專利名稱：一種向動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)移外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種向動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)移外源基因的方法。
目前在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制備上主要有兩種方法受精卵原核顯微注射和以精子為載體的導(dǎo)入方法。前者要求受精卵原核具有一定的能見度(這在相當(dāng)多的動物中是很困難的)和操作者具有相當(dāng)高的操作技術(shù)(不易掌握)，而且易造成核損傷，導(dǎo)致出生率很低，轉(zhuǎn)基因失??；后者則不穩(wěn)定，重復(fù)性差。而體外培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，一直困于轉(zhuǎn)染率很低，只能進行細(xì)胞學(xué)的觀察實驗，無法進行其它研究。因此人們一直在嘗試另一途徑通過細(xì)胞質(zhì)注射基因獲得轉(zhuǎn)基因動物。這一途徑在80年代和90年代曾嘗試過，結(jié)果是失敗的[Mario R.et al.Cell 22479～488；Mirzayans R，et al.Mutat Res，281(2)115～22]。近年來隨著核定位序列(nuclear localization signals，NLS)和功能的研究，一些實驗室嘗試用NLS攜帶靶基因構(gòu)件進入細(xì)胞核，這一嘗試取得了初步成功[Collas P，etal.Transgenic Res 1998，7(4)303～9；Dean DA，et al.Exp Cell Res，1999，253(2)713～22；Wilson GL，et al.J Biol Chem，1999，274(31)22025～32；Collas P，et al.Transgenic Res 1996 5(6)451～8；Page RL，et al.TransgenicRes 1995 4(6)353～60]。Collas P等在斑馬魚卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛凶C明用一種經(jīng)典的NLS-SV40 T抗原與DNA形成復(fù)合物，可以提高轉(zhuǎn)基因的整合率和進入細(xì)胞核的DNA量，增加染色質(zhì)上整合位點[Collas P，et al.Transgenic Res 1998，7(4)303～9；Collas P，et al.TransgenicRes 1996 5(6)451～8]；傳代跟蹤檢測，用這種方法轉(zhuǎn)基因，外源基因進入種質(zhì)系的比例從14％提高到43％(P＜0.01)。Page RL[Page RL，et al.Transgenic Res 1995 4(6)353～60]等用人工合成的多聚賴氨酸與DNA構(gòu)件形成復(fù)合體，進行細(xì)胞質(zhì)注射獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠，其整合率為12.8％；而在細(xì)胞質(zhì)只注射靶基因構(gòu)件的對照組的小鼠整合率為零。通過原核注射獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠整合率為21.7％(只注射了靶基因構(gòu)件)。這些結(jié)果說明，核定位序列是能夠以復(fù)合體形式將外源基因構(gòu)件從細(xì)胞質(zhì)帶入細(xì)胞核的。
本發(fā)明的向動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)移外源基因的方法，包括使用靶基因構(gòu)建靶基因表達(dá)載體；使用核定位蛋白基因構(gòu)建核定位蛋白基因表達(dá)載體；以及將得到的靶基因表達(dá)載體和核定位蛋白基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染或共注射或電穿孔到培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中或動物受精卵細(xì)胞質(zhì)中的步驟。
在本發(fā)明的方法中，所述的細(xì)胞可以是培養(yǎng)中的動物細(xì)胞，也可以是動物的受精卵。動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)，可按常規(guī)方法進行[司徒鎮(zhèn)強等.細(xì)胞培養(yǎng).北京世界圖書出版西安公司，(第一版)，1996年.58～84]。受精卵的獲得按常規(guī)方法進行[Hogan B，et al.Manipulating the mouseembryo，A laboratory manual.Cold Spring Harbor，New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1986.89～175]。
所述的核定位蛋白基因表達(dá)載體是可以在真核細(xì)胞表達(dá)核定位蛋白的基因構(gòu)件(DNA形式)。其編碼序列可以是生物細(xì)胞天然序列，也可為人工合成的基因序列。其調(diào)控區(qū)在真核細(xì)胞具有調(diào)控編碼序列表達(dá)的功能，可以是病毒基因序列，如CMV啟動子、SV40啟動子，也可為核定位蛋白基因本身的啟動區(qū)序列，如H2A.z的promoter。所述的靶基因表達(dá)載體是具有特定調(diào)控區(qū)的目的或目標(biāo)基因的表達(dá)單位或構(gòu)件。可為重組載體或天然表達(dá)單位。這種載體可以是現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何一種可以引導(dǎo)外源基因在動物細(xì)胞中表達(dá)的載體。
本發(fā)明的靶基因構(gòu)件與動物核定位蛋白基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)運的細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)入法，靶基因適用范圍廣泛，可用于a.真核類所有動物種類，如昆蟲類、兩棲類、鳥類、脊椎動物等；b.不同組織的體外培養(yǎng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞；以及c.生殖細(xì)胞如受精卵、精子等?；?qū)敕绞娇梢允窃噭┺D(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射等，只要被導(dǎo)入的基因溶液中含有核定位(信號)蛋白基因表達(dá)載體且被導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)中，本方法均可促進外源基因在宿主染色體上的整合。在本發(fā)明的方法中，核定位蛋白是指一類具有趨核性遷移并在細(xì)胞核區(qū)定位的多肽或蛋白，存在于各種真核生物、病毒或為人工合成產(chǎn)物，如作用于核的激素、SV40大T抗原、人工合成的多聚賴氨酸，組蛋白等。組蛋白主要有H1、H2A、H2B、H3、H4、H2A.z等六種，推薦優(yōu)先使用H2A.z作為核定位(信號)蛋白。組蛋白基因序列可以從GenBank中直接查閱。現(xiàn)給出實施例中所用的小鼠組蛋白基因H2A.z的GenBank的登錄號碼MMU 70494，NM 016750。
將靶基因表達(dá)載體(DNA)與核定位蛋白基因表達(dá)載體(DNA)共注射或共轉(zhuǎn)染或電穿孔到受體細(xì)胞質(zhì)中。先將靶基因表達(dá)載體與核定位蛋白基因表達(dá)載體分別用DNA純化試劑盒純化，再用瓊脂糖凝膠電泳估算DNA濃度。靶基因表達(dá)載體與核定位蛋白基因表達(dá)載體的DNA分子按照10∶1～1∶5的分子數(shù)比例混合(推薦使用1∶1的分子數(shù)比例)，導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)(共注射、共轉(zhuǎn)染或電穿孔方式導(dǎo)入)。
在本發(fā)明的方法中，假孕鼠的制備和胚胎移植均按常規(guī)方法[HoganB，et al.Manipulating the mouse embryo，A laboratory manual.Cold SpringHarbor，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1986.89～175]。
本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后可進行轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體外篩選，再進行相應(yīng)研究，如細(xì)胞水平的研究和核移植、胚胎移植，直至首代轉(zhuǎn)基因動物出生。對首代轉(zhuǎn)基因動物可進行外源基因整合檢測，按PCR-Southern雜交進行(張靖溥等.遺傳學(xué)報，1999，26135～141)。
(ii)實驗動物.昆明白小鼠。
(iii)基因構(gòu)件與引物.核定位蛋白基因為小鼠H2AZ基因表達(dá)構(gòu)件，其上游及下游調(diào)控區(qū)以及H2AZ基因的編碼區(qū)均來自小鼠基因組文庫的篩選，其cDNA序列的GenBank編號為MMU 70494和NM 016750。牛α-s1-casein-hG-CSF構(gòu)件由牛α-s1-casein 5’調(diào)控元件2.2kb和3’調(diào)控序列2kb與人G-CSF基因組序列1.5kb拼接而成[Zhang J P，et al.Biotechnology Letters，2001(in press)]。用于bovine-α-s1-casein-hG-CSF構(gòu)件的整合檢測的引物序列為5’TCCTCTGACAAACCCTAC3’(GF1)和5’CATGCTGTTCCCTACCAC3’(GF2)。引物設(shè)計策略是上游引物位于牛α-s1-casein 5’promoter區(qū)域，下游引物位于目的基因區(qū)域，所得PCR產(chǎn)物跨越5’上游序列與目的基因的拼接位點。
(iv)轉(zhuǎn)基因小鼠的制備.將靶基因表達(dá)構(gòu)件牛α-s1-casein-hG-CSF(5.7kb)從質(zhì)粒載體上用限制性內(nèi)切酶KpnI和SacII切下(見

圖1)，用DNA純化試劑盒純化DNA片段，并用瓊脂糖凝膠電泳估算DNA濃度。H2AZ基因表達(dá)構(gòu)件進行同樣處理。這兩種DNA片段按照1∶1的分子數(shù)比例混合，并按每一種DNA分子40拷貝/2pL每卵進行小鼠受精卵細(xì)胞質(zhì)注射，再將經(jīng)基因注射的胚胎移入假孕母體內(nèi)，共移卵313枚，做為細(xì)胞質(zhì)共注射實驗組；對照組，只含同等濃度的靶基因構(gòu)件牛α-s1-casein-hG-CSF，而不含H2AZ基因表達(dá)構(gòu)件。移卵62枚；二者共移卵375枚。受精卵細(xì)胞核對照注射組也只注射同等濃度的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件牛α-s1-casein-hG-CSF，注射方法同文獻(xiàn)[Hogan B，et al.Manipulating the mouse embryo，Alaboratory manual.Cold Spring Harbor，New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1986.89～175]，移植220個注射卵到假母體內(nèi)。
(v)基因組DNA的提取取小鼠尾尖1.5厘米長，按常規(guī)方法提取基因組DNA[Hogan B，et al.Manipulating the mouse embryo，A laboratorymanual.Cold Spring Harbor，New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1986.89～175]。用0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的質(zhì)量和濃度。進行PCR-Southern分析。
(vi)PCR-Southern雜交.轉(zhuǎn)基因構(gòu)件在小鼠染色體上的整合采用PCR-Southern雜交方法檢測。以上述不同基因組合和不同注射途徑的首代小鼠基因組DNA為PCR模板，每一組均含未進行基因注射的正常小鼠為陰性對照，轉(zhuǎn)基因構(gòu)件DNA片段為陽性對照模板。PCR反應(yīng)系統(tǒng)按照試劑盒說明進行，每一反應(yīng)含上游引物和下游引物各30pmol、DNA模板0.1ug。35個循環(huán)98℃ 500sec，58℃ 60sec，72℃ 60sec，94℃ 60sec。PCR產(chǎn)物為480bp。取15ul PCR產(chǎn)物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移至Nylon膜，進行常規(guī)Southern雜交(65℃)[Sambrook J，et al.1989.Molecular Cloning.A Laboratory Manual.(2nded).New York.Cold SpringHarbor Laboratory Press]。雜交探針為陽性模板的PCR片段，用α-P32-dATP隨機引物法標(biāo)記。
(vii)Western blot法檢測靶基因在乳腺細(xì)胞的特異表達(dá)。收集分娩7天的首代小鼠的乳汁，每一乳樣取50ul，用一倍體積的TBS緩沖液(137mM NaCl，20mM Tris，pH7.6)稀釋，混勻，4℃離心12,000rpm 20分鐘。取上清(乳清)儲存于-20℃待用[張靖溥等.遺傳學(xué)報，1999，26135～141；Simons J P，et al.Nature，1987，328530～532]。Westernblotting取5ul乳清與蛋白變性液[Sambrook J，et al.1989.MolecularCloning.A Laboratory Manual.(2nded).New York.Cold Spring HarborLaboratory Press]按1∶1混勻，煮沸5分鐘，取4ul進行SDS-PAGE(12％)電泳，同時，以重組的人G-CSF蛋白(大腸桿菌產(chǎn)物)為陽性對照、未轉(zhuǎn)基因的正常鼠乳為陰性對照，進行同樣處理。電泳后，將SDS-PAGE凝膠上樣品電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用脫脂奶粉-TBS在4℃封閉過夜。用第一抗體兔抗人G-CSF多克隆抗體(1∶3000稀釋于TBS-T溶液)與轉(zhuǎn)移膜在室溫下溫育一小時。用TBS-T充分洗滌后，將膜與第二抗體羊抗兔IgG(H+L)-AP(1∶3000稀釋)在室溫下溫育一小時。再次充分洗滌后，用BCIP/NBT染色液顯色。結(jié)果與討論1)卵細(xì)胞質(zhì)注射與原核注射的出生率比較以原核注射為對照組，卵細(xì)胞質(zhì)注射分為兩個實驗組(與mH2AZ共注射組和只注射靶基因表達(dá)構(gòu)件組)，進行顯微注射轉(zhuǎn)基因，分別計算仔鼠的出生率。計算公式出生率(％)＝(出生仔數(shù)÷移植卵數(shù))×100。卵細(xì)胞質(zhì)注射組，共移卵375枚，出生仔數(shù)為133只。出生率為35.47％。其中，靶基因表達(dá)構(gòu)件與mH2AZ表達(dá)載體共注射組移卵313枚，出生仔鼠數(shù)111只，出生率為35.46％；只有靶基因表達(dá)構(gòu)件組移卵62枚，出生仔鼠22枚，出生率為35.48％。原核注射組共移卵220枚，出生仔數(shù)為25只。出生率為11.5％(圖2)。
上述結(jié)果表明，卵細(xì)胞質(zhì)注射組的出生率是原核注射的小鼠出生率的三倍以上，說明細(xì)胞質(zhì)注射可以大大減少受精卵的損傷，增加轉(zhuǎn)基因首代小鼠的出生率，即在一定程度上，可以提高獲得轉(zhuǎn)基因動物的機率，降低成本。在細(xì)胞質(zhì)注射組中，共注射組與只注射靶基因構(gòu)件組的出生率沒有明顯差異(分別為35.46％和35.48％)，說明mH2AZ表達(dá)載體對小鼠出生率沒有影響。2)核定位蛋白基因與轉(zhuǎn)基因的整合率為了驗證核定位蛋白的促進外源基因整合功能，在細(xì)胞質(zhì)注射實驗中設(shè)制了不加mH2AZ表達(dá)載體的細(xì)胞質(zhì)注射組做為對照。用PCR-Southern雜交方法檢測牛α-s1-casein-hG-CSF基因構(gòu)件在小鼠基因組的整合情況，所用PCR引物分別位于牛α-s1-casein 5’調(diào)控區(qū)和人G-CSF基因區(qū)。結(jié)果表明，含有mH2AZ表達(dá)載體的細(xì)胞質(zhì)注射組，整合率為58％(29/50只)(圖3a)；而不含mH2AZ表達(dá)載體的對照組，整合率為零(0/22只)(圖3b)，但有一只小鼠在兩次重復(fù)檢測中有一次為陽性，判為可疑。原核注射對照組的整合率為17.4％。
上述結(jié)果說明核定位蛋白基因表達(dá)載體與靶基因構(gòu)件的共注射具有促進外源基因在宿主染色體上整合的作用。完全可以替代原核注射方法來制備轉(zhuǎn)基因動物。Page等[Page RL，et al.Transgenic Res 19954(6)353～60]用多聚賴氨酸與靶基因構(gòu)件DNA片段形成復(fù)合體，進行細(xì)胞質(zhì)注射獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠，整合率為12.8％，而無NLS對照組的整合率為0％，原核注射對照為21.7％。其結(jié)果中除其細(xì)胞質(zhì)注射的整合率低于本文結(jié)果外，其它兩項與我們的結(jié)果相同或類似。不同點是本文所用核定位信號是哺乳類的mH2AZ，且以DNA形式進入細(xì)胞，推測mH2AZ表達(dá)載體先進行暫態(tài)表達(dá)，然后其蛋白產(chǎn)物攜帶靶基因載體進入核區(qū)，其轉(zhuǎn)基因整合率是人工合成的NLS四倍以上。這可能是由于天然核定位信號更容易識別和攜帶DNA所致。其機理有待進一步研究。3)靶基因在小鼠乳汁中的的表達(dá)采用Western-blotting方法對小鼠乳汁中是否含有人G-CSF蛋白進行了檢測。共檢測了12只通過細(xì)胞質(zhì)注射獲得的整合陽性的雌鼠乳汁，其中9只可以表達(dá)人G-CSF蛋白。表達(dá)率達(dá)75％，初步估算表達(dá)水平在60-550mg/l乳清(圖4)。
說明大多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件可以在乳腺細(xì)胞表達(dá)。另外，從上述結(jié)果可知，重組的人G-CSF蛋白分子量(約14kD)比小鼠乳汁中的人G-CSF蛋白分子量(約20kD)要小，這是由于前者為大腸桿菌的產(chǎn)物，是未經(jīng)糖基化的分子形式；而后者可能是由于在真核細(xì)胞表達(dá)的經(jīng)過了糖基化的后修飾所致(吳梧桐等，基因工程藥物一基礎(chǔ)與臨床.北京人民衛(wèi)生出版社，1996.169～171)。這也說明經(jīng)乳腺細(xì)胞表達(dá)的蛋白與天然形式的蛋白結(jié)構(gòu)很接近，因此其產(chǎn)品的活性和生理功能也更接近。此外，在正常乳汁中，還可以檢到痕跡量的G-CSF蛋白，這在國際刊物上也有報道(Calhoun D A，et al.Pediatrics，2000，105e7；Goldman A S，etal.J Mammary Gland Biol Neoplasia，1996，1251～8；Juul S E，et al.PediatrRes，1999，46263～268；Kling P J，et al.Pediatr Res，1998，43216～221)，說明某些細(xì)胞因子在哺乳類的乳汁中確實存在。
綜上所述，利用哺乳類核定位基因進行細(xì)胞質(zhì)共注射制備轉(zhuǎn)基因動物是一種簡便、實用的技術(shù)。這種技術(shù)不僅易于掌握和普及，而且轉(zhuǎn)基因的整合率和表達(dá)率也很可觀。完全可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的受精卵原核注射方法，可以大大促進轉(zhuǎn)基因動物相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。
權(quán)利要求
1.一種向動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)移外源基因的方法，包括使用靶基因構(gòu)建靶基因表達(dá)載體；使用核定位蛋白基因構(gòu)建核定位蛋白基因表達(dá)載體；以及將得到的靶基因表達(dá)載體和核定位蛋白基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染或共注射或電穿孔到培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中或動物受精卵細(xì)胞質(zhì)中的步驟。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的核定位蛋白是作用于核的激素、SV40大T抗原、人工合成的多聚賴氨酸，或者組蛋白等。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述的組蛋白是H1、H2A、H2B、H3、H4、或者H2A.z。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述的組蛋白是H2A.z。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，靶基因表達(dá)載體與核定位蛋白基因表達(dá)載體的DNA分子比例為10∶1～1∶5。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，靶基因表達(dá)載體與核定位蛋白基因表達(dá)載體的DNA分子比例為1∶1。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種向動物細(xì)胞中轉(zhuǎn)移外源基因的方法，包括使用靶基因構(gòu)建靶基因表達(dá)載體；使用核定位蛋白基因構(gòu)建核定位蛋白基因表達(dá)載體；以及將得到的靶基因表達(dá)載體和核定位蛋白基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染或共注射或電穿孔到培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中或動物受精卵細(xì)胞質(zhì)中的步驟。
文檔編號C12N15/64GK1400310SQ0112068
公開日2003年3月5日 申請日期2001年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月27日
發(fā)明者張靖溥, 李光三, 杜淼 申請人:中國科學(xué)院發(fā)育生物學(xué)研究所