deoR，araD139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endA1，nupG(Invitrogen，NV Leek，荷蘭)載體λgt11(Clontech)pCR2.1-TOPO(Invitrogen)pOCUS-2pBluescript II SK-(Stratagene)pGBPh9(Wery等，酵母，12，641-651，1996)培養(yǎng)基在YPD培養(yǎng)基(DIFCO，Detroit，美國)中常規(guī)維持P.rhodozyma菌株。在LB培養(yǎng)基(每升10g細(xì)菌用胰蛋白胨(DIFCO)，5g酵母提取物(DIFCO)和5g NaCl)中維持大腸桿菌菌株。在軟瓊脂(0.7％瓊脂；WAKO)中使用NZY培養(yǎng)基(每升5g NaCl，2g MgSO4-7H2O，5g酵母提取物(DIFCO)，10g A型NZ胺(WAKO，Osaka，日本))增殖λ噬菌體。當(dāng)制備瓊脂培養(yǎng)基時(shí)，需添加1.5％瓊脂(WAKO)。水楊基羥肟酸(SHAM)購自Aldrich(Milwaukee，美國)。方法分子遺傳技術(shù)的一般方法根據(jù)的是分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)中的方法。限制性酶和T4 DNA連接酶購自TakaraShuzo(Ohtsu，日本)。
使用QIAGEN基因組試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國)根據(jù)廠商提供的方法從P.rhodozyma中分離染色體DNA。用自動(dòng)化的DNA分離系統(tǒng)(PI-50，Kurabo有限公司，Osaka，日本)少量制備已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA。使用QIAGEN柱(QIAGEN)少量制備大腸桿菌轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒DNA。使用QIAquick或QIAEX II(QIAGEN)從瓊脂糖中分離和純化DNA片段。
使用Isogen(Nippon Gene，Toyama，日本)用酚法分離P.rhodozyma的總RNA。使用mRNA分離試劑盒(Clontech)從所得總RNA中純化mRNA。使用CapFinder cDNA構(gòu)建試劑盒(Clontech)合成cDNA。
使用Gigapack III金包裝提取物(Stratagene，La Jolla，美國)進(jìn)行體外包裝。根據(jù)廠商提供的方法，通過Wizard λ preps DNA純化系統(tǒng)(Promega，Madison，美國)分離λDNA。
用Perkin Elmer 2400型熱循環(huán)儀進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。實(shí)施例中描述了每個(gè)PCR的條件。PCR引物購自供貨商。用自動(dòng)化的熒光DNA測(cè)序儀(ALFred，Pharmacia)進(jìn)行DNA測(cè)序。
DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自Toyobo。除非另有說明，所有化合物均購自WAKO。
實(shí)施例1 從P.rhodozyma ATCC 96594中分離SHAM-抗性突變體，SHAMI，SHAM2和SHAM3為了檢查由選擇性(alternative)氧化酶介導(dǎo)的KCN-抗性呼吸的抑制作用對(duì)P.rhodozyma生長的影響，在YPD-瓊脂培養(yǎng)基上的P.rhodozyma培養(yǎng)物中加入SHAM。將SHAM溶解于乙醇中，分別以0.05，0.15，0.30，0.45和0.90mg/ml的終濃度加入YPD-瓊脂培養(yǎng)基。經(jīng)稀釋將2×107個(gè)細(xì)胞/ml P.rhodozyma ATCC96594涂布在這些培養(yǎng)基上。于20℃培養(yǎng)3天之后，計(jì)數(shù)所產(chǎn)生的菌落。結(jié)果，在含-SHAM的YPD瓊脂上生長的菌落數(shù)幾乎與不含SHAM的對(duì)照培養(yǎng)基上的相等。但在含-SHAM的培養(yǎng)基上生長的菌落小于對(duì)照培養(yǎng)物。表1顯示出與對(duì)照菌落相比的相對(duì)菌落直徑。
表1在含-SHAM的YPD瓊脂上生長的菌落的相對(duì)大小SHAM (mg/ml) 0.05 0.15 0.30 0.45 0.90相對(duì)菌落直徑(％)10070403012有趣的是，在含有0.3和0.45mg/ml SHAM的培養(yǎng)基上生長的菌落中，一些菌落顯示出與對(duì)照菌落相似的大小。這些菌落也顯示出比對(duì)照菌落更深的色素形成。挑出4個(gè)與對(duì)照菌落大小相似的菌落，在YPD-瓊脂培養(yǎng)基上劃線。甚至在不含SHAM的YPD-瓊脂培養(yǎng)基上，所有菌落都顯示出比對(duì)照菌落更深的色素形成。此結(jié)果表明這些菌株可能是自發(fā)突變體，將它們稱為SHAM1，SHAM2，SHAM3和SHAM4。
實(shí)施例2 搖瓶發(fā)酵抗性突變體SHAM1，SHAM2和SHAM3為了評(píng)價(jià)SHAM-抗性突變體SHAM1，SHAM2和SHAM3生產(chǎn)蝦青素的能力，在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵。從新鮮制備的瓊脂培養(yǎng)物中將這些突變體及其親代菌株ATCC96594接種于大小為500ml的帶擋板搖瓶內(nèi)的50ml YPD培養(yǎng)基中，使最終的660nm OD值為0.05。于20℃以200r.p.m.進(jìn)行發(fā)酵。以適當(dāng)?shù)拈g隔取出3ml肉湯培養(yǎng)基，分析細(xì)胞量和蝦青素的含量。
將細(xì)胞量測(cè)定為660nm處的OD值。將1.0ml肉湯置于1.5ml微量離心管中以120℃加熱過夜之后稱重細(xì)胞而測(cè)定細(xì)胞干重。按下述，用玻璃珠破碎P.rhodozyma細(xì)胞，從中提取類胡蘿卜素之后，用HPLC法測(cè)定P.rhodozyma中的蝦青素含量。用蒸餾水將離心1ml肉湯所得的細(xì)胞濃縮2倍，在褐色避光試管(13.5mm，11cm)內(nèi)的細(xì)胞懸浮液(0.5ml)中加入10.0g玻璃珠。接著，加入1.5ml丙酮/丁基化羥基甲苯(BHT)/水(45mg BHT溶于450ml丙酮和50ml水中)，然后在水平臺(tái)式搖床上將試管振蕩1小時(shí)。提取之后，加入5ml含有適當(dāng)濃度的胭脂樹橙(nacalai tesque，Kyoto，日本)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的丙酮/BHT/水。用下列HPLC系統(tǒng)(HPLC系統(tǒng)的硬件購自Tosoh(Tokyo，日本))分析上清液中的蝦青素含量。
HPLC柱YMC-Pak ODS-A(6mm，150mm(YMC公司，Milford，美國)。
溫度室溫洗脫溶劑乙腈/甲醇/異丙醇(85/10/5)注射量10微升流速2.0ml/分鐘檢測(cè)471nm的紫外線結(jié)果概述于表2。所有突變體顯示出比親代菌株ATCC96594高50％的蝦青素生產(chǎn)能力。由此結(jié)果看，這些突變體中可能發(fā)生了一些能通過增加蝦青素生產(chǎn)能力來補(bǔ)償選擇性(alternative)氧化酶活性的抑制作用的突變。
表2SHAM-抗性突變體的蝦青素生產(chǎn)能力蝦青素生產(chǎn)能力(mg/L) (mg/g-干細(xì)胞)OD@660nm(小時(shí)) 387238 72 3872SHAM-1 1.65 4.07 0.179 0.380 24.5 30.6SHAM-2 2.36 4.43 0.217 0.385 29.5 30.5SHAM-3 2.87 3.97 0.247 0.381 29.2 29.5ATCC96594 2.00 2.76 0.164 0.258 27.4 28.7實(shí)施例3從P.rhodozyma中分離mRNA并構(gòu)建cDNA文庫為了構(gòu)建P.rhodozyma的cDNA文庫，在破碎細(xì)胞之后立即通過苯酚提取法分離總RNA，使用mRNA分離試劑盒(Clontech)純化P.rhodozymaATCC96594菌株的mRNA。
首先，通過離心(1500xg，10分鐘)從10ml已在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天的培養(yǎng)物中收集ATCC96594菌株的細(xì)胞，用提取緩沖液(含有0.7M KCl的10mM檸檬酸鈉/HCl(pH 6.2))將細(xì)胞清洗一次。懸浮于2.5ml提取緩沖液中之后，用弗氏壓碎勻漿器(Ohtake Works Corp.，Tokyo，日本)以1500kgf/cm2的壓力破碎細(xì)胞，立即根據(jù)廠商特別說明的方法與兩倍體積的isogen(Nippon gene)混合。在此步驟中，回收到400微克總RNA。
然后根據(jù)廠商特別說明的方法，使用mRNA分離試劑盒(Clontech)純化總RNA。最終從P.rhodozyma ATCC96594菌株中得到16g mRNA。
為了構(gòu)建cDNA文庫，根據(jù)廠商特別說明的方法，使用CapFinder PCRcDNA構(gòu)建試劑盒(Clontech)。將1微克純化的mRNA用于第一條鏈的合成，接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增之后，得到1mg cDNA庫。
實(shí)施例4 從P.rhodozyma中克隆部分AOX(選擇性(alternative)氧化酶)基因?yàn)榱藦腜.rhodozyma中克隆部分AOX基因，使用了簡(jiǎn)并PCR法。下文列出了一些菌種和數(shù)據(jù)庫的登記號(hào)，所述菌種的選擇性(alternative)氧化酶序列被用于多重序列對(duì)比分析(ClustalW，Thompson J.D等，核酸研究，22，4673-4680，1994)。
黑曲霉 AB016540(DDBJ/GenBank/EMBL)白色念珠菌 AF031229(DDBJ/GenBank/EMBL)Chlamydomonas reinhardtiiAF047832(DDBJ/GenBank/EMBL)粗糙鏈孢霉 Q01355(Swissprot)稻(Oryza sativa) AB004813(DDBJ/GenBank/EMBL)Pichia anomala Q00912(Swissprot)Trypanosoma brucei bruceiQ26710(Swissprot)如表3所示，根據(jù)其它物種的已知選擇性(alternative)氧化酶基因的共有序列設(shè)計(jì)和合成兩個(gè)混合引物的核苷酸序列。
表3用于克隆AOX基因的引物序列
aox3AAYGARMGNATGCAYYTNYTNACNTT(有義引物)(SEQ IDNO3)aox5GCYTCYTCYTCNARRTANCCNACRAA(反義引物)(SEQ ID NO4)(N＝A，C，G或T；R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C)使用ExTaq(Takara Shuzo)為DNA聚合酶，實(shí)施例1中所得的cDNA庫為模板，進(jìn)行25輪PCR，每輪的條件是95℃30秒，50℃30秒和72℃15秒，然后對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳?；厥站哂兴栝L度的PCR帶，根據(jù)廠商提供的方法用QIAquick(QIAGEN)純化，然后連接至pCR2.1-TOPO(Invitrogen)。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10之后，選擇6個(gè)白色菌落，用自動(dòng)DNA分離系統(tǒng)分離質(zhì)粒。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)3個(gè)克隆所具有的序列的推定氨基酸序列類似于已知的選擇性(alternative)氧化酶基因。將此分離的cDNA克隆稱為pAOX514并用于進(jìn)一步研究。
實(shí)施例5 分離P.rhodozyma的基因組DNA為了分離P.rhodozyma的基因組DNA，根據(jù)廠商特別說明的方法使用QIAGEN基因組試劑盒。
首先，通過離心(1500xg，10分鐘)從100ml已在YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物中收集P.rhodozyma ATCC96594菌株的細(xì)胞，用TE緩沖液(含有1mM EDTA的10mM Tris/HCl(pH 8.0))將細(xì)胞清洗一次。懸浮于QIAGEN基因組試劑盒中的8ml Yl緩沖液之后，以2mg/ml的濃度加入溶細(xì)胞酶(SIGMA，St.Louis，美國)以通過酶促降解破碎細(xì)胞，于30℃保溫該反應(yīng)混合物90分鐘，然后進(jìn)行后續(xù)的提取步驟。最終得到20微克基因組DNA。
實(shí)施例6使用pAOX514為探針進(jìn)行Southern印跡雜交進(jìn)行Southern印跡雜交以克隆含有P.rhodozyma之AOX基因的基因組片段。用EcoRI消化2微克基因組DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行酸和堿處理。通過1小時(shí)反轉(zhuǎn)印跡(Joto Rika，Tokyo，日本)將變性的DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Hybond N+，Amersham，Buckinghamshire，英國)。通過熱處理(80℃，90分鐘)固定轉(zhuǎn)移至尼龍膜上的DNA。通過用DIG多引發(fā)法(BoehringerMannheim)標(biāo)記模板DNA(經(jīng)EcoRI消化的pAOX514)來制備探針。根據(jù)廠商特別說明的方法進(jìn)行雜交。結(jié)果觀察到5.5至7.0千堿基(kb)的雜交帶。
實(shí)施例7 克隆含有AOX基因的基因組片段用EcoRI消化4微克基因組DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。然后，根據(jù)廠商特別說明的方法，用QIAEX II凝膠提取試劑盒(QIAGEN)回收長度為5.0至7.0kb的DNA。通過16℃過夜，將純化的DNA連接至0.5微克經(jīng)EcoRI-消化和CIAP(牛小腸堿性磷酸酶)-處理的λgt11(Clontech)，通過Gigapack III金包裝提取物(Stratagene)進(jìn)行包裝。用經(jīng)包裝的提取物感染大腸桿菌Y1090菌株，并與NZY培養(yǎng)基一起鋪于LB瓊脂培養(yǎng)基上。使用經(jīng)EcoRI-消化的pAOX514為探針篩選出約6000個(gè)噬斑。1個(gè)噬斑與經(jīng)標(biāo)記的探針雜交。
使用Wizard λ preps DNA純化系統(tǒng)(Promega)制備含有推定的P.rhodozyma AOX基因的λgt11衍生物。用EcoRI消化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該λgt11衍生物含有6kb EcoRI插入物。接著，使用該λgt11衍生物為模板，兩個(gè)引物aox3和aox5為引物進(jìn)行PCR。按與實(shí)施例4相同的PCR條件進(jìn)行PCR，結(jié)果產(chǎn)生預(yù)期的0.3kb帶。這表明該λgt11衍生物可能含有推定的P.rhodozymaAOX基因。使用QIAquick(QIAGEN)純化此λgt11衍生物中的6.0kb EcoRI插入片段，然后使用DH5α為宿主菌株將其亞克隆至pOCUS-2載體(Novagen)，產(chǎn)生pOCUSAOX607。
實(shí)施例8含有AOX基因之基因組片段的測(cè)序?qū)OCUSAOX607轉(zhuǎn)移至感受態(tài)的γδ供體細(xì)胞，用于制備可用于LocusPocus系統(tǒng)(Novagen)的測(cè)序衍生物。制備測(cè)序衍生物的方法由廠商提供。至于測(cè)序引物，可合成經(jīng)Cy5-標(biāo)記的引物(其序列示于表4)并用于通過使用AutoCycle測(cè)序試劑盒(Pharmacia)進(jìn)行測(cè)序。
表4測(cè)序AOX基因所用引物的序列poc1(Cy5-)AGCTACAACATACGAAAGGG(SEQ ID NO5)poc2(Cy5-)GGGGAACTGAGAGCTCTAAA(SEQ ID NO6)測(cè)序的結(jié)果測(cè)出了含有2561個(gè)堿基對(duì)的核苷酸序列，該段序列是含有P.rhodozyma AOX基因的基因組片段。
編碼區(qū)位于由10個(gè)外顯子和9和內(nèi)含子組成的1206個(gè)堿基對(duì)內(nèi)。內(nèi)含子在整個(gè)編碼區(qū)內(nèi)都有分布，而無5’或3’偏好。通過使用基因分析軟件GENETYX-SV/RC(軟件開發(fā)有限公司，Tokyo，日本)版本4.0.1，發(fā)現(xiàn)開放閱讀框由402個(gè)氨基酸組成(SEQ ID NO1)，其序列與其它物種的選擇性(alternative)氧化酶的已知氨基酸序列驚人地相似(與黑曲霉的選擇性(alternative)氧化酶有51.5％的同一性)。氨基末端的一段疏水氨基酸殘基有望形成α-螺旋，這表明該氨基末端區(qū)域可能是跨膜結(jié)構(gòu)域或是線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。PSORTII程序(http∥psort.nibb.ac.jp8800/)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)可能是線粒體蛋白，預(yù)測(cè)值為82.6％。
實(shí)施例9 克隆AOX基因的上游區(qū)域使用Genome Walker試劑盒(Clontech)克隆AOX基因的5’-鄰接區(qū)域，因?yàn)閜AOX514可能具有足夠的長度可以含有AOX基因的啟動(dòng)子。首先，合成PCR引物，其序列示于表5。
表5 克隆AOX基因的5’-鄰接區(qū)域所用引物的序列aox13GTGTCAGAAACCTCAGATCAACAGGC(初始引物)(SEQ IDN07)aox14CAACAGGCAGTACAGTCAGCAGATTC(嵌套引物)(SEQ IDNO8)文庫構(gòu)建方法和PCR條件與廠商特別說明的相同。將實(shí)施例5得到的基因組DNA制品用作PCR模板?；厥?’末端具有ScaI位點(diǎn)的PCR片段(1.2kb)和5’末端具有DraI位點(diǎn)的PCR片段(3.0kb)，使用大腸桿菌TOP10為宿主菌株，將上述PCR片段克隆至pCR2.1-TOPO。測(cè)定上述2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的每一個(gè)的序列，結(jié)果得到被稱為pAOXSc702的質(zhì)粒，該質(zhì)?？捎糜谶M(jìn)一步研究。根據(jù)pAOXSc702中插入片段的序列，合成4個(gè)PCR引物，其序列列于表6。
表6 克隆AOX啟動(dòng)子區(qū)域所用引物的序列aox15GAATTCAACAGGTCAAATGA(有義引物)(SEQ ID NO9)aox16ATCCACCCACGCCTGTTTCC(反義引物)(SEQ ID NO10)aox17GGAAACAGGCGTGGGTGGAT(有義引物)(SEQ ID NO11)aox18GAATTCAGTAAACGCATTAG(反義引物)(SEQ ID NO12)PCR條件與實(shí)施例4所述的相同，不同之處在于HF聚合酶(Clontech)被用作DNA聚合酶。在aox15和aox16的組合中，擴(kuò)增出長度為0.7kb的片段。在aox17和aox18的組合中，擴(kuò)增出長度為0.5kb的片段。將這些片段克隆至pCR2.1-TOPO并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。分別制備6個(gè)獨(dú)立的白色菌落的質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果得到插入片段的序列彼此相同的預(yù)期克隆。在aox15和aox16的組合中，所得克隆被稱為pAOX714#1516。在aox17和aox18的組合中，所得克隆被稱為pAOX714#1718。測(cè)序的結(jié)果測(cè)出了含有P.rhodozyma AOX基因之啟動(dòng)子區(qū)域的pAOX714#1516和pAOX714#1718的序列。測(cè)出的含有AOX啟動(dòng)子的序列長度為1406個(gè)堿基對(duì)。
聯(lián)合實(shí)施例8和9得到的序列，測(cè)出該核苷酸序列(3.7kb)含有AOX基因及其啟動(dòng)子和終止子(SEQ ID NO2)。
實(shí)施例10 構(gòu)建AOX基因的反義質(zhì)粒通過PCR法擴(kuò)增反義基因片段，該片段覆蓋了AOX基因的整個(gè)結(jié)構(gòu)基因，將該片段克隆至整合載體中，其中反義AOX基因由P.rhodozyma中的AST啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。
表7 反義構(gòu)建AOX基因所用引物的序列aox101GGCCATTATGGCCTCAATTGGTCTGAGACATGC(SEQ IDNO13)aox102GGCCGAGGCGGCCATGTCTCTTGCTAGATGTCT(SEQ IDNO14)兩個(gè)引物aox101和aox102具有不對(duì)稱的限制性酶SfiI識(shí)別序列(GGCCNNNNNGGCC)，但它們的不對(duì)稱突出序列被設(shè)計(jì)成不同的序列。這樣就可以定向克隆至在其連接序列中具有相同不對(duì)稱序列的表達(dá)載體中。
使用HF聚合酶(Clontech)為Taq聚合酶，實(shí)施例3中制備的cDNA為模板，在下列條件下進(jìn)行PCR94℃15秒，55℃30秒和72℃45秒共30輪循環(huán)。純化擴(kuò)增的PCR片段，克隆至pCR2.1-TOPO載體。測(cè)序后發(fā)現(xiàn)一個(gè)克隆具有正確的片段，該克隆被稱為pAOX1007#0102。AOX基因之反義片段的序列示于SEQ ID NO15。
關(guān)于驅(qū)動(dòng)反義AOX基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和終止子片段，AST啟動(dòng)子和終止子克隆自實(shí)施例5中制備的染色體。
表8 克隆AST啟動(dòng)子和終止子所用引物的序列ast49GCGGCCGCACGTACAGACTAAGATCGAC(有義引物)(SEQID NO16)ast50GGCCATAATGGCCATGGAGAAAGTAGGTGGCAA(反義引物)(SEQ ID NO17)ast36CCTGCAGGCCGCCTCGGCCGTTGATTCTTCATATGTTAA(有義引物)(SEQ ID NO18)
ast37GGTACCCTGCAGTCGACAAACATGAA(反義引物)(SEQ IDNO19)PCR條件如下94℃15秒，55℃30秒和72℃90秒共25輪循環(huán)。在ast49和ast50的組合中，擴(kuò)增出長度為1.25kb的片段。在ast36和ast37的組合中，擴(kuò)增出長度為0.3kb的片段。將這些片段克隆至pCR2.1-TOPO并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。分別制備6個(gè)獨(dú)立的白色菌落的質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果，選擇具有正確AST啟動(dòng)子和終止子序列(EP 1035 206 Al)的克隆進(jìn)行進(jìn)一步研究(pUAST407-AST啟動(dòng)子和pAST526#3637-AST終止子)。
接著，通過將NotI+KpnI消化的pAST526#3637和KpnI+SacI消化的pG418Sa330(EP 1 035 206 Al)與NotI和SacI消化的pBluescriptII SK-(Stratagene)連接，使AST終止序列與G418抗性盒融合。將連接混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的KB822細(xì)胞。經(jīng)過限制性分析，選擇一個(gè)具有正確結(jié)構(gòu)的克隆(pUAST418)進(jìn)行進(jìn)一步研究。
然后，將3.1kb含有核糖體DNA(rDNA)基因座(Wery等，基因，184，89-97，1997)的SacI片段插入pUAST418之G418盒的下游。rDNA片段以多拷貝存在于真核生物的染色體中。經(jīng)由該rDNA片段的整合事件導(dǎo)致所用宿主染色體上的多拷貝整合，這樣可以使表達(dá)載體上攜有的外源基因過量表達(dá)。為此，將含有rDNA基因的pGBPh9的SacI片段連接至經(jīng)SacI消化和細(xì)菌堿性磷酸酶處理的pUAST418中。將連接混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的KB822細(xì)胞中。經(jīng)過限制性分析，選擇2個(gè)克隆(pURDNA421和pURDNAR421)進(jìn)行進(jìn)一步研究，這2個(gè)克隆中的rDNA片段以彼此不同的方向插入。
隨后，將AST啟動(dòng)子插入AST終止子的上游以構(gòu)建能在P.rhodozyma中起作用的表達(dá)載體。將pUAST407的1.0kb的Notl-和BglII-片段和pUAST407的0.25kb的BglII和PstI片段與經(jīng)NotI-和Sse8387I-消化的pURDNA421或pURDNAR421連接。用該連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的KB822細(xì)胞，對(duì)各6個(gè)所得菌落進(jìn)行限制性分析。選擇AST啟動(dòng)子正確插入的克隆進(jìn)行進(jìn)一步研究(pF718和pR718，它們的rDNA片段方向彼此相反)。
最后，通過將pAOX1007#0102的1.2kb SfiI片段插入經(jīng)SfiI消化的pF718或pR718即可完成反義AOX構(gòu)建體。所得質(zhì)粒被稱為pFAOX828和pRAOX828。
實(shí)施例11 用AOX-反義載體轉(zhuǎn)化P.rhodozyma
將AOX反義載體pFAOX828和pRAOX828轉(zhuǎn)化至P.rhodozyma野生型菌株ATCC96594。根據(jù)“分子生物學(xué)方法”(Johnson等，53，147-153，1996)中所述的方法進(jìn)行biolistic轉(zhuǎn)化。在YPD培養(yǎng)基中將P.rhodozyma菌株ATCC96594培養(yǎng)至穩(wěn)定期。離心肉湯之后，用無菌水將細(xì)胞濃縮10倍，將200微升細(xì)胞懸浮液涂布于含有100微克/ml遺傳霉素和0.75M D-甘露糖醇和D-山梨糖醇的YPD培養(yǎng)基上。將5微克質(zhì)粒包被于1.5mg 0.9微米的金粒上，用作biolistic轉(zhuǎn)化的供體DNA。選擇出一個(gè)遺傳霉素抗性菌落進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，該菌落被pFAOX828轉(zhuǎn)化并顯示出增加的色素形成，鑒定的內(nèi)容包括該菌落生產(chǎn)蝦青素的能力及其由AOX基因編碼的選擇性(alternative)氧化酶活性的降低。
實(shí)施例12 鑒定衍生自P.rhodozyma ATCC96594的pFAOX828整合體于20℃，在500ml錐瓶中的50ml YPD培養(yǎng)基中將P.rhodozyma轉(zhuǎn)化子ATCC96594∷pFAOX828及其親代菌株ATCC96594培養(yǎng)3天，培養(yǎng)所用的種子培養(yǎng)物是于20℃，在試管(直徑為21mm)中的10mlYPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后的培養(yǎng)物。在接種后的不同時(shí)間點(diǎn)，例如24，43和65小時(shí)，取出適量培養(yǎng)物肉湯，用于分析其在存在或缺乏KCN時(shí)的生長、生產(chǎn)蝦青素的能力及其氧攝取活性。24，43和65小時(shí)時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)于其對(duì)數(shù)生長期后期，穩(wěn)定中期和穩(wěn)定晚期。
為了分析生長情況，除了通過將微量離心1ml肉湯所得的細(xì)胞置于100℃干燥1天以測(cè)定其細(xì)胞干重外，還通過使用UV-1200光度計(jì)(ShimadzuCorp.，Kyoto，日本)測(cè)定660nm處的光密度。
為了分析蝦青素和總類胡蘿卜素的含量，微量離心1.0ml肉湯后從中收集細(xì)胞，通過用玻璃珠破碎從P.rhodozyma細(xì)胞中提取類胡蘿卜素。提取之后，離心除去破碎的細(xì)胞，用HPLC分析殘留物中的類胡蘿卜素含量。HPLC條件如下HPLC柱Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)溫度室溫洗脫溶劑丙酮/己烷(18/82)加1ml/L水注射量10微升流速2.0ml/分鐘檢測(cè)450nm處的紫外光蝦青素參照樣品得自F.Hoffmann-La Roche AG(Basel，瑞士)。
為了通過測(cè)定存在或缺乏KCN時(shí)的氧攝取活性來測(cè)定呼吸活性，使用了B-505型DO計(jì)和DO探針GU-BM(由Iijima Electronics公司(Aichi，日本)制備)。用0.5M KPB(pH7.4)重新懸浮收集的細(xì)胞，然后，在DO分析小室中用2.3ml水稀釋200微升該細(xì)胞懸浮液。在存在或缺乏0.48mM KCN時(shí)通過加入0.2ml 1M葡萄糖來啟動(dòng)測(cè)量。
結(jié)果概述于表9。
表9
(呼吸活性被表示為nmol O2-攝取/分鐘×mg干細(xì)胞)如表9所示，在培養(yǎng)43小時(shí)時(shí)，反義AOX轉(zhuǎn)化子ATCC96594∷pFAOX828顯示出與親代菌株ATCC96594類似的細(xì)胞產(chǎn)量，但在第24小時(shí)時(shí)顯示出較慢的生長。轉(zhuǎn)化子的蝦青素和類胡蘿卜素含量增加了15％。就其呼吸活性而言，轉(zhuǎn)化子具有與其宿主菌株相似的KCN-敏感型呼吸活性(95％)，但在24小時(shí)培養(yǎng)物中，由選擇性(alternative)氧化酶介導(dǎo)的KCN-抗性呼吸降低其宿主菌株的20％水平，而在43小時(shí)培養(yǎng)物中已完全受損。
此結(jié)果表明介導(dǎo)KCN-抗性呼吸的選擇性(alternative)氧化酶活性的降低可能至?xí)?dǎo)致P.rhodozyma中蝦青素和類胡蘿卜素的過量產(chǎn)生。
序列表<110> F.HOFFMANN-LA ROCHE AG<120>生物生產(chǎn)類胡蘿卜素的改良方法及其所用的生物材料<130> 案號(hào) 20685<140> -<141> -<150> 00111148.3<151> 2000-05-24<160> 12<170> patentIn Ver. 2.0<210> 1<211> 401<212> PRT<213> Phaffia rhodozyma<400> 1Met Ser Leu Ala Arg Cys Leu Val Gln Ala Ser Thr Arg Ser Leu1 5 10 15Ser Arg Thr Val Arg Pro Ser Tyr Leu Thr Pro Leu Thr Val His20 25 30Phe Phe Ser Ser Thr Ile Ser Arg Set Cys Ser Arg Ser Tyr Ser35 40 45Thr Ser Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Asn Gly Gln Gln Ser Thr50 55 60His His Leu Ala Asp Asn Val Pro Leu Thr Thr Asp Lys Gln Arg65 70 75His Leu Gln Gly Val Ile Gly Gly Glu Gly Met His Gln His Asp80 85 90Ala Thr Thr Val Ala His Thr Asp Pro Leu Ala Ser Val Ile Gln95 100 105Asp Leu Thr Val Pro Thr Asn Gly Ser Trp Val Met His Asn Pro110 115 120Val Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Asp Ala Val Gln Val Val His Arg125 130 135Pro Pro Thr Asn Thr Ser Asp Gln Val Ser Thr Lys Leu Val Lys140 145 150Met Leu Arg Trp Gly Phe Asp Leu Val Ser Asn Tyr Lys His Val155 160 165Pro Phe Pro Ala Asn His Lys Glu Leu Ser Val Thr Gln Leu Arg170 175 180Gln Met Gly Cys Leu Leu Ser Pro Asp Gln Trp Met Thr Arg Phe185 190 195Ile Phe Leu Glu Thr Thr Ala Ala Ile Pro Gly Met Val Gly Gly200 205 210Leu Leu Arg His Leu Gln Ser Leu Arg Leu Met Arg Arg Asp Gly215 220 225Gly Trp Ile His Thr Leu Leu Ala Glu Ala Glu Asn Glu Arg Leu230 235 240His Leu Leu Thr Phe Met Ser Met Ala Asn Pro Pro Leu Trp Phe245 250 255Arg Ala Leu Ile Leu Gly Ala Gln Gly Val Phe Tyr Asn Leu Phe260 265 270Phe Ile Thr Tyr Leu Ile Ser Pro Pro Val Ala His Arg Phe Val275 280 285Ala Cys Leu Glu Glu Glu Ala Val Val Thr Tyr Thr Arg Ile Ile290 295 300Ser Asp Ile Glu Asn Gly Tyr Val Pro Glu Trp Glu Lys Leu Pro305 310 315Ala Pro Glu Ile Ala Ile Ser Tyr Trp Arg Leu Pro Pro Asp Ala320 325 330Thr Phe Leu Asp Thr Leu Arg Ala Ile Arg Ala Asp Glu Ala Thr335 340 345His Arg Phe Val Asn His Thr Phe Ala Ser Leu Asp Ser Lys Lys350 355 360Asp Phe Asn Pro Phe Ala Ile Ala Glu Pro Asp Ala Thr Thr Lys365 370 375Gly Ser Val Tyr Gly Phe Thr Arg Asp Glu Ala Ala Ala Phe Ala380 385 390Gln Lys Thr Arg Glu Arg Met Ser Gln Thr Asn395 400<210> 2<211> 3724<212>DNA<213> Phaffia rhodozyma<220><221>外顯子<222> (1407)..(1674)<220><221>內(nèi)含子<222> (1675)..(1769)<220><221>外顯子<222> (1770)..(1873)<220><221>內(nèi)含子<222>(1874)..(1948)<220><221>外顯子<222> (1949)..(2155)<220><221>內(nèi)含子<222>(2156)..(2264)<220><221>外顯子<222>(2265)..(2295)<220><221>內(nèi)含子<222>(2296)..(2372)<220><221>外顯子<222>(2373)..(2423)<220><221>內(nèi)含子<222>(2424)..(2515)<220><221>外顯子<222>(2516)..(2645)<220><221>內(nèi)含子<222>(2646)..(2735)<220><221>外顯子<222>(2736)..(2831)<220><221>內(nèi)含子<222>(2832)..(2914)<220><221>外顯子<222>(2915)..(2998)<220><221>內(nèi)含子<222>(2999)..(3085)<220><221>外顯子<222>(3086)..(3206)<220><221>內(nèi)含子<222>(3207)..(3320)<220><221>外顯子<222>(3321)..(3434)<220><221>5′UTR<222>(1295)..(1296)<223>(實(shí)驗(yàn)型)<220><221>polyA_位點(diǎn)<222>(3682)..(3683)<223>(實(shí)驗(yàn)型)<400>2gaattcaaca ggtcaaatga gaaaggacaa ggtgaagaga tggaaccaga 50agcaatcagc gagagtaaag acgatggttc taaacataca 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1.生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法，所述方法包括處理可生產(chǎn)類胡蘿卜素的親代生物體，以誘導(dǎo)選擇性氧化酶活性降低，培養(yǎng)所得到的生物體，并選擇類胡蘿卜素生產(chǎn)能力增加的生物體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生物體可以是借助于改變對(duì)選擇性氧化酶之抑制劑的抗性而使類胡蘿卜素生產(chǎn)能力增加的突變菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中生物體是抗選擇性氧化酶之抑制劑的突變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中所述生物體屬于原生生物界或真菌界，更優(yōu)選為聚球藍(lán)細(xì)菌屬，集胞藍(lán)細(xì)菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物體是選自DSM13429，13430和13431的菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述選擇性氧化酶的抑制劑可選自正丙基沒食子酸和水楊基羥肟酸。
8.建立突變菌株的方法，所述突變菌株相對(duì)于親代生物體而言能生產(chǎn)出水平有所增加的類胡蘿卜素，所述方法包括在降低選擇性氧化酶活性的條件下培養(yǎng)可生產(chǎn)類胡蘿卜素的生物體，并選擇類胡蘿卜素生產(chǎn)水平比所述親代生物體高的生物體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中降低選擇性氧化酶活性的條件包括選擇性氧化酶之抑制劑的存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述選擇性(alternative)氧化酶之抑制劑選自正丙基沒食子酸和水楊基羥肟酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物體屬于原生生物界或真菌界，更優(yōu)選為聚球藍(lán)細(xì)菌屬，集胞藍(lán)細(xì)菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
13.根據(jù)權(quán)利要求8至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物體是選自DSM13429，13430和13431的菌株。
14.一種生物體的突變菌株，其可通過權(quán)利要求8至13中任一項(xiàng)所限定的方法得到，其相對(duì)于親代生物體而言能產(chǎn)生水平有所增加的類胡蘿卜素。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的突變菌株，其中所述生物體屬于原生生物界或真菌界，更優(yōu)選為聚球藍(lán)細(xì)菌屬，集胞藍(lán)細(xì)菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的突變菌株，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生物體是重組生物體，與親代生物體相比，該重組生物體中的選擇性氧化酶的基因表達(dá)經(jīng)改變后降低了效力。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中借助于選自反義技術(shù)，定點(diǎn)誘變，化學(xué)誘變等技術(shù)改變這種生物體中選擇性氧化酶的基因表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中所述生物體屬于原生生物界或真菌界，更優(yōu)選為聚球藍(lán)細(xì)菌屬，集胞藍(lán)細(xì)菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中的任一項(xiàng)的方法，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
21.根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項(xiàng)的方法，其中所述生物體是選自DSM13429，13430和13431的菌株。
22.相對(duì)于宿主生物體而言能產(chǎn)生水平有所增加的類胡蘿卜素的重組生物體，其特征在于與宿主生物體相比，該重組生物體中的選擇性氧化酶的基因表達(dá)經(jīng)改變后降低了效力。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的重組生物體，其中借助于選自反義技術(shù)，定點(diǎn)誘變，化學(xué)誘變等技術(shù)改變這種生物體中選擇性氧化酶的基因表達(dá)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的重組生物體，其中所述生物體屬于原生生物界或真菌界，更優(yōu)選為聚球藍(lán)細(xì)菌屬，集胞藍(lán)細(xì)菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬。
25.根據(jù)權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)的重組生物體，其中所述生物體是Phaffia rhodozyma的菌株。
26.根據(jù)權(quán)利要求22至25中任一項(xiàng)的重組生物體，其中所述生物體是選自DSM13429，13430和13431的菌株。
27.重組DNA序列，該序列編碼衍生自能產(chǎn)生類胡蘿卜素之生物體的選擇性氧化酶。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的重組DNA序列，其中所述生物體屬于原生生物界或真菌界，更優(yōu)選為聚球藍(lán)細(xì)菌屬，集胞藍(lán)細(xì)菌屬，Haematococcus，Dunaliella，Phaffia，Xanthophyllomyces，鏈孢霉屬，紅酵母屬，布拉霉屬或須霉屬。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28的重組DNA序列，其中所述生物體是Phaffiarhodozyma的菌株。
30.根據(jù)權(quán)利要求27至29中任一項(xiàng)的重組DNA序列，其中所述序列由SEQ ID NO2鑒定，或與SEQ ID NO2的同一性高于55％。
31.根據(jù)權(quán)利要求27至29中任一項(xiàng)的重組DNA序列，其推定的氨基酸序列由SEQ ID NO1鑒定，或與SEQ ID NO1的同一性高于51.5％。
全文摘要
生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法,所述方法包括在誘導(dǎo)選擇性(alternative)氧化酶活性降低的條件下對(duì)可生產(chǎn)類胡蘿卜素的親代生物體進(jìn)行處理,對(duì)得到的生物體進(jìn)行培養(yǎng),并選擇類胡蘿卜素生產(chǎn)能力增加的生物體。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1340628SQ01119510
公開日2002年3月20日 申請(qǐng)日期2001年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月24日
發(fā)明者星野立夫, 小島一之, 瀨戶口豐 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司