專(zhuān)利名稱(chēng)：抗hiv－1外膜蛋白的單鏈抗體及重組免疫毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供抗人I型免疫缺陷病毒(HIV-1)外膜蛋白gp120的單鏈抗體基因以及兩種針對(duì)HIV-1感染細(xì)胞的重組免疫毒素，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
單克隆抗體在艾滋病的診斷及治療中發(fā)揮重要作用，但是鼠源性單克隆抗體作為藥物在實(shí)際應(yīng)用中存在兩個(gè)難題一是鼠源抗體對(duì)人是異源性蛋白，反復(fù)應(yīng)用人體會(huì)產(chǎn)生抗鼠抗體即HAMA(human anti-mouse antibody)；二是單抗分子量大，組織穿透力差。另外，由于單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株在長(zhǎng)期保存過(guò)程中會(huì)造成遺傳變異，使其分泌單克隆抗體的能力下降，人—人雜交瘤又存在不能隨意免疫、建株難、產(chǎn)量低、不穩(wěn)定等困難，因此限制了單克隆抗體作為藥物在臨床上的應(yīng)用。為了使抗體人源化及小型化，基因工種抗體應(yīng)運(yùn)而生，其發(fā)展過(guò)程大致經(jīng)歷了人—鼠嵌合抗體(human-mouse chimeric antibody)、改形抗體(reshaped antibody)、小分子抗體(如Fv、Fab、scFv)、重組噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)(recombinant bacteriophage antibody repertoire)幾個(gè)階段。
目前基因工程抗體研究的熟點(diǎn)是小分子抗體，尤其是單鏈抗體(single chainFvfragment，scFv)受到青睞。單鏈抗體是利用基因工程手段制備的小分子抗體，它是通過(guò)一段人工合成的連接肽Linker將天然抗體的輕重鏈可變區(qū)基因連接起來(lái)，具有分子量小，穿透性強(qiáng)，抗原性低，利于進(jìn)行基因工程操作及大量表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。ScFv具有以下優(yōu)點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，構(gòu)建表達(dá)方便，它由輕鏈可變區(qū)基因VL與重鏈可變區(qū)基因VH通過(guò)一個(gè)15肽接頭(Gly4Ser)3的短肽連接而成。ScFv可以在大腸桿菌及真核細(xì)胞中表達(dá)，被認(rèn)為是具有高親和力的最小抗體片段；(1)只有V區(qū)，比相應(yīng)鼠源單抗免疫原性小得多；(2)分子量約為27kDA，組織穿透力強(qiáng)，適合導(dǎo)向治療；(3)沒(méi)有恒定區(qū)Fc片段，因而不能與非靶細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合，特異性增強(qiáng)；單鏈抗體的應(yīng)用范圍較廣，利用基因治療的手段，將制備的抗HIV-1 gp120的ScFv于細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，可產(chǎn)生具有重要治療意義的胞內(nèi)抗體，由于HIV-1gp120蛋白在病毒的復(fù)制，侵入過(guò)程中，起著十分重要的作用。因此針對(duì)HIV-1 gp120的胞內(nèi)抗體可產(chǎn)生對(duì)HIV-1感染較強(qiáng)的抵抗力，從而使病毒滴度降低。對(duì)于其產(chǎn)生的抗病毒效力，要依賴(lài)于其親和活性的高低和胞內(nèi)表達(dá)的位置。因此可在單鏈抗上加入細(xì)胞核定位信號(hào)(NLS)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(hào)(KDEL)等。或在ScFv的輕重鏈的可變區(qū)適當(dāng)位置各引入一個(gè)半胱氨酸形成的二硫鍵固定的FV段，構(gòu)建成具有更高親和力的DsFv抗體。另外，在單鏈抗體的VL末端加上相關(guān)一些毒素基因；如PE40，DT等，可構(gòu)建成具有殺傷功能的重組毒素類(lèi)“自殺分子”，完成對(duì)攜帶有HIV-1病毒蛋白標(biāo)記的靶細(xì)胞的殺傷破壞，從而減少病毒在體內(nèi)的潛伏。在HIV-1感染的診斷方面?？赏ㄟ^(guò)進(jìn)一步偶聯(lián)不同的標(biāo)記基因，通過(guò)間接ELISA或竟?fàn)幾钄郋LISA法完成對(duì)HIV-1抗原或抗體的診斷。
利用抗HIV-1外膜蛋白單鏈抗體制備的重組免疫毒素，可用于作為艾滋病病毒感染的治療藥物，目前國(guó)內(nèi)外用于HIV-1治療的藥物主要是化學(xué)藥物，1987年首先開(kāi)始的核苷類(lèi)藥物，如齊多夫定(ADV)、去羥肌苷(ddI)、扎西他淇濱(ddC)、拉杰夫定(3TC)等，但臨床應(yīng)用來(lái)看，核苷類(lèi)藥物對(duì)HIV-1的療效不盡人意；1994年，經(jīng)過(guò)4-5年的研究，非核苷類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑開(kāi)始被用于臨床，主要包括奈韋拉平、沙奎那韋、Ritonavir和Indinavir，這些藥物可減少病毒量，增加CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)，但單藥療效不佳，1995年開(kāi)始使用多種藥物的聯(lián)合治療，即高效抗病毒療法(Highly active anti-retroviraltherapyHAART)，目前研究發(fā)現(xiàn)，高效抗病毒療法可以取得較好的治療效果，可有效抑制病毒復(fù)制，對(duì)于HIV-1感染的治療起到了十分重要的作用，它可以基本上的完全清除血液中的游離HIV-1病毒粒子。但盡管如此，這種方法仍不能完全治愈艾滋病，其根本原因在于，在靜止的CD4+記憶T淋巴細(xì)胞中存在HIV-1的潛伏感染，因此當(dāng)停止使用高效抗病毒療法的治療性藥物時(shí)，這種潛伏感染的HIV-1可隨著原本處于靜止?fàn)顟B(tài)的CD4+記憶T淋巴細(xì)胞的激活而再次復(fù)制，造成體內(nèi)HIV-1病毒數(shù)量的反彈，對(duì)于這種狀況，人們提出了兩種可行的輔助治療途徑，第一種途徑就是利用IL2激活原本處于靜止?fàn)顟B(tài)的HIV-1感染CD4+記憶T淋巴細(xì)胞，激活的CD4+記憶T淋巴細(xì)胞可被機(jī)體的CTL反應(yīng)所識(shí)別殺傷，另外感染的HIV-1本身也可對(duì)激活的CD4+記憶T淋巴細(xì)胞造成一定的破壞，從而使這些細(xì)胞崩解散并釋放出HIV-1病毒粒子，這些病毒粒子則被機(jī)體的中和抗體及HAART藥物的所殺滅；另外一種治療策略是利用重組毒素對(duì)HIV-1感染的靶細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷破壞，這種重組毒素一方面可以直接破壞被HIV-1感染的靜止CD4+記憶T淋巴細(xì)胞，另外也可以使之激活，并可加速激活的HIV-1感染T淋巴細(xì)胞的崩解。
目前重組毒素的構(gòu)建原是利用有一定特異性的載體，把藥物或其他可殺傷HIV-1感染靶細(xì)胞的活性物質(zhì)選擇性地運(yùn)送到HIV-1感染的靶細(xì)胞部位，以殺傷被病毒寄生的細(xì)胞，清除病毒的潛伏，從而達(dá)到提高療效的一種治療途徑與方法。目前研制的抗HIV-1的導(dǎo)向藥物大多數(shù)可以利用人CD4表面抗原或抗HIV-1結(jié)構(gòu)蛋白的標(biāo)致性單抗作為導(dǎo)向載體。這些單抗所針對(duì)的靶標(biāo)通常為HIV-1感染靶細(xì)胞表面的病毒相關(guān)抗原或特定的受體。用作＂彈頭＂的物質(zhì)主要有三類(lèi)，即放射性核素、藥物和毒素。目前體外實(shí)驗(yàn)證明，重組毒素可特異性地殺傷被HIV-1感染的靶細(xì)胞，抑制病毒復(fù)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供抗HIV-1外膜蛋白的單鏈抗體基因及相關(guān)序列，提供針對(duì)HIV-1外膜蛋白，可有效識(shí)別并殺傷HIV-1感染靶細(xì)胞的兩種重組免疫毒素，用于艾滋病的治療的新型生物工程藥物。
本發(fā)明方案的實(shí)現(xiàn)方法將抗HIV-1的單鏈抗體基因，克隆入相關(guān)載體之中，用于進(jìn)行艾滋病病毒感染的基因治療；將抗HIV-1的單鏈抗體基因，在原核及真核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，得到的重組單鏈抗體可用于作為艾滋病病毒感染的被動(dòng)免疫制劑；抗HIV-1的重組免疫毒素，可直接用于作為艾滋病病毒感染者的輔助治療藥物。
以下敘述本發(fā)明的主要內(nèi)容一種抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體的基因序列是本發(fā)明說(shuō)明書(shū)附圖1所指的基因序列。利用這種抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體可作為艾滋病的診斷、治療的方法和手段。
一種抗HIV-1的重組免疫毒素，其特征在于該重組免疫毒素由抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體和綠膿桿菌外毒素A構(gòu)成，其中，綠膿桿菌外毒素A的受體結(jié)合區(qū)被抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體所取代。去除受體結(jié)合區(qū)的綠膿桿菌外毒素PE40核苷酸序列見(jiàn)圖3，該重組毒素scFv-PE的構(gòu)建過(guò)程如圖6所示。本發(fā)明所述的這種重組免疫毒素可作為艾滋病的治療藥物。
一種抗HIV-1的重組免疫毒素，其特征在于該重組免疫毒素由抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體和白喉毒素構(gòu)成，其中，白喉毒素的受體結(jié)合區(qū)被抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體所取代。去除受體結(jié)合區(qū)的白喉毒素DT的核苷酸序列見(jiàn)圖4，該重組毒素DT-scFv的構(gòu)建過(guò)程如圖5所示。本發(fā)明所述的這種重組免疫毒素可作為艾滋病的治療藥物。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明具有下述優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明得到的抗HIV-1單鏈抗體基因，在表達(dá)后證明不但具有很強(qiáng)的抗原結(jié)合特性，而且可以有效識(shí)別不同分離株的HIV-1外膜蛋白。
2、本發(fā)明所涉及的重組免疫毒素，體外實(shí)驗(yàn)證明，可直接殺傷被HIV-1感染的靶細(xì)胞，而對(duì)健康細(xì)胞及組織無(wú)破壞作用。
3、本發(fā)明所涉及的重組免疫毒素，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)明顯毒副作用，不產(chǎn)生特異性病理變化。


圖1為本發(fā)明抗HIV-1外膜蛋白gp120單鏈抗體scFv的基因序列圖2為本發(fā)明抗HIV-1重組毒素的制備原理3為本發(fā)明綠膿桿菌外毒素PE40核苷酸序列圖4為本發(fā)明白喉毒素DT的核苷酸序列圖5為本發(fā)明重組毒素DT-scFv的構(gòu)建過(guò)程示意6為本發(fā)明重組毒素scFv-PE的構(gòu)建過(guò)程示意7為不同濃度重組毒素對(duì)HIV-1感染MT4淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)抗HIV-1外膜蛋白單鏈抗體基因分離及重組毒素的制備與鑒定敘述本發(fā)明的實(shí)施方法。1.單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)、保存及復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)、保存及復(fù)蘇采用常規(guī)方法，具體步驟參照沈關(guān)心、同汝麟等編著的《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》湖北科學(xué)技術(shù)出版社，第24-25頁(yè)。雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為M-1640完全培養(yǎng)基。2.分子生物學(xué)常規(guī)的基因操作大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的提取及限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段的回收、線性DNA的片段的連接、重組質(zhì)粒的篩選與鑒定、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白印跡實(shí)驗(yàn)參照金冬雁、黎孟楓等譯《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社(1992)相關(guān)章節(jié)進(jìn)行。3.鼠源單鏈抗體基因的分離與序列測(cè)定(1)雜交瘤細(xì)胞總RNA的提取培養(yǎng)分泌抗HIV-1外膜蛋白gp120的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株102(本室制備保存細(xì)胞株)至最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，計(jì)算細(xì)胞總量大約為2～3×107。用細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞，離心收集，利用利用總RNA提取試劑盒提取分離出總RNA，用500ul無(wú)RNase水溶解，20℃放置備用。
(2)雜交瘤細(xì)胞mRNA的分離將上步提取的總RNA利用生物素多聚體-磁珠mRNA純化試劑盒分離純化mRNA，用100ul水重懸，-70℃凍存。
(3)cDNA第一條鏈的合成將提取到的mRNA按Mouse ScFv Module Recombinant Phage Autibodysystem提供的方法，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。
(4)鼠免疫球蛋白VH和VL基因的PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物純化分別取上述合成的cDNA產(chǎn)物分別使用VL、VH基因引物(由pharmacia公司生產(chǎn)的Mouse ScFv Module Recombinant phage Antibody System提供)，以94℃ 1min，55℃2min；72℃ 2min的PCR術(shù)式，作用30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因片段。
(5)ScFv的組裝回收的VII和VL基因片段與Lirker-primer Mix以等摩爾濃度混合，使用RSprimer Mix，并加入dNTPs，Tag DNA聚合酶5單位，進(jìn)行7次循環(huán)，反應(yīng)條件為(94℃ 1min，63℃ 4min)，以此反應(yīng)將VII，VL基因拼接為ScFv基因。此反應(yīng)可將ScFv基因兩端分別加上Sfi I和Not I酶切位點(diǎn)。采用Wizard PCR prepsDNA Purification system回收ScFv基因產(chǎn)物。
(6)ScFv基因的克隆及測(cè)序?qū)⑸鲜黾兓募佣薖CR產(chǎn)物，在T4DNA連接酶的作用下，與pGEM-T載體系統(tǒng)(Promega公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至受體菌DH5a中，提取并純化含ScFv的重組質(zhì)粒用ABI377全自動(dòng)熒光DNA序列分析儀進(jìn)行測(cè)序。4.鼠源單鏈抗體基因的人源化改造利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)，找出單鏈抗體的鼠源樞架區(qū)，利用人源抗體樞架區(qū)基因?qū)ζ溥M(jìn)行替換。5、單鏈抗體及重組免疫毒素的制備(1)單鏈抗體及重組免疫毒素在大腸桿菌中的表達(dá)(除利用本發(fā)明pET28原核表達(dá)載體外，還可應(yīng)用其它載體系統(tǒng)表達(dá)重組免疫毒素，包涵體的變性、復(fù)性及純化方法，除本文中所陳述的方法外，還可用其它方法)
利用人工設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，對(duì)人源化單鏈抗體基因進(jìn)行加端PCR擴(kuò)增，將得到的單鏈抗體基因分別代替綠膿桿菌外毒素PE及白喉毒素DT基因的受體結(jié)合區(qū)，得到重組毒素基因，將單鏈抗體及重組毒素基因克隆入大腸桿菌原核表達(dá)載體pET28(Novagen公司產(chǎn)品)中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受體大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen公司產(chǎn)品)中，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定單鏈抗體及重組免疫毒素的表達(dá)量，其中表達(dá)的單鏈抗體N’端融合有His-Tag的純化標(biāo)志，這種表達(dá)方式可便于對(duì)單鏈抗體進(jìn)行活性測(cè)定。
下面結(jié)合附圖5敘述本發(fā)明重組毒素DT-ScFv的制備過(guò)程。
DT重組毒素使用的引物序列引物A5’---AGA TAT ACC ATG GGC GCT GAT GAT GTT GTT GAT---3’NcoI引物B5’---A GTG CCT GAA TTC GGA TCC GGA AGC AAA TGG CGT T---3’BamHI引物C5’—CCA TTT GCT TCC GGA GGT CCT GAG CCA GGT CAA GCT GCA GGA G---3’引物D5’---CCC AAG CTT CTA CTA TAT TTC CAG CTT GGT CC---3’HindIII重組毒素DT-ScFv的制備為將ScFv基因取代DT基因的受體結(jié)合區(qū)，其具體的構(gòu)建過(guò)程為，利用PCR方法擴(kuò)增DT基因，使用引物(A和B)，引物A中，在DT基因上游加入了NcoI位點(diǎn)和ATG序列，引物B在DT基因(389位氨基酸)下游加入了編碼A、S、G三個(gè)氨基酸的核苷酸序列和BamHI位點(diǎn)，擴(kuò)增出的DT基因使用NcoI和BamHI酶切消化后，克隆入pET28載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28-DT；利用PCR方法擴(kuò)增ScFv基因，使用的引物(C和D)，引物C中含有388、389位氨基酸序列以及編碼A、S、G、G、P、E的核苷酸序列和ScFv的上游序列，引物D在ScFv基因下游引入了Hind III酶切位點(diǎn)和終止密碼子；將DT和ScFv基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，回收純化，作為模板，經(jīng)鏈重疊PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)(Overlap extension SOE)，擴(kuò)增DT-ScFv嵌合基因，將得到的嵌合基因使用ClaI和HindIII進(jìn)行酶切消化，克隆入pET28-DT的ClaI和HindIII位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pET28-DT-ScFv。
下面結(jié)合附圖6敘述本發(fā)明重組毒素ScFv-PE的制備過(guò)程。
ScFv-PE重組毒素使用的引物序列引物I5’—AGA TAT ACC ATG AGG TCA AGC TGC AGG AG—3’NcoI引物II5’—G GAA TTC CAT ATG TCC GGA AGC TAT TTC CAG CTT GGT CCC CCC TC—3’NdeI重組毒素ScFv-PE的制備為將ScFv基因取代PE基因的受體結(jié)合區(qū)，其具體的構(gòu)建過(guò)程為，利用PCR方法擴(kuò)增ScFv基因，使用引物(I和II)，引物I中在ScFv基因中引入了Nco I位點(diǎn)，引物II中在ScFv基因下游引入了編碼A、S、G三個(gè)氨基酸的核苷酸序列和NdeI位點(diǎn)。經(jīng)PCR擴(kuò)增ScFv基因后，用NcoI和NdeI酶切回收，克隆入pET28-PE的NcoI和NdeI位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒pET28-ScFv-PE。
(2)單鏈抗體及重組毒素的制備用1/10培養(yǎng)基體積50mmol/L Tris—Cl(pH8.0)、2mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重懸表達(dá)菌體，加溶菌酶(10mg/ml)至終濃度100μg/ml，加1/10體積的1％TritonX-100，振蕩混勻，30℃水浴15min；置冰浴中超聲波處理或加DNA酶I(1mg/ml)至終濃度20μg/ml室溫放置至不再粘稠；分別利用5％TritonX100約30ml洗滌包涵體兩次，再利用2％DOC(脫氧膽酸鹽)按每克菌/6ml洗滌包涵體一次，用含1M Nacl的Tris-Cl(pH8.0)緩沖液洗洗滌包涵體，按每克菌/6ml脲溶解包涵體，4℃12000rpm離心20分鐘后，對(duì)變性包涵體進(jìn)行復(fù)性，建產(chǎn)以下復(fù)性體系蛋白的初始濃度為30-50ug/ml，50mMTris-Hcl PH8.5，1M脲，lmMGSH，0.1MGSSG，2mM-MT，放于10-20℃冷室中復(fù)性20小時(shí)，用2000ml 50mM Tris-Hcl(pH8.0)緩沖液于4℃透析，每12小時(shí)換液一次，共48小時(shí)，超濾濃縮，利用離子交換樹(shù)脂進(jìn)行復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物-20℃凍存?zhèn)溆谩?.單鏈抗體的抗原結(jié)合活性測(cè)定利用HIV-1血清抗體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)膜條，采用蛋白印跡法對(duì)單鏈抗體進(jìn)行活性測(cè)定，所用二抗為抗His-Tag單克隆抗體，具體操作如下利用封閉液(10mmol/LTris-Cl pH7.5、150mmol/L NaCl、2％Tween20、3％BSA)浸泡HIV-1血清抗體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)膜條，室溫封閉2小時(shí)，以封閉無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，回收封閉液；用洗滌緩沖液(10mmol/L Tris·Cl pH7.5、0.15mol/L NaCl、0.05％Tween20)漂洗膜條3次，每次5分鐘；用含0.4％BSA的洗滌緩沖液1∶10稀釋待檢單鏈抗體，與HIV-1血清抗體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)膜條進(jìn)行反應(yīng)；室溫反應(yīng)2小時(shí)回收抗體，用洗滌緩沖液洗滌HIV-1血清抗體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)膜條膜3次，每次5分鐘；后與第二抗體(抗His-Tag單克隆抗體)反應(yīng)，室溫作用2小時(shí)，用含O.4％BSA的洗滌緩沖液l300稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗鼠抗體，與HIV-1血清抗體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)膜條膜進(jìn)行反應(yīng)，室溫作用2小時(shí)；回收抗體，用洗滌緩沖液漂洗硝酸纖維素膜3次，每次分鐘。取O.5gNBT溶于10ml 70％二甲基甲酰胺溶液中配制NBT液；取0.59BCIP溶于10ml 100％二甲基甲酰胺溶液中配制BCIP液。將33μl NBT液和16.5μl BCIP液依次加入堿性磷酸酶緩沖液(100mmol／LNaCl、5mmol/L MgCl 2、100mmol／L Tris·Cl pH9.5)混勻，配制NBT／BCIP顯色液。用堿性磷酸酶緩沖液漂洗硝酸纖維素膜后，加入顯色液進(jìn)行顯色。顯色完成后，將硝酸纖維素膜移至餾水中終止顯色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，制備的單鏈抗體可以與HIV-1gpl20標(biāo)準(zhǔn)抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，可在HIV-1血清抗體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)膜條膜的gpl20位置出現(xiàn)特異性顯色條帶。7.重組毒素的生物學(xué)活性測(cè)定為了驗(yàn)證所得到的產(chǎn)物是安全有效的生物活性物質(zhì)，本發(fā)明對(duì)目的蛋白進(jìn)行了一般性藥理、藥效、及急性和亞急性動(dòng)物毒性試驗(yàn)。(1)細(xì)胞殺傷作用首先制備HIV感染的靶細(xì)胞模型，(H1V-1強(qiáng)毒操作需在P3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行)，將傳代的淋巴腫瘤細(xì)胞MT4，調(diào)整細(xì)胞密度為106/ml，接入B亞型HIV-1，感作2小時(shí)后，去除病毒，更換健康M-1640完全細(xì)胞培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2下培養(yǎng)過(guò)夜，用于測(cè)定重組毒素對(duì)HIV-1感染細(xì)胞的殺傷破壞作用。將純化復(fù)性后的重組毒素進(jìn)行超濾除菌，進(jìn)行濃度測(cè)定后分別作用于HIV-1感染細(xì)胞，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)，測(cè)定重組毒素對(duì)這兩種細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。測(cè)定結(jié)果證明，制備的重組毒素具有良好的細(xì)胞殺傷活性，可以特異性殺傷HIV-1感染的靶細(xì)胞。具體結(jié)果見(jiàn)圖7。圖7為使用不同濃度的重組毒素對(duì)HIV-1感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，當(dāng)重組毒素ScFv-PE和DT-ScFv的濃度小于0.4以下時(shí)，HIV-1感染細(xì)胞的生長(zhǎng)不受影響，而當(dāng)重組毒素的濃度達(dá)到4ng/m時(shí)，HIV-1感染細(xì)胞的生長(zhǎng)減慢并出現(xiàn)細(xì)胞的死亡，當(dāng)重組毒素的濃度達(dá)40ng/ml時(shí)，90％以上的細(xì)胞出現(xiàn)死亡。(重組毒素的作用效果以重組毒素加入細(xì)胞24小時(shí)中，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì))(2)抗原親和力測(cè)定利用間接ElISA法，具體步驟參照沈關(guān)心、同汝麟等編著的《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》湖北科學(xué)技術(shù)出版社，第121-123頁(yè)。比較抗HIV-1重組毒素與原始HIV-1gp120單克隆抗體的抗原親和力，分別對(duì)重組毒素及抗HIV-1gp120單克隆抗體進(jìn)行測(cè)定，所用的抗原為重組HIV-1gp120蛋白，測(cè)定結(jié)果證明重組毒素具有與親本抗體相同的抗原親和活性。(3)毒理學(xué)檢查動(dòng)物靜脈注射相當(dāng)與人用劑量100倍的抗HIV-1重組毒素，通過(guò)動(dòng)物的生長(zhǎng)狀況及病理學(xué)檢查測(cè)定重組毒素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒副作用，結(jié)果表明，抗HIV-1重組毒素沒(méi)顯示出明顯的毒副作用(主要臟器未出現(xiàn)明顯的病理變化)。
研究結(jié)果證明，抗HIV-1重組毒素是一種安全、有效的新型融合蛋白，具有開(kāi)發(fā)利用成為新的艾滋病治療藥物的良好前景。
權(quán)利要求
1.一種抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體，其特征在于該單鏈抗體的基因序列是本發(fā)明說(shuō)明書(shū)附圖1所指的基因序列。
2.一種抗HIV-1的重組免疫毒素，其特征在于該重組免疫毒素由抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體和綠膿桿菌外毒素A構(gòu)成，其中，綠膿桿菌外毒素A的受體結(jié)合區(qū)被抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體所取代。
3.一種抗HIV-1的重組免疫毒素，其特征在于該重組免疫毒素由抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體和白喉毒素構(gòu)成，其中，白喉毒素的受體結(jié)合區(qū)被抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體所取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于利用這種抗HIV-1外膜蛋白gp120的單鏈抗體作為艾滋病的診斷、治療的方法和手段。
5.根據(jù)權(quán)利要求2和3所述的重組免疫毒素，其特征在于所述的重組免疫毒素作為艾滋病的治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗HIV－1外膜蛋白的單鏈抗體,兩種抗HIV－1的重組免疫毒素。其中,抗HIV－1外膜蛋白的單鏈抗體具有特定的基因序列;兩種重組免疫毒素是利用抗HIV－1外膜蛋白的單鏈抗體分別代替綠膿桿菌外毒素和白喉毒素的受體結(jié)合區(qū)而制備的?？笻IV－1外膜蛋白的單鏈抗體可應(yīng)用于艾滋病病毒感染的診斷和免疫治療;重組免疫毒素可對(duì)HIV－1感染的靶細(xì)胞進(jìn)行特異性的殺傷破壞,可用于作為艾滋病病毒感染的治療藥物。
文檔編號(hào)C12N15/62GK1330081SQ01120240
公開(kāi)日2002年1月9日 申請(qǐng)日期2001年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月11日
發(fā)明者金寧一, 王宏偉, 金洪濤, 江文正, 張應(yīng)玖, 金擴(kuò)世, 郭志儒, 夏志平 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所