專利名稱：一種檢測水中常見致病菌的dna微振列的制作方法
本技術(shù)屬于微生物檢測技術(shù)、尤其是水中致病菌的檢測技術(shù)范疇。
由致病菌污染水或食品等而引起的疾病每年導(dǎo)致成千上萬的人發(fā)病或死亡和無法估量的經(jīng)濟(jì)損失，因此，致病菌的快速、準(zhǔn)確檢測與鑒定是控制細(xì)菌性疾病發(fā)生的重要手段。傳統(tǒng)的致病菌檢測一般采用培養(yǎng)法和生化反應(yīng)及血清型鑒定技術(shù)，操作復(fù)雜、檢測時間長，PCR技術(shù)檢測致病菌一次實(shí)驗(yàn)只能檢測一種細(xì)菌，對分離到的未知細(xì)菌或樣品中存在的多種檢測十分困難。該芯片可以對水中存在的所用常見致病菌進(jìn)行快速、系統(tǒng)的檢測。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過以下方案來實(shí)現(xiàn)的1、利用細(xì)菌的16s rRNA基因設(shè)計引物，兩條PCR引物分別設(shè)計在16s rRNA基因的保守區(qū)，引物序列是上游引物5’AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT 3’下游引物5’AGG AGG TGA TCC AAC CGC A 3’，其中一條引物經(jīng)過5’端熒光素標(biāo)記。利用這一對引物可以擴(kuò)增出細(xì)菌的約370bp長的片段(針對不同細(xì)菌，產(chǎn)物片段長度有所不同)，該技術(shù)利用一對引物可以擴(kuò)增樣品中所有的細(xì)菌的核酸，擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA微陣列上探針雜交后可以檢測出樣品中致病細(xì)菌的種類。
2、探針的序列設(shè)計在16s rRNA基因的可變區(qū)，探針分為五類A.所有真細(xì)菌共有探針；B.區(qū)分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的探針；C.科特異性探針；D.屬/種特異性探針；E.陽性對照探針和陰性對照探針。探針為寡核苷酸探針，探針的3’端或者5’端經(jīng)過了氨基化修飾。
3、探針固定在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等固相載體上，形成n*n的陣列，每一陣列的第一行第一列、第一行最后一列、最后一行第一列和最后一行最后一列這四個位置上的探針為陽性對照探針?？梢杂卸鄠€這樣的陣列分布于同一個固相載體上。
4、將探針涂布到固相載體的途徑是機(jī)械手打印、噴印或者手工點(diǎn)樣，這樣制備好的探針陣列就是DNA微陣列。
5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在一定的雜交反應(yīng)條件下與DNA微陣列共保溫20分鐘至2小時，利用熒光掃描儀即可檢測到熒光信號。根據(jù)信號出現(xiàn)的位置可以判斷出細(xì)菌的種類。
這項(xiàng)DNA微陣列技術(shù)可以檢測的細(xì)菌有埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、葡萄球菌屬、變形桿菌屬、厭氧梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬的細(xì)菌以及嗜肺軍團(tuán)桿菌、結(jié)核分枝桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核增生李斯特氏菌、綠膿假單胞菌、空腸彎曲菌等。這項(xiàng)DNA微陣列技術(shù)可以用于臨床疾病診斷、水和食品的監(jiān)督與檢測與流行病學(xué)調(diào)查等。
權(quán)利要求
1.一種利用16s rRNA基因檢測與鑒定水中常見致病菌的DNA微陣列技術(shù)，該技術(shù)利用一對引物擴(kuò)增樣品中的細(xì)菌，擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA微陣列雜交后可以檢測出樣品中致病細(xì)菌的種類，其特征在于PCR引物、探針的序列、探針的排布、雜交檢測過程和檢測細(xì)菌的范圍五個方面
2.根據(jù)專利要求1所述的DNA微陣列技術(shù)，其特征在于，兩條PCR引物分別設(shè)計在16s rRNA基因的保守區(qū)，利用這一對引物可以擴(kuò)增出細(xì)菌的約370bp長的片段(針對不同細(xì)菌，產(chǎn)物片段長度有所不同)，作為下一步DNA微陣列檢測的靶序列。
3.根據(jù)專利要求1所述的DNA微陣列技術(shù)，其特征在于，引物序列是上游引物5′AAC TGG AGG AAG GTG GGG AT 3′，下游引物5′AGG AGG TGA TCC AAC CGC A3′，其中一條引物經(jīng)過5’端熒光素標(biāo)記。
4.根據(jù)專利要求1所述的DNA微陣列技術(shù)，其特征在于，探針的序列設(shè)計在16srRNA基因的可變區(qū)，探針分為五類A.所有真細(xì)菌共有探針；B.區(qū)分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的探針；C.科特異性探針；D.屬/種特異性探針E.陽性對照探針和陰性對照探針。
5.根據(jù)專利要求1所述的DNA微陣列技術(shù)，其特征在于，探針為寡核苷酸探針，探針的3’端或者5’端經(jīng)過了氨基化修飾。
6.根據(jù)專利要求1所述的DNA微陣列技術(shù)，其特征在于，探針固定在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等固相載體上，形成n*n的陣列，每一陣列的第一行第一列、第一行最后一列、最后一行第一列和最后一行最后一列這四個位置上的探針為陽性對照探針。可以有多個這樣的陣列分布于同一個固相載體上。
7.根據(jù)專利要求1所述的DNA微陣列技術(shù)，其特征在于，將探針涂布到固相載體的途徑是機(jī)械手打印、噴印或者手工點(diǎn)樣，這樣制備的探針陣列就是DNA微陣列
8.根據(jù)專利要求1所述的DNA微陣列技術(shù)，其特征在于，利用上述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在一定的雜交反應(yīng)條件下與DNA微陣列共保溫20分鐘至數(shù)小時，利用熒光掃描儀即可檢測到熒光信號。根據(jù)信號出現(xiàn)的位置及強(qiáng)度可以判斷出細(xì)菌的種類。
9.根據(jù)專利要求1所述的DNA微陣列技術(shù)，其特征在于，這項(xiàng)DNA微陣列技術(shù)可以檢測的細(xì)菌有埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、葡萄球菌屬、變形桿菌屬、厭氧梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬的細(xì)菌以及嗜肺軍團(tuán)桿菌、結(jié)核分枝桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核增生李斯特氏菌、綠膿假單胞菌、空腸彎曲菌等。
10.根據(jù)專利要求1所述的DNA微陣列技術(shù)，其特征在于，這項(xiàng)DNA微陣列技術(shù)可以用于臨床疾病診斷、水和食品的監(jiān)督與檢測與流行病學(xué)調(diào)查。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DNA微振列檢測水中常見致病菌的技術(shù)。該技術(shù)利用16s rRNA基因檢測與鑒定水中常見致病菌，兩條引物分別設(shè)計在16srRNA基因的保守區(qū)，探針在16s rRNA基因的可變區(qū)。該DNA微陣列技術(shù)可檢測埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、葡萄球菌屬、變形桿菌屬、厭氧梭狀芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、軍團(tuán)桿菌、結(jié)核分枝桿菌、耶爾森氏菌、李斯特氏菌、銅綠假單胞菌、空腸彎曲菌，可用于臨床疾病診斷、水和食品的監(jiān)督與檢測與流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號C12Q1/68GK1396270SQ0112029
公開日2003年2月12日 申請日期2001年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月16日
發(fā)明者李君文, 靳連群, 晁福寰, 鄭金來, 王新為 申請人:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所